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KR100812636B1 - 항원 결정기를 포함하는 재조합 개 아데노바이러스 섬유단백질 및 이에 대한 항체 - Google Patents

항원 결정기를 포함하는 재조합 개 아데노바이러스 섬유단백질 및 이에 대한 항체 Download PDF

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KR100812636B1
KR100812636B1 KR1020060103365A KR20060103365A KR100812636B1 KR 100812636 B1 KR100812636 B1 KR 100812636B1 KR 1020060103365 A KR1020060103365 A KR 1020060103365A KR 20060103365 A KR20060103365 A KR 20060103365A KR 100812636 B1 KR100812636 B1 KR 100812636B1
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KR
South Korea
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recombinant
fiber protein
cav
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adenovirus fiber
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양시용
김정우
김인호
우승은
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주식회사 단바이오텍
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Abstract

본 발명은 개 아데노바이러스 섬유 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 함유하는 백신 조성물, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 항체 및 상기 항체를 함유하는 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질과 이에 대한 항체는 개 아데노바이러스에 대한 감염증을 효율적으로 치료 또는 예방하는데 유용될 수 있다.
개 아데노바이러스, 항원 결정기, 재조합 CAV 섬유 단백질

Description

항원 결정기를 포함하는 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질 및 이에 대한 항체{Recombinant Canine Adenovirus Fiber Protein Comprising Epitope and Antibody}
도 1a는 개 아데노바이러스의 전장 섬유 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 전기영동 사진이다.
도 1b는 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 전기영동 사진이다.
도 1c는 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한 클로닝 벡터를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한 재조합 발현 벡터를 나타낸 것이다.
도 2b는 도 2a의 재조합 발현 벡터에 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질의 유전자가 삽입되었음을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 2c는 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질이 유전자 재조합 기술을 통하여 발현 가능함을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3은 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질이 면역원성을 발휘함을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 투여받은 산란계의 난황 중 항체가 변화를 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 난황 항체를 투여받은 자견에게서 개 아데노바이러스에 의한 감염증이 감소되는 것을 보여주는 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 난황 항체를 투여받은 자견에게서 개 아데노바이러스에 의한 감염증이 예방 및 치료되는 것을 보여주는 그래프이다.
본 발명은 항원 결정기를 포함하는 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질 및 이에 대한 항체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 개 아데노바이러스 섬유 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 함유하는 백신 조성물, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 항체 및 상기 항체를 함유하는 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
애완견에서 심각한 소화기 질환을 유발하여 경제적 및 정서적 폐해를 발생시키는 병원성 바이러스로는 개 파보바이러스 (canine parvovirus type 2; CPV-2), 개 아데노바이러스 (canine adenovirus; CAV), 개 코로나바이러스 (canine coronavirus; CCV), 개 로타바이러스 (canine rotavirus; CRV) 등이 알려져 있다(Mochizuki et al. 2001. J. Vet. Med. Science. vol.63, pp.573-575).
상기 언급한 병원성 바이러스에 의한 경제적 손실은 각각의 바이러스에 의한 이병율을 고려하여야 하나, 현재까지 국내에서는 그러한 바이러스에 의한 소화기 질환 이환견에 대한 통계가 없다. 그러나, 상황이 유사한 일본의 경우 각각의 바이러스에 의한 이병율은 개 파보바이러스 (CPV-2); 23.4%, 개 아데노바이러스 (CAV); 2.2%, 개 코로나바이러스 (CCV); 55.4%, 개 로타바이러스 (CRV); 2.1% 정도로 보고되었다(Mochizuki et al. 2001). 이러한 통계를 기초로 국내 전체 애완견 상황을 유추해보면 상기 바이러스들에 의해 유발되는 경제적 손실은 가히 엄청나다고 할 수 있다.
애완견에서의 감염성 설사 예방용 백신 사용에 따른 문제점인 백신 브레이크 현상으로 인한 방어 능력 부재시에는 각 병원체에 대한 난황 항체를 경구 투여하여 일차적으로 장관에서 병원성 바이러스를 중화함으로써 병원체의 장관감염을 예방할 수 있다.
기존에는 난황 항체 생산을 위한 항원으로 바이러스 배양액을 사용하였다. 이를 위해서는 숙주 세포를 배양한 후에 바이러스를 접종하고 다시 바이러스에 의해 감염된 숙주 세포를 배양하는 단계를 거쳐야 하는데, 이러한 항원생산 과정이 복잡하고 항원생산 기간이 길며, 또한 수득율이 낮아 생산단가가 매우 높고 난황 항체의 역가도 낮은 단점이 있다.
한편, "개 아데노바이러스"는 가축, 야생 개과 동물에서 전염되는 바이러스로서, 많은 감염 사례에서는 임상증상이 없으나, 어린 개체의 경우에는 심한 간염, 방광 부종, 편도염, 다발성 혈관염 출혈 등의 소견을 보일 수도 있다. 또한, 백신 미 접종 개체의 경우에는 간 경변을 유발하는 심한 전신성 증상을 보일 수 있다. 이러한 개 아데노바이러스는 전염성이 매우 높은 바이러스로서, 이에 대한 효율적인 방어가 요구된다.
