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KR100797242B1 - 펙틴 가수분해 생성물의 제조를 위한 방법 - Google Patents

펙틴 가수분해 생성물의 제조를 위한 방법 Download PDF

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KR100797242B1 KR1020037006865A KR20037006865A KR100797242B1 KR 100797242 B1 KR100797242 B1 KR 100797242B1 KR 1020037006865 A KR1020037006865 A KR 1020037006865A KR 20037006865 A KR20037006865 A KR 20037006865A KR 100797242 B1 KR100797242 B1 KR 100797242B1
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모하마트 무니르
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엔.브이. 뉴트리시아
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Abstract

본 발명은 펙틴 가수분해 생성물의 제조 방법, 이 방법으로 제조된 펙틴 가수분해 생성물 및 그의 용도에 관한 것이다.
펙틴 가수분해 생성물, 종양 질병

Description

펙틴 가수분해 생성물의 제조를 위한 방법 {METHOD FOR PRODUCING PECTIN HYDROLYSIS PRODUCTS}
본 발명은, 병원성 물질 및 생물이 진핵 세포, 특히 포유동물 세포에 유착하는 것을 감소 및(또는) 방지하거나, 또는 갈렉틴-3(galectin-3)에 의해 매개되어 종양 질병을 유발시키는 세포와 세포 사이의 상호작용 및(또는) 세포와 기질 사이의 상호작용을 억제하기 위한, 특히 제약 제제 또는 식이요법적 제제의 펙틴 가수분해물의 제조를 위한 방법, 병원성 물질 또는 생물이 진핵 세포에 부착되는 것을 차단하기 위한 방법, 갈렉틴-3에 의해 매개되는 세포와 세포 사이의 상호작용 및(또는) 세포와 기질 사이의 상호작용의 억제하기 위한 방법, 이러한 방법들로 제조되는 펙틴 가수분해물 및 제제에 관한 것이다.
병원성 세균 뿐 아니라 세포 손상성 물질도 공격 대상 세포의 감염 또는 손상을 유발시키기 위해서는 우선 표적 세포의 표면에 유착되어야 한다. 이런 유착은 예를 들어 리간드-수용체 상호작용을 통해 매개되는데, 이때 글루코스 구조가 결정적인 역할을 한다. 이러한 글루코스 구조가 표적 세포 표면 또는 리간드에서 차단되면, 감염을 억제할 수 있다.
또한, 글루코스 구조는 종양 형성 및 전이 형성에도 중요한 역할을 한다(Liotta et al., Annu. Rev. Cell Biol., 55(1986), 1037-1057). 종양 형성은 특히 탄수화물과 결합하는 단백질과 같은 세포 표면 구성성분에 의해 매개되는 세포의 상호작용을 포함한다. 따라서 종양 세포의 유착은 세포 유착 분자를 통해 매개된다. 또한 복수의 전이 형성 단계는 세포 표면 구성성분에 의해 매개되는, 세포와 세포외 기질(ECM) 사이의 상호 작용 또는 세포와 세포 사이의 상호 작용을 포함한다. 세포외 기질(ECM)은 주로 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin) 및 프로테오글리칸(proteoglycan)으로 이루어지는데, 이중 대부분은 포도당화되며(glycosylation), 이것들의 올리고당은 세포 유착 분자에 대한 인식 결정기를 제공한다. 라미닌은 질소가 결합된 당단백질로서 폴리-N-아세틸 락토사민-서열을 갖는다. 종양 세포, 혈소판 및 림프구의 응집체가 모세혈관 내에서 순환시 유착 분자를 통해 내피 세포와 접촉하면 전이가 이루어진다. 이런 접촉은 내피 세포 기능의 개방을 위한 신호를 제공한다. 이를 통해 종양 세포는 다른 유착 세포를 통해 기저막 상의 수용체에 결합할 수 있다. 기저막 파괴 후에 종양 세포는 소공(stoma)으로 통하는 직접적인 통로를 갖게되는데, 이때 1차 종양 침입의 경우와 같이 라미닌 및 피브로넥틴 및 상응하는 수용체 사이에서 상호 작용이 발생한다.
탄수화물-결합 단백질에서 중요한 대표물은 갈락토시드-결합 렉틴인 갈렉틴-1 및 갈렉틴-3이다(Raz & Lotan, Cancer Metastasis Rev. 6 (1987), 433; Gabius, Biochim. Biophys. Acta, 1071 (1991), 1). 갈렉틴-3은 혈관계 내에서 색전적 종양 확산을 촉진하며, 전이 형성을 증대시키는 것으로 알려져 있다. 갈렉틴-3은 복 수의 종양 세포의 세포 표면에서 발현되었는데, 종양이 진행할수록 갈렉틴-3-발현이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 갈렉틴-3은 활성 대식세포 및 종양 유전자로 형질전환된 세포 또는 전이 세포에서도 발현되었다. 갈렉틴-3은 폴리락토스아민을 포함하는 올리고당에 강한 친화성을 나타내며, 특히 갈렉틴-3은 예를 들어 사람 대장암종 세포 및 사람 유방암종 세포와 같은 복수의 세포 유형에 나타나는 두 가지 당단백질에 결합된다. 갈렉틴-3의 다른 리간드는 예를 들어 라미닌이다. 또한 내피 세포의 표면에서도 발현된 갈렉틴-3은 내피 세포에서의 종양 세포의 유착에도 관련이 있다.
