KR100817934B1 - 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 이용한스테로이드 화합물의 선택적 추출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 이용한 스테로이드 화합물의 선택적 추출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 β-사이클로덱스트린에 에피클로로히드린을 처리하여 제조된 젤상의 중합체를 경화시킨 다음 분쇄하여 제조된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용하여 기존의 고체상 추출 방법과는 달리 별도의 장치 없이 간단하게 생체시료 내에 존재하는 스테로이드 호르몬을 효과적으로 추출할 수 있는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 이용한 스테로이드 화합물의 선택적 추출방법에 관한 것이다.
스테로이드, 호르몬, 사이클로덱스트린
Description
도 1의 (a)는 β-사이클로덱스트린의 화학적 구조를 나타내는 것이고, (b)는 β-사이클로덱스트린의 입체 구조를 간략하게 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에 제시한 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말의 제조방법을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
도 3의 (a)는 β-사이클로덱스트린의 SEM 사진이고, (b)는 실시예 1에 의하여 제조된 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말의 물리적 형태를 나타내는 SEM 사진이며, (c)는 경화제 성분인 Ca 이온이 표면에 존재하고 있음을 나타내는 원소 성분분석 결과이다.
도 4a와 도 4b는 실시예 2에 의하여 소변으로부터 추출된 내인성 안드로겐과 에스트로겐의 분석결과를 나타낸 크로마토그래프이다.
도 5a, 5b, 5c 및 5d는 실시예 3에 의하여 소변으로부터 추출된 도핑 검사용 합성 동화성 스테로이드 호르몬 분석결과를 나타낸 크로마토그래프이다.
도 6은 실시예 4에 의하여 소변으로부터 추출된 부신피질 호르몬의 분석결과 를 나타낸 크로마토그래프이다.
본 발명은 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 이용한 스테로이드 화합물의 선택적 추출방법에 관한 것이다.
종래에는 임상시험, 식품, 환경, 마약분석 분야뿐만 아니라 운동선수들의 금지약물 검사를 위한 생체시료로부터 스테로이드 호르몬을 추출하기 위하여 충진 물질과 분석물질과의 반친수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 기본 원리로 하는 고체상 추출방법(Solid-Phase Extraction, 이하 "SPE"라고 한다)이 광범위하게 사용되고 있다(Journal of Chromatography A, 885: 3-16, 237-250, 321-341, 2000; Rapid Communications in Mass Spectrometry, 16: 2221-2228, 2002).
반친수성 상호작용에 의한 스테로이드 호르몬의 SPE에는 주로 변형된 실리카(C8, C18, phenyl, amino)와 공중합체(XAD: styrene과 divinylbenzene; Oasis HLB™: divinylbenzene과 N-vinylpypyrrolidone) 형태의 흡착제들이 주로 사용되고 있다.
상기 기술 중 실리카 흡착제를 사용할 경우에는 시료 전처리 과정에서 pH에 따라 변형된 부분이 비활성화되는 문제점이 지적되고 있으며, 공중합체 형태의 흡착제는 pH의 영향을 받지 않는 장점이 있으나, 극성이 높은 화합물의 전처리과정에 서 사용이 제한적 이라는 것이 문제점으로 지적되고 있다.
최근 생체시료로부터 스테로이드 호르몬을 분석하는 경우, SPE에 의한 시료 전처리 과정에서 추출된 스테로이드 호르몬을 기체 혹은 액체크로마토그래피(gas / liquid chromatography; GC-MS or LC-MS) 방법에 의해 생체 시료 내에 존재하는 다양한 형태의 방해물질과 분리하여 검출한다.
크로마토그래피 방법에 의해 시료 내에 존재하는 방해물질로부터 분석물질인 스테로이드 호르몬을 분리하는 과정에서 가장 많이 사용되고 있는 역상 크로마토그래피 이론 또한 반친수성 상호작용을 기본 원리로 한다(Journal of Chromatography A, 935: 141-172, 2001). 따라서 화학적 성질이 크게 다른 생체 물질들은 SPE에 의한 시료 전처리 과정에서 용이하게 제거가 되지만 유사한 화학적 성질을 지니고 있는 물질들은 함께 추출이 되며, 결국 역상 크로마토그래피에 의한 분리에서 유사한 머무름 시간을 갖게 된다.
상기한 단점을 극복하기 위하여 생물학적 특이성을 이용한 시료전처리 (immuno-affinity chromatography)방법이 사용되기도 하지만(Journal of Chromatography A, 794: 37-43, 1998; Rapid Communications in Mass Spectrometry, 16: 370-374, 2002), 해당 스테로이드 호르몬의 항체를 얻는 과정에서의 복잡성과 높은 비용문제로 인해 그의 사용이 제한적이다.
한편, 상기한 종래 기술에서 사용되는 흡착제들과는 달리 β-사이클로덱스트린은 특정 형태의 유기화합물 또는 스테로이드 호르몬을 구조적으로 화합물 내부에 포획하는 성질이 있는 것으로 알려져 있다(Journal of Separation Science, 25: 789-813, 2002; Steroids, 68: 321-327, 2003).
이러한 β-사이클로덱스트린의 성질을 이용하여 대한민국특허 출원번호 제1997-0018599호, 제1997-0037127호 및 제1997-0037128호에서는 우유나 크림 등의 액상시료에서 스테로이드 호르몬의 출발 물질인 콜레스테롤을 제거하는 기술이 소개되기도 하였다.
그러나, 상기한 기술은 우유나 크림 등의 액상시료에 첨가하여 목적하는 콜레스테롤을 흡착시킨 β-사이클로덱스트린을 액상시료로부터 분리하는 과정에서 원심분리에 의해 제거한 후에도 미량의 β-사이클로덱스트린이 남아있는 문제점을 가지고 있다.
