KR100794876B1

KR100794876B1 - 자유 유영성 아르테미아 나우플리이 생산 방법 및 이러한방법에 사용하기 위한 패키지된 낭포

Info

Publication number: KR100794876B1
Application number: KR1020037004807A
Authority: KR
Inventors: 에디 네슨; 윔 트랙아에르트; 룩 반뉴벤호프; 하워드 더블유. 뉴만; 그리트 메르치에
Original assignee: 인베 테크놀로지즈 엔.브이.
Priority date: 2000-10-05
Filing date: 2001-10-04
Publication date: 2008-01-14
Anticipated expiration: 2021-10-04
Also published as: CN100490637C; AU2001293522A1; EA005276B1; TWI226818B; KR20030055277A; WO2002028173A1; CN1471357A; EA200300369A1; EP1195088A1

Abstract

본 발명은 휴면성 낭포를 포함한 아르테미아(Artemia) 낭포를 부화용 배지 내에서, 부화용 배지 1리터당 최대 약 5g의 낭포 무수물을 포함하는 밀도로 항온 배양함으로써, 상기 일정 량의 아르테미아 낭포(휴면성 낭포 포함)로부터 출발하여 자유 유영성 아르테미아 나우플리이를 생산하는 방법에 관한 것이다. 부화율을 증가시키기 위해 상기 휴면성 낭포 내의 휴면 상태를 중단시키기 위해, 0.5 내지 30mg/l 범위 내에서 선택된 과산화수소의 양을 부화용 배지에 도입하는데, 이러한 도입은 과산화수소 용액을 부가하거나 또는 부화용 배지에 부가될 때 과산화수소를 생성시키는 화합물, 예를 들면, 과산화칼슘 또는 과산화마그네슘을 부가함으로써 이루어진다. 이들 고형의 과산화수소 생성 화합물의 이점은, 이들을 적당한 양으로 낭포와 혼합한 다음, 이러한 낭포와 함께 상기 부화용 배지에 가할 수 있다는 점이다.

자유 유영성 아르테미아 나우플리이, 과산화수소, 과산화수소 생성 화합물, 부화용 배지

Description

자유 유영성 아르테미아 나우플리이 생산 방법 및 이러한 방법에 사용하기 위한 패키지된 낭포{Method for producing free swimming Artemia nauplii and packaged cysts for use in that method}

본 발명은 휴면성 낭포(diapauzing cyst)를 포함한 아르테미아(Artemia) 낭포를 부화용 배지 내에서, 부화용 배지 1리터당 최대 약 5g의 낭포 무수물을 포함하는 밀도로 예정된 항온 배양 기간 동안, 이러한 예정된 항온 배양 기간 내에 상기 낭포의 적어도 일부분을 부화시켜 자유 유영성 나우플리이를 방출시킬 수 있는 조건 하에 항온 배양함으로써, 상기 일정 량의 아르테미아 낭포(휴면성 낭포 포함)로부터 출발하여 자유 유영성 아르테미아 나우플리이를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법에서는, 상기 낭포를 과산화수소와 접촉시켜 적어도 일정 수의 상기 휴면성 낭포가 휴면 상태를 중단하여 상기 예정된 항온 배양 기간 내에 자유 유영성 나우플리이를 생산할 수 있도록 함으로써, 상기 항온 배양된 낭포의 부화율(%)을, 해당 낭포가 과산화수소와 접촉하지 않을 경우의 전체 낭포 총 수의 제1부화율(X%)에서부터 이들 낭포가 과산화수소와 접촉한 경우의 제2부화율(X% 보다 높은 부화율)로 증가시킨다.

아르테미아 나우플리이는 양식 분야에서 생물 이료(live food; 生物餌料) 유기체로서 통상 사용되고 있는데, 보다 특히 해산 어류와 새우의 초기 유생기(larval stage)용 생물 이료로서 사용되고 있다. 생물 이료로서의 아르테미아 나우플리이 그 자체는 시판되고 있지 않으나, 이로부터 나우플리이를 부화시킬 수 있는 아르테미아 낭포로서 시판되고 있다. 상기 낭포의 부화는, 동일한 부화 기반(hatching infrastructure)을 사용하여 매일 새로운 자유 유영성 나우플리이 공급물을 생산할 수 있도록, 전형적으로 24시간 미만의 항온 배양 기간 동안 이들 낭포를 부화용 배지에서 항온 배양함으로써 수행한다.

아르테미아의 피낭 배아 또는 낭포에서는, 해당 동물의 배아 발생이 낭배 기(gastrula stage)에서 중지된다(또는 휴면 상태로 들어간다). 그 자체로서 암컷에 의해 수생(aquatic) 환경 내로 방출되었기 때문에, 이들 휴면성 또는 휴지기 배아는, 그 밖의 다른 부화 촉진성 환경 조건에 노출되었을 때 자유 유영성 나우플리이로의 추가의 발생을 진행하지 않을 것이다. 휴면 제어 기전이 외부 자극에 의해 활성을 상실한 경우에만 발생이 다시 시작될 것이다. 천연 환경 하에서는, 한냉 쇽(동면)과 탈수가 이러한 휴면 상태를 종결시키는 것으로 공지되어 있다. 이로써 활성화된(또는 정지성) 배아는 항온 배양 조건이 허용되는 경우에 다시 발생을 진행할 수 있다.

정지성 낭포 뿐만 아니라 휴면성 낭포도 장기간의 탈수 및 무산소 상태, 극온 및 극압을 견뎌낼 수 있다. 천연 환경 하에서는, 이러한 내성이 해당 종의 생 존 전략인데, 이는 낭포가 종종 일시적으로, 소정의 소생활권에서의 해당 동물의 유일한 생존 기이기 때문이다. 이들의 천연 환경을 벗어나서, 충분히 탈수되고 적당히 저장된 경우, 즉 무수 환경, 바람직하게는 저온에서 빛과 산소가 없는 환경 하에 놓여진 경우, 상기 낭포는 상당 기간(수 년) 동안 여전히 생육 가능하다. 이러한 장기간의 저장능력과 이에 따라 연중 계속해서 살 수 있어 이용 가능한 특성은, 상기 자유 유영성 나우플리이 생산에 필요한 짧은 항온 배양 시간과 함께, 상기 낭포가 가장 편리하고도 최소한의 노동-집약적인 양식용 생물 이료 공급원이 되도록 만들었다[참조: Van Stappen, 1996].

상기 낭포의 통상적인 항온 배양 동안 관찰될 항온 배양 배지의 무생물적 파라미터는 염도, pH, 산소 농도, 및 항온 배양 동안의 수온이다. 문헌[참조: Van Stappen (1996)]에는 이들 각각의 파라미터가 논의되어 있고, 정지성 낭포를 최적으로 부화시킬 수 있는 범위(즉, 자유 유영성 나우플리이의 최대 생산 범위)가 제공되어 있다:

- 염도: 용해된 염 5 내지 35g/ℓ

- pH: >8

- 산소: >2g/ℓ, 바람직하게는 >5g/ℓ

- 온도: 25 내지 28℃.

항온 배양 동안 배아 발생을 다시 시작하는 것을 촉진시키기 위해서는, 수 표면에서의 광도가 2000룩스(lux) 이상이어야 한다. 문헌[참조: Van Stappen (1996)]에는, 항온 배양기 탱크에 원뿔형 바닥부가 장착된 경우와, 해당 낭포 밀도 가 1리터당 낭포 2g을 초과하지 않는 경우에 최상의 결과가 수득된다고 추가로 기재되어 있다.

후자 양식 적용을 위한 아르테미아 낭포를 천연 환경으로부터 수집한다. 이와 같이 수거된 천연 그대로의 생성물에서는, 정지성 및 휴면성 낭포가 다양한 비율로 존재한다. 일련의 처리 과정과 컨디셔닝 과정을 적용한 후에, 즉시 사용할 수 있는 무수 시판품을 수득한다. 이러한 처리 과정에서는, 상기 천연 그대로의 생성물을 정제하고[쇄설물(debris) 제거], 세척하며(염 제거) 최종적으로 건조시킨다. 표준 컨디셔닝 기술은 전형적으로, 천연 동면 환경(냉장 창고에서의 저장) 및/또는 천연 건조 환경(상기 처리 과정의 일부로서 열기를 이용하여 건조시킴)을 모방하여 시도하며, 이로써 대개는, 상기 개개의 낭포 거의 모두에서 휴면 기전 활성이 상실된다.

