KR100761329B1 - 피부노화 방지 및 주름 생성 억제 효과를 나타내는장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을함유하는 피부외용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다년생 도라지인 장생도라지 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들은 콜라겐(collagen) 합성 촉진효과, 콜라게나제(collagenase) 활성 저해 효과 및 활성 산소 종(reactive oxygen species : ROS) 억제 효과를 나타내어 피부노화 방지 및 주름개선을 위한 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

장생도라지, 활성 산소, 콜라겐, 콜라게나제, 주름개선, 피부노화

Description

피부노화 방지 및 주름 생성 억제 효과를 나타내는 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 함유하는 피부외용 조성물{A topical composition comprising the extract of old platycodon and the purified fractions therefrom inhibiting skin aging and wrinkle formation}

도 1은 장생도라지 조사포닌 분획(CKS)의 HPLC 데이터를 나타낸 도이고,

도 2는 장생도라지 분획물의 제조방법을 나타낸 도이며,

도 3은 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들의 콜라겐 합성 효과를 나타낸 도이고,

도 4는 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들의 콜라겐 합성 효과를 ELISA를 이용하여 확인한 도이며,

도 5는 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들의 COLIA2 프로모터 전사 활성 효과를 나타낸 도이고,

도 6은 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들의 콜라게나제 저해 효과를 나타낸 도이며,

도 7은 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들의 콜라게나제 저해 효과를 나타낸 도이고,

도 8a는 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들의 콜라게나제 관련 유전자 발현 억제 효과를 나타낸 도이며,

도 8b는 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들에 의한 콜라게나제 관련 유전자의 발현 정도를 나타낸 도이고,

도 9는 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들의 활성산소 종의 억제 효과를 나타낸 도이며,

도 10은 AP-1-루시페라제 재조합 벡터를 나타낸 도이고,

도 11은 AP-1(activator protein-1)의 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 피부노화 방지 및 주름개선 효과를 나타내는 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 끊임없이 변화를 겪게 되며, 그 중 가장 대표적인 것이 노화에 의한 피부의 기능 저하 및 시각적인 아름다움의 감소이다. 피부의 노화는 크게 유전적 요소에 따른 내적 노화와 태양광선 등의 외부 환경적 요소에 따른 외적 노화로 구분 된다. 이러한 외적 노화는 피부의 주름을 형성시키며, 대표적인 주름 형성의 인자로서 활성 산소, 자외선 및 콜라겐의 생합성 감소 등을 들 수 있다(Danielle, A study in the epidermiology of crow's feet., Ann . Intern . Med ., 75, pp.873-880, 1971 ; Grove et al., Optical profilometry ; an objective method for quantification of facial wrinkles., J. Am . Acad . Dermatol., 21, pp.631-637, 1989). 피부의 내적 노화의 경우 인위적인 조절이 불가능하나, 외적 노화의 경우 활성산소 제거, 섬유아세포의 증식 및 콜라겐의 생합성 촉진 등의 조절로서 내적 요인에 비하여 용이하다(Schwartz et al., Topical all-trans retinoic acid stimulates collagen synthesis in vivo., J. Invest . Dermatol., 96(6), pp.975-978, 1991).

