KR100797534B1 - 식물세포배양배지에 혼합당 처리를 통한 이차 대사산물의대량 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물세포배양에 의한 이차대사산물을 고수율로 생산하는 방법 및 이차대사산물 생산용 배지에 관한 것으로서, 구체적으로 식물 세포를 배양할 때 배양 배지에 당의 혼합처리를 통해 식물세포의 이차대사산물 생산성을 향상시키는 것을 특징으로 하는 이차대사산물의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명은 식물세포배양에 포도당과 과당을 혼합 처리함으로써 이차대사산물의 생산성을 향상시키고 배양기간을 단축시키는 방법을 확립하여 식물세포배양을 이용한 이차대사산물 생산의 산업화에 크게 기여할 수 있다.

식물세포, 이차대사산물, 당

Description

식물세포배양배지에 혼합당 처리를 통한 이차 대사산물의 대량 생산방법{MASS PRODUCTION OF SECONDARY METABOLITE IN PLANT CELL CULTURE BY TREATMENT OF SACCHARIDE MIXTURE IN MEDICUM}

도 1a는 실시예 1에 따라, 자당, 과당, 엿당, 또는 포도당을 첨가하여 택서스 취넨시스(Taxus chinensis) 세포주 SYG-1를 배양한 뒤, 세포건조중량의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 1b는 실시예 1에 따라, 자당, 과당, 엿당, 또는 포도당을 첨가하여 택서스 취넨시스 SYG-1를 배양한 뒤, 파클리탁셀의 생산 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 2a는 본 발명의 실시예 2에 따라, 포도당과 과당을 혼합 처리하여 택서스 취넨시스 SYG-1를 배양한 뒤, 세포건조중량의 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 2b는 본 발명의 실시예 2에 따라, 포도당과 과당을 혼합 처리하여 택서스 취넨시스 SYG-1를 배양한 뒤, 파클리탁셀의 생산 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 실시예 3에 따라, 배양 진행 중에 탄소원으로서 단일 당을 추가로 첨가하여, 파클리탁셀의 생산 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 실시예 4에 따라, 배양 진행 중에 탄소원으로서 상이한 당을 혼합처리하여 추가로 첨가하여 택서스 취넨시스 SYG-1를 배양한 경우의 파클리탁셀의 생산 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명의 실시예 5에 따라, 식물세포 생장시와 이차대사산물 생산시에 탄소원으로서 상이한 당을 혼합처리하여 택서스 취넨시스 SYG-1를 배양한 경우의 파클리탁셀의 생산 양상을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 식물세포배양에서 이차대사산물을 대량 생산하는 방법 및 이에 사용되는 배지에 관한 것으로서, 구체적으로 식물 세포를 배양할 때 배양 배지에 2종 이상의 당류를 혼합 처리함으로써 식물세포의 성장을 촉진하고 이차대사산물의 생산성을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 식물세포배양을 이용한 이차대사산물의 제조 방법에 관한 것이다.

식물은 의약품, 농약, 향신료, 색소, 식품 첨가물, 화장품 등으로 사용되는 폭 넓은 이차대사산물을 생산하는 유용한 자원이다. 그러나 다양한 산업 분야에서 이차대사산물에 대한 수요가 증가하는 추세인 반면 식물로부터의 직접적인 생산을 통한 공급은 제한이 있기 때문에 이러한 식물 기원 이차대사산물을 식물세포배양 기술을 이용하여 산업적으로 대량 생산하려고 하는 시도가 있어 왔다 (Stockigt 등의 문헌 [Plant Cell Tissue Org. Cult. 43: 914-920, 1995] 참조).

식물세포배양을 통한 이차대사산물의 대량생산은 배양 세포주의 불안정성, 낮은 생산성, 느린 성장과 대량 배양(scale-up)의 문제 등으로 인하여 여전히 어려움을 겪고 있다. 식물세포배양의 낮은 생산성을 극복하기 위하여 여러 가지 노력이 시도된 바 있으며, 이러한 시도에는 1) 당, 질산염, 인산염, 성장조절제, 전구체의 첨가 등과 같은 배양 배지의 영양 물질 조작; 2) 배양 온도, 조명, 배지의 pH, 진탕 및 통기 조건 등과 같은 배양 환경의 최적화; 3) 생산성을 증가시키기 위한 유도제(elicitor)의 처리; 4) 이차대사산물의 효과적인 회수를 위한 세포막의 투과성화(permeabilization)와 이원상 배양 (two-phase culture); 5) 이차대사산물의 생합성에 관여하는 유전자를 변형하거나 외래 유전자를 도입하여 이차대사산물의 생산성을 증가시키는 대사공학 등의 방법이 있다.

그러나 이러한 시도들은 특정 식물세포 혹은 특정 이차대사산물에만 한정되어 긍정적인 결과를 얻었으며, 대다수의 식물세포배양과 이차대사산물에 일반적으로 적용될 수 있는 방법은 아직 확립되지 않았다.

식물세포를 기내 배양하기 위해서는 식물세포의 성장에 필수적인 각종 영양물질을 포함하는 영양배지에서 배양하게 된다. 이때 영양배지의 성분인 당, 질산염, 인산염, 성장조절제 등의 조성 조절 및 이차대사산물 생산에 필요한 전구체의 첨가 등과 같은 배양 배지의 영양 물질 조작을 통하여 식물세포배양의 이차대사산물 생산성을 향상시킬 수 있다.