소정의 낭포 샘플의 전체 량은 몇몇 특징에 따라서 결정된다. 낭포 샘플을 정량화하기 위해 가장 자주 고려되는 특성들은 해당 낭포의 순도(예를 들면, 깨어진 외피를 지닌 낭포의 비율, 즉 비어있는 외피, 외피 단편, 모래 및/또는 기타 쇄설물과 같은 불순물의 비율(%)); 낭포와 나우플리이의 생물 측정학(biometrics)(낭포의 직경, 나우플리이의 길이 및 폭); 유생 어류 및 새우에 대한 나우플리이의 영양가(예: HUFA의 함량); 낭포 및 궁극적으로는 나우플리이가 독성 물질, 예를 들면, 중금속 및 살충제에 오염된 정도; 및 낭포의 부화율이다. 경제적인 관점에서 보면, 상기 후자 특징이 가장 잘 고려되고 있는데, 이는 이러한 특징이 최적의 부화 조건 하에서 소정 량의 낭포로부터 수득될 수 있는 생물 이료(나우플리이)의 양 을 직접적으로 지시해주기 때문이다. 이는 일반적으로 허용되고 있는 몇몇 방식으로 표현될 수 있다[참조: Van Stappen, 1996]: 부화율(H%: 100개의 완전한 낭포로부터 출현되는 자유 유영성 나우플리이의 수), 부화 효율(Heff: 낭포 생성물 1g으로부터 부화되는 자유 유영성 나우플리이의 수), 부화 생산량(Houtput: 낭포 생성물 1g으로부터 부화되는 자유 유영성 나우플리이의 중량). 부화 특징에 근거하여 낭포 샘플을 상호 비교하고 분류하는 것은, 부화 특징을 각 샘플 중에서 동일한 실험 조건 하에서 결정할 경우에만 유효하다. 이들 조건은 문헌[참조: Van Stappen (1996)]에 논의된 바와 같이 결정적인 몇몇 무생물적 파라미터의 최적의 범위를 고려해야만 한다.

부화는 허용될 수 있는 환경상의 조건 하에서 정지성 낭포에서만 일어난다. 이는 실제적으로 복잡하고도 통합적인 사건 순서에 따른 결과인데, 이는 3가지 별개의 상(phase)으로 분류될 수 있는 것으로 널리 인식되고 있다[참조: Clegg and Conte, 1980].

부화 과정의 제1 상은 소위 예비-출현 발생(PED) 상이다. 항온 배양 조건에 따라서, PED는 약 6 내지 18시간 지속된다[참조: Clegg and Conte, 1980]. 상기 상은 해당 낭포의 외피가 파쇄되면서 종결되고, 이와 같이 파열된 외피 벽을 통하여 미래의 나우플리우스(nauplius)를 부분적으로 볼 수 있게 된다[참조: Hofmann and Hand, 1990a]. 이러한 낭포 부화기가 E1-기(stage)로 불리운다[참조: Nakanishi et al., 1962, Clegg and Conte, 1980]. PED 동안에는, 세포 수가 전혀 증가하지 않았을 뿐만 아니라[참조: Nakanishi et al., 1962] DNA 합성에 대한 어 떠한 증거도 존재하지 않는다[참조: Nakanishi et al., 1963]. 배아 변화는 세포하 수준에 있고, 이는 특히, 미토콘드리아의 성숙도, 난황 혈소판(yolk platelet)의 구조적, 정량적 및 정성적 변화, 몇몇 효소 시스템의 활성화, 및 저장된 에너지의 부분적 소모를 포함한다[참조: Hofmann and Hand, 1990a; Hofmann and Hand, 1990b; Hand, 1993; Clegg, 1997].

부화 과정의 제2 상 동안에는, PED가 완료된지 약 2시간 후에[참조: Clegg and Conte, 1980] 완전히 가시적으로 될 때까지, 상기 E1 기가 해당 외피로부터 점점 더 증가하여 비어져 나온다. 이때, 이러한 배아 발생기는 E2-기 또는 움브렐라 기(umbrella stage)로 칭해진다. 상기 E2-기는 부화 막으로 둘러싸여 있으며, 이는 또한, 해당 배아에 현재 비어있는 낭포 외피를 마지막으로 연결시켜 준다.

2 내지 4시간 동안 더 항온 배양하면, 상기 부화 막이 파열되어, 현재 완전히 발생된 나우플리우스 유생(N-1 기 또는 제1 기 나우플리우스)이 주변 배지에 방출된다(실제적 부화기 또는 전반적인 부화 과정 중의 제3 기)[참조: Clegg and Conte, 1980].

부화율(H%, Heff 또는 Houtput로서 측정된다)은 부화 과정의 최종 결과, 즉 자유 유영성 나우플리우스를 고려한 것이다. 이러한 자유 유영성 나우플리우스의 방출 보다 먼저 일어나는 상이한 부화 상에 관한 어떠한 징후도 제시되지 않고 있다. 따라서, 부화율이 반드시 피낭 배아의 생육도를 지시해주는 인자는 아니다. E1-기(=PED 완료 후)의 배아가 종종 자유 유영성 나우플리우스 기로 진행될 수 없는 이유는 부적절한 항온 배양 조건과 가장 밀접한 관련이 있다. 그러나, 해당 낭 포에 내재된 요인이 상기와 같은 문제를 유발시킬 수도 있다(예를 들면, 저장된 에너지의 불충분한 양). 더우기, 몇몇 아르테미아 균주 또는 이와 동일한 균주 내에서의 몇몇 배치에서는, 다소 다수의 배아가 살아 있긴 하지만, PED를 시작할 수 없고, 이로 인해 E1-기에 도달하지 못한다. 이러한 균주 또는 배치의 경우, 이 순간까지 적용된 처리 과정 및/또는 컨디셔닝 기술이, 개개의 낭포 모두에서의 휴면 상태를 탈활성화시키지 못한 것은 명백한 일이며, 최대 수의 자유 유영성 나우플리이를 수득하기 위해서는, 상보적이고도 보다 특이적인 휴면 상태 탈활성화 과정이 필요할 것이다[참조: Van Stappen, 1996]. 보고된 과정으로는, 건조된 낭포의 한냉 저장 연장, 수화-탈수 주기 반복, 특정한 화학물질(예: 과산화수소) 용액 중에서의 단기간 항온 배양이 있다. 이들 기술은 균주 및 배치 특이적이고, 게다가 해당 낭포는 종종 상궤를 벗어난 방식으로 반응한다. 적절하게 수행되지 않을 경우에는, 심지어 불리한 결과가 초래되기도 한다(예를 들면, 부적당한 시간-용량 조합 하에 화학물질 용액 중에서의 항온 배양). 이들 기술은 낭포 사용자에 의해 지금까지 적용되어 온 상기 처리 과정에 덧붙여 및 이러한 처리 과정 후에 적용해야 한다. 이를 위해서는, 사용자가 처리하고자 하는 특정한 균주 또는 배치에 관한 특정한 정보 뿐만 아니라 많은 작업량, 기술 및 충분한 총칭적 아르테미아 배경 지식을 필요로 한다. 이러한 것을 충분히 인지하지 못하면, 실수가 발생되고/되거나 바람직하지 못한 결과가 초래될 것이다. 이러한 특정의 상보적 휴면 상태 탈활성화 기술이 지니는 사용자에 대한 비우호적인 성질로 인해, 아르테미아 낭포의 주요 이점 중의 하나가 없어지는데, 즉 용이하게 입수 가능한 신선한 양식용 이료 공급원이라 는 이점이 없어진다.

휴면성 낭포를 포함한 아르테미아 낭포의 부화율을 증가시키기 위해 과산화수소를 사용하는 방법이, 예를 들면, 문헌[참조: Van Stappen et al. (1998)]에 기재되어 있다. 이에 보고된 방법에서는, 상기 낭포를 수돗물에서 30 내지 180분 동안 예비수화시킨 다음, 1, 5, 10, 20 또는 27%(w/w)의 농도로 탈이온수로 희석된 과산화수소 용액에서 처리한다. 1, 5, 10, 20 또는 30분 동안 처리한 후, 미량의 H₂O₂를 제거하기 위해 상기 낭포를 수돗물로 철저히 세정시킨 시브 상에 수집하고, 이를 문헌[참조: Sorgeloos et al. (1986)]에 요약된 표준 부화 조건 하에 해수에서 항온 배양한다. 이와 같이 과산화수소를 제거한 후에 상기 낭포를 해수에서 재-항온 배양하는 것은 상기 공지된 방법의 필수 단계인데, 이는 상기 저자가 언급한 바와 같이, 적용된 H₂O₂-농도 수준이 어떠한 동물 세포에 대해서도 치명적인 것으로 일반적으로 인식되기 때문이다.