사람의 피부는 나이가 들어가면서 양적인 면에서나 질적인 면에서 상당히 많은 변화가 일어나게 된다. 이러한 자연 노화 외에도 여러 가지의 외부 환경에 의해서 자극을 받는다. 즉, 분자생물학적인 변화나 외부의 물리, 화학적 인자에 의하여 일련의 변화가 일어난다. 그 중에서도 특히 태양광선에 포함되어 있는 자외선 (ultraviolet ray)에 의한 손상을 광노화 (photoaging)라고 하며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 일반적으로 자외선은 그 파장에 따라 자외선 A (320 ～ 400 nm), 자외선 B (280 ～ 320 nm), 그리고 자외선 C (190 ～ 280 nm) 등 세 가지로 나뉘어 진다. 태양광으로부터 지표에 도달하는 자외선 중 자외선 C는 대기권의 상층부에 있는 오존층에서 흡수, 산란되어 여과되므로 자연적 광화학 반응에 별다른 영향을 미치지 않는다. 자외선 A는 일차적으로는 태양으로부터 방출되나 인공 램프 등에 의해서도 방출되며 피부의 표피와 진피층에 깊숙하게 투과한다. 따라서 자외선 A는 현재 피부에 가장 많은 영향을 주는 요소로서 주시되고 있다. 그러나 자외선 B 조사는 자외선 A보다 더 위험하다. 즉 자외선 B는 자외선 A보다 파장이 짧아 서 피부 깊숙이 침투하지는 못한다고 알려져 있으나 자외선 A보다 훨씬 강한 에너지를 가지고 있어서 피부 표면에 예리한 홍반을 발생시키는 한편 피부의 광노화를 촉진시키는 파장으로 알려져 있다. 자외선에 의한 피부 손상 원인 중 하나는 자외선에 의해 형성된 활성 산소종이 세포 신호체계에 신호를 보내어 결국 피부의 세포간물질 (extracellular matrix, ECM)의 성분인 콜라겐이나 젤라틴 등을 분해하는 효소인 MMP (matrix metalloproteinase)를 합성하게 함으로서 콜라겐이나 젤라틴을 파괴하여, 피부에 주름이 형성되게 하는 것이다. 이러한 광노화를 억제할 목적으로 지금까지 많은 기능성 화장품들이 개발되었으며 이들 중에는 비타민 A 계통의 레티놀을 사용하는 것과 비타민 C 계통의 아스코빅산을 사용하는 것이 대부분이다. 그러나 이들 두 가지 성분은 실온에서 불안정하여 화장품을 장기 보존할 경우 쉽게 분해되어 그 효능을 잃게 된다. 현재 이들 두 성분의 실활을 막기 위하여 이들 물질에 지방산을 결합시켜 변형하거나 리포좀으로 포집하는 등 다양한 방법이 동원되고 있다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고, 생체 단백질 총중량의 30 %를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 주된 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화의 유도 등이 알려져 있다. 콜라겐은 피부노화의 외적인 원인이 되는 자외선 노출에 의해서도 파괴되며, 자외선에 의한 변화는 자외선에 노출된 시간의 축적에 비례하는 것으로 알려져 있다. 자외선은 피부 진피층에서 탄력섬유성 물질을 축적시키고 교원섬유를 변성시켜 피부에 주름이 생기게 만들고 탄력성을 저하시킨다.

한편, MMP (matrix metalloproteinases)는 다형핵성 호중구 (Polymorphonuclear neutrophil), 대식세포 (Macrophage), 치은섬유아세포 (Fibroblast), 골세포 (Bone cell) 등과 같은 세포로부터 분비되는 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제 (Endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며, 기질로서 여러 가지 세포외기질을 이용한다. 이러한 단백질분해효소는 배 발생, 조직의 형성, 암전이, 치주질환, 류마토이드 관절염, 염증, 당뇨병, 각막궤양, 골다공증, 위궤양, 외상, 피부노화 및 주름, 화상 및 상처 치료와 같은 병리학적 과정과 각종 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다. 주름의 예방 및 치료를 위한 연구가 발전되면서 피부에서 콜라겐의 중요한 기능들이 밝혀지고 있으며, 이러한 연구들로부터 피부 내 콜라겐의 합성 촉진에 의해 콜라겐 대사가 활발해지면 진피 메트릭스의 성분이 중가 되어 주름개선, 탄력증진, 피부강화 등의 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다. 콜라겐 합성을 촉진하기 위해 종래에 사용한 물질로서, 레티노이드 (RE36068), TGF-β (trans-forming growth factor), 동물태반유래의 단백질 (JP8-231270), 베툴린산 (JP8-208424), 클로렐라 추출물 (JP9-40523, JP10-36283) 등이 알려져 있으나, 레티노인산의 경우 불안정하고 피부적용 시 자극, 발적 등의 안정성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성 촉진으로 인한 피부기능 개선효과를 기대할 수 없다. 최근 새롭게 등장한 주름치료법으로 초음파 치료 및 피부 스케일링, 레이저 박피술, 보툴리눔톡신 주사, 레스틸렌 주사 등이 있으나 시술 비용 및 지속성 면에서 큰 효과를 발휘하지 못하 고 있는 실정이다. 따라서 생체에서 콜라겐 합성 촉진 효과가 매우 우수한 촉진제의 개발 및 발굴이 절실히 요망되고 있다.