본 발명자들은 개 아데노바이러스의 섬유 단백질을 분석하여 이의 항원 결정기를 포함하도록 재조합 개 아데노바이러스의 섬유 단백질과 이에 대한 항체를 제조한 후 개에게 투여한 결과, 개 아데노바이러스의 감염증을 예방 및 치료할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 한 관점으로서, 개 아데노바이러스 섬유 단백질의 항원 결정기를 포함하는 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 제공한다.
다른 관점으로서, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 코딩하는 유전자가 발현 벡터의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 포함된 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 관점으로서, (1) 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터의 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (3) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 상기 유전자를 발현시키는 단계; (4) 배양물로부터 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 분리하는 단계를 포함한 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질의 제조방법을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 항체, 특히 난황 항체를 제공한다.
또 다른 관점으로서, (1) 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질로 산란계를 면역화시키는 단계; (2) 상기 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 난황 항체를 분리하는 단계를 포함한 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 난황 항체의 제조방법을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 유효성분으로 함유하는 개 아데노바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 함유하는 개 아데노바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 상기 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 항체를 유효성분으로 함유하는 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 상기 백신 조성물을 사람을 제외한 포유동물에 투여함으로써 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 상기 약제학적 조성물을 사람을 제외한 포유동물에 투여함으로써 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 개 아데노바이러스(canine rotavirus) 유래 섬유(fiber) 단백질의 항원 결정기(epitope)를 포함하도록 재조합된 개 아데노바이러스(이하, "CAV"로 간략하게 표기함)의 섬유 단백질에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질은 개 아데노바이러스의 섬유 단백질을 분석하여 항체가 결합하는 부위, 즉 항원 결정기를 포함하도록 절편화한 것으로서, 서열번호: 3, 서열번호: 6, 서열번호: 9, 서열번호: 12, 서열번호: 15, 서열번호: 18 및 서열번호: 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열번호에 기재된 아미노산 서열로 이루어지며, 이들은 각각 CAV Fa, CAV Fb, CAV Fc, CAV Fd, CAV Fe, CAV Ff, CAV Fg로 간략하게 표기된다.
본 발명에서 재조합 CAV 섬유 단백질은 당해 서열번호에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하여 그 단백질을 포함한 당단백질 및 이로부터 유래된 모든 유도체를 포함한다.
본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질은 (1) 재조합 CAV 섬유 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터의 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계; (3) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 상기 유전자를 발현시키는 단계; (4) 배양물로부터 재조합 CAV 섬유 단백질을 분리하는 단계를 거쳐서 제조할 수 있다.
전술된 유전자 재조합 기술로 본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질을 제조하기 위해서는 상기 단백질을 코딩하는 유전자가 요구된다. 본 발명에 따른 재조합 CAV 섬유 단백질을 코딩하는 유전자는 당해 유전자의 염기 서열을 참조하여 핵산 합성기 등을 이용하여 인공적으로 합성하거나, 개 아데노바이러스의 게놈 DNA를 주형으로 목적한 재조합 CAV 섬유 단백질을 코딩하는 유전자의 양 말단에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 실시함으로써 제조할 수 있다. 한편, 코돈의 축퇴성으로 인하여 본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질을 코딩하는 유전자는 다양한 염기 서열로 존재할 수 있으며, 이들은 모두 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 단계 (1)에 따라 발현 벡터의 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 재조합 발현 벡터를 제조한다. 여기서, "발현 벡터"는 외래 유전자를 숙주 세포로 도입하고 발현시킬 수 있는 DNA 분자를 의미하는 것으로서, 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 특정한 숙주 세포에서 외래 유전자의 발현을 효과적으로 유도하는 다양한 발현 벡터가 상업적으로 입수 가능한데, 본 발명에서는 예를 들면 pUC8, pBR322, pET/Rb, pGEX, pET28a 등을 이용할 수 있으며, pMAL-c2x를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 발현 벡터의 조절 서열에 본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질을 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결시켜 수득한 DNA 분자를 "재조합 발현 벡터"라고 한다.
이렇게 제조한 재조합 발현 벡터는 상기 단계 (2)에 따라 숙주 세포로 형질전환시킨다. 본 발명의 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들을 사용할 수 있으며, 대장균을 사용하는 것이 바람직하다.
숙주 세포로 형질전환하는 방법은 통상의 형질전환 방법, 예를 들면 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection)을 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 바를 참조하여 숙주 세포 및 발현 벡터 등의 종류에 따라 또 다른 최적의 형질전환 방법을 도입할 수도 있다.
형질전환된 숙주 세포들은 상기 단계 (3)에 따라 본 발명에 따른 재조합 CAV 섬유 단백질의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포들은 적합한 배지와 재조합 CAV 섬유 단백질의 발현 및/또는 분리를 용이하게 하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해 배양될 수 있다. 배양은 공지 기술을 사용하여 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 수행한다. 이러한 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 문헌 (예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그)에 공지된 바에 따라 제조할 수도 있다.
형질전환된 숙주 세포에서 생산된 재조합 CAV 섬유 단백질은 상기 단계 (4)에 따라 통상의 단백질 분리 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 재조합 CAV 섬유 단백질은 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 방법에 따라 배양물로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 재조합 CAV 섬유 단백질은 크로마토그래피 (예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도 (예, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 공지된 방법을 통해서 정제될 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 항체, 특히 난황 항체도 본 발명의 한 측면을 형성한다.