US 제5,834,442호에는 포유동물의 암 치료를 위한 방법, 특히 전립선암의 치료를 위한 방법이 공지되어 있는데, 여기에서는 암의 치료 및 전이 형성의 억제가 변형된 펙틴의 경구 투여, 바람직하게는 수용성의 pH-변형된 시트러스 펙틴의 경구 투여를 통해 이루어진다. pH-변형된 펙틴을 제조하기 위해서는, pH 값을 10.0으로 증가시킨 후에 다시 pH 값을 3.0으로 감소시킴으로서 펙틴 용액을 해중합시킨다. 변형된 펙틴은 약 1 내지 15 kd의 분자량을 갖는다. 변형된 시트러스 펙틴을 식수 중에 넣어 투여한 쥐에서는 치료하지 않은 대조군에 비해 폐전이의 형성이 현저히 감소됨이 관찰되었다. 시험관내 실험에서는, 갈렉틴-3이 발현된 MLL-내피 세포의 쥐 대동맥 내피 세포(RAEC)로의 유착이 변형된 시트러스 펙틴의 존재하에서 거의 완전하게 억제되는 것으로 나타났다. 다른 실험에서는 pH-변형된 시트러스 펙틴이 MLL 내피 세포의 군체형성에 미치는 영향을 연구하였다. 반고정 매질 내에서의 세포 생장 능력은 세포의 이동 및 군체의 형성을 필요로 하므로, 반고정 매질 (비부 착성 (anchorage-independence)) 내에서의 세포의 생장력은 세포 형질전환 및 세포의 침투 잠재성에 대한 기준으로서 사용될 수 있다. 또한 이 실험에서는 변형된 시트러스 펙틴이 형성된 MLL 군체의 수뿐 아니라 군체의 크기도 현저하게 감소시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 변형된 시트러스 펙틴은 세포 독성적 효과보다는 세포 증식 억제적 효과를 나타내는 것으로 보인다. 변형된 시트러스 펙틴이 탄수화물-매개된 메카니즘, 특히 갈렉틴-3에 의해 매개되는 상호 작용에 기인하는 세포와 세포 사이의 상호 작용 및 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용에 미치는 영향도 또한 조사하였다. 이 실험에서는 변형된 시트러스 펙틴이, 변형되지 않은 시트러스 펙틴과는 달리 B16-F1-흑색종 세포가 라미닌에 유착되는 것을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 라미닌은 가용성 갈렉틴-3의 리간드로서 작용하는 것으로 알려져 있다.
EP 제0 716 605 B1호에서는, 특별하게 제조된 당근 수프, 버블티 (bubble tee), 코코넛 밀크 등을 통해 대장균과 같은 병원성 세균이 세포, 특히 위장관 및 비뇨생식기관의 상피 세포에 유착되는 것을 현저하게(즉, 90％까지) 억제할 수 있다고 공지되어 있다. 상기 문헌에 따르면 이런 효과는 식물 생성물에 존재하는 펙틴에 기인한 것인데, 주로 이 펙틴은 산기의 20 내지 80％가 메탄올에 의해 에스테르화되며, 갈락투론산 외에도 예들 들어 글루코스, 갈락토스, 크실로스 및 아라비노스를 포함할 수 있는 1,4-α-글루코스 결합된 갈락투로나이드의 사슬이다. 또한, 상기 문헌에 따르면, 모노갈락투론산은 유착 차단 기능을 갖지 않는 반면, 디갈락투로나이드 및 트리갈락투로나이드는 각각 91.7％까지 또는 84.6％까지 유착을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 상기 문헌에 따르면, 단량체 갈락투론산은 유착 차단 기능을 갖지 않으며, 목적하는 차단 효과는 갈락투로나이드의 분자량이 증가할수록 감소한다. 따라서 바람직한 갈락투로나이드의 중합도는 DP 2 또는 DP 3이다. 이외에도 2％ 미만의 에스테르화도가 필요하다. 하지만, 상기 문헌에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물은 유효 성분인 디갈락투로나이드 및 트리갈락투로나이드의 함량이 매우 낮다(원료를 기준으로 약 12％). 상기 제조 방법에서는 사용할 수 없는 다량의 부산물이 발생하여 이를 폐기해야 하므로, 상기 제조 방법은 자원을 고갈시키고 환경 문제를 유발시킨다.
따라서 본 발명의 목적은, 감염을 치료하고, 유해한 물질, 특히 병원성 물질 및 생물이 진핵 세포, 특히 포유동물 세포에 유착되는 것을 감소 및(또는) 방지하고, 세포 표면에 존재하는 탄수화물-결합 갈렉틴-3 분자에 의해 매개되며 특히 종양 질병의 원인이 되는 포유동물 세포 사이, 특히 종양 세포 사이에서 나타나는 상호 작용을 차단하고, 종양 질병을 치료하고, 포유동물에서 전이 형성을 방지하기 위한, 감염을 치료하기 위한 방법 및 수단을 제공하는 것이다.
이런 목적은 본 발명에 따른 펙틴 가수분해 생성물의 제조 방법을 통해 달성되는데, 이 방법은 가능한 한 낮은 비율의 단량체를 포함하며, 적어도 하나의 이중결합을 갖는 높은 비율의 분자를 포함하고, 에스테르화도가 20％ 이상인 올리고갈락투로나이드의 제조를 가능하게 하며, 이 방법의 수율은 종래 방식의 수율보다 현저히 높다.
더욱 상세하게 설명하자면, 상기 목적은 다음을 통해 달성된다. 바람직하게는 높은 에스테르화도를 갖는, 펙틴 또는 펙틴-함유 원료 (특히 식물성 원료임)의 수용액 및 현탁액을 제1 공정 단계에서 제1 펙틴 가수분해 효소 A로 처리한 후, 제2 공정 단계에서 제2 펙틴 가수분해 효소 B로 처리한다. 이런 공정을 통해, 예를 들어 병원성, 알레르기 유발성, 감염성 또는 독성물질과 같은 세포에 유해한 물질 또는 세균, 즉 예를 들어 효모, 균류, 아균, 박테리아, 바이러스, 포자, 바이로이드 및 프리온의 생존 및(또는) 증식 기능을 위해 필수적인 유착을 감소 또는 방지하기 위한 수단으로서 우수한 특성을 갖는 펙틴 가수분해 생성물이 얻어진다.