도라지 (길경, Platycodon grandiflorum A. DC)는 배농, 거담, 기관지염, 천식 등의 호흡기계 질환에 사용되어온 생약재로서, 도라지가 배합되어 있는 한방 처방의 수가 동의보감에 273건, 방약합편에 49건에 이를 정도로 다양한 약리작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

이러한 도라지의 주요 약리성분은 테르펜계 사포닌이며, 이 약리성분은 동물실험을 통하여 진해, 거담작용, 중추신경억제작용 (진정, 진통, 해열효과), 급만성 염증에 대한 항염증작용, 항궤양 및 위액분비억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 항콜린작용, 혈당강하작용, 콜레스테롤 대사 개선작용 등이 있는 것으로 밝혀져 있다 (Tada A. et al., Chem . Pharm . Bull., 23, 2965, 1975).

이외에도 도라지의 열수 및 에탄올 추출물은 곰팡이의 아플라톡신을 억제하며, 이눌린 분획은 식균 작용과 고형암 및 복수암에 대한 강력한 항종양효능이 있고, 40% 도라지엑기스는 알코올흡수 억제작용이 있는 것으로 알려져 있다 (JP60-89427, 1985).

이러한 도라지의 다양한 약리작용에도 불구하고 장기간 재배에 어려움이 있어 개발이 쉽지 않았으나 최근에는 20년 이상의 도라지를 재배할 수 있는 기술이 개발되어 다량 생산이 가능해졌기에 (이성호, “다년생도라지재배법”, 대한민국 특허 제 045731호) 이를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 현재까지 장생도라지에 관한 연구는 항당뇨 효과에 관한 실험, 고지혈증에 관한 실험, 항암 및 면역 질환에 관한 실험(Choi C.Y. et al., International Immunopharmacology, 1(6), pp.1141-1151, 2001 ; Choi C.Y. et al., Cancer Letters, 166(1), pp.17-25, 2002) 등이 있으며, 간예방 및 손상억제에 대한 연구(Lee K.J. et al., Cancer Letters, 174, pp.73-81, 2001 ;Lee K.J. et al., Food and Chemical Toxicology, 40(4), pp.517-525, 2002) 등이 계속되고 있다.