상기한 문제점을 해결하기 위하여, 고정상 추출법의 한 방법으로 β-사이클로덱스트린을 작은 유리구슬 표면에 화학적으로 결합시켜 스테로이드 호르몬 구조를 지니고 있는 콜레스테롤을 우유로부터 제거하는 기술도 소개되었다(Archives of Pharmaceutical Research, 27: 873-877, 2004). 그러나, 상기한 기술에서는 β-사이클로덱스트린이 유리 표면에 화학적으로 결합하므로, 화학처리에 의해 β-사이클로덱스트린의 활성이 저하되어 콜레스테롤의 제거율이 효과적이지 못한 문제점이 지적된다.
또한, NaOH 수용액 내에서 에피클로로히드린(epichlorohydrin)을 화학적 가교제(linker)로 사용하여 β-사이클로덱스트린 분자 간의 교차 결합을 형성함으로써 그 활성도를 높여 콜레스테롤의 제거율을 증가시키는 방법(Archives of Pharmaceutical Research, 27: 1183-1187, 2004)이 제시되었으며, β-사이클로덱스 트린 분자간의 교차결합시 다양한 조건들을 적용하여 β-사이클로덱스트린 중합체를 제조하고, 얻어진 다양한 β-사이클로덱스트린 중합체의 물성 및 활성도를 측정하기도 하였다(Polymer International, 54: 744-753, 2005). 그러나, 에피클로로히드린을 사용하여 제조된 β-사이클로덱스트린 중합체는 젤(gel)을 형성하게 되므로, 생체 시료로부터 스테로이드 호르몬을 추출하는 과정에서 사용하는 경우 젤 상태인 중합체의 부풀림 현상이 발생하므로, 시료 전처리시에는 시료의 양에 비해 극히 적은 양의 β-사이클로덱스트린 중합체를 사용해야 하는 어려움을 초래하기도 한다.
이에 본 발명의 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 에피클로로히드린을 사용하여 제조한 젤상의 β-사이클로덱스트린 중합에 금속이온을 도입하여 경화시키고 분말화함으로써, 부풀림 현상 없이 액상의 생체시료에서 β-사이클로덱스트린 중합체와 스테로이드 호르몬과의 복합체를 형성, 효과적인 생체시료의 분석이 가능하게 되어 본 발명을 완성하였다.
상기한 본 발명의 β-사이클로덱스트린 중합체 분말은 고체상 추출용 충전제로 적용할 수 있으며, 또한 분리하고자 하는 다양한 형태의 스테로이드 화합물을 포함하는 액상시료에 본 발명에 의한 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 첨가하여 β-사이클로덱스트린과 스테로이드 화합물의 복합체를 형성한 다음 유기용매로 추출하는 간단한 방법으로 β-사이클로덱스트린과 스테로이드 화합물의 복합체로부터 스테로이드 화합물만을 간단하게 분리해 낼 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 액상 시료로부터 스테로이드 화합물을 효과적으로 추출할 수 있으므로, 소변 등의 생체 시료로부터 안드로겐, 에스트로겐, 부신피질 호르몬 등을 포함하는 스테로이드 호르몬을 선택적으로 추출할 수 있어 수많은 종류의 내분비 의존성 질환 관련 임상연구에서 유용하게 사용될 수 있을것으로 기대할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 스테로이드 화합물의 선택적 추출이 용이하게 이루어지므로 필요에 따라 스테로이드 화합물이 제거된 시료의 제조가 가능한 효과를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 액상 시료로부터 합성 동화성 스테로이드 화합물을 효과적으로 추출할 수 있으므로, 운동선수들의 금지약물 검사에 적용시 유리한 효과를 기대할 수 있다.
따라서, 본 발명은 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 이용하여 스테로이드 화합물을 선택적으로 추출하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 1) 스테로이드 화합물을 포함하는 액상시료에 완충용액 및 가수분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계와, 2) β-사이클로덱스트린 단량체가 가교결합되어 층구조를 이루고 있고, 상기 가교된 β-사이클로덱스트린 결합체의 층간에 금속 이온이 도포되어진 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 첨가하여 교반한 후 원심분리하여 수층을 제거하는 단계, 및, 3) 상기 수층 제거 후 인산완충용액과 극성 유기용매을 첨가하고 pH를 9.0 ∼ 10.0 범위로 조절한 다음 유기용매를 가하여 스테로이드 화합물을 추출하는 단계를 포함하여 이루어지는 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법을 그 특징으로 한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 β-사이클로덱스트린에 에피클로로히드린을 도입하여 젤상의 중합체를 제조한 후 이를 경화시킨 다음 분쇄하여 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 제조함으로써, 스테로이드 호르몬 만을 선택적으로 추출할 수 있는 효과를 나타낼 수 있는 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 이용한 스테로이드 화합물의 선택적 추출방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에서 사용된 β-사이클로덱스트린을 나타내는데, (a)는 화학적 구조식을 나타내며, (b)는 입체적인 모양을 나타낸다. β-사이클로덱스트린은 전분을 액화하여 얻은 포도당 잔기 7개로 구성되며(a), 내부에 커다란 소수성 공간을 나타내며, 외부에는 친수성 기능기들이 노출되어 있어서 공동 내부에 유기화합물을 포집할 수 있는 구조를 가지고 있다(b).