일반적으로 식물 조직 및 세포 배양에는 탄소원의 공급이 필요하며, 조직배양에서 가장 흔히 사용되는 탄소원은 자당과 포도당이다. 또한 과당, 젖당 엿당, 갈 락토오스 및 전분도 이용되고 있지만, 장미과(Rosaceae)의 어떤 식물과 사과나무 조직배양에는 솔비톨이 좋고, 사과대목인 M9과 Dedrobium에는 과당, 그리고 밀의 약배양에는 포도당이 좋은 것으로 보고 되어 있다. 자당의 일반적인 농도는 2~3%지만, 경우에 따라서는 5~12%의 농도를 사용하기도 한다. 단자엽식물을 배양할 경우에는 포도당이 많이 이용된다 (식물조직배양기술, 향문사, 1987).

그러나 식물의 종, 혹은 배양된 조직 또는 세포의 종류에 따라 선호하는 탄소원의 종류가 다르며, 특히 이차대사산물 생산을 위한 식물세포 배양의 경우에는 공급되는 탄소원에 따라 세포의 성장 및 이차대사산물의 생산에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 식물 기원 이차대사산물을 식물세포배양 기술을 이용하여 산업적으로 대량 생산하려고 하는 시도가 있어왔으나, 식물 조직 및 식물세포배양기술의 산업화를 위해 대다수의 식물세포배양과 이차대사산물에 일반적으로 적용될 수 있는 대량생산 방법 중 배양시 혼합 탄소원의 처리에 의한 대량 생산 방법에 대한 상세한 보고는 없는 실정이다.

본 발명의 목적은 2종 이상의 당류를 첨가하여 식물세포를 배양함으로써 이차대사산물의 생산량을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 2종 이상의 당류를 포함하는 식물세포의 성장배지 및 이차대사산물 생산용 생산배지를 제공하는 것이다.

본 발명은 단당류, 이당류, 다당류 및 당 알코올로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당류가 탄소원으로 첨가된 식물세포 배양용 배지에 식물세포를 배양하여 상기 식물세포가 생산하는 이차대사산물의 생산량을 증가시키는 단계를 포함하는, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단당류, 이당류, 다당류 및 당 알코올로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당류를 탄소원으로 포함하는, 식물 세포의 생장 배지 및 식물세포에 의한 이차산물 생산용 배지에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명자들은 다양한 식물세포배양에서 일반적으로 적용될 수 있는 효율적인 이차대사산물의 생산성 향상 방법을 제공하기 위하여, 2종이상의 당을 혼합하여 식물 세포배양을 실시하였다.

식물체가 일반적으로 세포의 성장과 무관하게 이차대사산물을 생산하지만, 식물세포 배양의 경우는 세포의 성장에 의존적 또는 무관하게 이차대사산물을 생산한다. 하지만 세포의 성장과 무관하게 이차대사산물을 생산하더라도 세포의 성장이 물질 대사에 영향을 줄 수 있다는 점에 기초하여, 배양 배지의 탄소원을 2종 이상의 당을 혼합하여 첨가하여 식물세포를 배양하였다. 그 결과, 식물세포의 성장이 촉진되고, 이차대사산물의 생산량이 증대됨을 발견하였다. 또한 식물세포배양에 탄소원으로 2종 이상의 당을 혼합하여 첨가하는 경우, 탄소원으로 자당만을 첨가하는 경우보다 배양기간이 단축되는 효과를 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 세포 생장 및 생산에 최적인 2종 이상의 탄소원의 선정 및 그 비율을 규명하고자 하였다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 2종 이상의 탄소원의 조합 및 그에 따른 비율을 조절함으로써 이차대사산물의 생산성을 증대하였다.

따라서, 본 발명은 탄소원으로 2 종 이상의 당류가 혼합된 혼합당이 첨가된 배지를 사용하여 식물세포배양을 수행함으로써, 식물세포의 이차대사산물 생산량을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 이차대사산물의 대량 생산 방법에 있어서, 상기 탄소원으로 첨가된 혼합당은 단당류, 이당류, 다당류 및 당 알코올류로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 당류가 혼합된 혼합당일 수 있다. 상기 사용 가능한 당류의 예를 하기 표 1에 나타내었으며, 이는 예시를 위한 것으로, 본 발명에서 사용 가능한 당류의 종류가 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 일 예에 있어서, 상기 혼합당으로 포도당 및 과당, 또는 자당 및 과당의 혼합당을 사용할 수 있다. 상기 포도당과 과당의 혼합비는 1:5 내지 5:1 중량비, 더욱 바람직하게는 1:2 내지 1:1 중량비로 사용될 수 있다. 포도당에 비해 과당이 지나치게 많을 경우에는 세포성장이 매우 빠르고 이차대사산물의 생산성도 빠르게 증가하지만, 이차대사산물의 생산성이 증가하기도 전에 과도한 성장으로 인해 세포가 괴사하는 현상을 나타내는 문제점이 있다.

본 발명의 한 구체예에 있어서, 택서스 취넨시스(Taxus chinensis) 세포 배양을 이용하여 파클리탁셀 및 택센 화합물을 생산하는 경우, 탄소원으로서 포도당과 과당의 혼합당을 사용할 수 있으며, 이 때, 포도당과 과당의 혼합비율(포도당:과당)은 1:5 내지 5:1 중량비, 바람직하게는 1:2 내지 1:1 중량비이고, 가장 바람직하게는 1:2의 비율인 것이 좋다.

본 발명의 또 다른 일 예에 있어서, 상기 포도당과 과당의 혼합당 처리시에, 상기 포도당을 포도당과 과당이 세포 배양액 내에서 1:1로 분해되어 존재할 수 있는 자당으로 대체하여, 자당과 과당의 혼합당을 처리하는 것이 가능하다. 이 경우, 자당과 과당의 혼합비율은 자당이 분해되어 포도당과 과당이 생성되는 비율을 고려하여, 상기 포도당과 과당의 혼합당 내의 두 당의 혼합비율 범위를 기준으로 적합하게 설정할 수 있다. 예컨대, 자당과 과당의 혼합비율(자당:과당)은 1:4 내지 4:1 중량비, 바람직하게는 1:2에서 2:1 중량비, 가장 바람직하게는 2:1일 수 있다.