본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질을 항원으로 하여 개 아데노바이러스에 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 폴리클로날 항체는 일반적으로 포유동물을 적절한 양의 항원으로 1회 이상의 회수로 면역화시키고 항체의 역가가 일정 수치에 이르렀을 때, 상기 포유동물의 항혈청으로부터 회수하여, 원하는 경우 공지된 공정을 이용하여 정제하고, 사용시까지 냉동 완충된 용액에 저장할 수 있다. 한편, 모노클로날 항체는 포유동물에 항원을 주입하여 생긴 B 림프구를 분리해서 마이엘로마 세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 만들고 이를 배양하여 항체를 제조할 수 있다. 이러한 공정의 상세한 사항들은 당업계에 잘 알려져 있다.
난황 항체의 경우에는 (1) 상기 재조합 CAV 섬유 단백질로 산란계를 면역화시키는 단계; (2) 상기 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 난황 항체를 분리하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.
본 발명에 이용되는 산란계는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 산란율이 높은 백색 레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 산란계에 항원을 투여하는 경로로는 복멤브레인내, 근육내, 안내 또는 피하 주사 등이 포함된다. 본 발명의 항원, 즉 재조합 CAV 섬유 단백질은 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
추가 항원 접종(booster)은 충분한 항체가 얻어질 때까지 실시할 수 있다. 바람직하게는 약 2주 간격으로 약 3회 면역을 실시하고, 필요할 경우에는 6 내지 10주 간격으로 실시한다. 면역화된 산란계로부터 알을 수집하고 이로부터 목적하는 항체를 분리한 후 유도된 항체의 양을 측정하여 그 증가량이 정체 상태에 도달하면, 최종적으로 알을 회수한다.
상기 유도된 항체의 양은 당업계의 통상적인 방법에 따라 측정할 수 있다. 바람직하게는, 효소면역흡착법 또는 마이크로타이터법으로 측정한다. 더욱 바람직하게는, 마이크로플레이트에 부착된 본 발명의 항원(재조합 CAV 섬유 단백질)과 본 발명에 따라 면역화된 알의 난황으로부터 분리한 항체를 반응시킨 후 2차 항체를 반응시키고 여기에 기질용액을 가하여 효소작용에 의한 발색반응을 일으킨 후 특정 한 파장에서 측정함으로써 유도된 항체를 정량할 수 있는 방법인 효소 결합된 면역흡착 검사법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELISA)을 사용한다.
본 발명의 난황 항체는 상기 회수된 알에서 난황을 분리하고, 이를 증류수로 희석한 다음, 희석액의 pH를 4.0 내지 6.0으로 조절한 후 동결시키고, 동결체를 해동시켜 원심분리하며, 형성된 상등액을 여과함으로써 분리할 수 있다. 바람직하게는 회수된 알에서 난황을 분리하고 증류수를 가하여 5배 내지 15배로 희석한 다음, 희석액의 pH를 약 5.0으로 조절한 후 -10℃ 내지 -30℃에서 10 내지 20시간 이상 동결시키고, 동결체를 실온에서 해동시켜 5,000 내지 15,000×g, 1℃ 내지 10℃에서 20 내지 40분간 원심분리하며, 형성된 상등액을 여과지로 여과하여 분리한다.
이상, 본 발명의 재조합 CAV VP 4 단백질 및 이에 대한 항체는 모두 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는데 이용될 수 있다. 재조합 CAV 섬유 단백질은 능동 면역을 통하여, 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 항체는 수동 면역을 통하여 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있다. 능동 면역은 병원체가 침입하였을 때 생체 스스로가 자기 몸속에 항체가 생성되게 하여 면역되는 것을 의미하고, 수동 면역은 다른 생체에서 생성된 면역체를 자신의 체내에 받아들임으로써 얻어진 면역을 의미한다.
이러한 기작으로 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방할 수 있는 재조합 CAV 섬유 단백질 및 이에 대한 항체는 백신 및 약제학적 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 이러한 경우 유효성분은 단독으로 이용되기 보다는 약제학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 이용하는 것이 적합하다.
여기서, 약제학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물에 이용할 수 있는 약제학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물과 약제학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
특히, 액상 제제의 경우에는 박테리아 포획 필터 등을 통한 여과에 의해 살균제 등을 혼입시켜 살균하는 것이 바람직하다. 이렇게 살균된 조성물은 예를 들면 동결건조에 의해 고형화시킬 수 있으며, 사용시에 이를 무균수 또는 무균 희석액에 용해시킨다.
본 발명에 따른 백신 조성물과 약제학적 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 개, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물과 약제학적 조성물의 투여량은 동물의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 동물에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 CAV 섬유 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로 각각의 용량은 본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질 또는 항체의 면역원량의 멸균용액 ㎖ 당 0.1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다. 백신 조성물의 경우에는 필요에 따라 초기 용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.
