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KR100808630B1 - 클로린 화합물을 포함하는 경구투여용 항종양 조성물 - Google Patents

클로린 화합물을 포함하는 경구투여용 항종양 조성물 Download PDF

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Publication number
KR100808630B1
KR100808630B1 KR1020060136610A KR20060136610A KR100808630B1 KR 100808630 B1 KR100808630 B1 KR 100808630B1 KR 1020060136610 A KR1020060136610 A KR 1020060136610A KR 20060136610 A KR20060136610 A KR 20060136610A KR 100808630 B1 KR100808630 B1 KR 100808630B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
chlorine
present
oral administration
tumor
Prior art date
Application number
KR1020060136610A
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English (en)
Inventor
김용철
박지용
김효준
Original Assignee
광주과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 광주과학기술원 filed Critical 광주과학기술원
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Priority to PCT/KR2007/006964 priority patent/WO2008082200A1/en
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Abstract

본 발명은 클로린(chlorin) 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하며, 상기 클로린 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 항종양 활성을 위하여 광을 요구하지 않는 것을 특징으로 하는 경구투여용 항종양 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 광 민감성 물질로서 종래에 암에 대한 광역학 치료제로 이용되고 있는 클로린 화합물의 새로운 용도 및 사용법을 제시한다. 즉, 본 발명에 따르면 클로린 화합물을 경구 투여하여 광의 조사 없이도 항종양 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구 투여 되어 위장관에서 잘 흡수가 이루어지며, 우수한 항종양 효과를 나타내며, 세포 독성 및 면역 독성이 없는 생체에 매우 안전한 조성물이다.
암, 종양, 클로린, 경구 투여, 클로린 e6

Description

클로린 화합물을 포함하는 경구투여용 항종양 조성물{Antitumoric Compositions for Oral Administration Comprising Chlorin Compounds}
도 1a는 해수 클로렐라에 포함되어 있는 성분들을 분석한 HPLC(high pressure liquid chromatography) 분석 결과를 보여 준다.
도 1b는 클로렐라를 60% 에탄올로 세척하여 클로로필 a 이외의 다른 성분들을 제거한 결과를 보여주는 HPLC 분석 결과이다. HPLC 분석은, 세척 결과 형성된 상등액에 대한 것이다.
도 1c는 100% 에탄올로 클로로필 a를 추출한 결과를 보여주는 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 방법에 따라 최종적으로 제조된 클로린 e6에 대한 분자량 분석 결과이다.
도 3 및 도 4는 클로린 e6의 동물 개체에서의 약물동력학(pharmacodynamics) 분석 결과를 보여주는 그래프이다. 클로린 e6를 래트에 경구 투여하고 시간 간격으로 혈청에서의 클로린 e6의 농도를 측정하였다.
도 5는 본 발명의 조성물의 동물개체 수준에서의 항종양 효과를 보여 주는 그래프이다. 종양세포가 이식된 래트에 본 발명의 조성물을 투여하고 이식된 종 양 조직의 크기를 시간별로 측정하였다.
본 발명은 클로린 화합물을 유효성분으로 포함하는 항종양 조성물에 관한 것이다.
암 질환의 위험군은 크게 두 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째 그룹은 외부 또는 내부 환경 요인에 일정하게 계속적으로 노출된 그룹이고, 두 번째 그룹은 암 질환을 가졌었던 자로서 차도(remission) 단계에 있는 그룹이다.
첫 번째 그룹에서, 외부 환경 요인으로는 생태학적 요인들이 있으며, 예를 들어, 화학 공장 설비로부터 나오는 공기 및 물, 자동차의 배기 가스, 방사능, 그리고 합성 보존제를 포함하는 음식 등이 있다.
내부적 환경 요인은 만성적 대사 이상을 포함하며, 상기 대사 이상에 의해 신체의 주 기능 시스템, 예컨대 세포 구조 등에 악영향을 미치는 산물들이 생성된다.
첫 번째 그룹에서 암 발생에 큰 영향을 미치는 것은 인체 내에서의 산화환원 과정의 손상이며, 이러한 손상에 의해 자유 라디칼이 과도하게 생성되며, 이는 정상 세포에 손상을 주며, 암 세포의 생성을 초래한다.
한편, 두 번째 암 질환 위험 그룹에서 암 재발 가능성은 매우 높다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 인체에 안전한 항종양 조성물, 특히 기능성 식품으로서 적용성이 우수한 조성물을 개발하고자, 다양한 물질에 대하여 안전성 및 항종양 활성을 조사하였다. 그 결과, 종래 광민감성 물질로서 항암치료에 이용하였던 클로린 화합물, 특히 클로린 e6가 광을 조사(irradiation) 하지 않았음에도 불구하고 생체 내에서 우수한 항종양 활성을 나타낼 뿐만 아니라 인체에 안전한 물질임을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 클로린 화합물을 유효성분으로 포함하는 경구투여용 항종양 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 클로린(chlorin) 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하며, 상기 클로린 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염(pharmaceutically acceptable salt)은 항종양 활성을 위하여 광을 요구하지 않는 것을 특징으로 하는 경구투여용 항종양 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 인체에 안전한 항종양 조성물, 특히 기능성 식품으로서 적용성이 우수한 조성물을 개발하고자, 다양한 물질에 대하여 안전성 및 항종양 활성을 조사하였다. 그 결과, 종래 광민감성 물질로서 항암치료에 이용하였던 클로린 화합물, 특히 클로린 e6가 광을 조사(irradiation) 하지 않았음에도 불구하고 생체 내에서 우수한 항종양 활성을 나타낼 뿐만 아니라 인체에 안전한 물질임을 발견하였다.
본 발명의 조성물에서 유효성분으로 이용되는 성분은 클로린 화합물이다. 본 명세서에서 용어 “클로린” 또는 “클로린 화합물”은 중심에 3개의 피롤을 있고, 4개의 메틴(methine) 결합을 통하여 커플링된 하나의 환원된 피롤을 포함하는 헤테로사이클릭방향족 고리 화합물을 의미한다. 통상적으로 클로린 화합물은 다음 화학식 1의 구조를 기본적으로 갖는다. 하기 화학식 1이 화학적 변형되어 형성된 클로린 화합물도 본 발명의 범위에 포함된다.
Figure 112006097739803-pat00001
클로린은 통상적으로 광민감성을 나타내기 때문에, 암의 광역학 치료(photodynamic therapy)에 이용되고 있다. 종래에는, 클로린의 광민감성을 이용하여 클로린을 인체 내로 투여(일반적으로, 주사(injection))한 다음 광을 조사하여 암을 치료하였다.
상기 종래 기술과 관련하여, 본 발명의 가장 큰 특징 또는 발견은, 클로린 화합물을 주사 또는 주입 방식이 아닌 경구 방식으로 생체 내에 투여하면, 클로린 화합물이 위장관을 통하여 생체 내로 흡수되고 이 흡수된 클로린은 광 조사 없이도 항종양 효과를 나타낸다는 것이다.
종래 기술에서의 클로린의 용도 및 사용방법과 본 발명에서의 클로린의 용도 및 사용방법을 비교하면, 본 발명의 특징 또는 발견은 매우 흥미로운 것이다.