본 발명자들은, 식물세포 배양용 배지에서 탄소원으로 자당(sucrose)을 사용하는 경우, 자당이 포도당과 과당으로 분해되었을 때, 포도당이 소모된 후 과당을 소모하는 시기에 이차대사산물의 생산성이 정체되는 현상을 발견하였다. 또한 배양 배지의 탄소원으로 자당이 아닌 포도당 또는 과당 등의 단당류를 한 가지 종류만 사용하는 경우에는 배양 중반에 일어나는 이차대사산물의 생산성 정체 현상은 나타나지 않지만, 자당을 사용하는 것에 비하여 이차대사산물의 생산성이 낮아지는 문제점이 있는 것으로 나타났다. 따라서 배양 배지에 자당의 분해 산물인 포도당 및/또는 과당을 일정 비율로 혼합하여 첨가하면, 당이 전환되는 시기의 변화를 줄 수 있을 것이며, 이러한 변화가 이차대사산물 생산성에도 영향을 미치게 된다.

본 발명은 이러한 인식에 기초한 것으로, 탄소원으로서 자당을 단독으로 첨가하는 대신, 혼합당 형태, 예컨대 포도당과 과당, 또는 과당과 자당의 혼합당을 첨가하고, 이 들의 혼합비율을 변화시키면서 이차대사산물 생산을 위한 최적 비율을 선발함으로써, 식물세포배양을 통하여 이차대사산물을 대량 생산할 수 있다.

식물로부터 생산할 수 있는 이차대사산물의 종류는 매우 광범위하며, 각 식물 종과 이로부터 생산되는 이차대사산물의 특성에 따라, 그 생산에 적용되는 기술은 매우 다양하다. 본 발명의 식물세포배양에서 이차대사산물을 대량으로 생산하는 방법은 이차대사산물을 생산하는 모든 식물세포에 적용할 수 있다. 바람직하게는 일반적으로 낮은 이차대사산물의 생산성을 보이는 여러 식물세포, 특히, 치료저항성 난소암 및 유방암의 치료에 유효한 것으로 입증된 파클리탁셀의 생산에 이용되는 주목(Taxus spe cies)세포 등에 적용함으로써, 이차대사산물의 생산성을 크게 향상시킬 수 있으며, 파클리탁셀의 산업적 생산에 이를 이용할 수 있다. 따라서, 한 구체예에 있어서, 본 발명의 식물세포배양에서 이차대사산물을 대량으로 생산하는 방법은 주목 속에 속하는 다양한 종의 주목 세포에 적용되어 이들의 이차대사산물의 생산성을 크게 향상시킬 수 있다.

본 발명에 의하여 생산되는 이차대사산물을 특별히 제한되지 않지만, 상기 식물세포가 생산하는 이차대사산물일 수 있으며, 예를 들면, 파클리탁셀, 택센 화합물일 수 있다. 상기 파클리탁셀, 및 택센화합물은 택서스속 식물에서 유래된 세포에서 생산할 수 있다.

본 발명의 식물세포 배양방법 및 배양용 배지에 적용가능한 식물세포는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 상기 식물세포는 택서스 바카타 (Taxus bacata), 택서스 브레비폴리아 (Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스 (Taxus canadensis), 택서스 취넨시스 (Taxus chinensis), 택서스 쿠스피다타 (Taxus cuspidata), 택서스 플로리다나 (Taxus floridana), 택서스 글로보사 (Taxus globosa), 택서스 메디아(Taxus media), 택서스 월리치아나 (Taxus wallichiana), 및 택서스 유나넨시스 (Taxus yunnanensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물로부터 유래된 식물세포일 수 있다.

본 발명에 있어서, 식물세포배양은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 모든 식물세포배양용 배지를 사용 할 수 있으며, 이들에 포함된 탄소원을 상기와 같은 혼합당으로 대체하여 본 발명에 사용할 수 있다. 상기 식물세포배양용 배양 배지는 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 영양분 및 식물세포의 생육력을 유지하는데 필요한 그 밖의 인자, 즉, 탄소원, 질소원, 염 및 비타민 등을 함유하는 것일 수 있다. 본 발명의 식물세포배양용으로 사용 가능한 배지로서, 앤더슨 로도덴드론 배지(Anderson rhododendron medium), 씨에이치유 배지(CHU(N6) medium), 씨엘씨 이포모에 배지(CLC/Ipomoea medium), 체-풀 비티스 배지(Chee & Pool (C2D) vitis medium), 데 그리프-야곱 배지(De greef & jacobs medium), 디케이더블유-정글란 배지(DKW/JUNGLANS medium), 에릭슨 배지(Eriksson(er) medium), 갬보그 배지(Gamborg B5 medium), 그리숍-도이 배지(Gresshof & doy (DBM2) medium), 헬러 배지(Hellers medium), 카오 미카이룩(kao michayluk medium), 운드슨 코키드 배지(knudson corchid medium), 린더만 오키드 배지(Lindemann Orchid medium), 리트베이 배지(Litvay medium), 린스마이어-스쿡 배지(Linsmaier & Skoog medium), 맥카운 우디플랜트 배지(McCowns woody plant medium), 무라시케-스쿡 배지(Murashige & Skoog medium), 무라시케- 밀러 배지(murashige & Miller medium), 니취 배지(nitsch medium), 엔엘엔 배지(NLN medium), 오키맥스 배지(orchimax medium), quoirin & Lepoivre medium, rugini olive medium, schenk & hildebrandt medium, 에스 배지(S-Medium), 베이신-웬트 배지(vacin and went medium), 화이트 배지(white medium) 또는 웨스트바코 배지(westvaco WV3 medium) 또는 이를 변형한 배지 등을 제한 없이 사용할 수 있으며, 필요에 따라 각종 첨가제를 가하거나, 성분 중 일부를 제거하여 사용할 수 있다. 본 명세서에 있어서, '통상의 식물세포배양용 배지'는 상기에 열거된 배지를 포함하는 것으로 사용된다.