본 발명자들은 안전하고 독성이 없는 천연물로부터 자외선에 대한 피부 노화를 억제하는 제제를 찾던 중 장생도라지의 지하부 유용 생리활성 물질이 콜라겐 합성을 촉진하고 콜라게나제 효소 활성 및 유전자 발현을 억제함으로써 피부 노화를 억제시킴을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 피부노화 방지 및 주름 개선 효과를 나타내는 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 함유하는 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물을 함유하는 피부노화 방지 및 주름개선용 피부외용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물을 함유 하는 피부노화 방지 및 주름개선 효과를 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 “추출물”은 정제수를 포함한 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 프로필렌글리콜, 초산에칠, 부틸렌글리콜, 에테르, 클로로포름으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 추출물은 장생도라지를 수분의 함량이 5 % 이하가 되도록 건조하고 이를 분쇄한 후, 추출 용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 프로필렌글리콜, 초산에칠, 부틸렌글리콜, 에테르 또는 클로로포름, 바람직하게는 물 또는 에탄올을 장생도라지 분말의 0.5 내지 30배, 바람직하게는 5 내지 15배 부피량을 10 내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 95℃의 추출 온도에서 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 2 내지 10시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 열수추출법으로 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 3회 추출한 후 여과하고 동결 건조하여 본 발명의 장생도라지 조추출물을 수득할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 제조방법으로부터 얻어진 장생도라지 조추출물로부터 피부노화 방지 및 주름개선 효과를 갖는 정제 분획물을 제조할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 상기 제조방법으로부터 얻어진 장생도라지 조추출물을 물에 녹여 여과한 여과액을 HP-20 컬럼과 같은 이온교환수지를 통과시켜, 당 성분을 제거한 후, 컬럼에 흡착되어 남은 유기물 성분을 다시 메탄올, 에탄올 등과 같은 저급알콜용액, 바람직하게는 메탄올 용액으로 탈착시켜, 물 및 저급 알콜 가용 분획물을 각각 제조한 후, 이 물 가용 분획물로부터 각각 올리고당이 다량 함유된 (1) 올리고당 정제 분획물 (이하, "CKO"라 명명함) 및 (2) 이눌린 정제 분획물 (이하, "CKI"라 명명함) 얻고; 이 저급알콜 가용분획물에 에틸에테르 등과 같은 비극성 용매를 가하여 침전된 침전물로부터 사포닌 성분이 다량 함유된 (3) 조사포닌 정제 분획물 (이하, "CKS"라 명명함)을 얻는 제조방법 및 이 제조방법으로부터 수득된 각 정제 분획물을 제공한다.

따라서, 본 발명은 장생도라지를 건조, 분쇄한 후, 물 또는 에탄올을 추출용매로 하여 열수추출법으로 추출한 후 수득한 장생도라지 조추출물을 물에 녹여 여과한 여과액을 HP-20 컬럼과 같은 이온교환수지를 통과시켜, 당 성분을 제거한 후, 컬럼에 흡착되어 남은 유기물 성분을 다시 메탄올, 에탄올 등과 같은 저급알콜용액, 바람직하게는 메탄올 용액으로 탈착시켜, 물 및 저급 알콜 가용 분획물을 각각 제조한 후, 이 물 가용 분획물로부터 각각 올리고당이 다량 함유된 올리고당 정제 분획물 및 이눌린 정제 분획물을 얻고; 이 저급알콜 가용 분획물에 에틸에테르 등과 같은 비극성 용매를 가하여 침전된 침전물로부터 사포닌 성분이 다량 함유된 조사포닌 정제 분획물을 얻는 상기 정제분획물을 제조하는 제조방법을 제공한다.

본원에서 정의되는 “정제 분획물”은 상기 제조방법으로부터 분리되는 올리고당 정제 분획물, 이눌린 정제 분획물 및 조사포닌 정제 분획물을 포함한다.

또한 본 발명의 장생도라지는 20년근 이상의 도라지임을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물들을 0.01 내지 10 % 중량 백분율, 바람직하게는 0.1 내지 8 % 중량 백분율, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 % 중량 백분율로 포함한다.

상기 추출방법에 의해 얻어진 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들의 콜라겐 생합성 효과, 콜라게나제 저해 효과 및 활성 산소종 억제효과를 확인한 결과 뛰어난 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 장생도라지 추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물들을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 주름 개선용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 피부노화 방지 및 주름 개선용 피부외용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물들을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 포함하는 피부외용 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트 제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학 조성물을 제공한다. 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라 틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 함유하는 피부노화 방지 및 주름 개선용 조성물은 피부에 적용할 수 있는 피부 외용제 제형으로서 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 포함하는 조성물은 피부의 노화방지 및 주름개선 효과를 위한 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산 화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스 테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리 돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N- 라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 % 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 % 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 또는 이로부터 분리된 정제 분획물들 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 피부노화 방지 및 주름개선용 기능성 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 장생도라지 조추출물의 제조

(주)장생도라지로부터 구입한 장생도라지 지하부를 수분의 함량이 5 % 이하가 되도록 건조하고 이를 분쇄한 후, 장생도라지 분말 0.25㎏에 증류수 4ℓ를 가하고 90 내지 95 ℃에서 5시간 동안 2회 추출한 후 여과하고 이를 동결 건조하여 장생도라지 열수 추출물(이하, CKT라 명명함) 99.5 g를 수득 (수득율 (%): 39.8) 하였다.