본 발명에서 이용되는 클로린 화합물으로는, 종래에 공지된 다양한 클로린 화합물이 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 클로린 화합물은 클로린 e6(13-카르복시-17-[2-카르복시에틸]-15-카르복시메틸-17,18-트란스-디하이드로-3-비닐-8-에틸-2,7,12,18-테트라메틸포르피린), 술폰화 메소-테트라페닐 클로린 또는 β,β’-디하이드록시 메소-치환 클로린이다.
클로린 e6(13-카르복시-17-[2-카르복시에틸]-15-카르복시메틸-17,18-트란스-디하이드로-3-비닐-8-에틸-2,7,12,18-테트라메틸포르피린)는 하기 화학식 2의 구조를 갖는다.
Figure 112006097739803-pat00002
본 발명에서 이용되는 클로린 e6는 상기 화학식 2의 구조뿐만 아니라, 화학식 1의 작용기 예컨대, -COOH 등이 치환된 치환 클로린 e6도 포함한다. 바람직하게는, 치환기로 치환되지 않은 상태의 상기 화학식 2의 화합물이 본 발명에서 이용되는 클로린 e6이다.
술폰화 메소-테트라페닐 클로린도 당업계에 공지된 광민감성 클로린 화합물로서, 이에 대한 상세한 내용은 EP 1 420 824에 개시되어 있으며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명에서 이용될 수 있는 술폰화 메소-테트라페닐 클로린은 하기 화학식 3으로 표시된다.
Figure 112006097739803-pat00003
상기 화학식 3에서, X는 -SO3H이고; n, p, q 및 r은 서로 독립적으로 0 또는 1이다.
β,β’-디하이드록시 메소-치환 클로린도 본 발명에서 이용될 수 있는 광민감성 클로린 화합물로 당업계에 공지된 화합물이다. 이에 대한 상세한 내용은 US 5,648,485에 개시되어 있으며, 상기 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명에서 이용될 수 있는 β,β’-디하이드록시 메소-치환 클로린은 하기 화학식 4로 표시된다.
Figure 112006097739803-pat00004
상기 화학식 4에서, A는
Figure 112006097739803-pat00005
세 개의 피롤 중 하나이며, D는
Figure 112006097739803-pat00006
세 개의 피롤 중 하나이다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 항종양 조성물에 포함되는 클로린 화합물은 클로린 e6이다.
본 발명에서 이용되는 클로린 e6는 당업계에 공지된 다양한 화학적 방법으로 합성될 수 있으며, 바람직하게는 클로렐라로부터 얻은 클로로필 a를 화학적으로 변형시켜 제조한다.
본 발명자들은 클로린 e6의 신규한 용도 및 사용뿐만 아니라, 자연적 소스(natural source)로부터 매우 높은 효율로 클로린 e6를 제조할 수 있는 방법을 개발하였고, 이에 대하여 특허출원 하였다. 본 발명자들에 의해 개발된 클로렐라의 클로로필 a로부터 클로린 e6를 제조하는 방법을 간략하게 소개하면 다음과 같다: 본 발명자들에 의해 개발된 클로린 e6 제법은 (a) 클로렐라에 30-68% 에탄올을 처리하여 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 성분을 제거하는 단계; (b) 상기 클로렐라에 80-100% 에탄올을 처리하여 클로로필 a를 추출하여 클로로필 a 추출액을 수득하는 단계; (c) 상기 클로로필 a 추출액에 산을 처리하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써 페오피틴(pheophytin) a를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 페오피틴 a에 염기를 처리하여 클로린 e6를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명자들의 방법에 따르면, 클로렐라로부터 클로린 e6에 대한 수율은 8.2-8.4%로서 종래의 다른 방법과 비교하여 높다.
본 발명에서 이용되는 클로린은 약제학적으로 허용되는 염의 형태일 수 있다. 본 발명에서의 약제학적으로 허용 가능한 염은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로, 예를 들면, 염산, 브롬화수소, 황산, 황산수소나트륨, 인산, 탄산 등의 무기산과의 염 또는 개미산, 초산, 옥살산, 벤조산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 게스티스산, 푸마르산, 락토비온산, 살리실릭산, 또는 아세틸살리실릭산(아스피린)과 같은 유기산과 함께 약제학적으로 허용 가능한 산의 염을 형성하거나, 또는 소듐, 포타슘 등의 알칼리금속이온과 반응하여 이들의 금속염을 형성하거나, 또는 암모늄 이온과 반응하여 또 다른 형태의 약제학적으로 허용가능한 염을 형성할 수도 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 클로린의 약제학적으로 허용되는 염은 소듐염이며, 클로린 화합물로서 클로린 e6가 이용되는 경우에는 클로린 e6 트리 소듐염이 가장 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 글리시리신산(glycyrrhizic acid), 렌티난(lentinan), 레이쉬딘(reishidin), 레티포린(letiporin), 아카세틴(acacetin), 아연, 셀레늄 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 성분을 추가적으로 포함한다.
상기 추가적인 성분 중에서, 바람직하게는, 베타-시토스테롤은 쇄기풀, 글리시리신산은 감초, 렌티난은 표고버섯, 레이쉬딘은 영지버섯, 레티포린 라티포러스 설퍼러스(Latiporus sulphereus), 아카세틴은 배초향, 그리고 아미노산은 효모로부터 유래된 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 거의 면역독성을 나타내지 않으면서도 대식세포(macrophage)의 활성을 증강시키는 작용도 한다.
본 발명의 조성물은 식품 조성물 또는 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 항종양 조성물은 식품, 특히 기능성 식품 조성물로 제조될 수 있 다. 본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다. 식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 식품은 암의 예방 또는 치료에 매우 유용하다.
본 발명의 항종양 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있으며, 이 경우 유효성분으로서의 상기 성분들 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 경구로 투여되어 생체 내에서 항종양 효능을 발휘한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-200 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암 또는 종양은 특히 제한되지 않으며, 예를 들어, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명 조성물의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 광 민감성 물질로서 종래에 암에 대한 광역학 치료제로 이용되고 있는 클로린 화합물의 새로운 용도 및 사용법을 제시한다.
(ⅱ) 즉 본 발명에 따르면 클로린 화합물을 경구 투여하여 광의 조사 없이도 항종양 효과를 얻을 수 있다.
(ⅲ) 본 발명의 조성물은 경구 투여 되어 위장관에서 잘 흡수가 이루어지며, 우수한 항종양 효과를 나타낸다.
(ⅳ) 본 발명의 조성물은 세포 독성 및 면역 독성이 없는 생체에 매우 안전한 조성물이다.
(ⅴ) 본 발명의 조성물은 경구 투여 되어 위장관에서 잘 흡수가 이루어지며, 우수한 항종양 효과를 나타낸다.