한편, 본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 항체를 통상의 사료와 혼합하여 개 아데노바이러스의 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물로 제조할 수도 있다. 사료로는 돼지고기, 소고기 및 닭고기 등의 부산물을 비롯하여 옥수수, 쌀, 일반 볏짚, 야초, 목초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다. 이러한 사료에 본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 항체를 첨가하여 배합하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 개 아데노바이러스 균주 확보 및 유전자 재조합
1-1 : 개 아데노바이러스 균주의 확보
10% FBS (Gibco Co. USA)와 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco Co. USA)을 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle medium[D-MEM(Gibco Co. USA)]에 CRFK 세포를 단층이 되도록 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 상기 CRFK 세포에 개 아데노바이러스 (ATCC-VR800)를 감염시켰다. 상기 CAV에 의해 감염된 CRFK 세포 중 약 80%에서 세포변성(cytopathic effect, CPE)이 일어날 때까지 37℃, 5% CO2 배양기에 1 내지 6일 동안 배양하였다.
1-2 : 개 아데노바이러스의 DNA 추출
Viral gene-spinTM viral DNA/RNA Extraction kit(iNtRON Biotechnology Inc. Korea)를 사용하여 제조업자의 메뉴얼에 따라 CAV 게놈 DNA를 추출하였다.
1-3 : 개 아데노바이러스의 섬유 단백질을 코딩하는 유전자의 재조합
개 아데노바이러스의 섬유 단백질을 코딩하는 유전자는 CAV 섬유 단백질의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR을 통하여 제조하였는데, 상기 CAV 섬유 단백질의 유전자에 특이적인 프라이머는 GenBank의 데이터(NCBI Z37498)를 기초로 하여 CAV 섬유 단백질 유전자 전체(1.9kb)를 증폭할 수 있도록 제작하였다. 상기 PCR은 바이러스의 게놈 DNA 주형 1㎕, 25mM MgCl2 4㎕, 10×EX Taq. 완충용액 5㎕, 2.5mM dNTP 4㎕, 포워드 프라이머 (CAV Fa-ggA TCC ATg TTT gCT AAg ACg TCT ggg TC - 서열번호: 1) 1㎕, 리버스 프라이머 (CAV Fg-gTC gAC gAC CTA TTA TTg ATT TTC GCC TA - 서열번호: 20) 1㎕, EX Taq DNA 폴리머라제 (5U/㎕) 0.5㎕에 전체 반응 용량이 50㎕가 되도록 증류수를 가하여 94℃에서 5분 동안 개시 변성, 94℃에서 1분 동안 변성, 54℃에서 1분 동안 어닐링, 72℃에서 2분 동안 연장하는 각 사이클을 30회 반복하였으며 최종 연장은 72℃에서 10분 동안 실시하였 다[MiniCycler™ Thermocycler(MJ Research. Inc. USA)]. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스 겔(SeaKem LE agarose, BMA. USA) 상에서 100V로 30분간 전기영동(RunOne Electrophoresis Cell, Embi Tec. USA)한 후 에티듐 브로마이드로 염색하여 밴드를 확인하였다.
도 1a에 나타낸 바와 같이 상기 PCR을 통하여 수득한 산물은 1.9kb의 CAV 섬유 단백질을 코딩하는 유전자 (서열번호: 22)를 확인할 수 있었다(레인 1: λ DNA EcoRI/ Hind Ⅲ 마커, 레인 2: PCR 산물, 레인 3: PCR 산물의 제한효소 분해산물, 레인 4: 100bp 래더 마커).
Figure 112006076789759-pat00001
* 진한 글씨체는 제한효소 인식 부위를 나타낸다.
한편, CAV 섬유 단백질 유전자의 7개의 단편은 앞서 PCR 증폭시킨 샘플을 주형으로 하고 표 1에 나타낸 올리고 뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하는 PCR을 통하여 증폭하였다. 즉, DNA 주형 1.0㎕, 25mM MgCl2 4㎕, 10×EX Taq. 완충용액 5㎕, 2.5mM dNTP 4㎕, 각각의 단편에 대한 포워드 프라이머 1㎕, 리버스 프라이머 1㎕, EX Taq DNA 중합효소 (5U/㎕) 0.5㎕에 전체 반응 용량이 50㎕가 되도록 증류수를 가하여 95℃에서 5분 동안 변성, 95℃에서 1분 동안 변성, 54℃에서 1분 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장하는 사이클을 35회 반복하고, 추가로 72℃에서 10분 동안 연장하는 과정을 통하여 실시하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔 상에서 100V로 30분간 전기영동한 후, 에티듐 브로마이드로 염색하여 밴드를 확인하였다.
상기 전기영동 분석 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 320, 314, 284, 335, 296, 362, 323bp의 크기를 갖는 CAV 섬유 단백질 단편 유전자 7개가 확인되었다(레인 1: 100bp DNA 래더, 레인 2: CAV Fa, 레인 3: CAV Fb, 레인 4: CAV Fc, 레인 5: CAV Fd, 레인 6: CAV Fe, 레인 7: CAV Ff, 레인 8 : CAV Fg).
확보된 PCR 산물을 도 1c에 나타낸 바와 같이 pGEM T easy vector(Promega Co, USA)에 클로닝하여 GenBank의 데이터베이스를 기초로 하여 염기서열을 확인하였고, 분석된 염기서열의 상동성을 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST 프로그램으로 비교하였다. 그 결과 개 아데노바이러스 섬유 단백질 유전자와 99%의 유사성을 나타내었다.
