KR100759520B1

KR100759520B1 - 올리고염기 칩을 이용한 성인병관련 유전자들의 단일염기다형성 검사 방법과 검사 키트

Info

Publication number: KR100759520B1
Application number: KR1020060029575A
Authority: KR
Inventors: 정운원; 김현숙; 한인권; 이득주; 고세종
Original assignee: 주식회사 마이진; 정운원; 한인권; 김현숙; 이득주; 고세종
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2026-03-31
Also published as: KR20060105654A

Abstract

본 발명은 고혈압, 동맥경화증, 치매, 골다공증, 당뇨합병증 등의 성인병 관련 유전자들 내에 존재하는 단일염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphisms: 이하 "SNPs"로 약칭함)의 검사 방법 및 그에 사용되는 검사용 키트에 관한 것이다.

본 발명은 검사하고자하는 유전자를 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction: 이하 "PCR")을 이용하여 증폭시키는 단계; 성인병 관련 유전자들내에 존재하는 SNPs를 포함하는 올리고염기가 부착된 올리고염기 칩에 증폭 산물을 교잡반응(hybridization)을 이용하여 부착하는 단계; 및 교잡반응에서 특이적으로 결합된 SNPs를 확인하는 단계를 포함하는 SNPs 검사 방법을 이용하여, 각각의 성인병관련 유전자의 SNPs를 신속, 정확하게 검사하고 또한 한번의 검사로 다수의 유전자의 SNPs를 동시에 검사할 수 있다.

성인병, 유전자, 단일염기 다형성, 검사 방법, 검사 키트.

Description

올리고염기 칩을 이용한 성인병관련 유전자들의 단일염기 다형성 검사 방법과 검사 키트{METHOD FOR ANALYSING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS OF GERIATRIC DISEASES USING OLIGONUCLEOTIDE CHIP AND KIT THEREFOR}

도 1은 본 발명에 따른 성인병 진단 올리고 칩 포맷(oligo chip format)의 개요도.

도 2은 성인병(geriatric diseases) 관련 유전자들의 SNPs 검사용 올리고염기 칩의 사진.

도 3는 올리고염기 칩을 이용한 성인병관련 유전자 SNPs 검사 키트의 구성을 나타내는 사진.

도 4은 성인병관련 유전자들의 SNPs 검사를 위한 PCR 관련 키트 및 키트의 구성성분을 나타내는 사진.

도 5는 성인병관련 유전자들의 SNPs 검사를 위한 올리고염기 칩 키트 및 키트의 구성성분을 나타내는 사진.

도 6는 성인병관련 유전자들의 SNPs 검사를 위한 검체로부터 유전자를 추출하는 수단의 구성성분을 나타내는 사진.

본 발명은 고혈압, 동맥경화증, 치매, 골다공증, 당뇨합병증 등의 성인병 관련 유전자들 내에 존재하는 SNPs의 검사 방법 및 그에 사용되는 검사 키트에 대한 것이다.

본 발명은 검사하고자하는 유전자를 PCR을 이용하여 증폭시키는 단계; 성인병 관련 유전자들내에 존재하는 SNPs를 포함하는 올리고염기가 부착된 올리고염기 칩에 증폭 산물을 교잡반응을 이용하여 부착하는 단계; 및 교잡반응에서 특이적으로 결합된 SNPs를 확인하는 단계를 포함하는 SNPs 검사 방법을 이용하여, 각각의 성인병관련 유전자의 SNPs를 신속, 정확하게 검사하고 또한 한번의 검사로 다수의 유전자의 SNPs를 동시에 검사할 수 있다.

종래의 SNPs 검사 방법에는 주로 중합효소 연쇄반응-제한효소 분절길이 다형성(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism: PCR-RFLP), 염기서열 분석(DNA sequencing), 변성구배 겔전기영동(Denaturing gradient gel electrophoresis) 등의 방법이 사용되어 왔다(Cotton, R. Trends Genet. 13:43-46, 1997). 그러나 이러한 방법들은 노동집약적이고, 많은 시간을 필요로 하며, 또한 방사선 동위원소와 암 유발인자를 시약으로 사용해야하는 위험성을 안고 있어 일상적인 검사 방법으로 사용하는데 어려움이 있었다.

DNA 칩은 최근에 개발된 유전자 검색 방법 중의 하나로서, 기존의 분자 생물학적 지식에 기계 및 전자공학의 기술을 접목해서 만들어졌다. DNA 칩이란 기계 자동화와 전자 제어 기술 등을 이용하여 한 장의 유리판 위에 적게는 수십개부터 많 게는 수십만개의 DNA를 고밀도로 붙여 놓은 것을 말한다. DNA 칩은 종래의 SNPs 검사 방법이 가지는 상기한 문제점들을 보완할 수 있는 것으로서, 기존의 검사 방법과의 가장 큰 차이점은 한번의 검사로 많은 수의 유전자를 빠른 시간 안에 손쉽게 검색할 수 있다는 것이다.