이러한 β-사이클로덱스트린은 특정한 구조를 갖는 화합물과 포접화합물을 형성하는 특성에 의해 그 이용분야가 급증하고 있으나, 상기 언급한 바와 같이 수용액 내에서 부풀림 현상이 나타나는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기한 β-사이클로덱스트린의 부풀림 현상이 억제된 것으로, β-사이클로덱스트린 단량체가 가교결합되어 층구조를 이루고 있고, 상기 가교된 β- 사이클로덱스트린 결합체의 층간에 금속 이온이 도포된 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말 및 이의 제조방법과, 이를 사용한 다양한 용도를 제공한다.
본 발명의 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말의 제조방법은, β-사이클로덱스트린을 알칼리성 수용액에 용해시킨 다음 에피클로로히드린을 첨가하여 젤(gel) 상태의 중합체를 제조하는 단계, 상기 젤 상태의 중합체를 금속염 수용액에 침지하여 경화시키는 단계, 및 상기 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체를 세척, 건조 및 분쇄하여 분말화하는 단계를 포함하여 이루어진다.
먼저, β-사이클로덱스트린 단량체 간의 연결을 위하여 에피크로로히드린을 사용하여 분자간의 교차결합을 형성시키는데, 이때 β-사이클로덱스트린 단량체를 알칼리성 수용액에 용해시켜 사용한다.
상기 알칼리성 수용액은 알칼리 금속의 수산화물을 사용하는데, 구체적으로 NaOH, KOH 등을 사용할 수 있으며, 동일한 농도일 경우 NaOH 수용액을 사용하는 것이 보다 좋은 반응성을 나타낸다. 다음으로, 교차결합이 형성된 젤상의 β-사이클로덱스트린 중합체를 경화시키는 과정에서는 금속이온을 도입한다. 이러한 금속 이온으로는 Ca 및 Na 중에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 금속염의 형태로 제조공정 중에 도입한다. 상기 금속염은 CaCl2, NaCl, Ca(NO3)2 및 CaSO4 등 중에서 선택된 금속염을 사용할 수 있는데, 이 중 CaCl2 가 동일한 농도를 처리하였을 경우 가장 빠른 경화 시간을 보인다.
상기 금속염 수용액은 0.05 ∼ 1.0 M 농도 범위에서 사용 가능하지만, 0.2 ∼ 0.3 M 농도 범위로 사용하는 것이 좋다. 상기한 범위로 농도를 조정한 금속염 수용액을 사용하는 것이 층구조를 이룬 β-사이클로덱스트린 중합체의 층간에 금속이온을 도입하는 데 효과적이다.
상기 할로겐화 금속염의 사용으로 층 구조를 나타내는 β-사이클로덱스트린 중합체의 층간에 금속이온이 도입된다. 금속이온이 층간에 도입된 결과는 도 2의 (b)와 (c)로서 확인할 수 있다. 금속이온의 층간 도입으로 기존의 β-사이클로덱스트린 중합체를 사용할 경우 야기되던 부풀음 현상이 나타나지 않으며, 스테로이드 화합물과의 선택적 결합력이 보다 우수해진다.
상기 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체는 에탄올, 물 또는 이들의 혼합물을 사용하여 충분히 세척한 다음 50 ∼ 70 ℃ 에서 건조시키고, 다양한 방법으로 분쇄하여 분말화한다. 이때, 분쇄된 β-사이클로덱스트린 중합체의 분말은 100 ∼ 500 ㎛ 범위, 바람직하기로는 약 200 ㎛ 범위의 직경을 가지도록 하는 것이 바람직하다.
이렇게 제조된 본 발명의 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말은 스테로이드 구조를 가지는 화합물과의 선택적 결합력이 우수하여 쉽게 β-사이클로덱스트린-스테로이드 화합물의 복합체를 형성할 뿐 아니라, 상기 복합체를 유기용매에 침지한 후 분리된 유기용매를 증발시키는 간단한 방법으로 스테로이드 화합물을 복합체로부터 분리할 수 있다.
상기한 특성은 복잡한 생체시료로부터 스테로이드 구조를 가지는 다양한 화합물의 추출 및 분리를 가능하게 하므로, 스테로이드 화합물을 사용하기 위하여 이 를 선택적으로 분리하거나, 스테로이드 화합물이 배제된 물질을 사용하기 위하여 이를 선택적으로 제거해낼 필요가 있는 다양한 분야에 적용이 가능하다.
바람직한 일례로서, 본 발명의 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말은 고체상 추출(SPE)용 카트리지 충전제로 적용할 수 있는데, 충전제로 적용시에는 추출 효율을 극대화 시키기 위하여 입자의 크기를 균일화하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 제조하는 방법의 일구현예는 도 3의 흐름도에 간략하게 나타내었다.
한편, 본 발명의 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용하여 스테로이드 화합물을 추출하는 방법을 설명하면 다음과 같다.
먼저, 스테로이드 화합물을 포함하는 액상시료를 인산완충용액으로 희석한 후 가수분해 효소를 첨가하여 반응 시킨다. 상기 액상시료는 스테로이드 화합물이 포함되어 있는 액상으로서 구체적으로 소변, 혈액, 조직 추출액 및 세포 배양액 등이 될 수 있다. 상기에 액상 시료로서 소변 외의 다른 생체 시료들은 소변과 유사한 형태로 물이나 인산완충용액을 사용하여 용액의 형태로 만든 후 (Rapid Communications in Mass Spectrometry, 16: 2221-2228, 2002)소변과의 동일한 방법으로 추출을 할 수 있다.
이때, 상기 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말의 사용량은 소변 시료의 경우 1 mL 당 0.2 ∼ 0.5 g 범위로 사용할 수 있다. 상기 가수분해 효소로는 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)또는 β-글루쿠로니다제와 아릴설파타제 (arylsulfatase)가 혼합된 용액을 사용할 수 있으며, 효소첨가량은 80 ∼ 140 Unit/mL 범위가 되도록 하는 것이 바람직하다.