(ⅵ) 본 발명의 조성물은 세포 독성 및 면역 독성이 없는 생체에 매우 안전한 조성물이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 클로렐라로부터 클로로필 a의 수득
실시예 1-1: 클로렐라로부터 클로로필 a 이외의 다른 불순물의 제거
(주)클로랜드에서 구입한 해수 클로렐라에서 우선 염분을 제거하기 위하여, 증류수로 세척한 다음 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시켰다. 이어, 침전물을 증류수로 재현탁하고 원심분리를 다시 실시하였다. 증류수에 의한 세척 과정을 총 5회 실시한 다음, 침전물을 소량 취한 후, HPLC(high pressure liquid chromatography)로 클로로필 a 및 다른 성분들이 얼마나 함유되어 있는 지 확인하였다. HPLC는 SPD-M10AVP 컬럼이 장착된 동일시마즈 HPLC 시스템을 이용하여 실시하였고, 주입 볼륨은 20 ㎕, 유속은 1 ml/min로 하였다. 전개액으로는 메탄올(67.5), 디클로로메탄(22.5), 아세토니트릴(9.5) 및 물(0.5)이 혼합된 것을 이용하였다. 레퍼런스(reference)로는, Fluka 회사의 클로로필 a를 사용하였다. HPLC 결과는 도 1a에 나타나 있다.
도 1a에서 확인할 수 있듯이, 머무름시간(retention time) 약 9.7 min에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰이 되었고, 머무름시간 2.5-7.5 min에서 다른 여러 성분에 해당되는 피크가 관찰되었다.
해수가 제거된 클로렐라(파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체) 100 g에 60% 에탄올 300 ml을 첨가하여 세척하고, 5000 rpm에서 원심분리하여 클로렐라를 침전시켜, 머무름시간 2.5-7.5 min에 있는 불순물을 제거하였다. 이와 같은 에탄올 세척 과정을 총 6회 반복 실시하였다. 도 1b는 최총 6회 에탄올 세척 과정에서 원심분리한 후 형성된 상층액에 대한 HPLC 결과이다.
도 1b에서 확인할 수 있듯이, 머무름시간 2.5-7.5 min에서 나타나는 불순물들이 60% 에탄올 세척 과정에서 다량 제거되고 있음을 알 수 있다.
한편, 70% 이상의 농도의 에탄올을 이용하여 세척 과정을 실시하면, 클로로필 a가 추출되어 세척, 즉 불순물의 제거를 할 수 없었다. 또한, 20%, 40% 및 50% 농도의 에탄올을 이용하여 세척 과정을 실시하였는데, 불순물의 제거가 60% 에탄올보다는 잘 되지 않았다.
따라서, 60% 에탄올이 가장 바람직한 세척 용액이라는 것을 알 수 있다. 즉, 60% 에탄올은 클로렐라로부터 클로로필 a를 추출시키지 않으면서도 클로렐라 세포에 포함되어 있는 클로로필 a 이외의 다른 성분들을 효과적으로 추출하여, 세척된 클로렐라에 클로로필 a가 상대적으로 높은 함량으로 포함되도록 한다.
실시예 1-2: 불순물이 제거된 클로렐라로부터 클로로필 a의 추출 I
상기 불순물이 제거된 클로렐라 100 g에 100% 에탄올 1L 을 첨가하고, 3시간 동안 교반하여 클로로필 a를 추출하였다. 추출과정에서 이용된 클로렐라는 음파파쇄(sonication) 등으로 파쇄되지 않은 것으로서, 클로렐라 세포 그 자체를 이용하여 추출을 하였다. 일반적으로는, 세포 파쇄물(cell lysate)에 유기용매를 처리하여 클로로필 a를 추출하는 데, 본 실시예에서는 파쇄 되지 않은 클로렐라 세포 자체를 이용하였다. 추출 결과는 도 1c에 나타나 있다.
도 1c에서 볼 수 있듯이, 머무름시간(retention time) 약 8.4 min에서 클로로필 a에 해당하는 피크가 관찰이 되었고, 도 1a에서 관찰되었던 머무름시간 2.5- 7.5 min의 불순물들이 상당량 제거되었음을 알 수 있었다. 또한, HPLC에서 크로마토그램에서 클로로필 a의 함량이 76.92% 임을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 클로로필 a로부터 클로린 e6 의 제조
실시예 1에서 얻은 클로로필 a를 포함하는 에탄올 추출물 1 L 당 2~5 ml의 1 N HCl을 처리하여 추출물의 pH를 2~3가 되도록 조정하고, 3시간 동안 교반하여 클로로필 a로부터 마그네슘 이온을 제거함으로써, 페오피틴(pheophytin) a를 수득하였다. 이어, 검은색의 페오피틴 a 용액 1 L 에 1 N NaOH 2~5 ml를 첨가하여 중화시키고, 여과하였다.
이어, 여과액 1 L에 1 N NaOH 2-5 ml을 첨가하여 페오피틴 a 용액를 포함하는 여과액의 pH를 11~12로 조정하고, 12시간 동안 교반시켜 페오피틴 a로부터 클로린 e6를 형성시켰다. 그런 다음, 반응 결과물에 1 N HCl을 첨가하여 중화시키고, 여과를 한 후 에탄올을 완전히 제거하여, 최종적으로 클로렐라 100 g으로부터 8.16 g의 클로린 e6를 수득하였다(수율: 8.2%).
최종적으로 수득한 클로린 e6를 확인하기 위하여, LCQ DecaXP Plus, Thermo Finnigan를 이용하여 분자량을 확인하였다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 측정된 분자량이 597.4인데, 이는 이론치 분자량인 596.97과 일치한다.(분자량 측정시 기계가 분자량 +1을 인식하므로 정확히 일치한다) 따라서, 본 발명의 방법에 의해 높은 수율로 클로린 e6가 제조되었음을 알 수 있다.
또한, 클로린 e6의 염 형태를 제조하기 위하여, NaHCO3 3 당량을 얼음물에 용해한 다음 클로린 e6에 첨가하고, 물을 여과한 후 동결건조를 하여 염 형태의 클로린 e6를 제조하였다.
실시예 3: 클로린 e6 를 주성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물의 제조
다음 표 1 및 2에 기재된 조성으로 클로린 e6를 주성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제조하였다. 하기 표 1은 시럽 조성물이고, 총 100 ml이며, 표 2는 캡슐 조성물이고 총 400 mg이다. 표 1 및 2의 조성물은 특히 식품 조성물로서 적합하다.
시럽 조성물
조성 함량 (mg) 지표물질
클로린 e6 40 클로린 e6
쇄기풀 추출물 10 베타-시토스테롤
셀레늄-메티오닌 350 셀레늄
아연 30 아연
배초향 추출물 40 아카세틴
설탕 시럽 100 ml 까지 -
캡슐 조성물
조성 함량(mg) 지표 물질
클로린 e6 35 클로린 e6
쇄기풀 추출물 20 베타-시토스테롤
감초 추출물 20 글리시리신산
표고버섯 분말 30 렌티난
영지버섯 분말 20 레이쉬딘
라티포러스 설퍼러스 20 레티포린
배초향 20 아카세틴
아연 6 아연
셀레늄-메티오닌 0.07 셀레늄
효모 분해물 100 아미노산
실시예 4: 급성독성 실험
상기 표 1의 조성물에 대하여 급성 독성 실험을 실시하였다.