본 발명의 바람직한 일 예에 있어서, 상기 식물세포배양용 배지로서 변형된 갬보그 B5 배지[참조: Gamborg et al., Can. J. Biochem., 46:417-421(1968), 본 명세서에 참조로서 포함됨]를 사용할 수 있으며, 이차대사산물을 생산을 위해서는 표 2에 기재된 바와 같은 변형된 갬보그 B5 배지가 바람직하다.

본 발명의 구체예에서는 상기 표 2의 배지를 기본 배지로 사용하였으며, 자당으로 되어 있는 탄소원을 본 발명의 혼합당으로 대체하여 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 혼합당은 통상의 식물세포 배양용 배지에 포함된 탄소원의 함량과 실질적으로 동일한 함량으로 사용될 수 있으며, 기존 배양 배지의 탄소원 농도와 동일하게 배양 배지내 혼합당의 함량이 2-12 %(w/v), 바람직한 4-8%(w/v)의 농도로 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 6 %(w/v)다. 이하, 본 명세서에서 사용된 '%'는 별도의 언급이 없는 한 '%(w/v)'을 의미하는 것으로 한다.

I) 본 발명의 한 측면에 있어서, 식물세포배양은 통상적으로 사용되는 식물세포배양용 배지의 탄소원을 상기한 바와 같은 혼합당으로 대체한 변형 배지를 배양 개시시부터 사용하여 수행하는 것일 수 있다.

II) 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 식물세포배양은 통상적으로 사용되는 식물세포배양용 배지의 탄소원을 상기한 바와 같은 혼합당으로 대체한 변형 배지를 배양 개시시부터 사용하고, 상기 탄소원의 고갈 시점에 탄소원으로서 상기 표 1에 기재된 당류 중 1 가지 이상을 추가로 첨가하여 배양을 속행하는 것일 수 있다.

III) 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 식물세포배양은 배양 개시시에는 통상적으로 사용되는 식물세포배양용 배지를 사용하여 식물세포를 생장시키고, 상기 배지 내의 탄소원의 고갈 시점에 탄소원으로서 표 1에 기재된 당류 중 2 가지 이상의 혼합당을 추가로 첨가하여 배양을 속행하는 것일 수 있다.

IV) 본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 식물 세포의 배양시에, 식물세포 생장기, 또는 이차대사산물 생산기, 또는 식물세포 생장기와 이차대사산물 생산기 모두에 상기 혼합당을 첨가하여 식물세포 배양을 수행하는 것일 수 있다. 이 때, 식물 세포의 생장기와 이차대사산물의 생산기에 사용되는 배지의 종류는 서로 동일하거나 상이한 것일 수 있으며, 이들 배지 중 하나 이상이 탄소원으로 상기 혼합당을 포함하도록 변형된 것일 수 있다.

상기한 바와 같이, 이차대사산물의 생산을 촉진하기 위하여 배양 중간에 탄소원을 첨가하는 경우 (상기 방법 II 또는 III), 탄소원의 추가적 첨가시기는 초기 배지 내의 탄소원의 고갈 시기로서 사용되는 배지 종류와 배양되는 식물세포 종류에 따라서 달라지며, 보통 배양 중 배지 내 당의 농도가 2% 이하로 되고 완전히 고갈되기 전에 탄소원을 첨가한다. 첨가되는 탄소원의 양은 첨가 후의 배지 내 당 농도가 6 % 이하, 바람직하게는 5 % 이하, 가장 바람직하게는 당 첨가 후 최종농도가 4 % 이하가 되도록 첨가할 수 있다. 예컨대, 탄소원의 추가적 첨가시기는 배양 개시 후 7일 이후일 수 있으며, 바람직하게는 배양 개시 후 14일 이후일 수 있다. 또한 첨가하는 당의 농도는 0.1% 내지 6%, 바람직하게는 1% 내지 6%의 농도로 처리할 수 있다. 이 때, 첨가하는 탄소원은 표 1에 기재되어있는 당에서 선택된 1종 또는 2 종 이상의 혼합당으로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있다.