상기한 액상 시료에, 경화된 β-사이클로덱스트린을 첨가하여 교반한 후 원심분리를 하는데, 이때 최소 1,500 rpm이상의 조건에서 수행하는 것이 바람직하다.
원심분리후 수층을 제거하고, 침전된 분말층에 인산완충용액와 테트라하이드로푸란(THF), 에틸아세테이트 및 에테르 등 중에서 선택된 극성 유기용매를 첨가하고 pH를 9.0 ∼ 10.0 범위로 조절하는데, pH 조절제로는 5% K2CO3 수용액을 주로 사용한다. pH를 상기 범위로 조절하는 이유는 분석물질의 pKa 값을 고려하였을 때 생체시료로부터 스테로이드 호르몬을 추출하기 위한 최적조건이며, pH가 상기 범위를 벗어나면 추출율이 현저하게 감소하게 되기 때문이다.
상기와 같이 pH가 조절된 후 유기용매를 가하여 스테로이드 화합물을 추출하는데, 이때 유기용매로는 에틸아세테이트, n-헥산 및 에테르 등 중에서 선택된 유기용매를 단독 또는 2 종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 유기용매의 사용량은 THF 등과 같은 상기한 극성 유기용매에 녹아있는 화합물을 수용액과 분리시킬 수 있는 최소한의 양으로 조절한다.
이러한 본 발명의 스테로이드 화합물 추출방법에 의하면 분자내에 스테로이드 구조를 가지는 다양한 화합물을 쉽게 추출해 낼 수 있으며, 구체적으로 콜레스테롤과, 내인성 안드로겐 및 에스트로겐을 포함하는 스테로이드 호르몬과, 운동선수들이 근육강화를 목적으로 흔히 복용하는 합성 동화성 스테로이드와, 부신피질호르몬 등을 선택적으로 쉽게 추출할 수 있다.
한정하는 것은 아니지만, 본 발명에서 사용한 내인성 안드로겐은 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT), 디히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 테스토스테론(testosterone), 5α-안드로스탄-3α,17β-디올(5α-androstane-3α,17β-diol), 안드로스텐디온(androstenedione), 에피테스토스테론(epitestosterone), 5α-안드로스탄-3β,17β-디올(5α-androstane-3β,17β-diol), 안드로스텐디올(androstenediol), 안드로스테론(androsterone), 에티오콜아놀론(etiocholanolone), 11-케토-안드로스테론(11-keto-androsterone: 11-keto-A), 11-케토-에티오콜아놀론(11-keto-etiocholanolone: 11-keto-E), 11-히드록시-안드로스테론(11-hydroxy-androsterone: 11-OH-A), 11-히드록시-에티오콜아놀론(11-hydroxy-etiocholanolone: 11-OH-E) 및 5α-안드로스탄디온(5α-androstanedione) 등이 있다.
또한, 상기 에스트로겐은 에스트론(estrone), 17β-에스트라디올(17β-estradiol), 에스트리올(estriol), 2-히드록시-에스트론(2-hydroxy-estrone: 2-OH-E1), 2-히드록시-에스트라디올(2-hydroxy-estradiol: 2-OH-E2), 17-에피에스트리올(17-epiestriol), 4-히드록시-에스트론(4-hydroxy-estrone: 4-OH-E1), 4-히드록시-에스트라디올(4-hydroxy-estradiol: 4-OH-E2), 2-메톡시-에스트론(2-methoxy-estrone: 2-MeO-E1), 2-메톡시-에스트라디올(2-methoxy-estradiol: 2-MeO-E2) 및 16α-히드록시-에스트론(16α-hydroxy-estrone: 16α-OH-E1) 등이 있다.
상기 합성 동화성 스테로이드는 칼러스테론(calusterone), 볼라스테론(bolasterone), 볼데논(boldenone), 클로스테볼(clostebol), 미볼레론(mibolerone), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 에티스테론(ethisterone), 드로스타놀론(drostanolone), 포르메볼론(formebolone), 16β-히드록시-퓨라자볼(16β-hydroxy-furazabol), 메틸테스토스테론(methyltestosterone), 볼디온(boldione), α-트렌볼론(α-trenbolone), 다이아나볼(dianabol), 스텐볼론(stenbolone), 메테놀론(metenolone), 19-노르안드로스테론(19-norandrosterone: 19-NA), 19-노르에티오콜아놀론(19-noretiocholanolone: 19-NE), 옥산드롤론(oxandrolone), 6β-히드록시-퓨리나볼(6β-hydroxy-furinabol), 옥시메스테론(oxymesterone), 3'-히드록시-스타노졸롤(3'-hydroxy-stanozolol), 노르볼에톤(norbolethone), 에틸에스트레놀 (ethylestrenol), 게스트리논(gestrinone), 테트라하이드로게스트리논(tetrahydrogestrinone) 및 이들의 대사체 등이 있다.
또한, 소변으로부터 미량 존재하는 부신피질 호르몬을 동시에 추출할 수 있는데, 상기한 부신피질호르몬으로는 트리암시놀론(triamcinolone), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), 플루오클로로코르티손(fluochlorocortisone), 6α-메틸프레드니솔론(6α-methylprednisolone), 베타메타손(betamethasone), 덱사메타손(dexamethasone), 플루메타손(flumethasone), 베크로메타손(beclomethasone), 트리암시놀론 아세토나이드(triamcinolone acetonide), 데소나이드(desonide), 플루니솔라이드(flunisolide), 플루르안드레놀 라이드(flurandrenolide), 플루오시놀론 아세토나이드(fluocinolone acetonide), 데스옥소메타손(desoximethasone), 부데소나이드(budesonide), 플루시노나이드( flucinonide), 암시노나이드(amcinonide), 코르티졸(cortisol) 및 코르티손(cortisone) 등이 있다.