상기 공지된 방법의 단점은 목적하는 결과를 달성하기 위해 적용된 과산화수소 농도와 처리 시간을 조심스럽게 제어해야만 한다는 것이다. 상기 저자는 또한, 그들이 보고한 방법을 상이한 아르테미아 균주 또는 동일한 균주의 상이한 배치 상에 적용하게 되면, 동일한 정도의 휴면 상태 탈활성화가 발생되지 않았다는 사실을 발견하였다. 따라서, 이들은 상기 방법을 일반론적으로 적용하는 것은 위험하다고 경고하고 있다. 추가의 단점은 해당 낭포를 수화 배지로부터 과산화수소 용액으로 옮긴 다음, 이를 부화용 배지에 옮겨야 하는데, 이를 위해서는, 정확한 시점에 수 행해야만 하는 다소 많은 추가 공정 단계가 수반된다는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 통상적인 부화 과정을 수행하는데 요구되는 단계 및 제어 이외의 많은 공정 단계와 제어를 요구하지 않으면서 해당 낭포의 부화율을 증가시키기 위해 낭포를 과산화수소로 처리할 수 있게 하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

이를 위해서, 상기 과산화수소를, 부화용 배지 1리터당 0.5 내지 30mg의 범위 내에서 선택된 양으로 부화용 배지에 도입하는데, 여기서 상기 낭포는 부화율을 X%에서부터 X% 보다 높은 값으로 증가시키기 위해 부화용 배지 1리터당 최대 약 5g의 낭포 무수물의 밀도로 항온 배양한다.

본 발명자들은 이러한 소량의 과산화수소를 부화용 배지에 도입함으로써, 휴면성 낭포의 휴면 상태를 중단시키고, 이로써 부화율을 증가시킬 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 이와 같이 소량의 과산화수소를 사용하는 경우의 중요한 이점은 특정한 처리 시간 후에도 부화용 배지를 재충전시킬 필요가 없을 뿐만 아니라 처리 시간 후에 과산화수소를 중화시키는 단계를 취할 필요가 없다는 것이다. 사실상, 과산화수소를 단지 해당 부화용 배지 내에 낭포와 함께 잔존시키기만 해도, 이의 농도는 특히 상기 낭포와의 화학적 반응 결과로서 감소하게 되어, 상기 낭포의 외피가 파열되면 과산화수소 농도가 나우플리이에 무해한 수준으로 감소하게 된다는 사실이 밝혀졌다.

과산화수소를 부화용 배지에 부가하는 것은 그 자체가 이미 문헌[참조: Bogatova and Erofeeva (1985)]로부터 공지되어 있다. 상기 문헌에 보고된 실험에서는, 무수 낭포를 부화시키기 위해 8, 10 및 15g/l의 밀도로 항온 배양한 다음, 과산화수소를 23, 33, 66, 99, 132 및 247mg/l의 양으로 가한다. 이로써 수득된 결과는, 33, 66 및 99mg H₂O₂를 사용한 경우에, 부화율의 상당한 증가가 획득될 수 있었다고 제시하고 있다. 그러나, 상기 저자에 따르면, 23mg/l의 H₂O₂ 양은 불충분한 것으로 입증된 반면, 132 및 247mg/l의 양은 다량의 나우플리이 사멸을 가져다 주었다.

문헌[참조: Bogatova and Erofeeva (1985)]에 보고된 방법의 중요한 단점은 이들 방법이 대규모 부화장 시스템에 적용될 경우에는 실제적인 중요성이 제한된다는 것인데; 문헌[참조: Van Stappen et al. (1996)]에 따르면, 소규모 용적(<20리터)에 대해서는 낭포 밀도가 5g/l 정도로 높을 수 있지만, 보다 큰 용적에 대해서는 최대 2g/l로 감소시켜야만 하는데, 이는 나우플리이의 기계적 상해를 최소화시키고 최적 기준 미달의 수 조건을 피하기 위해서이다. 이 때문에, 문헌[참조: Bogatova and Erofeeva (1985)]의 실험에서 항온 배양된 바와 같은 대규모 낭포 밀도는 실제적인 조건 하에서 큰 문제점을 제기할 것이며, 특히 나우플리이를 일정하고도 신뢰성 있는 수준으로 생산할 수 없게 만든다. 더우기, 문헌[참조: Bogatova and Erofeeva (1985)]에서 시험된 최적의 H₂O₂ 농도 하에서는, 해당 낭포가 단지 48시간 이내에 부화하는 반면, 실제적 목적을 위해서는, 동일한 부화 기반을 사용하 여 매일 신선한 나우플리이가 생산될 수 있도록 이들 낭포가 24시간 이내에 부화되어야 한다. 문헌[참조: Bogatova and Erofeeva (1985)]에 기재된 연구 목적은 휴면성 낭포의 휴면 상태를 중단시키는데 요구되는 과산화수소의 양을 감소시키는데 있기 때문에(부화되기 전에 해당 낭포를, 무수 낭포 1kg당 H₂O₂ 1kg의 양으로 활성화시키는 공지된 방법과 비교해서 감소시킴), 생산 표면적을 감소시킬 뿐만 아니라 해당 낭포를 활성화시키는데 필요한 과산화수소의 양을 감소시킬 의도로 고밀도의 낭포가 사용된 것으로 여겨진다. 이러한 목적은 문헌[참조: Bogatova and Erofeeva (1985)]에 기재되어 있을 뿐만 아니라 이들의 특허 출원 SU-A-935044에 기재되어 있다. 상기 특허 출원에 기재된 실험에서는, 항온 배양한지 48시간 후에 부화율을 결정하였다. 이는 1리터당 10g 낭포의 부화 밀도와, 33 내지 99ppm의 과산화수소 농도를 이용하여 수행하였다. 이 보다 적은 농도는 사용되지 않았는데, 이는 이러한 적은 농도를 이용하게 되면, 해당 낭포가 완전히 활성화되지 않을 수 있기 때문이다.

그러나, 본 발명에 따르면, 보다 낮은 낭포 밀도, 특히 1리터당 5g의 낭포 무수물, 바람직하게는 이 보다 더 적은 양의 낭포 무수물의 낭포 밀도를 사용하는 경우에는, 부화율을 목적하는 수준으로 증가시키기 위해 문헌[참조: Bogatova and Erofeeva (1985)]에 제시된 과산화수소의 양이 더 이상 이러한 부화율 증가를 제공해주지 않을 뿐 더러 오히려 부화율을 감소시킨다는 사실이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 다소 놀랍게도, 휴면 상태를 중단시키기에 불충분한 것으로 문헌[참조: Bogatova and Erofeeva (1985)]에 보고된 과산화수소의 양이, 본 발명의 방법에서는 오히려 휴면성 낭포의 휴면 상태를 효과적으로 중단시키는데 충분하다는 사실이 추가로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따르는 방법의 중요한 이점은, 낭포를 다량의 부화용 배지에서 부화시켜 본 방법을 실제적인 조건 하에서 효과적이도록 만든다는 사실에도 불구하고, 요구되는 이의 부화용 배지 내에서의 농도를 달성하는데 다량의 과산화수소가 필요치 않다는 점이다. 사실상, 휴면 상태를 중단시키는데 필요한 과산화수소의 양이 비교적 적거나 또는 보다 큰 용적의 부화용 배지에 부가되든지 간에, 휴면성 낭포는 이러한 과산화수소의 양을 흡수하여, 부화용 배지의 용적과 독립적으로, 실질적으로 동일한 양의 과산화수소가 낭포 1g당 요구되는 것으로 여겨진다.

과산화수소를 부화용 배지에 가하여 아르테미아 낭포를 활성화시키는 방법이 또한 SU-A-1472011에 기재되어 있다. 이러한 공지된 방법에서는, 부화용 배지 1리터당 10g의 밀도로 낭포를 항온 배양하고, 낭포 1kg당 과산화수소 10g을 상기 부화용 배지에 가한다. 이들 양에 근거하여, 부화용 배지 1리터당 100mg 양의 과산화수소가 도입된다는 것을 산정할 수 있다. 다시 언급하면, 훨씬 더 높은 밀도의 낭포와 과산화수소 농도가 상기 선행 기술 방법에 사용된다.