상기 추가로 첨가되는 탄소원으로서 자당 단독, 과당 단독, 포도당과 과당의 혼합당, 또는 자당과 과당의 혼합당을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 혼합당을 사용하는 경우에 혼합당 조성 및 혼합당의 함량은 상기한 바와 같이 하는 것이 좋다. 배양 개시시에도 혼합당이 첨가된 배지를 사용하고, 추가되는 탄소원도 혼합당인 경우, 상기 두 가지 혼합당은 서로 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 또한, 파클리탁셀의 생산에 적용되는 경우, 상기 추가로 첨가되는 혼합당 내의 과당의 함량이 높을수록 파클리탁셀의 생산량이 증가하는 것으로 실험적으로 나타났다. 따라서, 파클리탁셀의 생산에 적용하는 경우, 배양 진행중에 추가되는 탄소원으로서 과당을 단독으로 사용하거나 과당의 함량이 50% 이상인 포도당과 과당의 혼합당 또는 자당과 과당의 혼합당을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서, 식물세포의 배양 방법은 당업계에 널리 공지된 적절한 식물세포의 배양 방법이 모두 사용될 수 있다. 예를 들면, 회분식 배양 (batch culture), 연속식 배양 (continuous culture), 유가식 배양 (fed-batch culture), 반연속식 회분 배양 (semi-continuous batch process), 고정화 배양 (immobilized culture), 이원상 배양 (two-phase culture), 이단계 배양(two stage culture) 등의 배양 방법으로 식물세포를 배양할 수 있으며, 상기 배양 방법의 수행시, 배양 배지에 2 종 이상의 당류가 혼합된 혼합당을 탄소원으로 제공함으로써 이차대사산물의 대량 생산을 실현할 수 있다. 배양될 식물세포의 특성과 이차대사산물의 특성에 따라 적절한 배양 방법을 선택하여 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 식물세포 배양조건은 혼합당을 첨가하는 것을 제외하고는 통상의 식물세포 배양조건을 모두 적용가능하며, 특정 종류의 식물세포에 적합하다고 알려진 배양조건을 본 발명에도 적용가능하며 배양대상 식물세포의 특성을 고려하여 구체적으로 설정된 배양조건을 적용할 수도 있다.

본 발명의 구체적인 일 예에서, 상기 배양되는 식물세포가 택서스속 식물세포인 경우, 상기 식물세포 배양 단계는

(i) 택서스(Taxus)속 식물세포를 본 발명에 따른 혼합당을 첨가한 배지에 접종한 배양액을 20℃ 내지 25℃에서 배양하고,

(ii) 세포의 생육이 진행되었을 때, 배양온도를 26℃ 내지 32℃로 변화시켜 배양을 계속하는 것일 수 있다.

이와 같은 배양조건은 대한민국 특허 제0266448호(본 명세서에 참조로서 포함됨)에 상세히 기재되어 있다. 상기 온도 변화 시점은 세포 생장이 어느 정도 진행되고, 이차대사산물의 생산이 시작되는 시점으로, 일반적으로 식물세포 생육단계에서의 증식기 또는 대수기에 해당되며, 식물세포 종류, 생산되는 이차대사산물 종류 또는 배양온도, 배지조성 등의 배양조건에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 구체예에 있어서, 온도 변화 시점은 배양 개시 후 10일 이후, 바람직하게는 14일 이후 28일 이내일 수 있다. 상기와 같이, 식물세포 배양시, 상대적으로 낮은 온도에서 세포 생육을 어느 정도 또는 충분히 진행시킨 후, 배양 온도를 상승시키면 파클리탁셀 등의 이차대사산물의 생산량이 증대되며, 이는 이와 같이 변화된 배양온도가 파클리탁셀 등의 이차대사산물의 생합성에 관여하는 효소를 새로 생성시키는 데에 적당한 온도이거나, 또는 이미 존재하는 파클리틱셀 생합성에 관여하는 효소의 최적온도에 가까울 것이기 때문이라고 사료된다.

본 발명의 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 대량 생산 방법은 통상적인 방법으로 생산된 이차대사산물을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 방법과 같이 탄소원으로서 2종 이상의 당류가 혼합된 혼합당을 첨가하여 식물세포로부터 이차대사산물을 제조하는 경우, 자당만을 첨가하는 경우와 비교하여, 약 30% 이상, 바람직하게는 60% 이상의 이차대사산물의 생산량 증가 효과를 얻을 수 있다. 예컨대, 택서스 취넨시스 (Taxus chinensis) 세포를 배양하면서 파클리탁셀 및 택센 화합물을 생산할 경우, 파클리탁셀의 생산성은 약 2배 증가하였다.

또한, 본 발명은 탄소원으로 상기한 바와 같은 혼합당을 포함하고, 식물세포의 이차대사산물 생산성을 향상시키는, 식물세포배양용 배지를 제공한다. 상기 식물세포배양용 배지는, 통상적인 식물세포배양용 배지로서, 탄소원이 상기한 바와 같은 혼합당으로 대체된 것일 수 있다. 상기 혼합당의 조성과 각 성분의 함량, 식물세포배양용 배지의 종류, 및 적용 가능한 식물세포 종류는 상기한 바와 같다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 상세하게 설명하고자 한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 이차대사산물 생산성에 미치는 단일 탄소원의 효과

본 실시예에 있어서, 파클리탁셀 및 택산 화합물를 생산하는 택서스 취넨시스 (Taxus chinensis) SYG-1 세포주 (KCTC-0232BP)를 식물세포배양의 이차대사산물 생산에 사용하기 위한 세포주로 사용하였다.

세포의 증식을 위해 500 ㎖의 삼각플라스크에 3%의 자당을 포함하는 변형된 갬보그 B5 배지를 넣고 3g/L의 SYG-1 세포를 접종하여 24℃의 암조건에서 150 rpm으로 14일간 배양하였다.

파클리탁셀의 생산을 위해 250 ㎖의 삼각플라스크에 6%의 자당을 포함하는 변형된 갬보그 B5 배지를 넣고, 여기에 상기 14일간 배양한 SYG-1의 배양액 50 ㎖를 넣어, 24℃의 암조건에서 150 rpm으로 14일간 배양한 후, 배양 온도를 29℃로 변경하여 28일간 더 배양하였다. SYG-1의 파클리탁셀 생산성을 증가시키기 위하여 탄소원으로 상기 자당 및 다음과 같은 여러 가지 당을 사용하여 배양을 하였다.

즉, 변형된 갬보그 B5 배지에 자당, 포도당, 과당 및 엿당 중에서 선택된 한 가지 종류의 당을 배양 초기에 각각 6%를 첨가하여 세포를 배양하고, 배양 14, 21, 28, 35, 42일째에 각각 임의의 샘플을 취하여 세포의 성장 정도와 파클리탁셀의 생산량을 측정하였다.