실시예 2. 장생도라지 조추출물로부터 정제 분획물의 분리

상기 실시예 1에서 수득한 장생도라지 열수 추출물 100 g을 증류수에 녹여 여과한 여액을 HP-20(diaion사 제품) 컬럼에 통과 시켰다. 이때 당 성분을 제외한 HP-20 컬럼에 흡착된 유기물 성분들을 당 성분이 용출되지 않을 때까지 충분히 물로 씻어준 후 나머지는 100 % 메탄올로 탈착시켜 물과 메탄올에 용해되는 성분으로 각각 분리하였다. 물에 용출된 성분들은 당 성분들로서 물을 충분히 감압농축 시킨 후 50%-MeOH[H₂O(5)/MeOH(10)]로 침전시켜 얻어지는 침전물로서, 이눌린형 폴리사카라이드(inulin-type polysaccharide), 이눌린형 폴리프럭토스(inulin-type polyfructose)함유 β-D-(2→1) 폴리프럭토퓨라노실(polyfructofuranosyl) α-D-글루코스와 같은 성분을 다량 함유한 이눌린(Inuline) 분획 (CKI, 약 63 g)을 분리하였으며, 남은 여액은 감압농축하여 올리고당 (oligosaccharide) 분획 (CKO, 약 31 g ) 으로 분리 하였다. 메탄올에 용출된 성분들은 메탄올을 감압농축 시키고 나머지를 다시 소량의 메탄올에 녹여 충분히 저어주면서 에틸에테르를 가하여 침전이 형성되도록 하고 이를 여과하고 건조시켜 플라티코딘 A(platycodin A), 플라티코딘 C(platycodin C), 플라티코딘 D(platycodin D), 폴리갈락신 D(polygalacin D), 디아피오플라티코딘 D(deapioplatycodin D), 플라티코시드 E(platycoside E)를 함유한 조사포닌 분획 (CKS, 약 2.3 g)을 얻었다. 조사포닌 분획의 HPLC 데이터를 도 1에 나타내었으며, 전체적인 분획물 제조방법을 도 2에 나타내었다.

실험예 1. 인간 섬유아세포주에서의 콜라겐 합성 촉진 효과 측정

1-1. 시약 및 세포주 준비

인간 섬유아세포주(Human fibroblast)인 CCD986SK는 ATCC (수탁번호; CRL- 1947)에서 구입하였고, 메트리젤(Matrigel), 헤마톡시린(Hematoxylin), 에오신, 젤라틴, IMEM 배양액, 트립신, 우태혈청(Fetal bovine serum)은 시그마사 (Sigma, 미국)에서 구입하였다. 키트(Soluble collagen assay kit, 모델번호 : S1005)는 (biocolor Ltd.)에서 구입, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 세트는 R&D사(R&D system, Inc.)에서 구입하였고, 벡터(Activator-protein-1 (AP-1) liciferase 벡터)는 인비트로젠 (Invitrogen corporation) 사에서 구입, 항체(procollagen type I N-terminal propeptide (PICP))는 abcam사 (abcam Ltd.)에서 구입하였다.

1-2. 콜라겐 합성 효과 측정

CCD986SK 세포를 48 웰 플레이트에 계대 배양 후 실시예 1 및 실시예 2에서 수득한 장생도라지 추출물(CKT) 및 이로부터 분리된 정제 분획물 (CKO, CKI, CKS)을 처리하고 24 시간 후에 상층액을 회수하여 그 중 200 ㎕를 서콜 레드 용액(Sircol red solution) 1 ㎖과 혼합하여 상온에서 30분간 반응 시키면서 5분마다 한번 씩 섞어준 후 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 버리고 침전물을 0.4 N NaOH 1 ㎖에 녹여서 흡광도 550 nm에서 콜라겐 합성 촉진 효과를 측정하여 도 3에 나타내었다.