본 발명에 따르는 방법의 바람직한 양태에서는, 과산화수소의 선택 량이 20mg/l 미만, 보다 특히 15mg/l 미만 내지 1mg/l 초과, 특히 2mg/l 초과, 보다 특히 3mg/l 초과이다.

본 발명은 추가로, 자유 유영성 나우플리이를 생산하기 위해 부화용 배지에 서 항온 배양하도록 예정된 아르테미아 낭포에 관한 것인데, 이러한 낭포는 과산화수소의 부재 하에 부화용 배지에서 부화되는 경우의 전체 낭포의 총 수의 X% 부화율을 나타낸다. 본 발명에 따르는 낭포는, 이들을 일정 량의 과산화수소 및/또는 부화용 배지에 부가될 때 과산화수소를 생성시키는 한 가지 이상의 화합물과 조합되는 것을 특징으로 하는데, 상기 일정 양은, 이러한 양의 과산화수소를 부화용 배지에 도입할 때 낭포의 부화율을 X%에서부터 X% 보다 높은 부화율로 증가시키기에 충분한 정도로 부화용 배지에 도입되는 과산화수소의 양이다.

낭포 그 자체, 특히 휴면성 및 정지성 낭포를 함유하는 낭포와 비교하면, 본 발명에 따르는 낭포와 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물과의 조합물은, 상기 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물을 부화용 배지에 부가함으로써 보다 높은 부화율을 달성할 수 있다는 이점을 지니고 있다. 이러한 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물을 해당 낭포와 조합하기 때문에, 사용자가 항온 배양 방법에 사용되는 개개 성분들을 별도로 구입 및 저장해야 하는 것과 같은 상세한 계획을 세워야 하는 불편함을 피할 수 있다. 바람직하게는, 낭포와, 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물을 연합해서 패키지한다. 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물을 별도의 패키징에 함유할 수 있지만, 해당 낭포와 혼합하고/하거나 이에 부착 또는 피복시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르는 패키지된 낭포의 바람직한 양태에서는, 낭포를 항온 배양해야 하는 부화성 배지에 상기 량의 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물을 가할 때, 이러한 낭포의 부화율을 제1부화율(X%)에서부터 제2부화율(X% 보다 높은 부화율)로 증가시키는 방식으로, 상기 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물의 양을 결정한다.

이러한 바람직한 양태는 상기 첨가제(들)를 소정의 낭포 배치에 정확하고도 적시에 투여하기 위해 전문 지식을 이용할 필요성을 없애준다. 최적의 용량은 낭포 균주 간이나 동일한 균주 내의 배치 간에 상이할 수 있기 때문에, 따라서, 낭포와 요구 량의 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물의 조합물은 최적 기준 미달의 부화 결과 및 심지어 불리한 부화 결과의 위험성을 제거시켜 주는데, 예를 들면, 과산화수소 또는 과산화수소 생성 화합물의 지나친 과량 투여는 부화율을 상당히 감소시키는 반면, 최소한의 과량 투여는 부화 지연을 가져다 준다.

본 발명의 기타 특징 및 이점들은 본 발명에 따르는 패키지된 낭포 및 부화 방법의 몇몇 특정한 양태에 관한 다음 기재 내용으로부터 명백해질 것이다. 본 명세서에서, 다음과 같이 첨부된 도면을 참조한다:

도 1은 휴면성 낭포를 포함한 아르테미아 낭포의 부화에 대한, 이들 아르테미아 낭포의 항온 배양을 시작한 후에 부화용 배지에 과산화수소 5mg/l를 부가한 시간(h)의 효과를 도시한 그래프이다.

도 2는 휴면성 낭포를 포함한 아르테미아 낭포의 부화에 대한, 부화용 배지에 부가된 과산화수소의 용량 관련 효과를 도시한 그래프이다.

도 3은 부화용 배지 내에서의 낭포 밀도에 따른, 약 8.5mg/l의 과산화수소가 부가된 부화용 배지 내에서의 과산화수소 농도 감소를 도시한 그래프이다.

도 4는 약 8.5mg/l의 과산화수소가 부가된, 도 3에 대해 사용된 바와 동일한 부화용 배지에서의 이의 부화에 대한, 이들 낭포 밀도의 상응하는 효과를 도시한 그래프이다.

도 5는 도 3의 그래프와 유사하고 동일한 양의 약 8.5mg/l의 과산화수소가 부가된 동일한 부화용 배지에 대해 정립되었지만, 약간 적은 양의 휴면성 낭포를 함유하는 아르테미아 낭포의 또 다른 배치에 대해 정립된 그래프이다.

도 6은 도 4와 유사하지만, 도 5를 정립하기 위해 사용된 낭포에 대해 정립시킨 그래프이다.

본 발명은 일반적으로, 일정 수의 휴면성 낭포를 함유하는 아르테미아 낭포로부터 출발하여 자유 유영성 아르테미아 나우플리이를 생산하는 방법에 관한 것이다. 통상적인 부화 방법에서와 같이, 상기 낭포를 예정된 항온 배양 기간, 통상적으로 1일(24시간)의 항온 배양 기간 내에 부화시켜 자유 유영성 나우플리이를 방출시킬 수 있는 조건 하에 부화용 배지에서 항온 배양한다. 이러한 약 24시간 이하의 항온 배양 기간 동안, 48시간의 항온 배양 기간 내에 부화된 낭포의 90% 이상이 바람직하게는, 이러한 항온 배양 기간 내에 부화된다. 상기 항온 배양 기간은, 건조된 낭포 또는 염수에서 저장된 낭포(습윤 낭포)를 적어도 물을 함유하는 부화용 배지에 부가할 때 시작되는데, 즉 상기 낭포가 수화되기 시작할 때 항온 배양을 개시한다. 부화용 배지의 조성과 최적의 부화 조건은 일반적으로 당업자에게 공지되 어 있고 당해 분야의 문헌, 특히 앞서 언급된 바와 같은 문헌[참조: Van Stappen (1996)]에 기재되어 있기 때문에, 이러한 조성과 조건에 대한 추가의 기재가 본원에 요망되지 않는다. 그러나, 상기 낭포를 최적의 조건과 다소 상이한 조건 하에서 부화시킬 수도 있다는 것을 인지해야 한다. 상기 낭포는, 예를 들면, 28℃ 이상의 온도, 예를 들면, 약 30℃의 온도 또는 용해된 염 35g 이상을 함유하는 부화용 배지에서 부화시킬 수 있다. 약 2g/l 이하의 낭포 밀도가 실제적인 조건 하에서 바람직하긴 하지만, 낭포 밀도가 2g/l 보다 높을 수도 있는데, 본 발명에 따르면, 약 5g/l 보다 높지 말아야 한다.

본 발명에 따르는 방법의 본질적 특징은 예정 량의 과산화수소, 보다 특히 0.5 내지 30mg/l 양의 과산화수소를 부화용 배지에 도입한다는 것이다. 이러한 양은 상기 휴면성 낭포가 해당 항온 배양 기간 내에 자유 유영성 나우플리이를 생산할 수 있도록 하기 위해 적어도 일정 수의 휴면성 아르테미아 낭포의 휴면 상태를 중단시키기에 유효한 방식으로 상기 범위 내에서 선택된다. 상기 낭포가 일정 부분의 휴면성 낭포를 함유하는 경우에는, 부화율이, 과산화수소를 전혀 도입하지 않은 부화용 배지에서 상기 낭포를 부화시킨 경우의 전체 낭포 총 수의 X%에서부터, 과산화수소를 함유하는 부화용 배지에서 상기 낭포를 부화시킨 경우의 X% 보다 높은 부화율로 증가된다. 본 발명에 따르는 방법에서는, 부화용 배지에 부가된 적어도 일정 부분의 휴면성 낭포가 부화되는 것이지, 반드시 모든 휴면성 낭포가 부화될 필요는 없는 것이 명백하지만, 가능한 한 많은 휴면성 낭포가 부화되는 것이 바람직하다.