세포의 성장정도는 세포 건조중량 (dry cell weight, DCW)의 측정을 통해 관찰하였다. 세포 건조중량은 임의로 채취된 식물세포 배양액을 흡인여과기 (Buchner funnel)을 이용하여 와트만 4번 여과지로 여과하여 얻은 세포를 60 ℃의 건조오븐에서 24시간 동안 건조하여 측정한 중량이다.

또한 파클리탁셀의 생산량은 당업계에 널리 공지된 파클리탁셀 및 택센 화합물의 정량 방법 (대한민국 특허 제 0266448호 참조, 본 명세서에 참조로서 포함됨)으로 정량하였다.

탄소원을 한 종류씩 각각 처리하여 배양한 SYG-1의 세포의 성장정도 및 파클리탁셀 생산량을 도 1a와 도 1b에 도시하였다. 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이, 자당을 처리한 처리구에 비해 포도당, 과당 또는 엿당을 처리한 처리구에서 탁솔의 생산성이 낮은 것으로 나타났다.

실시예 2: 포도당과 과당의 혼합처리에 의한 파클리탁셀의 생산성 시험

배양에 사용된 배지에 탄소원으로서 포도당과 과당을 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 SYG-1 세포를 배양하였다. 배양 후 14, 21, 28, 35, 42 일째에 각각 임의의 샘플을 취하여 세포의 성장정도와 파클리탁셀의 생산량을 상기 실시예 1의 방법에 따라 측정하였다.

상기에서 얻어진 결과를 도 2a, 2b 및 표 3에 나타내었다. 도 2a는 포도당과 과당의 비율별 혼합처리를 실시한 세포 건조중량의 변화를 도시한 것이고, 도 2b는 파클리탁셀 생산량의 변화를 도시한 것이다. 상기 도 1a에 나타난 바와 같이, 탄소원으로 2% 포도당과 4% 과당의 혼합당 또는 3% 포도당과 3% 과당의 혼합당을 처리한 군은, 세포 성장에 있어서는 자당만 6% 처리한 군과 거의 유사한 빠른 세포성장을 보이면서, 배양 35일째의 파클리탁셀의 생산량에 있어서는 자당만 6% 처리한 군과 비교하여, 각각 약 67% 및 약 33%의 생산량 증가를 나타내었다. 상기 결과를 통하여, 본 발명의 혼합당 처리에 의하여 단일 종류의 당을 사용하는 경우와 비교하여 이차대사산물의 생산성이 증가되었음을 확인할 수 있다.

한편, 1% 포도당과 5% 과당을 처리한 구에서는 세포의 성장이 매우 활발하나, 파클리탁셀의 생산성은 낮은 것으로 나타났으며, 이는 세포의 과도한 성장이 세포의 괴사로 이어진 결과로 보인다.

실시예 3: 자당과 과당의 혼합처리에 의한 파클리탁셀의 생산성 시험

배양에 사용된 배지에 탄소원으로서 포도당과 과당, 및 자당과 과당을 하기 표 4와 같이 각각 처리한 다음, 배양 개시 후 배지내 당의 함량이 2% 이하가 되는 28, 49 일째에 자당을 첨가하여 56일까지 연장 배양하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1의 방법과 동일한 방법으로 SYG-1 세포를 배양하였다. 배양 후 14, 21, 28, 35, 49, 56일째에 임의의 샘플을 취하여, 세포의 성장 정도와 파클리탁셀의 생산량을 상기 실시예 1의 방법에 따라 측정하였다.

상기한 바와 같이 측정된 세포 성장 정도 측정 척도로서의 세포 건조중량 결과를 보면, 탄소원으로 본 발명의 포도당과 과당, 또는 자당과 과당의 혼합당을 사용하는 경우, 자당만을 사용하는 경우와 유사한 성장 정도를 보이는 것으로 나타났다.

상기와 같이 측정된 파클리탁셀의 생산량 결과를 도 3 및 표 4에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, SYG-1 배양세포에 2% 포도당과 4% 과당을 처리한 구와 4% 자당과 2% 과당을 처리한 군은, 파클리탁셀의 생산성에 있어서, 6% 자당만을 처리한 군과 비교하여, 56일째에 각각 약 58% 및 약 30%의 증가를 보였다. 상기 결과를 통하여, 본 발명의 혼합당 처리에 의하여 단일 종류의 당을 사용하는 경우와 비교하여 이차대사산물의 생산성이 증가되었음을 확인할 수 있다.

실시예 4: 배양 중 당의 첨가에 따른 파클리탁셀의 생산성 시험

탄소원으로서 4% 자당과 2% 과당이 첨가된 변형된 갬보그 B5 배지를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 SYG-1 세포를 배양하다가, 배지내 당의 함량이 2% 이하가 되는 21일 및 35일째에 하기의 표 5와 같은 조성의 탄소원을 2.5%의 양으로 추가로 첨가하여 연장 배양하였다. 배양 후 14, 21, 28, 35, 49일째에 임의의 샘플을 취하여 파클리탁셀의 생산량을 상기 실시예 1의 방법에 따라 측정하였다.