위스타 래트(195± 5 g) 및 마우스(19± 1 g)을 이용하였고, 각각의 실험군에 대하여 총 12 마리(웅성 6 마리 및 자성 6 마리)를 이용하였다. 시료를 실험동물에게 다음의 용량으로 단독 경구 투여 하였다: 래트에 대해 6.0 ml, 마우스에 대해 0.8 ml. 결과적으로 래트에 대해서는 30 ml/kg, 마우스에 대해서는 40 ml/kg을 투여한 것이다. 대조군 동물에게는 증류수를 동일 용량으로 투여 하였다. 실험 동물에 대한 관찰은, 시료 투여 후 14일 동안 실시하였다. 실험 결과는 표 3에 정리되어 있다.
급성독성 시험 결과
동물 시료 시료 투여량 ml/래트(마우스) 결과
성별 총 결과
웅성 자성
생존율(%) 사망율(%) 생존율(%) 사망율(%) 생존율(%) 사망율(%)
래트 본 발명 조성물 6.0 6(100.0) 0(0) 6(100.0) 0(0) 12(100.0) 0(0)
대조군 6.0 6(100.0) 0(0) 6(100.0) 0(0) 12(100.0) 0(0)
마우스 본 발명 조성물 6.0 6(100.0) 0(0) 6(100.0) 0(0) 12(100.0) 0(0)
대조군 6.0 6(100.0) 0(0) 6(100.0) 0(0) 12(100.0) 0(0)
상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 조성물은 매우 낮은 독성을 나타내었고, 사망한 동물은 없었다. 또한, 실험 동안에 동물의 행동에서도 대조군과 비교하여 이상이 없었다. 투여를 완료한 후 동물의 내부 기관을 관찰 하였는데, 대조군과 비교하여 다른 변화를 보인 기관은 없었다.
실시예 5: 아급성 독성 실험
위스타 래트(195± 5 g) 5 마리를 이용하여 아급성 독성 실험을 실시하였다. 시료를 래트에게 매일 26.3 ml/kg의 투여량으로 60일 동안 투여하였다. 대조군에는 설탕 시럽 또는 증류수를 투여하였다. 실험 동물들에 대한 전신적(systematic) 조사는 실험의 총 과정 동안 실시하였다. 실험 동물들에 있어서의 여러 변수에 대한 조사는 투여 후 30일 및 60일째, 그리고 회복기(실험 종료 후 30일째)에 각각 실시하였다.
실험 동물의 체중 변화, 특정 기관의 무게 변화, 다수의 생화학적 및 혈액학적 변수들은 실험 동물의 상태를 보여주는 주요한 지표로 간주하였다. 우레아, 크레아틴, 글루코오스, 총 단백질, 효소의 활성 등은 Cormay kits(Poland)를 이용하여 측정하였다. 혈액내 헤모글로빈의 농도는 헤미글로빈사이어나이드(hemiglobincyanide) 방법을 이용하여 실시하였다. 적혈구 및 백혈구의 수, 적혈구 침전 속도는 표준 방법에 따라 측정하였다.
실험 결과는 표 4-13에 정리되어 있다.
경구 투여 후 래트의 체중 변화(g)
투여량 (ml/kg) 성별 동물 수 조사 기간
원 데이터 30 일 60 일 회복기
대조군 증류수 (26.3) 웅성 5 175.0± 5.56 191.5± 5.50 230.8± 8.70 263.0± 13.70
자성 5 173.5± 7.60 189.3± 6.64 225.7± 7.45 276.0± 9.50
대조군 설탕 시럽 (26.3) 웅성 5 171.2± 8.85 210.2± 5.02* 250.9± 9.98* 292.5± 13.80**
자성 5 169.8± 5.14 211.8± 6.54** 263.6± 9.05* 290.0± 10.10**
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 5 170.9± 6.34 210.5± 5.23** 246.5± 7.44 280.0± 33.30
자성 5 172.6± 5.47 208.4± 3.75** 248.8± 8.18** 286.3± 13.30
Note: ** 대조군과 유의성 있게 차이 있음 p<0.05
* 대조군과 유의성 있게 차이 있음 p<0.01
경구 투여에 따른 래트의 조직의 무게 계수(%)(30일 투여)
투여량 (ml/kg) 성별 기관
심장 폐 간 신장 뇌 비장 부신
대조군 증류수 (26.3) 웅성 0.41± 0.02 0.96± 0.12 4.22± 0.12 0.7± 0.03 0.58± 0.03 0.48± 0.07 0.03± 0.001
자성 0.39± 0.01 0.96± 0.02 3.80± 0.07 0.72± 0.02 0.58± 0.02 0.5± 0.04 0.02± 0.002
대조군 설탕 시럽 (26.3) 웅성 0.44± 0.03 1.01± 0.1 3.80± 0.2 0.75± 0.04 0.62± 0.04 0.47± 0.07 0.02± 0.001
자성 0.35± 0.01 0.88± 0.03 3.60± 0.1 0.67± 0.04 0.58± 0.035 0.45± 0.03 0.02± 0.002
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 0.34± 0.01 0.76± 0.07 3.76± 0.07 0.67± 0.03 0.60± 0.02 0.55± 0.07 0.02± 0.002
자성 0.36± 0.01 0.87± 0.08 3.44± 0.10 0.65± 0.02 0.63± 0.08 0.50± 0.03 0.02± 0.003
경구 투여에 따른 래트의 조직의 무게 계수(%)(60일 투여)
투여량 (ml/kg) 성별 기관
심장 폐 간 신장 뇌 비장 부신
대조군 증류수 (26.3) 웅성 0.33± 0.01 0.83± 0.02 3.82± 0.08 0.63± 0.06 0.44± 0.04 0.46± 0.03 0.02± 0.0
자성 0.36± 0.01 0.91± 0.04 4.02± 0.2 0.65± 0.03 0.57± 0.03 0.48± 0.02 0.026± 0.002
대조군 설탕 시럽 (26.3) 웅성 0.33± 0.02 0.83± 0.04 3.70± 0.03 0.61± 0.02 0.46± 0.05 0.56± 0.05 0.02± 0.0025
자성 0.37± 0.01 1.00± 0.10 4.25± 0.2 0.72± 0.04 0.59± 0.03 0.46± 0.03 0.03± 0.002
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 0.42± 0.05 0.78± 0.04 4.36± 0.08 0.64± 0.01 0.46± 0.05 0.49± 0.05 0.01± 0.003
자성 0.34± 0.02 0.9± 0.04 3.82± 0.1 0.65± 0.02 0.54± 0.03 0.43± 0.03 0.02± 0.002
경구 투여에 따른 래트의 조직의 무게 계수(%)(회복기)
투여량 (ml/kg) 성별 기관
심장 폐 간 신장 뇌 비장 부신
대조군 물 (26.3) 웅성 0.40± 0.01 0.85± 0.05 3.70± 0.24 0.67± 0.01 0.57± 0.04 0.46± 0.03 0.02± 0.002
자성 0.37± 0.015 0.89± 0.03 3.65± 0.13 0.69± 0.02 0.65± 0.04 0.40± 0.02 0.02± 0.002
대조군 설탕 시럽 (26.3) 웅성 0.37± 0.014 0.79± 0.07 3.65± 0.11 0.69± 0.04 0.60± 0.04 0.35± 0.03 0.02± 0.002
자성 0.35± 0.04 0.85± 0.07 3.53± 0.08 0.65± 0.01 0.63± 0.02 0.42± 0.04 0.03± 0.001
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 0.38± 0.03 0.79± 0.05 3.62± 0.08 0.68± 0.03 0.58± 0.04 0.35± 0.01 0.02± 0.0
자성 0.37± 0.04 0.80± 0.05 3.62± 0.08 0.62± 0.02 0.61± 0.04 0.37± 0.04 0.02± 0.0
경구 투여에 따른 래트에서 혈액학적 지표 연구(30일 투여)
투여량 (ml/kg) 성별 HB. (g/l) 적혈구 s x1012/1 L x 109/π 색상 지표 ESR mm/h