부화시키기 전에 무수 낭포를 처리함으로써 부화율을 증가시키기 위해 과산화수소 1중량% 이상을 사용하는 선행 기술의 방법과는 대조적으로, 본 발명의 방법에서는, 비교적 저농도의 과산화수소, 보다 특히 나우플리이가 E1-기에 도달하게 되면 이러한 나우플리이에 대해 무해한 농도로 감소되기 때문에 세척 제거시킬 필요가 없는 농도의 과산화수소를 부화용 배지에 제공함으로써, 부화율 증가를 달성시킨다. 따라서, 본 발명에 따르는 방법의 이점은 과산화수소로의 예정된 처리 후에 부화용 배지를 재생시킬 필요가 없다는 점이거나, 또는 상기 처리 후에 과산화수소를 제거시키거나 중화시킬 필요가 없다는 점이다. 이는 특히, 과산화수소가 낭포에 의해 흡수되기 때문이며, 또한 추가로, 부화용 배지 내에서 부화되는 낭포의 양과 비교해서 비교적 소량의 과산화수소가 상기 부화용 배지에 도입되기 때문이다. 그러나, 임의로, 과산화수소의 중화를 증진시키는 화합물을 예정된 처리 기간 후에 상기 부화용 배지에 가할 수 있는데, 특히 PED 상을 완료한 후에 가하거나, 또는 부화용 배지를 재생시킬 수도 있다. 그러나, 이러한 부화용 배지의 중화 또는 재생이 본 발명의 방법에 반드시 필요한 것은 아니다.

본 발명의 방법에서는, 항온 배양 기간이 시작할 때, 특히 부화용 배지에 해당 낭포를 부가할 때 상기 부화용 배지에 과산화수소를 도입함으로써, 상기 과산화수소를 부화용 배지에 도입할 수 있다. 후술되는 바와 같이, 이는 과산화수소 생성 화합물을 건조된 낭포와 혼합하는 경우에 해당될 것이다. 부화용 배지에 낭포를 부가하기 전에 과산화수소를 상기 부화용 배지에 도입할 수도 있다. 이러한 경우, 부화용 배지에 도입된 과산화수소의 양은, 상기 부화용 배지에 낭포를 부가할 때 그 안에 존재하는 과산화수소의 양으로 인지해야 하는데, 이는 과산화수소의 부가 후에는 이의 일부분이 반응되어 제거될 수도 있기 때문이다. 과산화수소를 총 량의 부화용 배지에 도입하는 것 대신, 초기에는 일정 부분의 부화용 배지에 도입한 다음, 나중에 희석시켜 최종 용적의 부화용 배지로 만들 수도 있다. 이러한 경우, 부화용 배지에 부가되거나 도입된 과산화수소의 양은 부화용 배지 최종 용적 1리터당 mg으로 표현되는데, 이러한 부화용 배지에서는 상기 낭포가 1리터당 최대 약 5g의 낭포 무수물의 밀도로 항온 배양된다. 과산화수소가 초기에 도입된 제1 부분의 부화용 배지에서는, 다소 높긴 하지만 낭포에 치명적이지 않은 과산화수소 수준을 달성할 수 있다. 따라서, 해당 낭포를 이러한 부분의 부화용 배지에 가할 수 있다. 예를 들면, 해당 낭포를 부가한지 1시간 이내에 부화 과정의 결과로서 해당 낭포가 과산화수소 수준에 민감해지기 전에, 이러한 부분의 부화용 배지를 추가의 부화용 배지로 희석시켜, 해당 낭포를 1리터당 최대 약 5g의 낭포 무수물의 밀도로 항온 배양하는 최종 부화용 배지를 달성시켜야만 한다. 부화용 배지의 제1 부분은 최종 부화용 배지와 동일한 조성을 나타내지 않으며, 이는 예를 들어, 해수로서 저염 함량의 물, 예를 들면, 수돗물을 포함할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 과산화수소를 해당 낭포와 동시에 부화용 배지에 도입하지 않는 경우에는, 바람직하게는 항온 배양을 시작한지 10시간 이내, 가장 바람직하게는 8시간 이내에 상기 과산화수소를 도입한다. 가장 최상의 부화율 효과를 달성하기 위해서는, 항온 배양을 시작한지 6시간 이내, 특히 5시간 이내에 과산화수소를 부화용 배지에 도입한다. 과산화수소 총 량을 부화용 배지에 한번에 도입하지 말고, 이를 여러번 나누 어(수 회) 도입할 수 있다는 것은 명백하다.

5mg/l H₂O₂를 부화용 배지에 부가하는 시간이 부화율(H%)에 미치는 영향이 도 1에 도시되어 있다. 본 실시예에서는, 일련의 1리터용 원뿔체(cone)를 사용하는데, 여기서 동일한 배치의 휴면성 낭포를 포함한 아르테미아 낭포(수분 함량: 7.5%) 2g을 여과된 해수(35ppt)에서 항온 배양한다. 상기 원뿔체 내의 수온을 약 30℃로 일정하게 유지시키고, 물에 일정하게 탄산 가스를 주입하고 조명한다. 상이한 H₂O₂ 처리에 대해서는, 낭포를 항온 배양하기 시작한지 상이한 시간(0 내지 10시간) 후에 5mg의 H₂O₂를 부화용 배지에 가한다. 각 처리 과정을 2회 수행하고, 이러한 2회 처리 결과를 평균낸다. 도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 실시예에서는, 항온 배양을 시작한지 약 4시간 후에 H₂O₂를 부가하면, 24시간 후에 측정된 부화율이 가장 크게 증가한 것으로 나타났다.

최대 부화율을 획득하기 위해 본 발명에 따라서 부화용 배지에 도입시켜야 하는 과산화수소의 양은 해당 낭포의 배치에 따라 또는 균주에 따라 좌우된다. 일반적으로, 이러한 과산화수소의 양은 30mg/l 미만, 특히 20mg/l 미만, 보다 특히 15mg/l 미만 내지 1mg/l 초과, 특히 2mg/l 초과, 보다 특히 3mg/l 초과이다. 부화용 배지 내의 동일한 밀도의 낭포에 대해서는, 이것이 특히 휴면성 낭포의 수, 특히 휴면 상태 심도, 즉 휴면 기에 좌우된다.

부화율을 증가시키기 위해 부화용 배지에 도입시키고자 하는 과산화수소의 양, 특히 최대 부화율 M%를 제공해주는 과산화수소의 최적 량은 몇몇 낭포 샘플을 취한 다음, 이들 샘플을 대상으로 하여, 부화용 배지 내에서 단위 용적당 도입된 상이한 양의 과산화수소에 의해 서로 상이한 부화용 배지 내에서 실질적으로 동일한 조건(동일한 온도, 염 함량, 낭포 밀도 등) 하에 부화함으로써 결정할 수 있다. 연속해서, 상기 상이한 과산화수소 양에 대해 부화율을 결정할 수 있으며, 목적하는 부화율 증가를 제공해주는 과산화수소 양, 특히 가장 높은 부화율 M%을 제공해주는 최적의 과산화수소 양을 선택할 수 있다. 최대 부화율 M%를 제공해주는 과산화수소 양을 선택하는 것 대신, 이 보다 낮은 부화율, 특히 X% + 0.4*(M-X)%[여기서, X%는 H₂O₂가 전혀 부가되지 않을 경우의 부화율이다) 이상의 부화율, 바람직하게는 X% + 0.6*(M-X)% 이상의 부화율을 제공해주는 과산화수소 양을 선택하는 것이 또한 가능한데, 상기 최대 부화율 M%를 제공해주는 과산화수소 양에 실질직으로 상응하는 과산화수소 양을 선택하는 것이 가장 바람직하다.

도 2는 휴면성 낭포를 함유하는 아르테미아 낭포 배치의 부화율(H%)에 대한 H₂O₂의 용량 관련 효과를 도시한 것이다. 본 실시예에서는, 수분 함량이 8.3%인 아르테미아 낭포 2g을 도 1에 도시된 실시예에 대해 상기 언급된 바와 동일한 부화 조건(해수, 약 30℃ 온도, 일정한 탄산 가스 주입 및 조명) 하에 일련의 1리터용 원뿔체에서 항온 배양한다. 낭포를 항온 배양하기 시작한 직후에 과산화수소를 가한다. 상이한 원뿔체에 상이한 양의 H₂O₂를 가하여 0 내지 30g/l이 되도록 한다. 각 처리 과정을 다시 2회 수행하고, 이러한 2회 처리 결과를 평균낸다.