DNA 칩은 대표적으로 미국 Affymetrix 사의 올리고염기 칩과 미국 stanford 대학 Brown 연구실에서 개발한 customized DNA microarray 칩 두 종류가 개발되어 있다. customized DNA microarray 칩은 칩에 올리고나 cDNA 유전자를 부착시키는 것이고, 올리고염기 칩은 칩에 20 - 60 염기내외의 짧은 유전자 단편(올리고염기)을 칩위에서 직접 부착시킨다. 단일염기 다형성과 같은 유전자의 돌연변이여부 검색등에는 올리고염기 칩을 주로 사용한다. 이외에도 제작 방법이나 검사 방법이 다른 종류의 칩들도 개발되어 있으나 상기한 두 가지 종류와 유사하다.

현재까지 개발된 DNA 칩중 여러 종류의 SNPs를 짧은 시간 내에 분석할 수 있는 DNA 칩은 미국 Affymetrix사의 oligonucleotide칩과 국내에서는 마이진의 MyHPV chip등이 있다. 올리고염기 칩의 제작에 있어 가장 중요한 것은 올리고염기들의 염기서열이 전체 게놈(genome)에서 유일해야 하고, 또한 각각의 결합 온도(annealing temperature)가 서로 비슷해야 한다는 것이다. 만약 올리고 염기들이 게놈내의 다른 부분과 유사성이 있거나, 결합온도가 다르다면 결과를 해석할 수 없게 된다. 이와 같은 조건 때문에 전체 게놈의 염기 서열이 밝혀진 생물의 유전자를 올리고염기로 이용하는 것이 필수적이다.

본 발명은 종래의 SNPs 검사방법이 가지는 문제점을 보완하기 위해 상기한 DNA 칩 기술을 활용하였으며 성인병관련 유전자의 SNPs를 검사하기 위한 올리고 염기 칩을 고안 제작하였다. 본 발명인 올리고염기 칩 기술을 이용한 성인병관련 유전자들의 SNPs 검사 방법과 검사 키트는 성인병관련 유전자들의 SNPs를 신속 정확하게 검사할 수 있으며 저렴한 비용으로 대량으로 검사할 수 있다.

성인병은 현대 사회의 변화로 인하여 나타난 현상으로 식생활의 서구화와 인스턴트화와 더불어 경쟁으로 인한 현대사회의 스트레스, 운동부족, 대기오염, 수질오염 등으로 인한 환경오염이 복합적으로 어우러져 발생한다고 볼 수 있다. 또한 한국사회에 만연되어 있는 음주문화와 흡연습관 등이 원인이 될 수 있고, 식생활의 변화로 인하여서 어린이에게서도 여러 성인병들이 점점 많아지고 있다. 과거 1970년대까지 우리나라의 주 사망원인은 전염병이었으나 최근에는 만성성인병이 차지하고 있다. 성인병에는 고혈압, 동맥경화 등의 심혈관계질병, 비만, 당뇨병, 골다공증 등의 대사성질환이 있다.

유전자를 이용한 질병의 조기진단

1953년 Watson과 Crick에 의하여 DNA의 이중 나선의 구조가 밝혀짐으로 생명공학의 기술 혁명은 시작되었다. 2000년대가 시작되면서 1990년도부터 미국을 중심으로 시작되어온 인간게놈 프로젝트에 의하여 인간의 유전자 염기서열이 해독되어 또 한번의 생명공학 혁명을 맞게 되었다. 밝혀진 인간의 DNA 염기 서열 속에 존재하는 유전자의 기능에 대한 연구와 개체간 염기서열간의 차이를 연구하는 구조 및 기능 유전자 연구로 집약될 것이다. 인간은 30억쌍의 DNA 염기를 가지며 약 2만3천여개 정도의 유전자가 존재하리라 추정되며 현재 이들 유전자의 약 5% 정도만 그 기능이 밝혀져 있다. 인간 게놈 프로젝트의 효과로 유전자들의 위치와 그 기능에 관한 연구가 급속도로 진행이 될 것은 자명하며 그 결과로 질병의 기전과 치료 약제의 개발 등 생명 공학의 발전은 상상을 초월할 것이다. 또한 밝혀진 염기서열을 근거로 하여 각 개체 및 종족간의 염기서열의 차이를 찾아내어 그 의미를 밝히는 연구들이 진행될 것이며 따라서 각 개인간, 가족간, 혹은 종족간의 차이에 대한 유전적인 차이를 비교 분석할 수 있을 것이다. 또한 이러한 유전자 염기서열의 차이들이 특정 질병에 걸릴 감수성을 어느 정도로 결정하는 지에 관한 연구들로 각 개인 또는 유사한 유전적 특성을 가지는 집단을 대상으로 하는 새로운 개념의 예방의학이 태동할 것이다. 특정 유전자의 염기 서열 일부가 바뀌거나 없어지거나 중복되어 고유의 기능을 못하게 되는 유전병 또는 유전적 소인이 강한 질병들의 기전이 밝혀질 것이며 이를 근거로 유전자 치료 등을 이용하여 기존 질병의 치료 방법으로는 생각할 수 없는 불치병의 완치가 가능한 시대를 기대할 수 있게 되었으며 기존의 의학개념과 지식, 즉 질병의 분류에서부터 치료 및 예방에 이르기까지 혁신적인 전환이 예상된다. 이상과 같이 인간 게놈 프로젝트로 인하여 생명 공학과 현대 의학이 추구하는 방향에 일대 전환이 시작되고 있고 또한 이와 병행하여 분자생물학적 기술도 빠르게 발전하고 있는데 대표적인 기술이 한번의 검사로 수많은 유전정보를 일시에 분석할 수 있는 DNA chip의 개발이다. 기존의 의학은 증상의 발현이나 각종 임상 검사상 이상을 보여야 질병을 진단하고 치료하였다. 즉 질병이 발병된 후에야 진단과 치료가 이루어 졌다. 포스트 인간 게놈시대의 의학은 각종 유전자의 다양성이 질병의 발병 여부에 미치는 영향의 정도와 그 기전이 더욱 상세히 밝혀질 것이며 이를 기초한 발병전 개인적 차원에서의 예방적 치료가 이루어질 것으로 판단되며 실제로 여러 질병에서 이러한 연구가 진행되고 있다.