대조군 증류수 (26.3) 웅성 135.9± 3.13 6.59± 0.17 8.3± 0.23 0.61± 0.02 17.4± 2.10
자성 137.25± 7.25 6.39± 0.16 7.0± 0.23 0.64± 0.02 21.6± 2.87
대조군 설탕 시럽 (26.3) 웅성 130.57± 5.04 6.26± 0.42 8.84± 0.68 0.69± 0.02 30.5± 9.7
자성 133.26± 2.12 6.0± 0.21 8.08± 0.73 0.67± 0.01 20.2± 2.87
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 130.57± 5.04 6.26± 0.28 8.84± 0.11 0.62± 0.02 19.0± 1.9
자성 143.42± 5.18 6.20± 0.39 8.60± 0.43 0.66± 0.01 19.25± 2.18
투여량 (ml/kg) 성별 백혈구 혈액 조성
stab.% segm.% eos.% lymph.% mon.%
대조군 증류수 (26.3) 웅성 2.0±0.57 25.8±0.95 2.4±0.57 69.0±1.53 0.8±0.0
자성 0.8±0.19 26.6±3.45 4.6±1.72 66.2±2.68* 1.8±0.38
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 2.4±0.57 30.0±2.87 7.0±1.34 60.2±3.83 0.4±0.0
자성 2.2±0.38 25.6±4.02 2.0±0.38 70.2±4.21 -
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 1.8±0.38 1.6±5.93 3.4±1.15 63.2±5.74 -
자성 0.6±0.0 25.6±4.8 3.4±1.15 71.0±3.83 -
경구 투여에 따른 래트에서 혈액학적 지표 연구(60일 투여)
투여량 (ml/kg) 성별 HB. (g/l) 적혈구 s x1012/1 L x 109/π 색상 지표 ESR mm/h
대조군 증류수 (26.3) 웅성 127.42±0.53 6.11±0.17 7.92±0.53 0.62±0.02 16.6± 0.53
자성 134.42±4.0 6.27±0.17 8.76±0.31 6.64±0.02 16.4± 1.15
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 129.4±8.68 6.26±0.13 7.5±0.43 0.62±0.03 18.0± 1.21
자성 135.04±4.73 6.45±0.21 6.04±0.03 0.63±0.02 16.0± 0.57
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 137.77±9.47 6.43±0.27 9.2±0.83 0.64±0.03 16.7± 4.14
자성 134.27±8.08 6.51±0.09 6.35±0.29 0.66±0.03 17.25± 2.18
투여량 (ml/kg) 성별 백혈구 혈액 조성
stab.% segm.% eos.% lymph.% mon.%
대조군 증류수 (26.3) 웅성 2.2±0.57 22.0±3.25 3.8±0.76 71.4±3.45 0.6±0.12
자성 2.2±0.0 15.2±2.5 3.2±0.27 78.8±4.21 2.4±0.48
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 1.0±0.48 29.25±8.25 3.25±2.18** 66.0±6.8 0.5±0.1
자성 1.2±0.38 14.2±2.68 5.6±1.72 78.4±3.06 0.6±0.12
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 1.33±1.1 20.33±1.93 6.0±0.83 71.67±3.6 0.67±0.13
자성 1.25±0.48 18.75±4.85 6.50±4.46 73.5±3.88 -
경구 투여에 따른 래트에서 혈액학적 지표 연구(회복기)
투여량 (ml/kg) 성별 HB. (g/l) 적혈구 s x1012/1 L x 109/π 색상 지표 ESR mm/h
대조군 증류수 (26.3) 웅성 137.52±5.4 6.26±0.13 8.2±0.5 0.57±0.03 20.0±6.15
자성 136.4±6.15 6.16±0.2365 8.16±0.31 0.62±0.04 18.8±2.5
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 137.6±1.15 5.74±0.23 7.87±0.46 0.61±0.01 19.0±0.38
자성 133.0±2.14 5.90±0.25 7.16±0.42 0.58±0.02 13.0±1.34
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 136.46±6.49 6.02±0.15 7.60±0.69 0.58±0.02 14.0±0.96
자성 132.26±5.36 5.76±0.21 7.84±0.34 0.58±0.01 10.8±0.96
투여량 (ml/kg) 성별 백혈구 혈액 조성
stab.% segm.% eos.% lymph.% mon.%
대조군 증류수 (26.3) 웅성 0.4±0.24 24.6±4.6 4.0±0.96 70.6±6.7 0.4±0.24
자성 1.0±0.77 25.0±7.85 8.2±2.3 65.4±6.5 0.4±0.24
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 0.6±0.24 23.0±7.0 3.0±0.57 73.0±6.5 -
자성 1.7±0.75 23.6±5.22 4.4±0.97 69.8±5.2 0.6±0.6
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 1.6±0.33 22.6±5.4 4.2±0.96 71.4±5.3 2.0±1.0
자성 1.75±0.48 21.4±6.14 4.4±1.36 68.0±6.7 4.0±1.6
경구 투여에 따른 래트에서 혈액 생화학적 지표(30일 투여)
투여량 (ml/kg) 성별 우레아 mM/l 크레아틴 mcM/l 빌리루빈 mcM/l 포도당 mM/l
대조군 증류수 (26.3) 웅성 4.60±0.12 38.78±2.0 4.04±0.34 4.01±0.42
자성 4.13±0.33 39.22±2.6 4.06±0.3 3.96±0.30
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 4.43±0.27 38.06±2.0 4.75±0.07 4.32±0.31
자성 3.19±0.14 38.48±2.32 4.71±0.34 4.44±0.23
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 3.15±0.12 39.72±2.6 4.04±0.26 4.21±0.51
자성 3.94±0.27 35.72±2.66 3.96±0.21 4.15±0.21
투여량 (ml/kg) 성별 AsAT mM/l AlAT mM/l 알칼린 포스파타아제 mM/l 총 단백질 g/l
대조군 증류수 (26.3) 웅성 3.74±0.22 1.57±0.14 1.84±0.24 56.71±7.32
자성 4.51±0.36 1.81±0.28 1.90±0.26 60.0±4.7
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 4.39±0.25 1.70±0.24 2.08±0.26 70.22±1.6
자성 4.94±0.15 2.13±0.22 1.98±0.15 62.64±4.3
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 4.41±0.34 1.97±0.3 1.78±0.30 54.25±4.0
자성 4.73±0.24 1.85±0.11 1.95±0.38 61.86±5.3
경구 투여에 따른 래트에서 혈액 생화학적 지표(50일 투여)