장생도라지 추출물 (CKT) 및 이로부터 분리된 올리고당 (oligosaccharide) 분획 (CKO), 이눌린 분획 (CKI), 조사포닌 분획 (CKS)을 처리한 결과 도 2에서 보여지는바와 같이 콜라겐의 합성이 농도 의존적으로 촉진됨을 확인할 수 있었다.

실험예 2. ELISA 방법을 이용한 콜라겐 합성 촉진 효과 측정

CCD986SK 세포에 실시예 1 및 실시예 2에서 수득한 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물을 처리하고 24시간 후에 상층액을 따서 1형 콜라겐(type I collagen) 합성의 지표로 사용되는 PICP(procollagen type I N-terminal propeptide) 항체를 이용하여 콜라겐 합성 촉진 효과를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 3에서 보여지는바와 같이 장생도라지 추출물 (CKT) 및 이로부터 분리된 올리고당 (oligosaccharide) 분획 (CKO), 이눌린 분획 (CKI), 조사포닌 분획 (CKS)은 콜라겐 합성 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 3. COL1A2 유전자 프로모터( promoter )의 전사 활성도 측정

상기 실시예 1 및 실시예 2로부터 수득한 CKT, CKO, CKI 및 CKS의 COL1A2(collagen alpha2(I) gene)의 전사 활성도에 대한 효과를 측정하기 위하여 COL1A2의 프로모터(promoter: -406 ~ +82 부위)를 루시페라제 (luciferase)가 발현되는 벡터 (pGL3-promoter)의 멀티클로닝 부위에 삽입시켜 재조합 플라스미드를 만들고, COL1A2 전사촉진제의 활성도에 의존적으로 루시페라제가 발현되도록 하였다. CCD986SK 세포에 LipofectAMINE를 이용하여 pGL3-COL1A2를 형질전환 시킨 후 CCD986SK 세포를 48 웰 플레이트에 계대 배양 후 실시예 1 및 실시예 2에서 수득한 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물을 처리하고 24 시간 동안 배양한 후, 용해물(lysate)을 만들어 상층액만 취하여 리포터 유전자 에세이(reporter gene assay)를 수행하여 루시페라제의 활성도를 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.

실험 결과 장생도라지 추출물 (CKT) 및 이로부터 분리된 올리고당 (oligosaccharide) 분획 (CKO), 이눌린 분획 (CKI), 조사포닌 분획 (CKS)이 농도 의존적으로 COL1A2 프로모터의 전사 활성도를 증가시킴을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 콜라게나제 ( collagenase ) 활성 저해효과 측정

CCD986SK 세포를 48 웰 플레이트에 계대 배양 후 실시예 1 및 실시예 2에서 수득한 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 12 시간 전 처리하고 PBS로 1회 세척한 후 UVA(ultraviolet A)을 조사하고, 24 시간 후에 상층액만을 취하여 10,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 96 웰 플레이트에 상층액 50 ㎕과 최종 농도 1 mM의 APMA(4-aminophenylmercuric acetate)를 넣어 잘 섞어준 후 MMP-1 효소 활성은 37 ℃에서 6 시간 동안 반응 시키고 MMP-13 효소 활성은 37 ℃에서 40분간 반응 시켰다. 각각의 시간이 지난 후 MMP-1과 MMP-13에 해당하는 기질용액을 첨가하여 섞어준 후 1 시간 동안 5분 간격으로 형광 측정하여(Excitation 340 nm, Emission 490 nm) MMP-1(type I collagense)과 MMP-13(type III collagenase) 효소 활성 저해 효과를 측정하였다.