사용한 효소 A는 예를 들어 펙틴 분해 효소(EC 4.2.2.10) 또는 엔도폴리갈락투로나제(EC 3.2.1.15)인데, 바람직하게는 펙틴 분해 효소이다. 사용한 효소 B는 엔도폴리갈락투로나제 또는 펙틴 분해 효소인데, 바람직하게는 엔도폴리갈락투로나제이다.
<발명의 요지>
놀랍게도 본 발명에서는, 분자내에 이중 결합을 갖는 갈락투로나이드가 예를 들어 병원성 세균 및 세포 손상성 물질이 위장관 및 비뇨생식 기관의 상피 세포에 유착되는 것을 효과적으로 차단하는 것으로 밝혀졌다. 또한 매우 효과적인 감소 및(또는) 억제 또는 차단을 위해서는 특히 20％ 이상, 바람직하게는 30％, 40％, 50％ 이상, 더욱 바람직하게는 60％, 65％, 70％ 또는 71％ 이상의 더 높은 에스테르화도가 필요하다. 하지만 종래 기술에 따른 공정 방식에서는 이중 결합을 갖지 않고 사실상 거의 에스테르화되지 않은 갈락투로나이드만이 생산된다.
본 발명에서 "에스테르화도"란 에스테르화를 위해 기본적으로 제공되는, 갈락투로나이드의 산기의 비율과 관련이 있으며, 이런 갈락투로나이드는 알코올, 특 히 메탄올과 에스테르화한다.
본 발명에서 "불포화 갈락투론산 분자"란 특히 4,5-불포화 갈락투론산 분자를 의미한다.
<바람직한 실시태양에 대한 상세한 설명>
본 발명의 한 실시태양에서는, 효소 B로 처리한 후에 다른 제3의 효소 C로 처리한다. 이때 효소 C로서 펙틴 에스테라제(EC 3.1.1.11)를 사용할 수 있다. 이 효소를 통해 생성물의 에스테르화도를 매우 정확하게 조절할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서는, 본 발명에 따른 효소 처리 후에 용해되지 않은 잔류 성분을 원심분리 및(또는) 한외여과를 통해 용액으로부터 분리한다.
다른 실시태양에서는, 본 발명에 따른 효소 처리 및 정제 과정 후에 원심 분리 또는 한외여과를 통해 얻어진 용액을 공지된 방법에 따라 건조된 형태, 즉 예를 들어 분쇄형, 입자형, 과립형 또는 분말형으로 변형시킨다.
본 발명에 따른 효소 처리 후에 얻어진 용액 또는 여기에서 얻은 건조 생성물은, 예를 들어 병원성 세균 및 세포 손상성 물질이 예를 들어 사람 및 동물의 위장관 및 비뇨생식 기관의 상피세포에 유착하는 것을 차단하는 것과 관련해 매우 우수한 효과를 나타낸다. 따라서, 이런 생성물 또는 용액을 동물 사료에 사용할 수 있으며, 예를 들어 양돈 사육시 새끼 돼지의 설사 장애를 방지하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 펙틴 또는 펙틴-함유 원료 (바람직하게는 식물성임)의 용액 또는 현탁액의 pH 값은 3.5 내지 5.5이고(이거나), 다른 바람직한 실시 태양에서는 펙틴의 농도가 3％ 내지 25％이다.
효소 A, 효소 B 및 경우에 따라서는 효소 C를 사용한 처리는 pH 값이 3.5 내지 5.5이고 온도가 25℃ 내지 60℃이며 효소 A, 효소 B 및 경우에 따라서는 효소 C의 농도가 펙틴의 kg 당 10 내지 30 ml인 조건 하에서 2시간 내지 24시간 동안 진행된다.
다른 바람직한 실시태양에서는, 펙틴 가수분해물에서 갈락투로나이드의 비율이(건조 물질을 기준으로 한 중량％) 적어도 60 중량％ 이상, 70 중량％ 이상, 75 중량％ 이상, 80 중량％ 이상, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 85 중량％ 이상이다.
다른 바람직한 실시태양에서는, 펙틴 가수분해물에서 전체 탄수화물에 대한 DP-1(단량체)을 포함하는 탄수화물의 비율이 25 중량％ 미만, 20 중량％ 미만, 10 중량％ 미만, 8 중량％ 미만, 5 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 4 중량％ 미만이다(건조 물질 기준).
다른 바람직한 실시태양에서는, 탄수화물의 비율, 특히 중합도 DP가 10을 초과하는 갈락투로나이드의 비율이 펙틴 가수분해물의 전체 탄수화물 함량을 기준으로 10 중량％ 미만, 8 중량％ 미만, 더욱 바람직하게는 5 중량％ 미만이다(건조 물질 기준).
다른 바람직한 실시태양에서는, 펙틴 가수분해물 내에서 갈락투로나이드의 전체 함량에 대한 불포화 갈락투로나이드의 비율이 적어도 10 중량％ 초과, 바람직하게는 15 중량％ 초과, 20 중량％ 초과, 25 중량％ 초과, 30 중량％ 초과, 더욱 바람직하게는 36.5 중량％ 내지 46 중량％이다(건조 물질 기준).
바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따라 제조된 펙틴 가수분해물은 탄수화물, 특히 중합도가 2 내지 10, 바람직하게는 3 내지 8, 더욱 바람직하게는 4.5인 갈락투로나이드의 함량이 적어도 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 75 ％ 이상, 80 ％ 이상 또는 더욱 바람직하게는 85 ％ 이상(건조 물질 기준)이다(펙틴 가수분해물의 전체 탄수화물 함량을 기준으로 한 건조 물질의 질량％).
바람직한 실시태양에서, 사용한 펙틴은 시트러스 펙틴, 사과 펙틴 또는 사탕무 펙틴이다.
바람직한 실시태양에서 사용한 펙틴 함유 원료, 특히 펙틴 함유 식물성 원료는 사과 찌꺼기, 사탕무 조각 또는 시트러스 펠렛, 즉 예를 들어 오렌지 주스, 레몬 주스 및(또는) 라임 주스 생산시 얻을 수 있는 잔류물이다.