실시예 2 : 재조합 발현 벡터 구축과 단백질 발현 및 확인
2-1 : 재조합 발현 벡터의 구축
앞서 확보한 7종의 재조합 CAV 섬유 단백질의 유전자에 대한 양성 클론을 선발한 후 각각의 플라스미드를 제한효소 BamH I 과 Sal I으로 절단하여 320, 314, 284, 335, 296, 362, 323bp (CAV Fa, CAV Fb, CAV Fc, CAV Fd, CAV Fe, CAV Ff, CAV Fg)의 DNA 단편을 수득한 후 이 단편과 상기 제한효소로 절단하여 준비한 발현 벡터 pMAL-c2x를 라이게이션하였다. 이를 E. coli 컴페턴트 세포 JM109에 형질전환시켜 양성 클론을 선택하였다(도 2a 참조).
그로부터 재조합 발현 벡터를 분리한 후 제한효소 BamH I 과 Sal I으로 절단하여 아가로스 겔을 이용하여 전기영동해 본 결과 도 2b에 나타낸 바와 같이 재조합 CAV 섬유 단백질을 코딩하는 유전자 7개가 확인되었다(레인 1: λ DNA HindⅢ 크기 마커, 레인 2: pDMCAVFa, 레인 3: pDMCAVFb, 레인 4: pDMCAVFc, 레인 5: pDMCAVFd, 레인 6: pDMCAVFf, 레인 7: pDMCAVFg , 레인 8: 100bp 래더 마커).
2-2 : 대장균을 이용한 재조합 CAV 섬유 단백질의 발현 및 분리
상기에서 얻어진 양성 클론을 취하여 100㎍ 암피실린이 첨가된 5㎖의 LB broth(Merck co.)에 접종한 후 37℃, 200rpm에서 12 내지 16시간 동안 진탕 배양하였다. 상기 배양된 세포를 100㎍ 암피실린이 첨가된 100㎖의 LB broth에 접종하여 37℃, 200rpm으로 흡광도(OD600)가 0.5 내지 0.6이 될 때까지 배양하였다. 흡광도(OD600)가 0.5 내지 0.6이 되면 0.3mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside, DUCHEFA Co. Netherland)를 첨가한 후 3시간 30분 내지 4시간 동안 배양하였다. 이렇게 수득한 배양물은 6,000rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 균체를 회수한 후 세포 용해 완충용액(100mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM imidazole, pH 8.0)으로 재 현탁하고, 리소자임을 1㎎/㎖로 첨가하고 얼음에서 15분간 방치하였다. 이러한 과정을 통하여 용해된 세포를 초음파기(BRANSON SONIFIER 450, Branson Ultrasonic. USA)를 이용하여 분쇄한 후 4℃, 10,000×g에서 20분 동안 원심분리하여 상등액과 펠렛을 별도로 수집하여 재조합 CAV 섬유 단백질을 수득하였다.
2-3 : 재조합 CAV 섬유 단백질의 분석
앞서 수득한 단백질이 CAV 섬유 절편 단백질인지 여부는 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 여기서, SDS-폴리아크릴아미드 겔은 두 장을 동시에 만들어 사용하였고, 단백질 역시 동일한 1.5㎖ 튜브에서 조작한 단백질을 절반씩 나누어 SDS-폴리아크릴아미드 겔 두 장에 각각 로딩하고 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 한 장은 쿠사미 블루 R-250(SIGMA Co. USA)으로 염색하여 육안으로 단백질의 양상을 보았고, 다른 한 장은 나일론 멤브레인(Amersham Pharmacia Biosciences, UK)에 블로팅시킨 후 3% BSA/PBS로 4℃에서 16시간 블로팅시켰다. 이어서, 멤브레인을 TBST(100mM Tris-Cl pH7.5, 0.9% NaCl, 0.1% Tween 20)로 1회 세정하고, 일차 항체인 항-MBP 항체(NEB Co. USA)를 20,000배 희석하여 실온에서 한 시간 동안 반응시킨 후 TBST로 3차례 세정하였다. 여기에, 이차 항체인 알칼리성 포스파타제 콘쥬게이티드 고우트 항-래비트 IgG(Sigma Co. USA)를 10,000배 희석하여 그 희석을 멤브레인에 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 멤브레인 TBST로 3차례 각각 5분씩 세정하고, TNM(100mM Tris-Cl pH9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCl2)으로 1회 세정한 다음 BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3- Indolyl Phosphate, Amersham Pharmacia Bioscience, UK)와 NBT(Nitro blue tetrazolium, Amersham Pharmacia Bioscience, UK)로 발색반응을 유도하였다.
도 2c에 나타낸 바와 같이 레인 2-8에서 50~60kDa 크기의 단백질이 검출됨을 확인할 수 있었다(레인 1: 단백질 분자량 마커, 레인 2~8: 재조합 CAV Fa~Fg 단백질). 이는 대장균에서 발현시킨 단백질이 항-MBP 항혈청과 특이적으로 반응하여 나타난 결과이고, 이로써 대장균에서 유도되어 발현된 단백질은 재조합 CAV Fa~Fg 단백질임이 확인되었다.