투여량 (ml/kg) 성별 우레아 mM/l 크레아틴 mcM/l 빌리루빈 mcM/l 포도당 mM/l
대조군 증류수 (26.3) 웅성 4.20±0.42 39.27±1.03 3.9±0.35 4.34±0.16
자성 3.89±0.15 38.16±0.55 4.0±0.3 4.80±0.27
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 4.21±0.55 36.64±4.6 4.69±0.25 5.63±0.21*
자성 5.16±0.3 36.5±4.23 4.68±0.24 5.75±0.14**
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 3.51±0.25 26.77±1.8 3.74±0.6 5.30±0.45
자성 5.43±0.18 32.49±4.43 4.47±0.24 5.85±0.31**
Agent, dose (ml/kg) 성별 AsAT mM/l AlAT mM/l 알칼린 포스파타아제 mM/l 총 단백질 g/l
대조군 Distilled water, (26.3) 웅성 3.73±0.34 1.53±0.4 2.04±0.38 56.7±2.73
자성 3.90±0.35 1.43±0.3 1.93±0.30 52.72±4.7
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 3.48±0.3 1.42±0.15 1.82±0.21 57.83±5.3
자성 3.94±0.3 1.18±0.2 12.98±0.34 56.05±6.6
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 3.49±0.13 1.31±0.13 2.03±0.36 60.52±2.4
자성 4.20±0.24 1.70±0.2 1.99±0.17 61.4±7.0
경구 투여에 따른 래트에서 혈액 생화학적 지표(회복기)
Agent, dose (ml/kg) 성별 우레아 mM/l 크레아틴 mcM/l 빌리루빈 mcM/l 포도당 mM/l
대조군 증류수, (26.3) 웅성 4.80±0.33 24.15±2.24 5.61±0.91 4.21±0.42
자성 4.96±0.16 27.07±1.50 5.35±0.37 4.46±0.30
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 5.12±0.16 22.97±3.46 6.41±0.37 5.02±0.16
자성 4.89±0.29 23.62±3.36 5.98±0.43 4.98±0.21
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 4.39±0.36 29.97±3.06 5.54±0.53 4.47±0.30
자성 4.28±0.33 22.75±2.62 6.01±0.46 4.78±0.32
Agent, dose (ml/kg) 성별 AsAT mM/l AlAT mM/l 알칼린 포스파타아제 mM/l 총 단백질 g/l
대조군 증류수, (26.3) 웅성 4.05±0.13 1.85±0.06 2.01±0.11 66.40±4.15
자성 4.91±0.13 2.33±0.20 2.06±0.15 67.67±1.93
대조군 설탕 시럽, (26.3) 웅성 4.24±0.15 1.94±0.14 1.85±0.08 64.72±5.66
자성 4.27±0.24 2.05±0.02 1.95±0.08 66.52±4.57
본 발명 조성물 (26.3) 웅성 4.03±2.06 2.45±0.19 1.93±0.56 62.26±2.53
자성 4.14±0.20 2.09±0.11 2.25±0.17 56.52±2.55
실험 결과, 실험 동물의 행동은 대조군과 차이가 없었다. 래트는 활동적이고, 음식물을 잘 섭취하며, 부드러운 털을 가지고 있었다. 표 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 조성물을 투여 받은 실험동물의 체중은 대조군보다 조금 높았다. 이러한 변화는 본 발명의 조성물에 포함된 설탕(고칼로리 음식)에 의해 야기된 것이다.
내부 장기에 대한 검사에서도 실험 동물과 대조군이 크게 차이가 없었다(표 5-7). 또한, 래트의 혈액에 대한 검사에서도, 본 발명의 조성물을 투여 받은 실험 동물은 대조군과 크게 차이가 없었다(표 8-10).
한편, 실험 래트의 혈청에 대한 생화학적 지표 조사에 있어서, 시료 투여 후 30일째에 혈당의 소폭 증가가 있었고, 60일째에는 혈당이 상당히 증가하였다(표 11-13). 그러나, 인간에 대한 최대 일일 투여량의 30배를 실험 동물에게 투여한 사실을 고려한다면, 이러한 결과도 독성을 야기하는 것으로 판단될 수 없다.
아급성 독성 실험 결과, 본 발명의 클로린 e6를 포함하는 조성물은 인체에 부작용을 유발하지 않는 안전한 물질이라는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 클로린 e6 의 세포독성( cytotoxicity ) 실험
플레이트에 단일층 배양된 HeLa 종량세포주(배지 2.0 ml 당 100,000 세포)에 최종농도 10, 25, 50, 75 또는 100 ㎍/ml의 클로린 e6를 처리하였다. 상기 플레이트를 광차단 커버로 싸고 37.5℃에서 1시간 동안 항온처리 하였다. 그런 다음, 0.02% Versene 용액으로 종양세포주의 단일층을 분산시키고, Goriaev's 챔버에서 세포수를 계수 하였다. 각각의 실험군에서 세포의 생존율은 다음의 수학식으로 계산하였다: (N실험군/N대조군) x 100 (%), N은 세포 수. 세포 생존율을 계산한 다음, 데이터의 회귀분석에 따라 EC50(세포 50%를 죽이는 유효 농도)를 계산하였다. 실험 결과는 표 14에 정리되어 있다.
24시간 처리 후 HeLa 세포의 수(대조군과의 비율, %)
투여량 mcg/ml 클로린 시료 1 클로린 시료 2 클로린 시료 3
10 97.3 96.1 96.5
25 92.1 75.6 76.4
50 67.4 50.1 49.1
75 46.5 44.9 54.3
100 22.0 26.0 26.0
EC50, mcg/ml 69.1±1.8 63.1±4.6 66.4± 6.6
상기 표 14에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 클로린 e6는 종양세포주에 대하여 세포독성을 나타내었고, EC50은 69.1± 1.8, 63.1± 4.6 또는 66.4± 6.6 ㎍/ml임을 알 수 있다.
실시예 7: 클로린 e6 의 세포에서의 약물동력학
플레이트에 단일층 배양된 HeLa 종량세포주(배지 2.0 ml 당 100,000 세포)에 최종농도 10 ㎍/ml의 클로린 e6를 처리하고, 1, 2, 3, 4, 5 또는 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그런 다음, Hank's 용액으로 4회 클로린 e6를 세척하고, 플레이트에 0.5% Triton X-100 용액 2 ml을 첨가하였다. 이어, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하고, 665 nm에서의 형광을 측정하였다. 실험 결과는 표 15에 정리되어 있다.
24시간 처리하고, 3,3 joule/㎠의 광 노출(Ph#) 후 HeLa 세포의 수(대조군과의 비율, %)
투여량 mcg/ml 클로린 시료 1 클로린 시료 2 클로린 시료 3
0.1 83.1 81.1 90.9
0.5 83.6 76.3 86.8
1.0 44.7 51.6 1.0
5.0 1.9 0.9 0.3
10.0 0.5 0.3 0.5
EC50 (PhE) mcg/ml 0.78±0.5 0.8±1.1 1.1±1.1
EC50/EC50(PhE) 88.6 78.9 60.4
표 15에서 확인할 수 있듯이, 세포 내에 클로린이 축적되는 것은 투여 후 1시간 이내에 시작되며, 4-5시간까지 최대 축적 양상을 보이고, 그 후 클로린의 세포 내 양이 감소된다. 이러한 감소는 클로린이 세포 내에서 대사되기 때문이다.