상기에서 측정된 바와 같은 탄소원으로 혼합당을 첨가하여 배양 진행 중간에 추가로 다양한 탄소원의 첨가하여 배양하는 경우의 파클리탁셀의 생산량 결과를 도 4 및 표 5에 나타내었다. 그 결과, 첨가당 성분 중 과당의 비가 높을수록 파클리탁셀의 생산량 증가 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

실시예 5: 세포 생장 및 파클리탁셀 생산 시 상이한 혼합당 처리에 의한 파클리탁셀의 생산성 시험

세포의 증식을 위해 500 ㎖의 삼각플라스크에 3%의 자당 혹은 2% 자당과 1% 과당을 포함하는 변형된 갬보그 B5 배지를 넣고 3g/L의 농도가 되도록 SYG-1 세포를 접종하여 24℃의 암조건에서 150 rpm으로 14일간 배양하였다. 이렇게 14일간 배양된 세포 50 ㎖를 각각 6% 자당 혹은 4% 자당과 2% 과당이 포함된 변형된 갬보그 B5 배지에 넣고, 24℃의 암조건에서 150 rpm으로 14일간 배양한 후, 배양 온도를 29℃로 변경하여 28일간 더 배양하였다. 배양 후 14, 21, 28, 35, 42일째에 임의의 샘플을 취하여 파클리탁셀의 생산량을 상기 실시예 1의 방법에 따라 측정하였다.

그 결과, 생장 및 생산 배양 시 혼합당 처리에 의한 파클리탁셀의 생산변화를 도 5 및 표 6에 나타내었다.

도 5 및 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, SYG-1 세포의 생장시와 이차대사산물 생산시 모두 단일당인 자당을 사용하는 경우와 비교하여, 세포 생장시 및 이차대사산물 생산시 중 한 시기 이상에서 본 발명의 혼합당을 처리한 경우가 현저하게 증가된 파클리탁셀의 생산성을 보여주었다 (각각 183%, 67% 및 286%). 또한, 생장기와 생산기 모두에서 혼합당을 처리한 경우가 가장 높은 파클리탁셀의 생산성을 나타내었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 배양배지에 탄소원으로서 2종 이상의 당류가 혼합된 혼합당을 사용함으로써 일반적으로 그 생산성이 매우 낮은 것으로 알려진 식물세포배양의 이차대사산물의 생산성을 크게 향상시키며, 혼합당을 처리함으로써 이차대사산물의 최대생산성에 도달하는 기간이 짧아져 배양기간을 단축시키는 효과를 가져오므로, 파클리탁셀 등의 산업적으로 유용한 식물기원 이차대사산물의 산업적 생산에 크게 기여할 수 있다.

Claims (22)

1. 탄소원으로서 단당류 및 이당류로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당류가 혼합된 혼합당이 첨가된 식물세포배양용 배지를 사용하여 식물세포를 배양하여, 상기 식물세포에서의 이차대사산물의 생산성을 향상키는 것을 특징으로 하는, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 혼합당은 포도당, 과당, 만노오스, 리보오스, 아라비노오스, 자일로오스, 갈락토오스, 자당, 멜리비오스, 트레할로오스, 셀로비오스, 락토오스, 및 말토오스로 이루어진 군에서 2종 이상의 당류가 혼합된 것인, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 혼합당의 함량이 전체배지에 대해서 2 내지 12 %(v/w)인 것을 특징으로 하는, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 혼합당이 포도당과 과당이 1:5 내지 5:1의 중량비로 혼합되어 있는 것인, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 혼합당이 자당과 과당이 1:4 내지 4:1의 중량비로 혼 합되어 있는 것인, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 배지는 하기의 배지들로 이루어진 군 중에서 선택된 배지로부터 탄소원이 배제되고 포도당, 과당, 만노오스, 리보오스, 아라비노오스, 자일로오스, 갈락토오스, 자당, 멜리비오스, 트레할로오스, 셀로비오스, 락토오스, 및 말토오스로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 당류가 혼합된 혼합당이 전체 배지에 대하여 2 내지 12 %(v/w)의 양으로 첨가된 것인, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법:

   앤더슨 로도덴드론 배지(Anderson rhododendron medium), 씨에이치유 배지(CHU(N6) medium), 씨엘씨 이포모에 배지(CLC/Ipomoea medium), 체-풀 비티스 배지(Chee & Pool (C2D) vitis medium), 데 그리프-야곱 배지(De greef & jacobs medium), 디케이더블유-정글란 배지(DKW/JUNGLANS medium), 에릭슨 배지(Eriksson(er) medium), 갬보그 배지(Gamborg B5 medium), 그리숍-도이 배지(Gresshof & doy (DBM2) medium), 헬러 배지(Hellers medium), 카오 미카이룩(kao michayluk medium), 운드슨 코키드 배지(knudson corchid medium), 린더만 오키드 배지(Lindemann Orchid medium), 리트베이 배지(Litvay medium), 린스마이어-스쿡 배지(Linsmaier & Skoog medium), 맥카운 우디플랜트 배지(McCowns woody plant medium), 무라시케-스쿡 배지(Murashige & Skoog medium), 무라시케- 밀러 배지(murashige & Miller medium), 니취 배지(nitsch medium), 엔엘엔 배지(NLN medium), 오키맥스 배지(orchimax medium), quoirin & Lepoivre medium, rugini olive medium, schenk & hildebrandt medium, 에스 배지(S-Medium), 베이신-웬트 배지(vacin and went medium), 화이트 배지(white medium), 웨스트바코 배지(westvaco WV3 medium) 및 이들의 변형 배지.
7. 제1항에 있어서, 상기 식물세포는 택서스 바카타 (Taxus bacata), 택서스 브레비폴리아 (Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스 (Taxus canadensis), 택서스 취넨시스 (Taxus chinensis), 택서스 쿠스피다타 (Taxus cuspidata), 택서스 플로리다나 (Taxus floridana), 택서스 글로보사 (Taxus globosa), 택서스 메디아(Taxus media), 택서스 월리치아나 (Taxus wallichiana), 및 택서스 유나넨시스 (Taxus yunnanensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 유래된 것인, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 이차대사산물은 파클리탁셀 및 택센으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 화합물인, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 식물세포의 배양은 회분식 배양 (batch culture), 연속식 배양 (continuous culture), 유가식 배양 (fed-batch culture), 반연속식 회분 배양 (semi-continuous batch process), 고정화 배양 (immobilized culture), 이원상 배양 (two-phase culture), 및 이단계 배양(two stage culture)으로 이루어 진 군 중에서 선택된 식물세포배양 방법에 의하여 수행되는 것인, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 식물세포의 배양이