단일염기 다형성(SNP)

인간 유전자는 A(adenine), C(cytosine), G(guanine), T(thymine)등 네 가지 염기로 구성되어 있고 SNP는 이러한 염기서열 중 하나의 염기가 다른 염기로 치환되어 있는 것을 말한다. SNP는 100에서 300 염기 당 하나씩 발견되는 것으로 예상하고 있으므로 인간 유전체 염기서열은 약 30억 염기인 것을 감안하면 천만에서 삼천만 개의 SNP가 있을 것으로 예상하고 있다. SNP는 개인간의 질병 감수성 차이를 유발하는데 가장 중요한 원인중 하나이며 여러 질병에 관련된 유전적 성향을 연구하는데 있어 SNP의 분석은 필수적이다. SNP과 같은 유전인자는 질병에 대한 감수성이나 저항성을 부여하고 질병의 경중이나 진행여부에 영향을 미치게 된다. 이러한 복잡한 과정에 관여하는 모든 인자가 아직 다 밝혀지지 않은 상태이나 현재까지 발견된 질환과의 연관성이 많은 SNP를 분석함으로써 질병에 대한 예방이나 치료에 기여할 수 있다. 질환과 관련된 SNP의 역할을 이해하게 되면 유전적 차이에 의한 비유전적 인자 즉, 행태, 식이성향, 생활습관, 물리적 행동 등이 질환에 미치는 영향도 더 잘 이해할 수 있을 것이다. SNP는 개인이 특정 약물에 대하여 보이는 반응에 있어서 약물의 흡수나 대사하는 능력이 왜 각 개인마다 차이가 있는지 또는 같은 약물에 대해 부작용을 갖는지에 대한 답을 줄 수 있으며 따라서 질병의 진단뿐만 아니라 예방 및 맞춤치료, 새로운 약제의 개발 등에 이용할 수있다. 앞으로 SNP에 대한 연구가 진행될수록 질병에 대한 예방이나 새로운 치료제의 개발 등에 많은 혁 명적인 변화가 예고되고 있다.

유전자를 이용한 성인병 질병의 조기진단

유전자 진단은 유전자의 변이가 확실한 유전병들 외에도 유전적 소인은 있다고 생각되는 당뇨병, 고혈압, 비만, 심혈관 질환, 골다공증 등의 만성 질환, 각종 암 등의 질환에도 적용할 수 있으며 최근의 연구들도 일부 가능성 있는 유전적 기전들이 연구 보고되고 있다. 또한 특정 약제에 대한 유전적 차이에 의한 반응의 차이, AIDS와 같은 감염 질환에 대한 유전적 민감도의 차이 등도 연구되고 있는 영역들이다. 그러나 현재로서는 진단기법에 제한 및 문제점이 있으므로 DNA chip과 같은 새로운 진단을 다량화한 방법들이 빠르게 개발되고 있어 진단뿐 아니라 예방, 치료영역의 발전 역시 기대되고 있다.

고혈압

고혈압, 고지혈증, 관상동맥성 심장질환같은 증상이 한 가족간에 많이 나타나는 경향을 보이기 때문에 가족력을 고려하여야 하며 심혈관계의 위험요소를 평가하는 새로운 방법은 심혈관계 질환과 밀접하게 관련있는 것으로 알려진 유전자를 분석하는 것이다. 유전자를 분석하는 접근법은 개인의 심혈관계 질환에 대한 유전적 소인을 보는 전통적 진단 방법을 보완해줄 수 있으며 유전적 위험요소에 대한 이러한 유전자 진단은 가족력을 보는 것과 매우 유사하지만 보다 정확하고 보다 예언적이라 할 수 있다.

예를 들어 안지오텐시노겐(angiotensinogen: 이하 'AGT'로 약칭함) 유전자는 AGT 호르몬을 분비하며 AGT는 강력한 혈관 수축작용을 가진 안지오텐신 호르몬을 만들어내고 또한 염분과 수분을 콩팥에서 체내로 재흡수하도록 조장하는 알도스테론 호르몬을 만드는 전구물질이다. 안지오텐신 호르몬과 알도스테론 호르몬은 혈압을 조절하는 주요 호르몬들이며 이들의 전구물질인 ATG은 고혈압과 밀접한 관련이 있다.