실시예 8: 클로린 e6 의 동물 개체에서의 약물동력학
체중 190-210 g의 위스타 래트 12 마리에 프로브를 이용하여 300 mg/kg의 투여량으로 위장 내에 클로린 e6를 주입하였다. 이어, 0.5, 1, 2, 3 및 5시간 후에 채혈하고 혈액 내 클로린 e6의 농도를 측정하였다. 클로린 e6의 농도는 664 nm에서 스펙트로포토미터를 이용하거나 675 nm에서 혈광측정기를 이용하여 측정하였다. 측정된 흡광도 값을 다음 수학식에 대입하여 클로린 e6의 농도를 얻었다: X (시료내 클로린 e6 농도, %) = [(D664 x 662 x Vsample)/(34230 x L x 1000 x Vtotal)] x 100. D664: 664 nm에서의 클로린 e6 용액의 흡광도; 662: 클로린 e6 트리소듐 염의 몰 중량 g/mol; 34230: 664 nm에서의 클로린 e6 용액의 몰 익스팅크션 비율; l/mol x cm-1; L: 플라스크 코팅 두께, cm; 1000: L를 ml로 전환하는 인자; Vtotal: 흡광측정 시료의 총 부피, ml; Vsample: 시료에 첨가되는 혈청 분획의 부피, ml.
실험 결과는 표 16-17 및 도 3-4에 정리되어 있다.
래트 혈청에서의 클로린 농도의 동력학
지표 채혈 시간, hours
0 hour 0.5 hour 1 hour 2 hours 3 hours 5 hours
클로린 농도, % 0 0 0.0002 0.0011 0.0012 0.0017
0 0 0 0.0009 0.0026 0.0009
평균값 0 0 0.0001 0.001 0.0019 0.0013
래트 혈청에서의 형광 세기의 동력학
지표 채혈 시간, hours
0 hour 0.5 hour 1 hour 2 hours 3 hours 5 hours
D (형광 세기), c.u.. 0 110 350 820 1300 1600
0 90 300 400 1390 1000
평균값 0 100 325 610 1345 1300
표 16-17 및 도 3-4에서 확인할 수 있듯이, 래트에 경구 투여된 클로린 e6는 위장관을 통하여 흡수된다는 것을 알 수 있다. 투여 후 1시간째에 스펙트로포토미터로 클로린 e6가 검출되었고, 혈액 내 클로린 e6의 농도는 3시간째에 최대 값을 나타내었다. 래트의 혈청에서 최대 클로린 e6의 농도는 0.0019% (19 ㎍/ml)이었다.
실시예 9: 본 발명의 조성물의 동물개체 수준에서의 항종양 효과
Waker 256 암육종세포(carcinosarcoma)가 이식된 체중 190-210 g의 위스타 래트 12 마리에 상기 표 1의 본 발명의 조성물을 프로브를 이용하여 500 mg/kg의 투여량으로 경구투여 하였다. 본 발명의 조성물은 종양 이식 한달 전부터 실험동안 계속적으로 래트에게 투여하였다. 종양크기를 측정하였고, 종양용적은 Schrek식에 따라 계산하였다: V (종양 용적, ㎤) = (a x b x c)π/6. a,b,c: 선형적 종양크기, cm.
상기 종양용적으로부터 종양 성장 억제율을 계산하였다: [(Vav (대조군) - Vav ( 실험군 ))/Vav(대조군)] x 100.
실험결과는 표 18-21 및 도 5에 정리되어 있다.
대조군에서의 W-256 성장의 변화
## 종양이식후 일수
5 7 10 12 14 17
1. 0.628 2.176 11.422 11.316 사망 -
2. 1.105 3.515 10.878 14.359 14.528 사망
3. 0.151 1.958 7.908 14.359 14.958 사망
4. 0.904 2.937 6.026 9.351 사망 -
5. 0.941 1.933 10.845 16.167 25.836 26.600
6. 0.586 3.046 6.766 13.472 18.828 24.504
7. 0.658 3.059 7.046 12.635 18.243 26.678
8. 0.785 2.938 6.394 10.957 16.484 23.566
9. 0.836 2.452 6.822 11.864 19.142 21.467
x± 0.733 2.688 8.234 12.720 18.28 22.554
Sx 0.091 0.186 0.726 0.697 3.144 4.852
500 mg/kg의 투여를 받은 실험군에서의 W-256 성장의 변화
종양이식후 일수
## 5 7 10 12 14 17
1. 0.050 0.050 0.188 0.803 1.172 1.172
2. 0.105 0.351 4.452 5.858 7.088 4.393
3. 0.402 0.669 3.515 6.627 6.543 8.432
4. 0.075 1.757 3.766 5.799 6.440 9.356
5. 0.113 0.151 0.469 0.586 0.753 10.243
6. 0.602 1.632 5.858 4.356 7.456 8.765
7. 0.264 0.452 2.343 5.648 8.284 9.414
8. 0.226 0.837 6.025 7.029 12.552 5.879
x± 0.230 0.737 3.327 4.588 6.286 7.206
Sx 0.067 0.228 0.781 2.527 3.089 3.133
투여 후 W-256 종양 조직을 갖는 래트의 수명
## 대조군 500 mg/kg 투여군
1. 14 21
2. 15 23
3. 16 26
4. 14 28
5. 18 39
6. 18 회복
7. 19 회복
8. 20 38
9. 21 36
x± 17.22 30.14
Sx 2.587 7.425
투여된 래트에서의 W-256 성장 억제율(대조군과 비교, 용적으로 표시됨)
투여량 W-256 성장 억제 비율
5일째 7일째 10일째 12일째 14일째 17일째
500 mg/kg 69 73 61 64 64 63
표 18-19 및 도 6은 본 발명의 조성물에 의하여 종양이 크게 감소되는 것을 보여준다. 표 20은 본 발명의 조성물에 의해 종양 이식된 래트의 수명이 상당히 연장됨을 보여주고 있다. 더욱이 회복(종양 이식후 120일 경과한 시점에서 종양의 완전한 제거)되는 래트가 2마리 관찰되었다. 한편, 대조군에서는 실험기간 동안 사망하는 동물의 비율이 50% 가까지 되었다.
표 21은 본 발명의 조성물에 의해 종양성장이 억제되는 비율이 60-70% 정도 됨을 보여주고 있으며, 이 결과에 따르면 본 발명의 조성물은 경구 투여되었음에도 불구하고 매우 우수한 항종양 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예 10: 본 발명의 조성물이 면역독성 분석
클로린 e6 및 본 발명의 조성물이 면역독성을 나타내는 지 여부를 조사하였다. 19-20 g의 마우스를 이용하였고, 각 실험군 당 7 마리의 마우스를 이용하였다. 시료는 10일 동안 마우스에 투여하였고, 클로린 e6 및 조성물 모두 170 mg/kg의 투여량으로 하루에 한번씩 투여하였다. 실험 3일째에 마우스를 ram 적혈구(NaCl의 등장액 0.1 ml 내의 1 x 107 적혈구)로 면역화 하였다. 실험 8일째에, 지연형 고민감화(delayed-type hypersensitivity: DTH)를 유도하였다. 실험 11일째에 분석을 위하여 동물들을 취하였다.