본 발명에 의하면 분리하고자 하는 스테로이드 화합물을 포함하는 액상시료에 상기 본 발명에서 제시한 방법에 의하여 제조한 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 첨가하여 β-사이클로덱스트린과 스테로이드 화합물의 복합체를 형성한 다음 극성 유기용매를 첨가하여 추출하는 방법으로 적용하는 간단한 방법으로 β-사이클로덱스트린과 스테로이드 화합물의 복합체로부터 스테로이드 화합물을 간단하게 분리해 낼 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 소변 등의 생체 시료로부터 안드로겐, 에스트로겐, 부신피질 호르몬 등을 포함하는 스테로이드 호르몬을 선택적으로 추출할 수 있어 수많은 종류의 내분비 의존성 질환 및 관련 임상학적 연구에 유용하게 사용될 수 있으며, 스테로이드 화합물의 선택적 추출이 용이하게 이루어지므로 스테로이드 화합물이 제거된 시료의 제조 또한 가능하다.
또한, 본 발명에 의하면 액상 시료로부터 합성 동화성 스테로이드 화합물을 효과적으로 추출할 수 있으므로, 운동선수들의 금지약물 검사를 효과적으로 수행할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
또한, 상기 스테로이드 화합물의 추출에 사용된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말은 회수하여 유기용매로 세척한 후 재사용이 가능하다.
이하 실시예에 의거하여 본 발명을 구체적으로 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
1 . β-
사이클로덱스트린
중합체 분말의 제조방법
NaOH 용액 (2.5 g / 7.5 mL)에 β-사이클로덱스트린(2.5 g)을 첨가하여 녹인 후, 20 분간에 걸쳐 서서히 에피클로로히드린(4.4 mL)을 첨가하여 실온에서 4시간동안 교반하였다. 이후 얻어진 젤 상태의 중합체를 0.3 M의 CaCl2 용액에 침지하여 경화시키고, 이를 물과 에탄올로 충분히 세척한 후 70 ℃에서 건조시킨 다음 분쇄기로 분쇄하여 β-사이클로덱스트린 중합체 분말(평균직경 200 ㎛)을 얻었다[도 3 참조].
실험예
1. β-
사이클로덱스트린
중합체의 확인
β-사이클로덱스트린과 상기 실시예 1에 의하여 얻어진 β-사이클로덱스트린 중합체 분말의 구조를 SEM 장비를 사용하여 15 kV에서 3000배로 확대하여 확인하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 중합체로 만들기 전의 각 β-사이클로덱스트린 입자는 균일하게 분포되어 있으나(a), 실시예 1에 의하여 얻어진 β-사이클로덱스트 린 중합체 분말은 서로 연결이 되어있음을 확인할 수 있다(b). 또한, (c)에 나타낸 바와 같이 β-사이클로덱스트린 중합체 분말은 표면에 CaCl2로부터 유래된 Ca 이온입자가 분포되어있음을 알 수 있다.
실시예
2. 경화된 β-
사이클로덱스트린
중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법
2 mL의 소변과 인산완충용액(1 mL; 0.2 M, pH 7.2)과 혼합한 후 50 ㅅL의 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)를 첨가하여 가수분해를 시켰다. 여기에 상기 실시예 1에서 제조된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말(0.5 g)을 첨가하여 10분간 흔들며 섞어준 후 3000 rpm에서 8분간 원심분리하고 침전된 분말을 제외한 수용액을 제거하였다.
분리된 분말에 1 mL의 인산완충용액과 3 mL의 테트라하이드로푸란(THF)을 첨가하여 10 분간 교반하고 0.5 % K2CO3 수용액 0.7 mL를 첨가하여 용액의 pH를 9.6으로 맞춘 후 에틸아세테이트와 n-헥산 혼합용액(2:3, v/v) 2 mL를 첨가하여 분말에 포함되어 있던 안드로겐과 에스트로겐을 추출하였다.
추출된 안드로겐과 에스트로겐은 유도체시약(MSTFA/NH4I/DTE, 1000:4:5, v/w/w) 50 ㎕와 함께 60 ℃에서 20분간 반응시킨 후 다음에 제시된 조건에서 GC-MS를 사용하여 선택적 이온 검출 방법(selected-ion monitoring mode)으로 분석하였다.
- 분석장비: Agilent 6890 GC 와 Agilent 5973N Mass Selective Detector
- 컬럼: Ultra-2 fused-silica capillary column
(Agilent Technologies; 길이 25 m, 내경 0.2 mm, 두께 0.33 ㅅm)
- 주입기 온도: 280 ℃
- 운반가스: 헬륨 (0.8 mL/min)
- 시료주입량: 2 ㎕
- 시료주입방법: 10:1 split mode
- 오븐온도: 200 ℃부터 260 ℃까지 분당 2 ℃씩 증가 시킨 후 5분간 유지, 다시 280 ℃까지 분당 4 ℃씩 증가시킨다. 이후 310 ℃까지는 분당 15 ℃로 증가시킨 후 3분간 유지시킨다.
- 이온화실 및 분석관 온도: 230 ℃ / 300 ℃
- 이온화방법: 전자충격법 (electron impact ionization: EI)
- 이온화 에너지: 70 eV
- 분석을 위한 특성이온: m/z 434, 432, 436, 430, 421, 419, 520, 522, 458, 414, 416, 504, 502, 487, 444, 446
각 화합물은 1개의 특성이온을 기본으로 그의 컬럼내 머무름 시간과 함께 정성분석이 이루어졌고, 총 6개의 그룹(group)에 대하여 각각 4 ∼ 11개의 이온들을 동시에 분석하였으며, 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다.