본 발명에 따라 제조된 펙틴 가수분해물, 즉 펙틴 가수분해 생성물은 감염증의 치료 및(또는) 유해한 물질 및(또는) 생물의 포유동물 세포, 특히 사람 세포로의 유착 방지를 위한 제약 제제 또는 식이요법적 제제로서 매우 적합하다.
또한 본 발명에 따라 제조된 펙틴 가수분해물은, 사람 또는 포유동물에서 세포와 세포 사이의 상호 작용 및(또는) 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용, 특히 세포 표면에 존재하는 갈렉틴-3에 의해 매개되는 상호 작용을 억제하기 위한 제제로서 매우 적합하다. 따라서 본 발명에 따른 펙틴 가수분해 생성물은, 종양 세포가 관여하여 포유동물 또는 사람에서 질병, 특히 종양 질병의 발생의 원인이 되는, 세포 사이 및(또는) 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용을 억제하기에 적합하다. 또한 본 발명에 따른 펙틴 가수분해물은 갈렉틴-3에 의해 매개되는 종양 세포의 유착 및(또는) 종양 세포의 침투 잠재성을 억제하므로, 종양 질병의 치료, 특히 암 질병에서 종양의 증식 억제 및(또는) 전이 형성의 억제를 위한 제약 제제로서 적합하다.
따라서 본 발명은, 예를 들어 유제품, 요구르트, 씨리얼, 제빵류 등과 같은 식료품 또는 기호품으로서 실시될 수 있는, 본 발명에 따라 얻어지는 펙틴 가수분해물, 즉 펙틴 가수분해 생성물을 함유하는 제약 제제 및 식이요법적 제제에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 포유동물 세포, 특히 사람 세포에 유해한 물질 및(또는) 생물이 유착 또는 부착되는 방지하기 위한, 특히 감염증, 중독, 알러지 등을 치료하기 위한, 즉 예방 및 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 전술된 펙틴 가수분해 생성물의 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은, 포유동물 세포, 특히 사람 세포에 유해한 물질 및(또는) 생물이 유착 또는 부착되는 방지하기 위한, 특히 감염증, 중독, 알러지 등을 치료하기 위한 전술된 펙틴 가수분해 생성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따라 치료되는 감염으로는 혈관계, 호흡기, 비뇨생식기, 비후강 또는 위장관의 감염을 들 수 있다.
다른 적용 분야는, 예를 들어 유아 또는 성인의 설사 질병의 억제를 돕는 식료품 분야이다.
또한 본 발명은, 세포와 세포 사이의 상호 작용 및(또는) 세포와 세포외 기 질 사이의 상호 작용, 특히 세포 표면에 존재하는 탄수화물-결합 갈렉틴-3 분자에 의해 매개되며, 특히 종양 질병과 같은 사람 또는 포유동물 질병의 원인인 상호 작용을 억제하기 위한 전술된 펙틴 가수분해 생성물의 용도에 관한 것이다. 특히 이런 질병으로는, 전립선암, 신장암, 카포시 육종, 진행형 만성 백혈병, 유방암, 유방 선암, 육종, 난소암, 직장암, 후두암, 흑색종, 소장 종양, 대장암종, 방광 종량, 비만세포종, 폐암, 기관지암, 인두 편평상피세포암, 위장관암, 위장암을 들 수 있다. 본 발명에 따른 펙틴 가수분해 생성물은, 특히 전이성 종양 세포의 침투 잠재성의 감소 및(또는) 종양 세포의 유착 억제를 위해 사용될 수 있다. 바람직하게넌, 본 발명에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물은 경구로 투여된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양은, 사람 또는 포유동물의 종양 질병 치료를 위한 펙틴 가수분해 생성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게도 본 발명에 따른 펙틴 가수분해물은 세포와 세포 사이의 상호 작용 및(또는) 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용, 특히 세포 표면에 존재하는 탄수화물-결합 갈렉틴-3 분자에 의해 매개되는 상호 작용에 기인하는 종양의 치료를 위해 사용된다. 따라서 바람직하게도 본 발명에 따른 펙틴 가수분해물을 사용하여, 전립선암, 신장암, 카포시 육종, 진행형 만성 백혈병, 유방암, 유방 선암, 육종, 난소암, 직장암, 후두암, 흑색종, 소장 종양, 대장암종, 방광 종량, 비만세포종, 폐암, 기관지암, 인두 편평상피세포암, 위장관암, 위장암을 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 펙틴 가수분해물은, 특히 종양 세포의 유착 억제 및(또는) 전이성 종양 세포의 침투 잠재성의 감소를 위한 목적으로 사용된다.
또한 본 발명은, 세포와 세포 사이의 상호 작용 및(또는) 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용, 특히 세포 표면에 존재하는 탄수화물-결합 갈렉틴-3 분자에 의해 매개되며, 특히 전술된 종양 질병과 같은 사람 또는 포유동물 질병의 원인인 상호 작용을 억제하기 위한 전술된 펙틴 가수분해 생성물의 용도에 관한 것이다. 바람직하게도 세포와 세포 사이의 상호 작용 및(또는) 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용을 억제하기 위한 제약 제제는 경구로 투여된다.
또한 본 발명의 다른 바람직한 실시태양은, 전술된 종양 질병의 치료, 즉 세포와 세포 사이의 상호 작용 및(또는) 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용, 특히 세포 표면에 존재하는 탄수화물-결합 갈렉틴-3 분자에 의해 매개되는 상호 작용에 기인하는 종양의 치료를 위해 사용될 수 있는 제약 제제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 펙틴 가수분해 생성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따라 상기 제약 제제는 종양 증식의 억제 및(또는) 전이 형성의 감소를 위해 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 제약 제제는 특히 종양 세포의 유착을 억제하거나 또는 종양 세포의 침투 잠재성을 감소시킨다. 바람직하게도 본 발명에 따른 제약 제제는 경구로 투여된다.