도 2로부터 추론할 수 있는 바와 같이, 사용된 아르테미아 낭포 배치의 경 우, 과산화수소의 최적 량은 약 12mg/l(=ppm) H₂O₂ 인데, 이는 부화율을 약 22%(=X%)에서 약 76%(=M%)로 증가시켜 준다. 상기 농도 이상의 과산화수소는 아르테미아 나우플리이에 대해 독성적으로 작용하여, 부화율 감소를 초래한다.

낭포의 상이한 균주 또는 배치 간의 상호 차이 이외에도, 가장 높은 부화율을 달성하기 위해 부화용 배지 내로 도입될 과산화수소의 최적 량이 또한, 부화용 배지 중의 낭포 밀도에 좌우된다는 사실이 본 발명에 따라서 밝혀졌다. 특히, 낭포 밀도가 더 높을 수록, 부화용 배지 내의 단위 용적당 도입시켜야 하는 과산화수소의 양이 더 많아지는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따르는 방법에서는, 낭포 밀도가 1리터당 많아야 약 5g의 낭포 무수물이지만, 바람직하게는 1리터당 4g 미만의 낭포 무수물, 보다 바람직하게는 1리터당 3g 미만의 낭포 무수물, 가장 바람직하게는 1리터당 약 2g 이하의 낭포 무수물이다. 본 발명자들은 낭포 밀도가 더 높을 수록, 부화용 배지 내의 단위 용적당 도입시켜야 하는 과산화수소의 양이 더 많아지고 해당 낭포에 의해 흡수되는 과산화수소의 양이 더 많아진다는 사실을 밝혀내었다.

다음 실시예에서는, 일련의 1리터용 원뿔체에 휴면성 낭포를 포함한 상이한 양의 낭포(낭포의 수분 함량=8%)를 0.5, 1, 2, 3 및 4g 무수 낭포/l의 밀도에 상응하게 접종한다. 시험된 각 낭포 밀도에 대해, 한 세트의 원뿔체는 과산화물을 전혀 함유하고 있지 않는 반면, 제2 세트의 원뿔체에는 항온 배양 개시시 약 8.5mg/l의 과산화수소를 가하였다. 낭포 밀도와 과산화물의 각 조합을 2회 수행하였다. 상기 총 20개의 원뿔체(실험 처리용)와는 별도로, 부화용 배지와 약 8.5mg/l 과산화수소 만을 함유하는 2개의 보충용 원뿔체(대조군 처리용)를 설치하였다. 모든 원뿔체에 여과된 해수 35ppt를 사용하였다. 이러한 실험 과정 동안, 물에 탄산 가스를 일정하게 주입하고, 조명한 다음, 약 30℃ 온도로 일정하게 유지시킨다. 본 실시예에서는, 항온 배양을 개시한지 4.5시간이 지날 때까지 30분 간격으로 모든 원뿔체에서 과산화수소 농도를 측정하였다. 도 3은 각 실험용 처리에 대해, 측정 시점에서의 과산화물 잔여량을 제시한 것이고, 이는 2가지 이중물의 평균 값을 감소시킴으로써 2가지 대조군의 평균 값에 상응하는 양과 함께 수득한다. 상기 실험용 처리에 대한 부화 결과는 항온 배양을 시작한지 24시간 후에 계수하였는데(도 4), 이러한 처리 결과는 상기 이중물의 평균치로 나타내었다. 도 3은 과산화수소의 감소가 낭포 밀도에 좌우된다는 것을 명백히 보여주고 있다. 8.5mg/l의 H₂O₂ 양은 4g/l의 밀도에 대해 너무 적은 것으로 여겨지는데, 이는 4.5시간 후에, 과산화수소가 이미 거의 완전히 소멸되었기 때문이다. 이는 약 8시간 후에 일어나야 하는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다. 이는 1리터당 2g 낭포 밀도의 경우에 해당될 것이기 때문에, 8.5mg/l가 1리터당 2g 낭포를 처리하는데 최적의 양이 되는 반면, 보다 낮은 밀도에 대해서는, 8.5mg/l의 양이 너무 많을 것으로 예상할 수 있다.

도 4는 해당 낭포의 부화에 대한 과산화수소 처리 효과를 도시한 것이다. 부화 결과가 부화율(H%: 100개의 완전한 낭포로부터 출현되는 자유 유영성 나우플리이의 수) 또는 유효율(E%: 100개의 완전한 낭포로부터 생산되는 자유 유영성 나 우플리이, E1 및 E2 기의 총 수)로서 나타낸다. 도 4는 과산화수소 처리하지 않은 경우에는, 낭포 배치의 부화율이 약 20%라는 것을 예시해준다. 부화용 배지 1리터당 8.5mg H₂O₂를 가한 경우에는, 부화율이 2g/l의 밀도에 대해 약 70%로 될 수 있다. 보다 낮은 밀도에서는, E1 및 E2 기가 추가로 발생되지 않았는데, 이는 너무 높은 농도의 과산화수소가 부화용 배지 내에 잔존하기 때문이다. E%가 H% 보다 실질적으로 높은 경우에는, 과량의 과산화물을 적용한다. 보다 높은 밀도에서는, 8.5mg/l가 최적의 부화를 획득하기에 충분히 높지 않다.

도 5는 도 3과 유사하지만, 상이한 배치에 대한 낭포 밀도에 따라서 부화용 배지 내에서의 H₂O₂ 감소를 예시해주고 있다. 도 6은 도 4와 유사한데, 이는 상기 상이한 배치의 낭포의 상이한 밀도에 대해 수득된 부화율과 유효율을 예시해준다. 해당 낭포를 앞서의 실시예에서와 동일한 조건 하에 부화시키고, 필적하는 양의 H₂O₂, 즉 부화용 배지 1리터당 약 8.5mg을 가한다. 도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 낭포는 부화용 배지 중의 과산화수소의 농도를 상당히 더 작게 감소시키고, E1 나우플리이가 부화될 때 너무 많은 양의 과산화수소가 부화용 배지 내에 잔존할 것이다. 도 6은 해당 낭포 배치에 대해, 정상적인 부화율(H%)이 약 65%이어서, 이러한 낭포 배치는 앞서의 실시예에서 보다 상당히 적은 양의 휴면성 낭포를 함유하고 있다는 것을 제시해준다. 외견상, 휴면상 낭포는 정지성 낭포 보다 더 많은 양의 과산화수소를 흡수한다. 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 심지어 4g/l의 낭포 밀도에 대한 과산화수소의 양이 너무 많은데, 이는 자유 유영성 나우 플리이를 생산하는(N1-기) 낭포의 비율이, 과산화수소를 전혀 부가하지 않은 경우 보다 더 적기 때문이다. 그러나, E1 기, E2 기 및 N1 기의 총 량이 증가되었다는 사실로 인해, 보다 적은 양의 과산화수소를 사용함으로써 부화율 증가를 획득할 수 있다.

과산화수소 용액을 부화용 배지에 부가함으로써, 과산화수소 요구 량을 상기 부화용 배지에 도입할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르는 방법에서는, 부화용 배지에 부가될 때 과산화수소를 생성시키는 화합물, 특히 과산화물, 과붕산염, 과황산염 및 과초산염과 같은 과산화물 연계물을 함유하는 과산화수소 생성 화합물을 사용할 수도 있다. 가장 바람직한 과산화수소 생성 화합물은 과산화마그네슘 및 특히 과산화칼슘이다. 이들 화합물은 통상적으로 활성 생성물을 50 내지 70중량% 함유하는 고형 생성물 형태로 입수 가능하다. 이러한 고형 생성물의 이점은, 건조된 낭포를 특히 캔(can)에 패키징하기 전에 이들 생성물을 상기 건조된 낭포와 혼합할 수 있다는 점이다. 기타 고형 생성물과 비교해 보면, 과산화마그네슘과 과산화칼슘이, 예를 들면, (칼륨 또는 나트륨의) 과붕산염 또는 과황산염 보다 더 안정적이라는 추가의 이점을 지니고 있어, 심지어 상기 캔을 실제적인 적용 기간 동안 비교적 고온에서 저장하는 경우에서도, 부화용 배지에 부가될 때 과산화수소 요구 량을 생성시키는 상기 마그네슘 및 칼슘 화합물의 능력을 실질적으로 저하시키지 않을 뿐만 아니라 상기 패키지된 낭포의 보장 수명(shelf live)에 손상을 가할 지도 모르는 상당 량의 산소 가스 방출도 없을 것이다.