즉, 소변 시료로부터 콜레스테롤(cholesterol)을 비롯 15종의 내인성 안드로겐(dihydrotestosterone: DHT, dehydroepiandrosterone: DHEA, testosterone, 5α-androstane-3α,17β-diol, androstenedione, epitestosterone, 5α-androstane-3β,17β-diol, androstenediol, androsterone, etiocholanolone, 11-keto-androsterone: 11-keto-A, 11-keto-etiocholanolone: 11-keto-E, 11-hydroxy-androsterone: 11-OH-A, 11-hydroxy-etiocholanolone: 11-OH-E, 5α-androstanedione)과 11종의 에스트로겐 (estrone, 17β-estradiol, estriol, 2-hydroxy-estrone: 2-OH-E1, 2-hydroxy-estradiol: 2-OH-E2, 17-epiestriol, 4-hydroxy-estrone: 4-OH-E1, 4-hydroxy-estradiol: 4-OH-E2, 2-methoxy-estrone: 2-MeO-E1, 2-methoxy-estradiol: 2-MeO-E2, 16α-hydroxy-estrone: 16α-OH-E1)을 선택적으로 추출하여 분석한 결과, 상기 15종의 안드로겐과 11종의 에스트로겐의 회수율은 92 ∼ 126 %이었다.
상기 회수율(이하 실시예 3 ∼ 4에서 측정한 회수율과 동일)은 상기의 모든 동일한 스테로이드 호르몬을 사용하여 추출과정을 거치지 않은 상태의 분석결과와 분석농도를 비교하여 그 효율을 계산하였다.
이는 이전에 발표되었던 다른 방법들(Journal of Chromatography A, 885: 3-16, 237-250, 321-341, 2000; Rapid Communications in Mass Spectrometry, 16: 2221-2228, 2002)과 비교하여 우수함을 알 수 있다.
또한, 콜레스테롤(cholesterol)의 분석에 있어서 추출율 또한 96 %로 높게 나타났다. 특히, 콜레스테롤의 경우, 본 기술과 관련된 많은 결과들이 특정 시 료로부터 콜레스테롤을 제거하는 기술을 소개하고 있는데(Archives of Pharmaceutical Research, 27: 873-877, 2004; Archives of Pharmaceutical Research, 27: 1183-1187, 2004), 본 발명에 의하여 제조된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 이용할 경우 생체 시료로부터 콜레스테롤의 제거율이 ∼ 98 %로서 매우 효과적임을 알 수 있다.
실시예
3. 경화된 β-
사이클로덱스트린
중합체 분말을 사용한 합성 동화성 스테로이드의 추출방법
2 mL의 소변을 인산완충용액 (1 mL; 0.2 M, pH 7.2)과 혼합한 후 50 ㅅL의 β-글루쿠로니다제를 첨가하여 가수분해를 시키고 0.5 g의 β-사이클로덱스트린 분말을 첨가하여 10분간 흔들며 섞어주었다. 이 후 혼합용액을 3000 rpm에서 8분간 원심분리하고 침전된 분말을 제외한 수용액을 제거한 후 분리된 분말에 1 mL의 인산완충용액과 3 mL의 테트라하이드로푸란을 첨가하고 10 분간 교반한 다음 0.5% K2CO3 용액 0.7 mL를 사용하여 용액의 pH를 9.6으로 맞춘 후 디에틸에테르(diethylether) 2 mL를 첨가하여 분말에 포함되어 있던 합성 동화성 스테로이드를 추출하였다. 추출된 합성 동화성 스테로이드는 중합체시약 (MSTFA/NH4I/DTE, 1000:4:5, v/w/w) 50 ㎕와 함께 60 ℃에서 20분간 반응시킨 후 다음에 제시된 조건에서 GC-SIM/MS로 분석한다.
- 분석장비: Agilent 6890 GC 와 Agilent 5975 Mass Selective Detector
- 컬럼: Ultra-1 fused-silica capillary column
(Agilent Technologies; 길이 17 m, 내경 0.2 mm, 두께 0.11 ㎛)
- 주입기 온도: 280 ℃
- 운반가스: 헬륨 (0.6 mL/min)
- 시료주입량: 2 ㎕
- 시료주입방법: 10:1 split mode
- 오븐온도: 180 ℃부터 260 ℃까지 분당 4 ℃씩 증가 시킨 후 다시 320 ℃까지 분당 15 ℃씩 증가시키고 320 ℃에서 3.67분간 유지시킨다.
- 이온화실 및 분석관 온도: 230 ℃ / 300 ℃
- 이온화방법: 전자충격법 (electron impact ionization: EI)
- 이온화 에너지: 70 eV
- 분석을 위한 특성이온: 각 화합물에 대하여 그들의 화학적 구조를 나타낼 수 있는 특성 이온 2개를 선정, 총 11개의 그룹(group)에 대하여 다음과 같이 설정하여 분석하였다. 1 (14), 2 (21), 3 (21), 4 (20), 5 (20), 6 (25), 7 (21), 8 (30), 9 (27), 10 (23), 11 (25)
각 화합물은 2개의 특성이온을 기본으로 그의 컬럼내 머무름 시간과 함께 정성분석이 이루어졌으며, 그 결과는 도 5a, 5b, 5c 및 5d에 나타내었다.