    (i) 식물세포를 상기 혼합당을 첨가한 배지에서 20℃ 내지 25℃의 온도조건 하에서 배양하고,

    (ii) 배양된 식물세포가 대수기에 이르렀을 때, 배양온도를 26℃ 내지 32℃로 변화시켜 배양을 계속 진행하여 수행되는 것을 특징으로 하는,

    식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄소원으로서 혼합당이 첨가된 식물세포배양용 배지를 배양 개시시부터 사용하여 식물세포 배양을 수행하는 것을 특징으로 하는, 첨가된 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄소원으로 혼합당이 첨가된 식물세포배양용 배양배지를 배양 개시시부터 사용하고, 상기 배지 내 당의 함량이 2% 이하일 때 포도당, 과당, 만노오스, 리보오스, 아라비노오스, 자일로오스, 갈락토오스, 자당, 멜리비오스, 트레할로오스, 셀로비오스, 락토오스, 및 말토오스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 당류를 배지내 당농도가 6% 이하가 되도록 추가로 첨가하여 배양을 계속 진행시키는 것을 특징으로 하는, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물세포의 배양개시시에는 탄소원으로서 상기의 혼합당 이외의 탄소원을 포함하는 식물세포배양용 배지를 사용하여 배양을 수행하고, 상기 배지 내 당 함량이 2% 이하로 된 때에 상기 혼합당을 추가로 첨가하여 배양을 계속 진행시키는 것을 특징으로 하는, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포의 배양시에, 식물세포 생장기, 또는 이차대사산물 생산기, 또는 식물세포 생장기와 이차대사산물 생산기 모두에 상기 혼합당을 첨가하여 식물세포 배양을 수행하는 것을 특징으로 하는, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 혼합당의 첨가 시기가 식물세포 생장기와 이차대사산물 생산기 모두인 경우, 상기 두 시기에 첨가되는 혼합당이 서로 상이한 것인, 식물세포배양에 의한 이차대사산물의 생산 방법.
16. 탄소원으로서 자당과 과당이 1:4 내지 4:1 중량비로 혼합된 혼합당 또는 포도당과 과당이 1:5 내지 5:1 중량비로 혼합된 혼합당을 전체 배지에 대하여 2 내지 12 %(v/w)의 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물세포에 의한 이차대사산물 생산용 배지.
17. 삭제
18. 제16항에 있어서, 상기 배지는 하기의 배지들로 이루어진 군 중에서 선택된 배지로부터 탄소원이 배제되고 자당과 과당이 1:4 내지 4:1 중량비로 혼합된 혼합당 또는 포도당과 과당이 1:5 내지 5:1 중량비로 혼합된 혼합당이 첨가된 것을 특징으로 하는, 식물세포의 이차대사산물 생산용 배지:

    앤더슨 로도덴드론 배지(Anderson rhododendron medium), 씨에이치유 배지(CHU(N6) medium), 씨엘씨 이포모에 배지(CLC/Ipomoea medium), 체-풀 비티스 배지(Chee & Pool (C2D) vitis medium), 데 그리프-야곱 배지(De greef & jacobs medium), 디케이더블유-정글란 배지(DKW/JUNGLANS medium), 에릭슨 배지(Eriksson(er) medium), 갬보그 배지(Gamborg B5 medium), 그리숍-도이 배지(Gresshof & doy (DBM2) medium), 헬러 배지(Hellers medium), 카오 미카이룩(kao michayluk medium), 운드슨 코키드 배지(knudson corchid medium), 린더만 오키드 배지(Lindemann Orchid medium), 리트베이 배지(Litvay medium), 린스마이어-스쿡 배지(Linsmaier & Skoog medium), 맥카운 우디플랜트 배지(McCowns woody plant medium), 무라시케-스쿡 배지(Murashige & Skoog medium), 무라시케- 밀러 배지(murashige & Miller medium), 니취 배지(nitsch medium), 엔엘엔 배지(NLN medium), 오키맥스 배지(orchimax medium), quoirin & Lepoivre medium, rugini olive medium, schenk & hildebrandt medium, 에스 배지(S-Medium), 베이신-웬트 배지(vacin and went medium), 화이트 배지(white medium) 또는 웨스트바코 배지(westvaco WV3 medium) 및 이들의 변형 배지.
19. 삭제
20. 삭제
21. 제16항에 있어서, 상기 식물세포는 택서스 바카타 (Taxus bacata), 택서스 브레비폴리아 (Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스 (Taxus canadensis), 택서스 취넨시스 (Taxus chinensis), 택서스 쿠스피다타 (Taxus cuspidata), 택서스 플로리다나 (Taxus floridana), 택서스 글로보사 (Taxus globosa), 택서스 메디아(Taxus media), 택서스 월리치아나 (Taxus wallichiana), 택서스 유나넨시스 (Taxus yunnanensis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물로부터 유래된 식물세포인 것을 특징으로 하는, 식물세포의 이차대사산물 생산용 배지.
22. 제16항에 있어서, 상기 이차대사산물은 파클리탁셀 및 택센으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 화합물인, 식물세포의 이차대사산물 생산용 배지.

Images