Thr174→Met(T174M)와 Met235→Thr(M235T) 변이가 고혈압과 관련됨이 확인되어져 있으며, 이 중에도 고혈압 환자에서 M235T 변이가 더 빈번히 일어남이 알려져 있다. 혈장 AGT의 양도 실제로 235T 대립유전자(allele)를 가진 개체에서 더 많이 증가되어 있다. 즉, MM의 동형접합체(homozygote)인 경우보다 이형접합체(heterozygote) 즉 MT에서는 10%, TT 동형접합체에서는 20%나 증가되어 있다.

안지오텐신 전환효소유전자는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, 이하 'ACE'로 약칭함)를 만드는 유전자로 ACE는 안지오텐신 호르몬과 알도스테론 호르몬을 체내에서 많이 만들어 내도록 촉진하는 효소이며 안지오텐신 호르몬은 강력히 혈관을 수축하는 작용을 하고 알도스테론 호르몬은 염분과 수분을 콩팥에서 체내로 재흡수하도록 조장하는 작용을 하므로 이들 호르몬이 많이 만들어 지면 고혈압의 위험성이 높아지게 된다. 또한 이들 호르몬은 고혈압으로 진단받은 환자에서 혈관의 합병증을 초래하며, 심근 경색증, 협심증 등의 심장질환이나 뇌출혈, 뇌경색 등의 뇌혈관 질환 그리고 신장 기능장애, 망막 중등 미세혈관 질환으로 이행되는 확률이 높아질 수 있다. ACE 유전자는 단일염기 다형성은 아니나 intron 15와 exon 16사이에 삽입유전자(insertion)의 존재유무에 따라 고혈압 환자에서 각종 합병증의 예측에 도움을 줄 수 있다.

안지오텐신 Ⅱ 호르몬수용체(angiotensin Ⅱ receptor, 이하 'ATR'로 약칭함) 유전자는 혈관에 있는 ATR과 결합하는 제1형 안지오텐신 Ⅱ 호르몬 수용체(angiotensin Ⅱ receptor 1, 이하 'ATR 1'로 약칭함)를 분비하며 ATR 1은 혈관에 존재하는 ATR과 결합하여 강력한 혈관수축작용을 일으킨다. ATR 1 유전자는 exon5에 위치한 A1166→C의 유전자형의 변이에 따라 고혈압의 발현도가 달라질 수 있고 이미 고혈압으로 진단된 환자에서도 협심증과 심근경색증의 위험도의 차이를 보일 수 있다.

동맥경화증

동맥경화증은 동맥혈관이 굳어지는 질병을 말하며 비교적 굵은 동맥의 내막에 생기는 병이며, 고혈압은 세소동맥의 경화로 인하여 생긴다. 고혈압은 혈압계로 재어 나타나는 숫자로 손쉽게 상태를 알 수 있으나, 동맥경화의 경우 질환의 진단은 쉽지 않다. 동맥경화증은 일종의 노화현상으로 콜레스테롤, 인지질 등을 함유한 지방성 물질의 침착으로 인해 동맥벽이 탄력성을 잃고 굳어지는 것을 말하며, 혈관벽이 두꺼워지고 내막면이 매끄럽지 않으며, 내막이 좁아지는 경우가 많다. 침전물들이 점차 딱딱해져서 섬유성 덩어리 등이 생기며, 이 수가 많아짐에 따라 동맥은 딱딱해지고 좁아지며 탄력성을 잃게 되어 혈관을 통한 혈액의 공급이 줄어들어 질병을 일으키게 된다.

혈관내피에 존재하는 내피 질산 합성효소(endothelial nitric oxide synthetase; 이하 'eNOS'로 약칭함) 유전자가 생성하는 NO는 중요한 혈관확장 물질로서 혈관의 탄력성 유지에 기여하며 혈류량을 조절하게 되고 동시에 혈압 조절에 중요한 역할을 하며 관상동맥의 경련과도 관련이 있다는 보고도 있다. 혈관 평활근세포의 증식을 억제하고 혈소판의 응집억제 및 혈소판 및 단핵구의 혈관내피세포에의 흡착도 억제하는 효과도 알려져 있어 동맥경화의 진행의 방지에 도움을 줄 수 있으리라 기대되는 물질이다. 따라서 eNOS 유전자의 변이에 따라 동맥경화의 진행이 더 빨라지리라고 예견할 수 있다. eNOS 유전자는 Glu298→Asp의 변이형이 존재하며 유전형 298 Asp/Asp형이 Glu/Glu 형에 비해 관상동맥 심장질환의 위험도가 높다고 볼 수 있다.

메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕테이즈(Methylene tetrahydro folate reductase, 이하 'MTHFR'로 약칭함)는 호모시스틴을 메치오닌으로 전환시키는 효소로서 이 효소를 생성하는 MTHFR 유전자에 결함이 생기면 혈중 호모시스틴의 농도가 올라가서 동맥경화증의 진행을 일으키는 원인 중 하나라 볼 수 있다. 677 C→T 의 동형변이인 V/V, 동형인 V/A, 동형 정상인 A/A 순으로 관상 동맥 심장 질환의 위험도가 높아질 가능성이 있다.