즉, 운동선수들의 금지약물 검사에 적용하기 위하여 30 종의 합성 동화성 스테로이드(calusterone, bolasterone, boldenone, clostebol, mibolerone, fluoxymesterone, ethisterone, drostanolone, formebolone, 16β-hydroxy-furazabol, methyltestosterone, boldione, α-trenbolone, dianabol, stenbolone, metenolone, 19-norandrosterone: 19-NA, 19-noretiocholanolone: 19-NE, oxandrolone, 6β-hydroxy-furinabol, oxymesterone, 3'-hydroxy-stanozolol, norbolethone, ethylestrenol) 또는 그들의 소변내에서의 대사체들을 선택적으로 추출한 결과, 84 ∼ 131 %의 일정한 추출율을 보였다.
소변 내에 존재하는 합성 동화성 스테로이드 화합물의 추출율은 화합물의 극성에 따라 추출율이 변하는 기존의 고체상 추출법(SPE)에 비해 상기 실시예 3의 경우 그 추출율이 일정함을 알 수 있다.
특히, 반친수성 상호작용에 의한 SPE 방법에서 플로옥시메스테론(fluoxymesterone)과 옥산드롤론(oxandrolone)의 대사체와 같이 극성이 높은 스테로이드 호르몬의 추출율이 약 40 %를 나타내는 반면, 상기 실시예 3의 경우 그들의 추출율이 91 ∼ 105 %로 나타나 화합물의 극성이 아닌 구조적인 특성에 의해 높은 수율을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예
4. 경화된 β-
사이클로덱스트린
중합체 분말을 사용한 합성 동화성 스테로이드 및 부신피질 호르몬의 추출방법
2 mL의 소변을 인산완충용액 (1 mL; 0.2 M, pH 7.2)과 혼합한 후 50 ㎕의 β-글루쿠로니다제를 첨가하여 가수분해를 시켰다. 여기에 0.5 g의 β-사이클로덱스트린 분말을 첨가하여 10분간 흔들며 섞어준 혼합용액을 3000 rpm에서 8분간 원 심분리하고 침정된 분말을 제외한 수용액을 제거하였다.
상기 분리된 분말에 1 mL의 완충용액과 3 mL의 테트라하이드로푸란을 첨가하고 10 분간 교반하고 0.5% K2CO3 용액 0.7 mL를 사용하여 용액의 pH를 9.6으로 맞춘 후 디에틸에테르 2 mL를 사용하여 분말에 포함되어 있던 부신피질 호르몬을 추출한다. 추출된 부신피질 호르몬은 0.1% 아세트산(acetic acid)으로 제조된 50% 아세토니트릴(acetonitrile)용액 100 ㎕에 녹인 후 다음에 제시된 조건에서 LC-탠덤 질량 분석기(LC-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)로 분석한다.
- 분석장비: Surveyor HPLC & TSQ Quantum Discovery MAX
- 컬럼: Hypersil Gold (Thermo Finnigan)
(Agilent Technologies; 길이 50 mm, 내경: 2.1 mm, 입자크기: 1.9 ㎛)
- 이동상: A (0.1% acetic acid in 5% acetonitrile)
B (0.06% acetic acid in 95% acetonitrile)
- 시료주입량: 5 ㎕
- 이온화방법: electrospray ionization (ESI), positive mode
- 분석방법: Single Reaction Monitoring (SRM), 0.02 sec/scan
- 스프레이 전압: 4500 V
- 피크 넓이: Q1 (0.5) & Q3 (0.7)
- 이동상 유속: 0.3 mL/min
- 이동상의 변화: 초기 90% (A)에서 2분간 10% (A)로 변화시킨 후 1분간 유 지시키고 다시 5분까지 90% (A)의 초기상태로 되돌린다. 분석 결과를 도 6[소변시료에 존재하는 2개의 합성동화성 스테로이드(17: gestrinone, 20: tetrahydrogestrinone)와 21종의 부신피질호르몬]에 나타내었다.
즉, 소변내에 존재하는 2개의 합성 동화성 스테로이드(17: gestrinone, 20: tetrahydrogestrinone)와 21종의 부신피질호르몬(1: triamcinolone, 2: prednisolone, 3: prednisone, 4: fluochlorocortisone, 5: 6α-methyly-prednisolone, 7: betamethasone & dexamethasone, 8: flumethasone, 9: beclomethasone, 10: triamcinolone acetonide, 11: desonide, 12: flunisolide, 13: flurandrenolide, 14: fluocinolone acetonide, 15: desoximethasone, 16: budesonide, 18: flucinonide, 19: amcinonide, 21: cortisol, 22: cortisone, IS: internal standard, d 4-cortisol)의 추출율은 72 ∼ 119 %로 나타났으며, 액체-액체 추출방법에 의한 기존의 방법 (Rapid Communications in Mass Spectrometry, 17: 2107-2114, 2003)과 비교하여 상호 보완적인 결과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 5 : 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 고체상 추출용 충전제
상기 실시예 1에 의하여 제조된 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말(평균직경 200 ㎛)을 충전제로 사용하여 고체상 추출을 수행하였으며, 그 결과 부풀음 현상이 나타나지 않았다.
비교예 : β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 고체상 추출용 충전제
경화처리되지 않은 β-사이클로덱스트린 중합체의 분말(평균직경 200 ㎛)을 충전제로 사용하여 고체상 추출을 수행하였으며, 그 결과 부풀음 현상이 나타났다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 임상시험, 식품, 환경, 마약분석 분야뿐만 아니라 운동선수들의 금지약물 검사를 위한 생체시료로부터 다양한 형태의 스테로이드 호르몬을 간단한 과정을 통하여 선택적으로 추출할 수 있다.