최대 부화율을 달성하기 위해 부화용 배지에 도입시켜야 하는 과산화수소의 최적 량을 결정하기 위한 상기 언급된 실시예에서는, 과산화수소 용액을 상기 부화용 배지에 직접 가함으로써 과산화수소를 도입하였다. 부화용 배지에서 과산화수소를 생성시키는 또 다른 화합물 또는 생성물의 실시에 사용하는 경우, 상기 화합물 또는 생성물의 상응하는 필요 량은, 예를 들어, 다음 반응식에 따라서 부화용 배지 중의 과산화수소와 반응하는 과망간칼륨을 통하여 간단히 적정함으로써 결정하거나 산정할 수 있다:

2KMnO₄ + 3H₂SO₄ + 5H₂O₂ ←---→ 5O₂ + 2MnSO₄ + K₂SO₄ + 8H₂O

또 다른 한편, 과산화수소 생성 화합물 또는 생성물의 양을 결정하기 위한 시험은 또한, 상기 화합물을 사용하여 직접적으로 수행할 수 있으므로, 어떠한 전환도 필요치 않다.

본 발명에 따르는 방법에 사용될 예정인 낭포는 바람직하게는, 특정 패키지, 특히 캔에 함유되고, 이를 일정 량의 과산화수소 및/또는 부화용 배지에 부가될 때 과산화수소를 생성시키는 한 가지 이상의 화합물과 조합한다. 이러한 화합물의 예가 상기 제시되어 있다. 상기 과산화수소 및/또는 기타 과산화수소 생성 화합물의 양은 부화용 배지 1리터당 많아야 약 5g의 낭포 무수물을 포함하는 밀도로 부화용 배지에 상기 패키지된 낭포를 부가할 때, 이러한 부화용 배지 내에 상기 언급된 양의 과산화수소를 도입하기에 적어도 충분한 양이다. 바람직하게는, 해당 낭포와 조합되는 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물의 양은, 상기 패키지된 낭포를 항온 배양해야 하는 부화용 배지에 상기 량을 가할 때, 이 안에 과산화수소 요 구 량이 도입되는 방식으로 결정한다. 이러한 방식으로, 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물의 총 량을 측정하지 않고서도, 이들 총 량을 낭포와 함께 부화용 배지에 간단히 가할 수 있다.

과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물의 양은, 상기 패키지된 낭포를 항온 배양해야 하는 일정 용적의 부화용 배지에 상기 량을 가할 때, 이 안에 0.5 내지 30mg/l을 차지하는 양의 과산화수소가 도입되는 방식으로 결정되는 것이 보다 바람직하다. 상술된 바와 같이, 이러한 양은 보다 특히, 해당 낭포를 과산화수소의 부재 하에 부화시킨 경우의 낭포 총 수의 X% 부화율로부터 이들 낭포를 상기 량의 과산화수소의 존재 하에 부화시킨 경우의 X% 보다 높은 부화율로 증가시키도록 상기 범위 내에서 선택한다. 바람직하게는, 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물의 양은, 부화용 배지 내에 이러한 양으로써 도입된 일정 량의 과산화수소의 존재 하에 해당 낭포를 부화시킨 경우에, 부화율이 X% + 0.4*(M-X)% 이상, 바람직하게는 X% + 0.6*(M-X)% 이상, 가장 바람직하게는 실질적으로 M%가 되도록 결정한다. 전술된 바와 같이, M%는 최적 량의 과산화수소를 부화용 배지에 도입할 때 적용된 부화 조건 하에 달성될 수 있는 최대 부화율이다.

본 발명에 따르면, 부화용 배지 중의 과산화수소의 최적 량은 낭포 밀도에 상당히 좌우된다는 사실이 밝혀졌다. 본 발명자들에 의해 수행된 실험으로부터, 사실상 놀랍게도, 낭포, 특히 휴면성 낭포가 부화용 배지 중의 과산화수소의 농도와 거의 독립적으로 과산화수소 요구 량을 흡수하는 것으로 밝혀졌다. 이는 과산화수소를 절약하기 위해 고밀도 낭포가 1회 용량분으로 적용된 것이 아니라는 것을 의미하는데, 이는 보다 저밀도의 낭포에서, 즉 보다 큰 용적의 부화용 배지를 사용하는 경우, 보다 낮은 과산화수소 농도를 달성시켜야 하기 때문이다. 휴면성 낭포의 수, 휴면 상태 심도, 및 배치 간의 차이 또는 균주 간의 차이에 따른 기타 요인에 따라서, 일정 량의 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물은 낭포 무수물 1g당 과산화수소 약 0.5mg 초과, 바람직하게는 약 1mg 초과, 가장 바람직하게는 약 1.5mg 초과 내지 약 15mg 미만, 바람직하게는 약 10mg 미만, 특히 약 7.5mg 미만을 포함하고/하거나 이를 생성시킨다. 실제적으로, 상기 낭포는 결코 절대적으로 건조 상태가 아니기 때문에, 이러한 낭포의 수분 함량(이는 전형적으로 10% 미만이다)에 따라서, 실제적인 낭포 1g당 상응하는 과산화수소 양은 다소 적다.

일정 량의 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물은, 이러한 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물을 해당 낭포로부터 분리시키는 추가의 패키징 내에 함유될 수 있으며, 이러한 조합물은 그 자체로서 시판될 수 있다. 바람직하게는, 상기 과산화수소 및/또는 과산화수소 생성 화합물을 낭포와 연합해서 패키징하는데, 예를 들면, 이를 상기 낭포의 패키징 외부에 고정시킨다. 추가의 패키징은 상기 낭포의 패키징과 함께 별도의 세트를 형성할 수 있지만, 해당 낭포와 함께 이의 패키징 내에 함유되는 것이 바람직하다. 액상의 과산화수소 용액을 사용하는 경우에는, 이것이, 예를 들면, 유리 또는 플라스틱 바이알(들)(병)에 함유될 수 있고, 이를 해당 낭포와 함께 캔에 채울 수 있다. 고형의 과산화수소 생성 화합물을 사용하는 경우에는, 상기 화합물을 분말 또는 미립자 또는 정제 또는 기타 고형물로서 상기 낭포와 직접 혼합할 수 있다. 물론, 예를 들면, 낭포와 혼합된 캡슐 내 에 상기 화합물을 함유시킬 수도 있다. 또 다른 한편, 과산화수소 생성 화합물을 해당 낭포에 추가로 부착시키거나 피복시킬 수 있다.

참조문헌:

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Claims

휴면성 낭포를 포함한 아르테미아(Artemia) 낭포를 과산화수소와 접촉시켜 상기 휴면성 낭포가 휴면 상태를 중단하여 예정된 항온 배양 기간 내에 자유 유영성 나우플리이를 생산할 수 있도록 함으로써, 상기 항온 배양된 낭포의 부화율(%)을, 제1 부화율에서부터 상기 제1 부화율보다 높은 제2 부화율로 증가시키는 것을 포함하여, 상기 휴면성 낭포를 포함한 아르테미아 낭포를 부화용 배지 내에서 부화용 배지 1리터당 최대 5g의 낭포 무수물을 포함하는 밀도로 예정된 항온 배양 기간 동안, 이러한 예정된 항온 배양 기간 내에 상기 낭포를 부화시켜 자유 유영성 나우플리이를 방출시킬 수 있는 조건 하에 항온 배양함으로써, 휴면성 낭포를 포함하는 상기 일정 량의 아르테미아 낭포로부터 출발하여 자유 유영성 아르테미아 나우플리이를 생산하는 방법으로서, 부화율을 상기 제1 부화율에서부터 상기 제2부화율로 증가시키기 위해 상기 낭포를 부화용 배지 1리터당 최대 5g의 낭포 무수물의 밀도로, 항온 배양하는 부화용 배지 1리터당 0.5 내지 30mg 범위 내에서 선택된 양으로 상기 과산화수소를 상기 부화용 배지에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 과산화수소의 선택 양이 배지 1리터당 1mg 초과하고 20mg 미만임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 과산화수소의 선택 양이 배지 1리터당 1mg 초과하고 15mg 미만임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 과산화수소의 선택 양이 배지 1리터당 2mg 초과하고 20mg 미만임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 과산화수소의 선택 양이 배지 1리터당 3mg 초과하고 20mg 미만임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 낭포가 상기 부화용 배지에서, 배지 1리터당 4g 미만의 낭포 무수물의 밀도로 부화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 낭포가 상기 부화용 배지에서, 배지 1리터당 3g 미만의 낭포 무수물의 밀도로 부화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 낭포가 상기 부화용 배지에서, 배지 1리터당 2g 이하의 낭포 무수물의 밀도로 부화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 낭포가, 상기 과산화수소의 양을 변화시켜 상기 부화용 배지에 도입함으로써 부화율을 상기 제1 부화율에서부터 최대 부화율로 증가시킬 수 있고,