플라스미노겐 활동억제물질(plasminogen plasminogen activator inhibitor I, 이하 'PAI-1'로 약칭함)은 플라스미노겐의 활성도를 저해시켜 심근경색증이나 뇌졸중 등의 혈관 질환과 관련이 될 수 있다. 유전자형은 4G/4G, 4G/5G, 5G/5G 형으로 구분이 되는데 4G 대립 유전자가 심근경색증과 관련도가 높다는 보고가 있다.

골다공증

골다공증은 전 여성의 3명중 1명의 비율로 발생하게 되는 심각한 질환으로 평균수명이 급속히 증가하는 고령화 사회에 접어들수록 사회적, 경제적으로 문제가 되는 만성 질환이다. 골다공증의 치료제로는 호르몬 대체요법이 가장 보편적으로 사용되고 있으며 호르몬 대체요법은 갱년기 질환, 골다공증, 고지질혈증 및 치매의 예방 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있어 폐경 후의 여성은 특별한 금기사항이 없는 이상 복용이 권유되고 있다. 비타민 D의 대사저하로 인한 비타민 D의 부족은 노인성 골다공증의 주요 기전인데 비타민 D는 세포내에서 고유한 수용체와 결합한 후 비로소 작용을 한다. 비타민 D는 호르몬 수용체(vitamin D receptor, 이하 'VDR'로 약칭함)의 intron7에 존재하는 tgc/tgt의 염기서열 변이에 따른 유전자형에 따라 치료 약제에 대한 반응이 차이를 보인다는 보고가 있다.

또한 에스트로겐 호르몬의 부족은 폐경 후 골다공증을 초래하게 되는데 이 호르몬은 세포내에서 고유한 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, 이하 'ER'로 약칭함)와 결합을 한 후 작용을 하게 되며 intron1 부위에 cag/ctg의 변이가 존재하면 에스트로겐의 결합에 영향을 미치게 된다. 따라서 이들 골다공증과 관련된 유전자형의 진단은 치료 전 골다공증의 치료반응예측과 약제선택에 도움이 될 수 있다.

비만

비만은 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심장병, 퇴행성 관절염, 유방암, 대장암등과 밀접하게 관계가 있으며 비만은 배가 나온 복부비만과 일반비만으로 구분되며 복부비만은 일반비만에 비해 위의 질병의 발생율과 유병율이 높다. 최근 비만의 발생기전이 분자 생물학적으로 규명되고 있으며, 비만은 에너지 섭취의 과잉뿐만 아니라 에너지 소비의 감소에 의해서도 일어날 수 있음이 알려졌다. 베타 아드레날린 수용체는 베타1, 베타2, 베타3 아드레날린 수용체의 세 종류의 아형이 있고 체내에서 지방조직의 지방분해를 촉진시킬 수 있다. 베타아드레날린 수용체 중에서 베타2 아드레날린 수용체(β2 adrenergic receptor, 이하 'β2AR'로 약칭함) 유전자는 β2AR를 만드는 유전자이며 코돈 27의 Gln27→Glu의 변이가 존재하며 이러한 β2AR 유전자의 다형성은 신체 지방의 양과 밀접한 관계가 있어 비만의 예측에 도움을 줄 수 있다.

β3 수용체(β3 adrenergic receptor, 이하 'β3AR'로 약칭함)는 지방 조직, 특히 내장 지방에 특이적으로 발현되어 지방의 분해와 열생산을 조절하고 있다. 식사에 의해 교감신경 기능이 항진되면 β3AR를 통해 백색 지방세포에서는 지방 분해가 항진되고, 갈색 지방세포에서는 열생산이 항진된다. 즉 β3AR 계는 비만을 억제하는 작용을 하여, β3AR의 장애는 비만의 원인이 될 수 있다. β3AR 구조의 이상으로 코돈 64의 트리프토판이 아르기닌으로 바뀐 Trp64→Arg의 변이가 발견되었으며 이러한 변이를 가진 사람에서 비만증과 인슐린 저항성, 당뇨병, 고혈압이 발생되는 것이 보고되어 있다. 이러한 변이가 이형접합으로 존재하면 1일 에너지 소비량이 40kcal, 동형접합으로 존재하면 80kca1 감소한다. β3AR 유전자 변이의 의의는 β3AR 유전자 변이 빈도는 비만에서 높으며 체질량지수나 내장 지방축적과 관련된다.