또한 본 발명에 의하여 제조된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말은 고체상 추출용 충전제로 사용할 수 있으며, 액상 시료로부터 스테로이드 화합물을 추출할 경우 β-사이클로덱스트린과 스테로이드 화합물이 형성한 복합체에 유기용매를 첨가하는 것으로 간단하게 스테로이드 화합물을 추출할 수 있으므로 기존의 SPE방법과는 달리 별도의 장치를 필요로 하지 않는다.
또한 상기 분말은 유기용매로 세척 후 재활용이 가능하므로 그 경제적 가치는 매우 크다고 할 수 있다.
Claims (12)
1) 스테로이드 화합물을 포함하는 액상시료에 완충용액 및 가수분해효소를 첨가하여 반응시키는 단계와,
2) β-사이클로덱스트린 단량체가 에피클로로히드린에 의해 가교결합되어 층구조를 이루고 있고 상기 가교된 β-사이클로덱스트린 중합체의 층간에 금속 이온이 도포되어진 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을, 상기 반응액에 첨가하여 교반한 후 원심분리하여 수층을 제거하는 단계, 및
3) 상기 수층 제거 후 인산완충용액와 극성 유기용매를 첨가하고 pH를 9.0 ∼ 10.0 범위로 조절한 다음 유기용매를 가하여 스테로이드 화합물을 추출하는 단계
를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 금속 이온은 Ca 및 Na 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 액상 시료는 소변, 혈액, 조직 추출액 및 세포 배양액 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 극성 유기용매는 테트라하이드로푸란(THF), 에틸아세테이트 및 에테르 중에서 선택된 단독 용매인 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유기용매는 에틸아세테이트, 헥산 및 에테르 중에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 가수분해효소는 β-글루쿠로니다제 단독, 또는 β-글루쿠로니다제와 아릴설파타제의 혼합물인 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 스테로이드 화합물은 콜레스테롤, 스테로이드 호르몬, 합성 동화성 스테로이드, 및 부신피질호르몬 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 7 항에 있어서, 상기 스테로이드 호르몬은 내인성 안드로겐 및 에스트로겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 8 항에 있어서, 상기 내인성 안드로겐은 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone), 디히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone), 테스토스테론(testosterone), 5α-안드로스탄-3α,17β-디올(5α-androstane-3α,17β-diol), 안드로스텐디온(androstenedione), 에피테스토스테론(epitestosterone), 5α-안드로스탄-3β,17β-디올(5α-androstane-3β,17β-diol), 안드로스텐디올(androstenediol), 안드로스테론(androsterone), 에티오콜아놀론(etiocholanolone), 11-케토-안드로스테론(11-keto-androsterone), 11-케토-에티오콜아놀론(11-keto-etiocholanolone), 11-히드록시-안드로스테론(11-hydroxy-androsterone), 11-히드록시-에티오콜아놀론(11-hydroxy-etiocholanolone) 및 5α- 안드로스탄디온(5α-androstanedione) 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 8 항에 있어서, 상기 에스트로겐은 에스트론(estrone), 17β-에스트라디올(17β-estradiol), 에스트리올(estriol), 2-히드록시-에스트론(2-hydroxy-estrone1), 2-히드록시-에스트라디올(2-hydroxy-estradiol), 17-에피에스트리올(17-epiestriol), 4-히드록시-에스트론(4-hydroxy-estrone), 4-히드록시-에스트라디올(4-hydroxy-estradiol), 2-메톡시-에스트론(2-methoxy-estrone), 2-메톡시-에스트라디올(2-methoxy-estradiol) 및 16α-히드록시-에스트론(16α-hydroxy-estrone) 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 7 항에 있어서, 상기 부신피질 호르몬은 트리암시놀론(triamcinolone), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), 플루오클로로코르티손(fluochlorocortisone), 6α-메틸프레드니솔론(6α-methylprednisolone), 베타메타손(betamethasone), 덱사메타손(dexamethasone), 플루메타손(flumethasone), 베크로메타손(beclomethasone), 트리암시놀론 아세토나이드(triamcinolone acetonide), 데소나이드(desonide), 플루니솔라이드(flunisolide), 플루르안드레놀라이드(flurandrenolide), 플루오시놀론 아세토나이드(fluocinolone acetonide), 데스옥소메타손(desoximethasone), 부데소나이드(budesonide), 플루시노나이드( flucinonide), 암시노나이드(amcinonide), 코르티졸(cortisol) 및 코르티손(cortisone) 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
제 7 항에 있어서, 상기 합성 동화성 스테로이드는 칼러스테론(calusterone), 볼라스테론(bolasterone), 볼데논(boldenone), 클로스테볼(clostebol), 미볼레론(mibolerone), 플루옥시메스테론(fluoxymesterone), 에티스테론(ethisterone), 드로스타놀론(drostanolone), 포르메볼론(formebolone), 16β-히드록시-퓨라자볼(16β-hydroxy-furazabol), 메틸테스토스테론(methyltestosterone), 볼디온(boldione), α-트렌볼론(α-trenbolone), 다이아나볼(dianabol), 스텐볼론(stenbolone), 메테놀론(metenolone), 19-노르안드로스테론(19-norandrosterone), 19-노르에티오콜아놀론(19-noretiocholanolone), 옥산드롤론(oxandrolone), 6β-히드록시-퓨리나볼(6β-hydroxy-furinabol), 옥시메스테론(oxymesterone), 3'-히드록시-스타노졸롤(3'-hydroxy-stanozolol), 노르볼에톤(norbolethone), 에틸에스트레놀 (ethylestrenol), 게스트리논(gestrinone), 테트라하이드로게스트리논(tetrahydrogestrinone) 및 이들의 대사체 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 경화된 β-사이클로덱스트린 중합체 분말을 사용한 스테로이드 화합물의 추출방법.
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