상기 과산화수소의 량을, 상기 제2부화율이 상기 제1부화율로부터 상기 최대부화율과 상기 제1 부화율의 차이의 40%를 더한 값 이상이 되도록 하는 범위 내에서 선택하는, 휴면성 낭포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 과산화수소의 량을, 상기 제2부화율이 상기 제1부화율로부터 상기 최대부화율과 상기 제1 부화율의 차이의 60%를 더한 값 이상이 되도록 하는 범위 내에서 선택하는, 휴면성 낭포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 최대 부화율이, 일정 수의 해당 낭포 샘플을 취하고, 이들 샘플을 부화용 배지 내에 단위 용적당 도입되고 상기 범위 내에 있는 상이한 양의 과산화수소에 의해 서로 상이한 상기 부화용 배지에서 부화시키며, 이러한 상이한 과산화수소 량에 대한 부화율을 결정한 다음, 이와 같이 결정된 부화율 중에서 가장 높은 부화율을 선택함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 과산화수소를 부화용 배지에 가함으로써, 상기 과산화수소를 상기 부화용 배지에 도입함을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제12항에 있어서, 과산화수소를 생성시키는 한 가지 이상의 과산화수소 생성 화합물을 부화용 배지에 가함으로써, 상기 과산화수소를 상기 부화용 배지에 도입함을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 한 가지 이상의 과산화수소 생성 화합물은 과산화물 연계물을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 과산화수소 생성 화합물이 과산화물, 과붕산염, 과황산염, 과초산염 또는 이들의 조합물 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 과산화수소 생성 화합물이 고형 화합물임을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 과산화수소 생성 화합물이 과산화칼슘, 과산화마그네슘 또는 과산화칼슘과 과산화마그네슘 화합물 중에서 선택되는 화합물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 과산화수소가, 해당 낭포를 부화용 배지에서 항온 배양하기 시작한 지 10시간 이내에 상기 부화용 배지에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 과산화수소가 상기 부화용 배지에 해당 낭포와 실질적으로 동시에 도입됨을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 과산화수소가 상기 낭포와 혼합됨을 특징으로 하는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 과산화수소가, 상기 낭포 위에 부착 또는 피복됨을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 예정된 항온 배양기간이 24시간 이하이고, 48시간의 항온 배양 기간 내에 부화되는 낭포의 90% 이상이 상기 예정된 항온 배양기간 내에 부화되는 것을 특징으로 하는 방법.
과산화수소의 부재 하에 부화용 배지에서 부화될 때, 제1 부화율을 나타내는, 자유 유영성 나우플리이를 생산하기 위해 부화용 배지에서 항온 배양하도록 예정된 아르테미아 낭포로서,

이러한 아르테미아 낭포가, 상기 부화용 배지에 부가될 때 과산화수소를 생성시키는 과산화수소 생성 화합물, 과산화수소를 포함하는 과산화수소 포함 화합물 또는 상기 과산화수소 생성 화합물 및 상기 과산화수소 포함 화합물의 일정 량과 조합되고, 상기 양은, 과산화수소가 부화용 배지에 도입되는 경우, 상기 낭포의 부화율을 상기 제1 부화율에서부터 상기 제1 부화율보다 높은 제2 부화율로 증가시켜 주는 과산화수소의 양을 부화용 배지 내에 도입하도록 하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제23항에 있어서, 상기 낭포를 항온 배양해야 하는 부화용 배지에 상기 양의 화합물을 가할 때, 이러한 낭포의 부화율을 상기 제1 부화율에서부터 상기 제2 부화율로 증가시키는 방식으로, 상기 과산화수소 포함 화합물, 상기 과산화수소 생성 화합물 또는 상기 과산화수소 생성 화합물 및 상기 과산화수소 포함 화합물의 양을 결정하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제23항에 있어서, 상기 낭포를 항온 배양해야 하는 부화용 배지에 상기 양의 화합물을 가할 때, 0.5 내지 30mg/l을 차지하는 과산화수소 량이 상기 부화용 배지에 도입되는 방식으로, 상기 과산화수소 포함 화합물, 상기 과산화수소 생성 화합물 또는 상기 과산화수소 생성 화합물 및 상기 과산화수소 포함 화합물의 양을 결정하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제23항에 있어서, 부화용 배지 1리터당 약 5g 이하의 낭포 무수물의 예정된 밀도로 상기 부화용 배지에서 항온 배양하도록 예정된 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제23항에 있어서, 상기 낭포가, 과산화수소를 부화용 배지에 도입함으로써 부화율을 상기 제1 부화율에서부터 최대 부화율로 증가시킬 수 있고, 상기 량의 과산화수소가, 낭포를 이의 존재 하에 부화시킨 경우에 상기 제2부화율이 상기 제1부화율로부터 상기 최대부화율과 상기 제1 부화율의 차이의 40%를 더한 값 이상이 되도록 하는 양의 휴면성 낭포를 포함하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제27항에 있어서, 상기 량의 과산화수소가, 낭포를 이의 존재 하에 부화시킨 경우에 상기 제2부화율이 상기 제1부화율로부터 상기 최대부화율과 상기 제1 부화율의 차이의 60%를 더한 값 이상이 되도록 하는 양의 휴면성 낭포를 포함하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제23항에 있어서, 아르테미아 낭포가, 부화용 배지에 부가될 때 과산화수소를 생성시키는 한 가지 이상의 과산화수소 생성 화합물의 일정 량과 조합되는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제29항에 있어서, 상기 과산화수소 생성 화합물이 과산화물 연계물을 함유하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제30항에 있어서, 상기 과산화수소 생성 화합물이 과산화물, 과붕산염, 과황산염, 과초산염 또는 이들의 조합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제29항에 있어서, 상기 과산화수소 생성 화합물이 고형 화합물임을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제32항에 있어서, 상기 과산화수소 생성 화합물이 과산화칼슘, 과산화마그네슘 또는 과산화칼슘과 과산화마그네슘 화합물 중에서 선택되는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제23항에 있어서, 상기 양의 화합물이 낭포 무수물 1g당 과산화수소 15mg 미만 내지 0.5mg 초과를 도입하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제34항에 있어서, 상기 부화용 배지에 부가될 때 상기 양의 화합물이 낭포 무수물 1g당 과산화수소 15mg 미만 내지 1mg 초과를 도입하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제35항에 있어서, 상기 부화용 배지에 부가될 때 상기 양의 화합물이 낭포 무수물 1g당 과산화수소 15mg 미만 내지 1.5mg 초과를 도입하는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제34항에 있어서, 상기 양의 화합물이 상기 낭포와 혼합되는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제34항 또는 제37항에 있어서, 상기 양의 화합물이 상기 낭포 위에 부착 또는 피복되는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제23항에 있어서, 상기 양의 화합물이 상기 부화용 배지에 부가될 때 낭포 무수물 1g당 과산화수소 10mg 미만을 도입하게 되는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제39항에 있어서, 상기 양의 화합물이 상기 부화용 배지에 부가될 때 낭포 무수물 1g당 과산화수소 7.5mg 미만을 도입하게 되는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제23항에 있어서, 상기 낭포가, 부화용 배지에 부가될 때 상기 화합물의 상기 양과 연합하여 패키징되는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제41항에 있어서, 상기 량의 화합물이, 이러한 화합물을 상기 낭포로부터 분리시키는 추가의 패키징에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제41항에 있어서, 상기 양의 화합물이 상기 낭포와 동일한 패키징 내에 함유되어 있음을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제43항에 있어서, 상기 양의 화합물이 상기 낭포와 혼합됨을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.
제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 양의 화합물이 상기 낭포에 부착 또는 피복됨을 특징으로 하는 아르테미아 낭포.