알쯔하이머

알쯔하이머병은 유전적 요인이 높은 질환으로 알려져 있다. 가족 중에 환자가 있는 경우 다른 구성원이 발병할 위험은 4배 가량 증가하고, 형제 자매가 환자 인 경우 10-50% 가량의 확률로 발병 가능성을 가진다. 현재까지 알려진 알쯔하이머병의 유전자는 65세 이전 발병하는 조발형 알쯔하이머병인 경우 베타 아밀로이드 전구제 단백질(beta amyloid precursor protein, 이하 'β-APP'로 약칭함) 유전자, 프리세닐린 1(presenilin 1, 이하 'PS1'로 약칭함) 유전자, 프리세닐린 2(PS2) 유전자의 돌연변이가 관여한다고 밝혀지고 있다. 이들 유전자에 돌연변이가 생기면 β-APP 전달에 이상이 생기면서 환자의 뇌에는 녹지 않는 A β peptide란 물질이 침착되어 세포가 파괴되고 노인반이 생성이 된다. 지발형 알쯔하이머병인 경우 아포리포프로테인 E(apolipoprotein E, 이하 'ApoE'로 약칭함) 유전자형 Cys112→Arg(allele E4)와 Arg158→Cys(allele E2)와 연관 관계가 있다고 알려져 있다. 50%의 지발성 알쯔하이머병 환자가 Apo E e4/e4형임이 보고되고 있다. 알쯔하이머병 환자가 Apo E e4/e4형을 가지는 경우 발병이 빨라지고 진행이 빠르다고 알려져 왔다. 임상에서 조발형 알쯔하이머병 가족력이 있는 경우 유전자 검사를 하여 유전상담을 하고 있다. 지발형 알쯔하이머병인 경우 조기 진단 목적으로 유전자 검사를 하지는 않고 치매 증상이 있는 경우 알쯔하이머병에 의한 것인지 감별 진단에 ApoE 유전자 검사를 참고하고 있다.

본 발명의 목적은 AGT, ACE, ATR1, ER, VDR ApoE, eNOS, MTHFR, PAI-1, β2AR, β3AR 등과 같은 성인병관련 유전자들의 SNPs를 신속 정확함은 물론 동시에 대량으로 검사할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 사용되는 올리고염기 칩을 포함하는 검 사 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AGT, ACE, ATR1, ER, VDR ApoE, eNOS, MTHFR, PAI-1, β2AR, β3AR 등과 같은 성인병관련 유전자들의 SNPs를 포함하는 올리고염기 칩을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 성인병관련 SNPs 검사용 올리고 칩을 포함하는 검사 키트를 제공한다. 이 때, 상기 검사 키트는 (ⅰ)성인병관련 유전자의 SNPs가 결합된 올리고염기 칩; (ⅱ)검체로부터 분리한 유전자를 증폭시키는 수단; 및 (ⅲ)증폭 산물과 올리고염기 칩의 보합결합을 탐지하는 검출수단을 포함하고, (ⅳ) 또한 선택적으로 검체로부터 유전자를 추출하는 수단을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 (ⅰ) 검체로부터 분리한 유전자를 PCR을 이용하여 증폭시키는 단계; (ⅱ) 증폭된 유전자를 상기 올리고염기 칩에 교잡반응시키는 단계; 및 (ⅲ) 교잡반응에서 특이적으로 결합된 SNPs를 확인하는 단계를 포함하는 성인병관련 유전자 SNPs 검사방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명한다.

본 발명은 성인병관련 유전자의 SNPs 검사용 올리고염기 칩과 그 제조 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명에 따른 성인병관련 유전자의 SNPs 검사용 올리고염기 칩은 (1) AGT, ACE, ATR1, ER, VDR ApoE, eNOS, MTHFR, PAI-1, β2AR, β3AR 등과 같은 성인병관련 유전자의 SNPs 올리고 염기의 5'-말단에 아민기를 결합시키는 단계; 및 (2) 상기 변형된 올리고 염기를 일정한 간격과 배열로 칩 제작용 유리판 위에 부착시키는 단계를 통하여 제조된다.

이 때 상기 올리고염기 칩에 사용되는 특이적인 올리고염기의 종류와 염기서열은 하기 표 1에 표기하였다.

올리고염기 칩에 spotting된 올리고염기(프로브)의 종류와 염기서열

서열번호	종류	염기서열 구조
1	AGT	AAA GCC AGG GTG CTG TCC ACA CTG GCT CCC
2	ATR	TGC AAA ATG TGG CTT TGC TTT GTC TTG TTG CA
3	ACE NOINS	TGA GCT CCA GCC CTT AGC TCA CCT CTG CTT G
4	ACE INS	TAG TGG CGG GCG CTG TGG TCC CAG CTA CTT
5	MTHFR	cac CTG GAT GGG AAA GAT CCC GGG GAC GAT
6	PAI-I	TGG TCT TTC CCT CAT CCC TGC CAT GTG CCC
7	eNOS	GTG CTC CAG GGG CAC CTC AAG GAC CAG CTC
8	APOE 4H	GT CAT CGG GAT CGC GGA GGA GCC GCT TAC
9	APOE 2H	GGG CCC CGG CCT GGT ACA CTG CCA G
10	ER	TGT CTC TGT TTC CCA GAG ACC CTG AGT GTG G
11	Vit D	TTG CAG AGT GTG CAG GCG ATT CGT AGG GGG
12	β2AR	CAT TGC CAA ACA CGA TGG CCA GGA CGA TGA
13	β3AR	ACC ACC AGG AGT CCC ATC ACC AGG TCG GCT

상기 성인병관련 SNPs 올리고 염기는 시판되는 것을 구입하거나 직접 합성하여 이용할 수 있다.