2-4 : 재조합 CAV 섬유 단백질의 정제 및 단백질의 농도 분석
재조합 CAV 절편 단백질을 pMALTM protein fusion and purification system(NEB Co. USA)을 사용하여 정제하였다. 실시예 2-2를 참조하여 1ℓ의 LB broth에 균을 배양한 후 원심분리하여 균체를 확보한 다음 이를 초음파 분쇄기로 분쇄하고 상등액을 수거한 후에 상기 키트내에 포함된 수지와 혼합한 후 4℃에서 교반하면서 3시간 동안 반응시켰다. 이어서, 글래스 울(glass wool)을 장착하여 폴리프로필렌 튜브에 앞서 반응시킨 단백질 수용액을 로딩하였다. 이 후 모든 과정은 제조업자의 메뉴얼에 따라 수행하였다. 또한, BCA(Bicinochoninic acid) Kit(Pierce Co.)를 사용하여 상기에서 획득한 정제된 재조합 CAV 섬유 단백질의 농도를 확인하였다.
실시예 3 : 재조합 CAV 섬유 단백질의 면역원성 조사
3-1 : 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 항혈청 제조
상기 실시예 2에서 수득한 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 면역원성과 중화테스트를 실시하기 위해 8주령의 BALB/C 마우스(Samtako BioKorea. Korea)에 면역을 실시하였다. 재조합 CAV 섬유 단백질 7종과 불활성화시킨 바이러스를 각각 프라운즈 컴플리트 보조제(Sigma Chemical Co.)와 동량으로 혼합하여 유화시켰다. 그 유화액 0.5㎖을 근육 주사하였으며, 추가 접종은 1차 접종 후 2주 간격으로 프라운즈 인컴플리트 보조제(Sigma Chemical Co.)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 총 2회 실시하였다. 각 접종 전에 마우스로부터 채혈하여 혈청을 분리하여 ELISA로 면역원성이 나타나는지 여부를 항체가를 통하여 확인하고, 분리된 혈청의 일부는 -20℃에 저장하여 (후술하는) 중화 테스트를 실시하였다.
도 3 및 표2에 나타낸 바와 같이 CAV Fg가 가장 높은 항체가(15,000)를 나타내었다. 또한 CAV 바이러스 자체를 면역한 것은 27,000으로 나타났으며, 나머지 단백질의 항체가는 10,000, 11,000, 13,000 (CAVFa, CAVFc, CAVFf)으로 나타났다.
3-2: 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 항혈청을 이용한 중화 테스트
앞서 생산된 CAV 섬유 단백질에 대한 각 항혈청이 CAV에 대하여 중화 효과를 발휘하는지 알아보기 위해 혈구응집억제반응(Hemagglutinin inhibition test)을 실시하여 중화 테스트를 실시하였다. 각 항혈청을 10배부터 2배씩 희석하여 96구판(NUNC, GmbH & Co. KG)에 분주하였다. 4HA CAV 바이러스를 동량 분주하고 37℃에서 1시간 반응시킨 후 1% 적혈구(RBC)를 50㎕ 분주하여 잘 혼합한 후 25℃에서 40분간 정치시킨 후 혈구응집반응을 관찰하였다. 이와 같은 혈구응집반응을 항혈청별로 3 반복으로 수행하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이 항-CAV Fc에서 가장 우수한 중화 성적을 보여주었다.
본 발명에 따른 재조합 CAV 섬유 단백질의 중화 성적
혈청 항체가 중화 테스트
Anti-CAV 27000 60
Anti-CAVFa 10000 80
Anti-CAVFc 11000 2400
Anti-CAVFf 13000 1400
Anti-CAVFg 15000 1200
실시예 4 : 재조합 CAV 섬유 단백질을 이용한 난황 항체 생산 및 확인
4-1 : 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 난황 항체의 생산
상기 실험에서 획득한 재조합 CAV 섬유 절단된 단백질에 대한 항체 생산을 위해 28주령의 ISA-브라운계 산란계에 면역을 수행하였다. 산란계의 사육 및 사양관리는 경기도 H농장에서 수행하였으며, 정제된 재조합 CAV 섬유 단백질과 프라운즈 컴플리트 보조제(Sigma Chemical Co.)를 각각 동량 혼합하여 유화하였다. 상기 유화액 1㎖를 산란계의 흉근에 0.25㎖씩 4곳에 근육주사 하였으며, 추가 접종은 1차 접종 후 2주 간격으로 프라운즈 인컴플리트 보조제(Gibco Co. USA)로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 총 3회 실시하였다. 각 접종 전에 산란계의 익하정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하고 이를 -20℃에 저장하였고 난은 매일 회수하여 8℃의 저온실에 저장하여 분석에 이용하였다.