실험 결과 도 6 및 도 7에서 보여지는바와 같이 장생도라지 추출물 (CKT) 및 이로부터 분리된 올리고당 (oligosaccharide) 분획 (CKO), 이눌린 분획 (CKI), 조사포닌 분획 (CKS)은 농도 의존적으로 MMP-1 및 MMP-13 효소의 활성을 저해시킴을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 콜라게나제 ( collagenase ) 유전자 발현 억제효과 측정

MMP-1 및 MMP-13의 유전자 발현 억제효과를 조사하기 위하여 CCD986SK 세포에 실시예 1에서 수득한 장생도라지 추출물을 12시간 전 처리하고 UVA를 조사하여 6시간 후에 MMP-1 및 MMP-13의 유전자 발현을 RT-PCR를 이용하여 측정하였다. 실험결과 도 8a 및 도 8b에서 보여지는바와 같이 장생도라지 추출물(CKT) 및 이로부터 분리된 정제 분획물(CKO, CKI, CKS)에 의해 MMP-1과 MMP-13 유전자 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 활성산소 종( ROS ) 억제효과 측정

UVA에 의해 피부상피세포에서 ROS(reactive oxygen species)가 증가하고, 증가된 ROS가 콜라겐 분해 효소인 콜라게나제(matrix metalloproteinases - MMPs)의 발현을 증가시키는 점에 착안하여, 장생도라지 추출물이 세포내 ROS의 형성을 저해 하는지 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.

CCD986SK 세포를 48 웰 플레이트에 혈청(serum) 0.1%의 배지로 24 시간 계대 배양한 후 다시 혈청 0.1%가 첨가된 배지로 바꿔준 뒤 실시예 1 및 실시예 2에서 수득한 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들을 24 시간 처리하였다. 24 시간 후에 2‘.7-디클로로플로리세린 디아세테이트 (2',7'-Dichlorofluorescein diacetate ; DCF-DA) 10 μM을 각 웰에 분주하여 30분 동안 발색 반응 시켰다. 30분 후에 배지를 제거하고 혈청을 0.1 % 첨가한 배지로 다시 바꿔준 후 UVA (200 mJ/cm²)를 조사하고 바로 1 시간동안 매 5분씩 형광 측정(excitation 495 nm, emission 520 nm)하였다.

실험 결과, 도 9에서 보여지는바와 같이 CKT, CKO, CKI 및 CKS가 TPA에 의해 증가된 세포내 ROS 형성을 감소시킴을 확인할 수 있었다.

실험예 7. AP -1( zctivator protein -1)의 활성 억제효과 측정

UVA에 의해 피부상피세포에서 ROS가 증가하고, 증가된 ROS가 세포내 전사인자인 AP-1(activator protein-1)의 활성도를 증가시켜 콜라겐 분해 효소인 콜라게나제(matrix metalloproteinases - MMPs)의 발현을 증가시키는 점에 착안하여, 장생도라지 추출물 처리에 의한 전사인자 AP-1의 전사 활성 억제 효과를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.

CCD986SK 세포에 AP-1-루시페라제 리포터 유전자(AP-1-luciferase reporter gene, 모델 번호 : K1118, invitrogen corporation 사)를 포함한 벡터(AP-1-Luciferase, 도 10 참조)를 트랜스펙션(transfection) 시키고 실시예 1에서 수득한 장생도라지 추출물과 AP-1 전사활성을 증가 시키는 TPA를 처리한 후 실험(AP-1-luciferase reporter gene assay)을 수행하였다. 그 결과 도 11에서 보여지는바와 같이 CKT, CKO, CKI 및 CKS이 TPA에 의해 증가된 세포내 AP-1의 전사 활성도를 감소시킴을 확인할 수 있었다.