올리고염기 칩의 제작에 있어 가장 중요한 것은 올리고염기들의 염기서열이 전체 게놈에서 유일해야 하고, 또한 각각의 결합 온도가 서로 비슷하여야 한다. 이러한 조건을 만족시키는 성인병관련 SNPs 올리고염기를 선택하기 위하여 본 발명에서는 고혈압, 동맥경화증, 치매, 골다공증, 당뇨합병증 등의 5가지 성인병관련 유전자를 스크리닝하고 그 중 결합 온도가 45 ~ 48 ℃의 범위 내에 해당하는 상기 11개의 유전자를 결정하였다. 성인병관련 유전자 11종의 유전자 염기서열은 모두 밝혀져 있고 인터넷을 통해서도 염기서열을 알 수 있다.(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 확보된 11종의 성인병관련 유전자의 염기서열 중 프라이머를 이용하여 증폭한 유전자 영역(PCR product)내에서 30bp 크기로 11종의 각 유전자에 특이적인 염기서열을 선정하였고 ACE와 APOE의 경우 각각 1종씩의 특이적인 염기서열을 추가하여 총 13종의 올리고 염기(프로브)를 결정하였다. 특이적인 프로브를 얻기 위하여 PCR product중 가능한 중간부위를 선택하였고 각각의 30bp의 유전자칩용 프로브는 유전자 염기서열 alignment 분석프로그램인 seqscape ver 2.5를 이용하여 같은 염기서열이 겹치지 않도록 디자인하였다. 그러나 alignment 분석 프로그램이라 하더라도 실제로 교잡결합의 결과와 일치하지는 않는 임의성이 있으므로 교잡결합과 프로브의 선정이 제대로 되었는지는 교잡결합의 결과로 11종의 각 성인병관련 유전자에 특이적인 프로브임을 증명하여 프로브 염기서열의 정당성을 확보하였다.

올리고염기 칩을 제작하는 구체적인 방법으로는, 먼저 성인병관련 SNPs 올리고염기의 5'-말단에 아민기를 연결시킨다.

그리고 알데하이드기로 코팅된 현미경용 유리슬라이드 글라스를 준비한 다음 그 위에 올리고염기를 부착시킨다. 올리고염기를 부착시키는 과정은 당업계에서 주지하는 방법을 모두 이용할 수 있다. 즉, Pin microarray, Inkjet, Electronic array 및 Photolitoarray를 이용한 직접합성도 모두 가능하다.

구체적으로 본 발명에서는 표면이 알데하이드기로 코팅된 현미경용 유리슬라이드 글라스를 8구역으로 분할하고 마이크로어레이 스포터(spotter, MicroGrid, Biorobotics, 영국)를 이용하여 상기 표 1의 성인병관련 올리고 염기를 20p㏖/㎕농도로 맞춰 스포팅(spotting)하였다(도6 참조). 13종류의 올리고 염기를 각 올리고 염기당 2 spots씩 동일하게 붙여 주었다. 이때 8구획으로 분할한 것은 이후 교잡반응에서 구역분할 교잡반응 챔버를 이용하기 위함이다. 올리고 염기가 부착된 spotting이 끝난 유리 슬라이를 500㎖ 0.2% SDS 용액에서 2분 동안 2번씩 세척하고 증류수로 2번 세척한 후 1.3g NaBH4와 375㎖ PBS 그리고 125㎖ 에탄올이 혼합된 용액에 넣고 5분 동안 격렬히 교반하여 준 후, 다시 0.2% SDS 용액에서 1분씩 3번의 세척과 증류수로 1분씩 2번 세척한 후 물기를 제거하여 건조 후 밀봉된 상자에 보관하여 사용하였다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 성인병관련 SNPs 검사용 올리고 칩을 포함하는 검사 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 검사 키트는 (ⅰ) 성인병관련 유전자의 SNPs가 결합된 올리고염기 칩; (ⅱ) 검체로부터 분리한 유전자를 증폭시키는 수단; 및 (ⅲ) 증폭 산물과 올리고염기 칩의 보합결합을 탐지하는 검출수단을 포함하고, (ⅳ) 또한 선택적으로 검체로부터 유전자를 추출하는 수단을 포함할 수 있다.

구체적으로 본 발명에 따른 검사 키트의 구성과 그 작용은 다음과 같다.

<SNPs를 검사하고자 하는 성인병관련 유전자의 추출 수단>

30ml 추출용액(5% chelex (Bio-Rad))이 포함된 50ml 용량의 보틀 2개.

혈액검체 100ul를 Tris 용액(10mM Tris HCl, pH 8.0) 1.0ml와 함께 1분간 전도혼화한후 3000rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 이과정을 2번 반복한다. proteinase K(50mg/ml)와 함께 55℃에서 3시간 이상 반응시키고 10회 전도혼화한 유전자추출 용액 0.1ml를 침전물에 넣고 1분간 진탕 혼합하여 침전물과 혼합시킨 후, 100℃에서 20분간 가열한다. 실온에서 5분간 방치한 후, 14,000rpm에 5분간 원심분리시켜서 분리된 상층액 0.1ml을 PCR에 사용하거나 사용시까지 냉장고에 보관한다.