또한 본 발명은, 본 발명에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물을 유해한 물질 또는 생물의 동물 세포로의 부착을 차단하고 감염의 발생을 방지하기에 충분한 양으로 사람 또는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 유해한 물질, 특히 병원성 물질 또는 생물이 사람 또는 포유동물의 세포에 부착하는 것을 차단하기 위한 방법에 관한 것이다. 바람직하게도 본 발명에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물 은 경구로 투여된다.
또한 본 발명은, 본 발명에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물을 갈렉틴-3에 의해 매개되는 세포와 세포 사이의 상호 작용 및(또는) 세포와 기질 사이의 상호 작용을 감소시키고(시키거나) 억제시키기에 충분한 양으로 종양 질병이 있는 사람 또는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 상호 작용들의 세포 표면에 존재하는 탄수화물-결합 갈렉틴-3 분자에 의해 매개되며 특히 전술된 종양 질병과 같은 사람 또는 포유동물 질병의 원인인 것인, 세포와 세포 사이의 상호 작용 및(또는) 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용의 억제를 위한 방법에 관한 것이다. 바람직하게도 본 발명에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물은 경구로 투여된다.
또한 본 발명은, 제약상 또는 치료상 유효한 양을 갖는, 본 발명에 따른 펙틴 가수분해 생성물을 포함하는 제약 제제에 관한 것이다. 본 발명에서 "제약 제제"란, 작용물질로서 본 발명에 따른 펙틴 가수분해 생성물을 환자 또는 포유동물에 쉽게 투여할 수 있는 형태로 포함하며, 진단, 치료 및(또는) 예방적 목적으로 사용되는 혼합물을 의미한다. 제약 제제는 고체 혼합물 뿐 아니라 액체 혼합물일 수도 있다. "제약상 또는 치료상 유효한 양"이란 제약 제제에 포함된 작용물질의 양이, 예를 들어 감염증 또는 종양 질병과 같은 질병의 발현을 억제하고, 이런 종류의 질병을 치유하며, 상기 질병의 진행을 중단시키고(시키거나) 상기 질병의 증상을 호전시키기에 충분하다는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 펙틴 가수분해 생성물 이외에, 바람직한 실시태양에서 본 발명에 따른 제약 제제는 또한 제약상 허용되는 담체 및 경우에 따라서는 희석제, 분리제, 윤활제, 보조제, 충전제, 감미 제, 향료, 색소, 향신료 또는 다른 제약상 유효한 물질을 포함한다.
또한 본 발명에 따른 식이요법적 제제에는 제약상 유효한 양의 펙틴 가수분해 생성물이 함유된다.
다른 바람직한 실시태양들은 종속항에 기술되어 있다.
본 발명은 다음의 실시예를 통해 더욱 상세히 설명된다.
실시예 1:
1 리터의 시트러스 펙틴 용액 (1 리터의 물 중 30 g의 고 에스테르화 펙틴)에 0.3 ml의 펙틴 분해 효소(예, 룀 (Roehm) 사의 로하펙트 (Rohapect) PTE)를 첨가하고 이 용액을 pH 5.0 및 45℃의 조건 하에서 교반하면서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.75 ml의 엔도폴리갈락투로나제(예, 아마노 (Amano) 사의 펙티나제 (Pectinase) PL)를 첨가하고 동일한 반응 조건 하에서 3시간 동안 더 배양하였다. 그 다음 95℃로 가열함으로써 효소를 비활성화시켰다. 용해되지 않은 잔류물을 원심분리를 통해 제거하고, 투명한 용액을 건조될 때까지 증발시키고, 여기에서 얻어진 고체의 질량을 측정했다. 측정된 질량은 25.8 g이었다(투입된 원료를 기준으로 수율 75.6％에 해당).
얻어진 생성물을 일반적으로 공지된 분석 방법에 따라 검사했으며 다음과 같은 조성이 관찰되었다.
탄수화물 DP 1 3.6％
갈락투로나이드 83.9％
이중 불포화된 성분 46.0％
(추정 평균값 DP. ≒ 4.5)
DP 2 - 10 80.4％
DP > 10 16.0％
에스테르화도 72.0％
염 함량 3.0％
조단백질(raw protein) 1.7％
수분 함량 4.6％
실시예 2:
1 리터의 시트러스 펙틴 용액 (1 리터의 물 중 30 g의 고 에스테르화 펙틴)에 0.3 ml의 펙틴 분해 효소(예, 룀사의 로하펙트 PTE)를 첨가하고 이 용액을 pH 5.0 및 45℃의 조건 하에서 교반하면서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.75 ml의 엔도폴리갈락투로나제(예, 아마노사의 펙티나제 PL)를 첨가하고 동일한 반응 조건 하에서 3시간 동안 더 배양하였다. 그 다음 95℃로 가열함으로써 효소를 비활성화시켰다.
용해되지 않은 잔류물을 원심분리를 통해 제거하고, 투명한 용액을 한외여과하였다(컷-오프 (cut-off) 10,000). 여과물을 건조시켜 22.8 g의 고체를 얻었다 (투입된 원료를 기준으로 수율 66.8％에 해당).
탄수화물 DP 1 3.0％
갈락투로나이드 84.1％
이중 불포화된 성분 36.5％
(추정 평균값 DP. ≒ 4.5)
DP 2 - 10 93.0％
DP > 10 4.0％
에스테르화도 72.0％
염 함량 6.7％
조단백질 1.3％
수분 함량 4.4％
실시예3:
1 리터의 시트러스 펙틴 용액 (1 리터의 물 중 30 g의 고 에스테르화 펙틴)에 0.3 ml의 펙틴 분해 효소(예, 룀사의 로하펙트 PTE)를 첨가하고 이 용액을 pH 5.0 및 45℃의 조건 하에서 교반하면서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.75 ml의 엔도폴리갈락투로나제(예, 아마노사의 펙티나제 PL)를 첨가하고 동일한 반응 조건 하에서 3시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.5 ml의 펙틴 에스테라제(예, 노보 노르디스크 (Novo Nordisk) 사의 레오자임 (Rheozym))를 첨가하고 다시 45분 동안 배양하였다. 그 다음 95℃로 가열함으로써 효소를 비활성화시켰다. 용해되지 않은 잔류물을 원심분리를 통해 제거하고, 투명한 용액을 건조될 때까지 증발시켰다.