본 발명의 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 유연 화장수

번호	원 료	함량(중량%)
1	실시예 1의 장생도라지 추출물	0.5
2	부틸렌 글리콜	4.0
3	글리세린	8.0
4	카르복시비닐폴리머	0.06
5	디소디움 에틸렌디아민테르라아세틱에시드	0.01
6	에탄올	7.0
7	트리에탄올아민	0.2
8	소르비탄모노스테아레이트	0.8
9	하이드로지네이티드 캐스터 오일	0.4
10	페닐트리메티콘	3.5
11	파라옥시안식향산프로필	0.2
12	파라옥시안식향산메틸	0.2
13	정제수	잔량
계		100.0

제제예 2. 영양화장수

번호	원 료	함량(중량%)
1	실시예 2의 CKO	0.5
2	스테아린산	1.0
3	세틸알코올	1.0
4	글리세릴모노스테아레이트	1.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	1.0
6	솔비탄세스퀴올레이트	1.0
7	유동파라핀	4.0
8	카르릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
9	스쿠알란	3.0
10	카르복시비닐폴리머	0.1
11	부틸렌글리콜	5.0
12	트리에탄올아민	0.2
13	파라옥시안식향산프로필	0.2
14	파라옥시안식향산메틸	0.2
15	정제수	잔량
계		100.0

제제예 3. 영양크림

번호	원 료	함량(중량%)
1	실시예 1의 CKI	0.5
2	스테아린산	2.0
3	세틸알코올	2.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0
8	왁스	1.0
9	유동파라핀	4.0
10	카르릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0
11	스쿠알란	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0
14	글리세린	3.0
15	트리에탄올아민	0.5
16	파라옥시안식향산프로필	0.2
17	파라옥시안식향산메틸	0.2
18	정제수	잔량
계		100.0

제제예 4. 에센스

번호	원 료	함량(중량%)
1	실시예 1의 CKS	0.5
2	시토 스테롤	1.70
3	폴리글리세릴 2-올레이트	1.50
4	세라마이드	0.7
5	세테아레스-4	1.2
6	콜레스테롤	1.5
7	디세틸포스페이트	0.4
8	농글리세린	5.0
9	선플라우어오일	15.0
10	카르복시비닐폴리머	0.2
11	산탄검	0.2
12	방부제	미량
13	향료	미량
14	정제수	잔량
계		100.0

상술한 바와 같이, 본 발명의 장생도라지 추출물 및 이로부터 분리된 정제 분획물들은 콜라겐 생합성 효과, 콜라게나제 저해 효과 및 활성산소 종의 억제효과 를 나타내는바, 피부노화 방지 및 주름개선용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

Claims (7)

1. 20년 근 이상의 도라지인 장생도라지를 건조, 분쇄한 후, 물을 추출용매로 하여 90 내지 95℃에서 열수추출법으로 추출한 후 수득한 (1) 장생도라지 조추출물; 상기 조추출물을 물에 녹여 여과한 여과액을 이온교환수지인 HP-20컬럼에 통과시켜, 당성분을 제거한 후, 컬럼에 흡착되어 남은 유기물 성분을 다시 메탄올 용액으로 탈착시켜, 물 또는 메탄올 가용 분획물을 각각 제조한 후, 물 가용 분획물로부터 얻은 (2) 이눌린 정제 분획물 및 (3) 올리고당 정제 분획물; 또는 메탄올 가용 분획물에 에틸에테르를 가하여 침전된 침전물로부터 얻은 사포닌 성분이 다량 함유된 (4) 조사포닌 정제 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 주름개선용 피부외용 약학 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 20년 근 이상의 도라지인 장생도라지를 건조, 분쇄한 후, 물을 추출용매로 하여 90 내지 95℃에서 열수추출법으로 추출한 후 수득한 (1) 장생도라지 조추출물; 상기 조추출물을 물에 녹여 여과한 여과액을 이온교환수지인 HP-20컬럼에 통과시켜, 당성분을 제거한 후, 컬럼에 흡착되어 남은 유기물 성분을 다시 메탄올 용액으로 탈착시켜, 물 또는 메탄올 가용 분획물을 각각 제조한 후, 물 가용 분획물로부터 얻은 (2) 이눌린 정제 분획물 및 (3) 올리고당 정제 분획물; 또는 메탄올 가용 분획물에 에틸에테르를 가하여 침전된 침전물로부터 얻은 사포닌 성분이 다량 함유된 (4) 조사포닌 정제 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부노화 방지 및 주름개선용 화장료 조성물.
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