투여에 따른 말초혈액에서의 백혈구 양 및 조성의 변화(평균± 표준 편차)
## 지표 마우스의 그룹
대조군 본 발명 조성물 투여군 클로린 투여군
1 백혈구 수, × 109/1 6.7±2.8 6.7±2.4 4.8±1.7
2 stab 뉴트로필, % 7.9±2.5 5.1±1.2 4.6±2.4
3 Segmental 뉴트로필, % 44.7±9.2 34.6±9.8^ 35.1±12.4^
4 에오시노필, % 0.57±0.98 2.6±5.6 1.7±2.2
5 단핵구, % 10.7±4.8 8.0±4.0 10.6±3.4
6 림프구, % 36.1±8.4 49.7±7.90* 46.6±8.3*
* 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이 있음, 스튜던트 기준, p < 0.05
^ 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이 있음, 피셔 기준, p < 0.05
대식세포에 대한 영향(평균 ± 표준 편차)
## 지표 마우스의 그룹
대조군 본 발명 조성물 투여군 클로린 투여군
1 FP, % 13.6±3.9 17.4±8.8 14.3±5.6
2 FC 1.9±0.25 1.8±0.55 2.01±0.24
3 NCT＋ -cells, % 3.4±2.2 7.6±3.7* 9.6±4.99*
4 SCK 0.044±0.03 0.1±0.06* 0.12±0.07*
* 대조군과 비교하여 유의성 있는 차이 있음, p < 0.05
보체 시스템에 대한 영향(평균± 표준 편차)
## Groups of animals 보체 시스템 활성
AP50, condit. units CH50, condit. units
1 대조군 6.1±2.5 37.3±12.3
2 본 발명 조성물 투여군 5.8±3.1 36.3±9.7
3 클로린 투여군 6.1±1.3 37.3±10.4
상기 표에서 볼 수 있듯이, 말초혈액의 백혈구, 뉴트로필, 에오시노필, 단핵구 및 림프구의 수는 대조군과 비교하여, 본 발명의 조성물 및 클로린 e6 투여군에서 크게 차이가 없었다. 그러나, 에오시노필 및 림프구는 본 발명의 조성물 및 클로린 e6 투여군에서 대조군보다 그 수가 증가하였고, 뉴트로필은 감소하는 경향을 나타내었다. 또한, 보체(complement) 시스템에서도 차이가 거의 없었다.
그러나, 대식세포의 경우에는, 본 발명의 조성물 및 클로린 e6 투여군에서 활성이 더 큰 것으로 조사되었다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 조성물 및 클로린 e6는 박테리아에 대한 면역성(저항성)을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.
한편, ram 적혈구를 주입하여 면역반응을 유도한 항원-특이 면역 시스템에 대한 영향을 분석한 결과는 표 25-27에 정리되어 있다.
ram 적혈구에 의한 면역화 과정에서의 체중, 비장 무게 및 비장 지표에 대한 영향(평균 ± 표준 편차)
## 지표 마우스 그룹
대조군 본 발명 조성물 투여군 클로린 투여군
1 체중, g 21.04±1.6 21.07±1.5 20.9±3.2
2 비장 무게, g 0.3±0.12 0.2±0.06 0.19±0.07
3 비장 지표, % 1.45±0.6 0.97±0.27 0.94±0.34
ram 적혈구에 의한 면역화 과정에서의 체액성 면역 반응에 대한 영향(평균 ± 표준 편차)
## 동물군 항원제시세포 수 (per 105 비장세포) 헴아글루티닌 양(log2)
1 대조군 237.1±92.4 4.7±0.76
2 본 발명 조성물 투여군 267.0±166.7 4.3±1.4
3 클로린 투여군 241.0±111.7 4.1±1.7
ram 적혈구에 의한 면역화 과정에서의 세포 면역 반응((DTH 지표, %)에 대한 영향(평균 ± 표준 편차)
## 동물군 DTH 지표, % DTH에 의해 반응하지 않는 마우스의 수 (abs. - % for group)
1 대조군 9.1±3.3 0
2 본 발명 조성물 투여군 6.4±5.0 2 - 28.6%
3 클로린 투여군 6.7±5.7 2 - 28.6%
상기 표의 결과로부터 알 수 있듯이, 항원-특이 면역 시스템에 대해서도 대조군 및 투여군에서 크게 차이는 없었다. 그러나, 투여군에서 비장 인덱스 및 DTH 인덱스가 감소하는 경향이 나타났다.
면역 독성 실험 결과를 종합하면, 본 발명의 조성물 및 클로린 e6는 기본적으로 면역독성을 나타내지 않으며, 오히려 세포성 면역계를 강화시키는 작용을 하고, 체액성 면역계에는 큰 영향을 미치지 않는다.
위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 클로린 화합물을 유효성분으로 포함하는 경구투여용 항종양 조성물을 제공한다. 본 발명은 광 민감성 물질로서 종래에 암에 대한 광역학 치료제로 이용되고 있는 클로린 화합물의 새로운 용도 및 사용법을 제시한다. 즉, 본 발명에 따르면 클로린 화합물을 경구 투여하여 광의 조사 없이도 항종양 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구 투여 되어 위장관에서 잘 흡수가 이루어지며, 우수한 항종양 효과를 나타내며, 세포 독성 및 면역 독성이 없는 생체에 매우 안전한 조성물이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 다음 화학식 2로 표시되는 클로린(chlorin) e6(13-카르복시-17-[2-카르복시에틸]-15-카르복시메틸-17,18-트란스-디하이드로-3-비닐-8-에틸-2,7,12,18-테트라메틸포르피린) 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하며, 상기 클로린 e6 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 항종양 활성을 위하여 광을 요구하지 않는 것을 특징으로 하는 경구투여용 항종양 조성물.
    화학식 2
    Figure 112008006583688-pat00014
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항종양 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 경구투여용 항종양 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 항종양 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 경구투여용 항종양 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 클로린 e6는 클로렐라로부터 얻은 클로로필 a를 화학적으로 변형시켜 제조된 것을 특징으로 하는 경구투여용 항종양 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 베타-시토스테롤, 글리시리신산, 렌티난, 레이쉬딘, 레티포린, 아카세틴, 아연, 셀레늄 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 성분을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 경구투여용 항종양 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 베타-시토스테롤은 쇄기풀, 글리시리신산은 감초, 렌티난은 표고버섯, 레이쉬딘은 영지버섯, 레티포린 라티포러스 설퍼러스(Latiporus sulphereus), 아카세틴은 배초향, 그리고 아미노산은 효모로부터 유래된 것을 특징으로 하는 경구투여용 항종양 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 대식세포(macrophage)의 활성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 경구투여용 항종양 조성물.
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