얻어진 생성물을 일반적으로 공지된 분석 방법에 따라 검사했다. 실시예 1과는 달리 35％의 에스테르화도가 관찰되었다.
실시예 4:
건조된 오렌지 껍질 또는 시트러스 펠렛을 약 1 내지 5 mm의 입자 크기로 절 단하고, 이중 100 g을 400 ml의 물에 넣고 팽윤시켰다. 그 다음 진한 질산 (10 g)을 첨가하고, 현탁액을 85℃로 가열한 후에, 이 온도에서 1.5시간 동안 교반시켰다. 그 다음 45℃로 냉각시키고 NaOH를 이용해 pH 값을 4.5로 높이고, 0.3 ml의 펙틴 분해 효소(예, 룀사의 로하펙트 PTE)를 첨가한 후에 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.75 ml의 엔도폴리갈락투로나제(예, 아마노사의 펙티나제 PL)를 첨가하고 동일한 반응 조건 하에서 다시 3시간 동안 배양하였다. 그 다음 95℃로 가열함으로써 효소를 비활성화시키고, 농축한 후에 이 현탁액을 롤러 건조기에서 건조시켰다.
실시예 5:
건조된 오렌지 껍질 또는 시트러스 펠렛을 약 1 내지 5 mm의 입자 크기로 절단하고, 이중 100 g을 400 ml의 물에 넣고 팽윤시켰다. 그 다음 진한 염산(HCl)(8 g)을 첨가하고, 현탁액을 85℃로 가열한 후에, 이 온도에서 1.5시간 동안 교반시켰다. 그 다음 45℃로 냉각시키고 NaOH를 이용해 pH 값을 4.5로 높이고, 0.3 ml의 펙틴 분해 효소(예, 룀사의 로하펙트 PTE)를 첨가한 후에 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 0.75 ml의 엔도폴리갈락투로나제(예, 아마노사의 펙티나제 PL)를 첨가하고 동일한 반응 조건 하에서 다시 3시간 동안 배양하였다. 그 다음 95℃로 가열함으로써 효소를 비활성화시키고, 농축한 후에 이 현탁액을 롤러 건조기에서 건조시켰다.
실시예 6:
병원성 세균의 사람 상피세포로의 유착 방지.
이 시험을 위해 아침 오줌을 원심분리함으로써 얻은 인체의 비뇨기 상피세포, 및 황색 포도구균(staphylococcus aureus) 및 대장균 (E.Coli)의 두 가지 균주가 포함된 109 세균/mL의 현탁액을 사용하였다.
시험 공정:
상피 세포와 세균 현탁액을 함께 37℃의 온도에서 30분간 배양하였다. 그 다음 막 여과(8μ)를 통해 상피 세포를 비유착 세균으로부터 분리했다. 필터는 수 차례 세척한 후에 생리 식염수 용액에 넣어 상피 세포가 이 용액 내에 현탁되었다. 식염수 용액 내의 현탁액을 원심분리한 후에 펠렛을 슬라이드에 도포하고 마이-그륀발트(May-Gruenwald) 및 김자(Giemsa) 법에 따라 염색하였다. 50개의 상피 세포에 부착된 세균의 수를 계수했다. 부착된 세균이 존재하지 않았다. 대조군으로서 세균 현탁액이 첨가되지 않은 상피 세포를 사용하였다.
본 시험에서는 우선 상피 세포를 본 발명에 따라 (실시예 1에 따라) 제조된 펙틴 가수분해 생성물이 포함된, 농도가 서로 상이한 수용액과 함께 1시간, 2시간 또는 3시간 동안 배양했다. 그 다음 이것을 세균 현탁액과 혼합하고 전술된 바와 같이 처리했다. 50개의 상피세포에 부착된 세균의 수를 측정하였다.
결과:
예를 들어 라피노오스, 니스토오스 및 이소멜레치토오스와 같이 비교를 위해 투입된 "중성" 탄수화물의 경우에는 상피 세포로의 세균 부착의 감소가 관찰되지 않았다. 본 발명에 따른 펙틴 가수분해 생성물을 통해 거의 모든 시험한 미생 물의 유착이 거의 완전하게 억제되었다(차단율: >95％).
실시예 7:
실시예 2에서 얻은 건조된 여과물 1.5 g을 pH 값이 5.0인 50mM 나트륨-아세테이트-용액 100 ml에 용해시키고, 그 다음 음이온 교환기 AG 1X2(바이오라드 (BioRad) 사)로 충전시키고 pH 값이 5.0인 50mM 나트륨-아세테이트-용액으로 평형화시킨 컬럼(2.6×30cm)에 부었다. 컬럼 내에서의 진행 상태는 HPAEC(고성능 음이온 교환 크로마토그래피)를 통해 분석했고 1N의 HCl로 95℃에서 1시간 동안 가수분해했다.
결과:
표준물로서 라프틸린 (Raftiline)(오라프티 (Orafti) 사)와 비교해 컬럼에서 용리된 올리고당은 2-12의 DP 값을 가졌다.
당 분석기(바이오트로니크 (Biotronik) 사)를 이용한 가수분해물의 분석에서는 단당류인 갈락토스(70％)가 주로 관찰되었으며, 이외에도 아라비노스(23％)와 약간의 글루코스 및 만노스가 관찰되었다. 전체적으로, 갈락투로나이드 함유 생성물 중에서 8.3％에 달하는 중성당 함유 올리고당을 얻을 수 있었다.