4-2 : 산란계의 난황으로부터 난황 항체의 확인
분리한 항혈청과 난황으로부터 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 항체가를 분석하기 위해 ELISA를 실시하였다. 재조합 CAV 섬유 단백질을 5㎍/㎖가 되도록 카르보네이트-비카르보네이트 완충용액(pH 9.6)으로 희석하여 MicrotestⅢ flexible assay plate(Falcon 3911, BD Biosciences, USA)의 각 구에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅막을 세정용 완충용액(PBST, 0.02M NaH2PO4, 0.13M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.2)으로 3회 세정한 후 3% BSA(bovine serum albumin, pH 7.3, Sigma Co. USA)/PBS를 각 구에 175㎕씩 분주한 후 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서, PBST로 5번 세정하고 3% BSA/PBS와 세정용 완충용액(PBST, phosphate buffered saline-Tween 20)을 동량으로 섞은 희석 완충용액을 이용하여 수득한 항혈청과 난황을 각각 2,000배 희석하여 3배씩 연속적으로 희석한 후, 상기 재조합 CAV 섬유 단백질이 코팅된 구에 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 한편, 2차 항체로는 알칼리성 포스파타제 콘주게이티드 래비트 항-치킨 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. USA)를 5,000배로 희석하여 37℃에서 2시간 동안 상기 플레이트의 구에 분주하여 반응시켰다. 기질 완충용액으로는 인산 기질 타블렛(ρ-nitrophenyl phosphate, PIERCE Co. USA)을 0.5mM MgCl2가 포함된 10% 디에탄올아민(pH 9.8)에 용해시킨 용액을 사용하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 정지 용액으로 5M NaOH을 사용하여 반응을 블로킹시킨 후 마이크로플레이트 리더기(EL-800, BIO-TEK Instrument Inc. USA)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 반응을 조사하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이 항체가는 면역 후 3주부터 꾸준하게 항체가가 상승하다가 6주에 최고의 항체가를 나타내었다(항체가 약 450,000). 그 후부터는 항체가가 감소하는 경향을 보여주었다. 이와 같은 현상은 면역 직후부터 2주경까지 혈중에 형성된 항체가 3주경부터 난황으로 이전되어 축적됨으로써 나타나는 현상으로 추정된다.
4-3 : 난황 항체의 분리
면역 접종한 산란계로부터 수득한 알을 채집하여 김 등(1998, 석사학위논문, 단국대학교)의 방법에 의해 난황 단백부분을 분리하였다. 먼저, 채집된 알에서 난황만을 분리하여 증류수로 10배 희석하고, 희석된 난황용액을 pH 5.0으로 조절한 후 -20℃에서 하룻밤 동안 동결하였다. 동결된 난황을 실온에서 해동시킨 후 30분 동안 4℃에서 10,000×g로 원심분리하여 상등액을 수거하였다. 상기 상등액을 여과하여 수용성 분획(WSF)을 분리하여 동결 건조한 후 보관하였다. 이어서, 난황 항체의 정제를 위해 DEAE를 이용한 이온교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)를 실시하였다. 즉, DEAE가 함유된 컬럼을 0.025M 인산 완충용액으로 평형시키고 컬럼에 난황 항체가 포함된 0.025M 인산 완충용액을 분주한 후 컬럼을 세척해 주고, 0.25M 인산 완충용액(pH 8.0)으로 용출하였다. 이 때 용출된 단백질을 튜브당 3㎖씩 분획하고 분광광도계를 이용하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 정제 여부를 확인하였다.
실시예 5 : 난황 항체를 이용한 임상시험
5-1 : 시험동물 및 시험설계
난황 항체를 이용한 임상실험은 개시체중 3.91±0.7(SD)의 2개월령 미만의 교잡종 이유자견 24두 공시하여 14일간 사양시험을 실시하였다. 시험설계는 다음과 같이 하였다.
1) 대조군: 일반 동결건조 난황 1 g/day 투여군
2) 저농도 처리구 (LAB) : CAV Fc에 대한 난황 항체를 함유한 난황 항체 1 g/day 투여군
3) 고농도 처리구 (HAB) : CAV Fc에 대한 난황 항체를 함유한 난황 항체 3 g/day 투여군
5-2 : 사양관리 및 난황 항체, CAV의 투여
모든 자견은 각각의 대사 케이지에 1마리씩 분리 사육하였다. 시험기간 동안 일반 이유자견용 사료(2~5kg용)를 급여하였고 사료 급여량은 자견에 있어 일반적인 일일 급여 권장량인 체중의 3%를 오전, 오후로 나누어 두 차례 급여하였다. 시험 개시일부터 종료일까지 난황 항체 및 일반 난황분말을 경구 투여하였고, 시험 개시 후 3일, 4일에 CAV (9×105 pfu/ml)를 경구 투여하여 육안으로 기력상실, 식욕부진, 설사정도, 눈과 코 분비물, 폐사율을 점검하였다.
도 5a와 표 3에 나타낸 바와 같이 14일간의 시험 기간동안 각 처리구에서 폐사는 없었다. 눈과 코의 분비물은 대조구가 37.5%, LAB 25%로 HAB 0%와 비교하여 높은 발생율을 나타내었으며 식욕부진과 기력상실은 모든 처리구에서 관찰되기는 하였으나 유의적인 차이는 없었다.
본 발명의 재조합 CAV 섬유 단백질에 대한 난황 항체에 의한 감염증 완화
처리구 임상증상
기력상실 식욕부진 설사 분비물 폐사
대조구 2/8 3/8 1/8 3/8 0/8
LAB 3/8 2/8 0/8 2/8 0/8
HAB 2/7 3/7 0/7 0/7 0/7
5-3 : 분석대상
개 아데노바이러스 항체의 진단을 위해 자견 정맥에서 시험 개시일, 3일, 5일, 7일, 9일, 14일에 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 시험 자견으로부터 얻은 혈청에서 IgG 역가를 분석하기 위해 ELISA를 실시하였다. CAV 바이러스 배양액을 3회 동결 융해시킨 다음 2500rpm에서 10분동안 원심분리한 후 상등액을 채취하였다. 채취한 상등액 100㎖당 7% 폴리에틸렌글리콜(PEG M. W.6000)과 2.3g의 NaCl을 첨가한 후 4℃에서 16시간 교반한 후 1000g에서 30분 동안 원심분리한 후 침전물을 수확하였다. 침전물은 TEN(Tris 10mM, EDTA 1mM, NaCl 100mM, pH7.4) 완충액을 처음 양의 1/10농도로 산정하여 재 용해시켜 ELISA를 위한 항원으로 사용하였다. CAV 항원 220㎕를 11㎖의 카르보네이트-비카르보네이트 완충용액(pH 9.6)으로 희석하여 MicrotestⅢ flexible assay plate(Falcon 3911, BD Biosciences, USA)의 각 구에 100㎕씩 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 코팅이 완료된 플레이트를 세정 완충용액(PBST, 0.02M NaH2PO4, 0.13M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.2)으로 3회 세정한 후 3% BSA(bovine serum albumin, pH 7.3, Sigma Co. USA)/PBS을 각 구에 175㎕씩 분주한 후 2시간 동안 37℃에서 배양하고, 이어서 PBST로 5번 세정하였다. 3% BSA/PBS와 세정 완충용액(PBST, phosphate buffered saline-Tween 20)을 동량으로 섞은 희석 완충용액을 이용하여 혈청을 10배 희석하여 3배씩 연속적으로 희석한 후, 상기 CAV 항원이 코팅된 구에 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 2차 항체로는 알칼리성 포스파타제 콘쥬게이티드 도그 IgG 항체(Kirkegaard and Perry Laboratories Inc. Gaithersburg, MD)를 2,500배로 희석하여 37℃에서 2시간 동안 상기 플레이트의 구에 분주하여 반응시켰다. 기질 완충용액으로는 포스페이트 기질 타블렛(ρ-nitrophenyl phosphate, PIERCE Co. USA)을 0.5mM MgCl2 가 포함된 10% 디에탄올아민(pH 9.8)에 용해시킨 용액을 사용하여 37℃에서 20분간 반응시켰다. 정지 용액으로 5M NaOH을 사용하여 반응을 블로킹시킨 후 마이크로 플레이트 리더 (EL-800, BIO-TEK Instrument Inc. USA)를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 반응을 조사하였다.
도 5b에 나타낸 바와 같이 시험 자견에서 획득한 혈청에서 IgG 항체가를 측정한 결과 CAV 투여 7일 후 대조구가 LAB 와 HAB 보다 1.3 배 높았다. 대조구의 IgG 항체가는 CAV 투여 후 시험 종료일까지 30배 증가하였으며, LAB는 5 일째 5배 증가하였으나 그 후 일정 수준을 유지하였다. HAB는 5일째 10배 증가하였으며 7일째부터 감소하기 시작하여 시험 종료일에 1.5배 감소하였다. 이는 시험 기간동안 눈의 분비물로 인하여 생긴 눈곱은 제거를 하였으나, 코에서 발생한 콧물은 시험동물의 특성상 코에 이물질이 붙게 되면, 혀로 닦아내는 습성이 있어 제거하기 곤란하였다. 이러한 과정에서 이물질을 통한 재감염이 일어났을 것이라 사료된다.
본 발명에 따른 재조합된 개 아데노바이러스 섬유 단백질과 이에 대한 항체는 개 아데노바이러스에 대한 감염증을 보다 효율적으로 치료 또는 예방하는데 유 용될 수 있다.
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Claims (16)

  1. 서열번호: 3, 서열번호: 6, 서열번호: 9, 서열번호: 12, 서열번호: 15, 서열번호: 18 및 서열번호: 21로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열번호에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 따른 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 코딩하는 유전자.
  4. 제 3항에 따른 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 코딩하는 유전자가 발현 벡터의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 포함된 재조합 발현 벡터.
  5. 제 4항에 있어서,
    발현 벡터가 pMAL-c2X인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  6. 제 4항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  7. 제 6항에 있어서,
    대장균인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  8. (1) 제 1항에 따른 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 코딩하는 유전자를 발현 벡터의 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (2) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; (3) 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 상기 유전자를 발현시키는 단계; (4) 배양물로부터 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 분리하는 단계를 포함한 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질의 제조방법.
  9. 제 1항에 따른 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 항체.
  10. 제 9항에 있어서, 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 의해 면역화된 산란계로부터 산란된 알의 난황으로부터 분리된 재조합 개 아데노바이러스의 섬유 단백질에 대한 난황 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  11. (1) 제 1항에 따른 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질로 산란계를 면역화시키는 단계; (2) 상기 산란계로부터 산란된 알의 난황에서 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 난황 항체를 분리하는 단계를 포함한 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 난황 항체의 제조방법.
  12. 제 1항에 따른 재조합 개 아데노바이러스 섬유 단백질을 유효성분으로 함유하는 개 아데노바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물.
  13. 제 9항에 따른 항체를 유효성분으로 함유하는 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
  14. 제 9항에 따른 항체를 유효성분으로 함유하는 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물.
  15. 제 12항에 따른 백신 조성물을 사람을 제외한 포유동물에 투여함으로써 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.
  16. 제 13항에 따른 약제학적 조성물을 사람을 제외한 포유동물에 투여함으로써 개 아데노바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.
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