실시예 8:
펙틴 가수분해물의 존재 하에서 세포외 기질(ECM) 상에서의 결장 암 세포주의 증식
사람 결장 세포주 HT-29 또는 Caco-2를 1×104 세포/ml의 세포 밀도로 15mm- 페트리 (Petri) 접시에 시딩하고, 10％의 소태아혈청(Fetal Calf Serum/FCS)이 첨가된 RPMI 1640 배지(HT-29) 또는 50％의 소태아혈청(FCS)이 첨가된 MEM 배지(Caco-2)에서 5％의 CO2가 포함된 대기 중에 37℃의 온도에서 배양했다. 융합이 이루어질 때까지 이 세포를 1 내지 2일 동안 증식시켰다. 그 다음 배양 접시를 PBS로 1회 세척하고, PBS 및 0.5％ 트리톤 (Triton) X-100과 함께 진탕기에서 실온에서 30분간 배양한 후에, PBS로 3회 세척하였다. 그 다음 전술된 세포주를 전술된 바와 같이 제조된 ECM 층이 포함된 배양 접시에 다시 도포하였다. 펙틴 가수분해물이 세포 증식에 미치는 영향을 세포수의 계수를 통해 측정하였다. 이를 위해 48시간 후에 트립신/EDTA-용액을 이용해 HBSS 내에서 10분간 세포를 다시 제거하고 PBS 용액으로 세척하였다. 그 다음 트립판 블루 (trypan blue) 용액을 이용해 염색함으로써 나우바우어 (Neubauer) 사의 계수 챔버 내에서 살아있는 세포의 수를 측정하였다. 대조군으로, 글루코스를 통한 실험을 수행하였다. 실험의 결과를 표 1에 기술하였다.
표 1에서는 글루코스가 세포주 HT-29 및 Caco-2에 아무런 영향을 미치지 않는 반면, 펙틴 가수분해물이 사용한 농도에 따라서 세포의 증식이 75％까지 감소하는 것을 알 수 있다.
세포 증식의 감소
HT-29 Caco-2
농도 펙틴 가수분해물 글루코스 펙틴 가수분해물 글루코스
0.01％ 30％ 0％ 25％ 0％
0.1％ 45％ 1％ 43％ 0％
1.0％ 75％ 0％ 70％ 0％
실시예 9:
펙틴 가수분해물을 통한 Caco-2 세포의 침투 능력의 감소
Caco-2 세포에 침투 능력에 미치는 펙틴 가수분해물의 영향을 에르켈 (Erkell) 및 쉬르바허 (Schirrmacher)(Cancer Research, 48(1988), 6933-6937)에 따른 침투 시험을 사용해 연구하였다. 이 시험은 니트로셀룰로오스 필터 상에서 예를 들어 I형 콜라겐, III형 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌과 같은 몇몇 ECM 단백질을 포함하는, 단백질 겔 내에 존재하는 뉴클레오포어 (Nucleopore) 필터, 즉 폴리카르보네이트 필터의 다공을 통해 세포가 이동한다는 사실에 근거한다. 세포를 펙틴 가수분해물과 함께 시험 장치에 투입하고, 그 다음 단백질 층을 통해 이동한 세포 중에서 니트로셀룰로오스 층 하단에 존재하는 세포의 수를 정량적으로 평가하였다. 대조군으로, 글루코스가 Caco-2 세포의 침투 능력에 미치는 영향을 연구했다.
이러한 연구의 결과를 표 2에 나타내었다. 결과에서는, 본 발명에 따른 펙틴 가수분해물이 투입된 농도에 따라서 Caco-2 세포의 침투 능력을 부분적으로 현저하게 감소시키는 반면, 글루코스는 단지 높은 농도에서만 Caco-2 세포의 침투 능력을 경미하게 감소시키는 것으로 나타났다.
Caco-2 세포의 침투 능력의 감소
농도 펙틴 가수분해물 글루코스
0.01％ 30％ 0％
0.1％ 69％ 2％
1.0％ 88％ 3％

실시예 10:
펙틴 가수분해물에 의한 항-갈렉틴-3 항체 결합
결장암 세포에서의 갈렉틴-3의 발현은 항-갈렉틴-3-특이적 모노클로날 항체 (쥐-Ig) 및 상응하는 항-쥐-FITC-커플링된 이차 항체를 사용하여 면역형광현미경법 및 유동 세포계측법(flow cytometry)을 통해 검사하였다. 대조군으로 사용되는 글루코스 및 펙틴 가수분해물을 일차 항체와 함께 표적 세포 상에서 배양하였고, 그 다음 용해성 당물질이 항-갈렉틴-3-결합에 미치는 억제 효과가 검사되었다.
펙틴 가수분해물이 항-갈렉틴-3-결합에 미치는 영향은 표 3에 표시되어 있다. 글루코스가 모노클로날 항-갈렉틴-3-항체의 결합 반응을 감소시키지 않거나 또는 단지 경미하게 감소시키는 반면, 펙틴 가수분해물은 투입된 농도에 따라서 항체 결합을 부분적으로 현저하게 감소시키는 것을 표 3을 통해 알 수 있다.
모노클로날 항-갈렉틴-3-항체의 결합 감소(단위: ％)
HT-29 Caco-2
농도 펙틴 가수분해물 글루코스 펙틴 가수분해물 글루코스
0.01％ 34 0 28 0
0.1％ 67 0 63 0
1.0％ 85 2 82 0

Claims (46)

  1. 제1 공정단계에서 펙틴 또는 펙틴-함유 식물성 원료의 수용액 또는 현탁액을 엔도폴리갈락투로나제 또는 펙틴 분해 효소(EC 4.2.2.10)인 펙틴 가수분해성 효소 A로 처리하고, 제2 공정단계에서 엔도폴리갈락투로나제(EC 3.2.1.15) 또는 펙틴 분해 효소인 펙틴 가수분해성 효소 B로 처리하여 (여기서, 효소 A가 펙틴 분해 효소인 경우, 효소 B는 엔도폴리갈락투로나제이고; 효소 A가 엔도폴리갈락투로나제인 경우, 효소 B는 펙틴 분해 효소임), 적어도 하나의 4,5-불포화 갈락투론산 분자를 포함하며 메탄올에 의해 20％ 이상 에스테르화되는 갈락투로나이드가 포함된 펙틴 가수분해 생성물이 얻어지는, 펙틴 가수분해 생성물의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제2 공정단계에서 얻어진 액상 가수분해 생성물이 제3 공정 단계에서 펙틴 에스테라제 (EC 3.1.1.11)인 효소 C로 처리되는, 펙틴 가수분해 생성물의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 공정단계 또는 제3 공정단계에서 얻어진 액상 가수분해 생성물로부터 여과, 원심분리 또는 둘다를 통해 불용성 성분을 제거하고, 액상 가수분해 생성물을 건조 형태로 전환시키는, 펙틴 가수분해 생성물의 제조 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 사용한 펙틴이 시트러스 펙틴, 사과 펙틴 또는 사탕무 펙틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펙틴-함유 원료가 사탕무 조각, 사과 찌꺼기, 또는 오렌지 주스, 레몬 주스 및 라임 주스 중 하나 이상의 생산시 얻을 수 있는 건조 잔류물인 것을 특징으로 하는 방법.
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  9. 제1항 또는 제2항에 따른 방법으로 제조 가능하고, 갈락투로나이드의 전체 건중량을 기준으로, DP-1(단량체)을 포함하는 갈락투로나이드 함량이 25 중량％ 미만인 펙틴 가수분해 생성물.
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  12. 감염증, 중독 또는 알러지의 예방 및 치료를 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 제약 제제.
  13. 제1항 또는 제2항에 따른 방법으로 제조된 펙틴 가수분해 생성물을 포함하는 인체 영양 공급을 위한 식품.
  14. 제1항 또는 제2항에 따른 방법으로 제조된 펙틴 가수분해 생성물을 포함하는 동물 사료.
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  31. 사람 또는 포유동물의 종양 질병의 치료를 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 방법으로 제조된 펙틴 가수분해 생성물 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 제약 제제.
  32. 제31항에 있어서, 종양 질병이 세포와 세포 사이의 상호 작용, 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용, 또는 두 가지 상호 작용 모두에 기인하는 것인 제약 제제.
  33. 제32항에 있어서, 세포와 세포 사이의 상호 작용, 세포와 기질 사이의 상호 작용, 또는 두 가지 상호 작용 모두가 세포 표면에 존재하는 탄수화물-결합 갈렉틴-3 분자에 의해 매개되는 제약 제제.
  34. 제31항에 있어서, 종양 질병이 전립선암, 신장암, 카포시 육종, 진행형 만성 백혈병, 유방암, 유방 선암, 육종, 난소암, 직장암, 후두암, 흑색종, 소장 종양, 대장암종, 방광 종양, 비만세포종, 폐암, 기관지암, 인두 편평상피세포암, 위장관암 및 위장암 중 하나 이상인 제약 제제.
  35. 제31항에 있어서, 종양 증식의 감소를 위해 사용되는 제약 제제.
  36. 제31항에 있어서, 전이 형성의 감소를 위해 사용되는 제약 제제.
  37. 제31항에 있어서, 경구로 투여되는 제약 제제.
  38. 제1항 또는 제2항에 따른 방법으로 제조된 펙틴 가수분해 생성물을, 유해한 물질 또는 생물이 사람을 제외한 포유동물 세포로 부착되는 것을 차단하기에 충분한 양으로 사람을 제외한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 유해한 물질 또는 생물이 사람을 제외한 포유동물의 세포로 부착되는 것을 차단하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 펙틴 가수분해 생성물이 경구로 투여되는 방법.
  40. 제1항 또는 제2항에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물을 갈렉틴-3에 의해 매개되는 세포와 세포 사이의 상호 작용, 세포와 기질 사이의 상호 작용, 또는 두 가지 상호 작용 모두를 감소시키거나 억제시키기에 충분한 양으로 종양 질병이 있는 사람을 제외한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 상호 작용들이 세포 표면에 존재하는 탄수화물-결합 갈렉틴-3 분자에 의해 매개되며 사람을 제외한 포유동물 질병의 원인인 것인, 세포와 세포 사이의 상호 작용, 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용, 또는 두 가지 상호 작용 모두를 억제하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 펙틴 가수분해 생성물이 경구로 투여되는 방법.
  42. 감염 치료를 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 제약 제제.
  43. 제31항에 있어서, 종양 세포의 유착 억제를 위해 사용되는 제약 제제.
  44. 제31항에 있어서, 종양 세포의 침투 잠재성의 감소를 위해 사용되는 제약 제제.
  45. 제1항 또는 제2항에 따른 방법으로 제조된 펙틴 가수분해 생성물을, 감염증의 발생을 방지하기에 충분한 양으로 사람을 제외한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 유해한 물질 또는 생물이 사람을 제외한 포유동물의 세포로 부착되는 것을 차단하는 방법.
  46. 제1항 또는 제2항에 따라 제조된 펙틴 가수분해 생성물을 갈렉틴-3에 의해 매개되는 세포와 세포 사이의 상호 작용, 세포와 기질 사이의 상호 작용, 또는 두 가지 상호 작용 모두를 감소시키거나 억제시키기에 충분한 양으로 종양 질병이 있는 사람을 제외한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 상호 작용들이 세포 표면에 존재하는 탄수화물-결합 갈렉틴-3 분자에 의해 매개되며 사람을 제외한 포유동물 종양 질병의 원인인 것인, 세포와 세포 사이의 상호 작용, 세포와 세포외 기질 사이의 상호 작용, 또는 두 가지 상호 작용 모두를 억제하는 방법.
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