<SNPs를 검사하고자 하는 성인병관련 유전자의 PCR 수단>

500 ㎕의 P 1 이 포함된 1.5 ㎖ 튜브 1개.

500 ㎕의 P 2 가 포함된 1.5 ㎖ 튜브 1개.

500 ㎕의 P 3 가 포함된 1.5 ㎖ 튜브 1개.

500 ㎕의 P 4 가 포함된 1.5 ㎖ 튜브 1개.

100 ㎕(5 units/㎕)의 Taq DNA polymerase가 포함된 1.5 ㎖ 튜브 1개.

500 ㎕의 25mM dNTP가 포함된 1.5 ㎖ 튜브 1개.

500 ㎕의 10X 버퍼용액(750mM Tris-Cl (pH9.0), 150mM (NH4)2SO4,

1mg/ml BSA, 25mM MgCl2)이 포함된 1.5 ㎖ 튜브 1개.

이 때 상기 P1으로 표기된 용기에는 서열번호 14, 17, 20, 22, 24, 27 및 30의 정상적인 염기서열을 가진 상류 프라이머와 서열번호 16, 19, 21, 23, 26, 29 및 32의 하류 프라이머가 혼합되어 있고,

P2로 표기된 용기에는 서열번호 15, 18, 21, 23, 25, 28 및 31의 변이 염기서열을 가진 상류 프라이머와 서열번호 16, 19, 21, 23, 26, 29 및 32의 하류 프라이머가 혼합되어 있고,

P3으로 표기된 용기에는 서열번호 33, 36, 39, 42, 45 및 48의 정상적인 염기서열을 가진 상류 프라이머와 서열번호 35, 38, 41, 44, 47 및 50의 하류 프라이머가 혼합되어 있고,

P4로 표기된 용기에는 서열번호 34, 37, 40, 43, 46 및 49의 정상적인 염기서열을 가진 상류 프라이머와 서열번호 35, 38, 41, 44, 47 및 50의 하류 프라이머가 혼합되어 있다.

성인병관련 유전자의 PCR을 위한 프라이머의 종류와 염기서열 구조

서열번호	유전자		염기서열구조	형광유무
14	AGT	5'-wt	5' - AAG ACT GGC TGC TCC CTG AT - 3'	Cy5
15		5'-mt	5' - AAG ACT GGC TGC TCC CTG AC - 3'	Cy5
16		3'	5' - GGT GGT CAC CAG GTA TGT CC - 3'	없슴
17	ATR	5'-wt	5' - GCA CTT CAC TAC CAA ATG AGC A - 3'	Cy5
18		5'-mt	5' - GCA CTT CAC TAC CAA ATG AGC C - 3'	Cy5
19		3'	5' - GAG CAG CCG TCA TCT GTC TA - 3'	없슴
20	ACE NOINS	5'	5' - CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT- 3'	Cy5
21	ACE NOINS	3'	5'-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T- 3'	없슴
22	ACE INS	5'	5'- CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT - 3'	Cy5
23	ACE INS	3'	5'-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3'	없슴
24	PAI-I	5'-wt	5' - GTC TGG ACA CGT GGG GA - 3'	Cy5
25		5'-mt	5' - GTC TGG ACA CGT GGG GG - 3'	Cy5
26		3'	5' - TGC AGC CAG CCA CGT GAT TGT CTA - 3'	없슴
27	MTHFR	5'-wt	5' - AAG GTG TCT GCG GGA GCC - 3'	Cy5
28		5'-mt	5' - AAG GTG TCT GCG GGA GCT - 3'	Cy5
29		3'	5' - GTG GGG TGG AGG GAG CTT AT - 3'	없슴
30	eNOS	5'-wt	5' - CTG CAG GCC CCA GAT GAG - 3'	Cy5
31		5'-mt	5' - CTG CAG GCC CCA GAT GAT - 3'	Cy5
32		3'	5' - CTT GCA GGC CCT TCT TGA G - 3'	없슴
33	APOE 4H	5'-wt	5' - CGG ACA TGG AGG ACG TGT - 3'	Cy5
34		5'-mt	5' - CGG ACA TGG AGG ACG TGC - 3'	Cy5
35		3'	5' - GTA CAC TGC CAG GCG CTT CT - 3'	없슴
36	APOE 2H	5'-wt	5' - CCC GAT GAC CTG CAG AAG C - 3'	Cy5
37		5'-mt	5' - CCC GAT GAC CTG CAG AAG T - 3'	Cy5
38		3'	5' - GGC CAG GGA GCC CAC AGT - 3'	없슴
39	Vit D	5'-wt	5' - AGC CTG AGT ATT GGG AAT GC - 3'	Cy5
40		5'-mt	5' - AGC CTG AGT ATT GGG AAT GT - 3'	Cy5
41		3'	5' - CCT CAC TGC CCT TAG CTC TG - 3'	없슴
42	ER	5'-wt	5' - GAG TTC CAA ATG TCC CAG CT - 3'	Cy5
43		5'-mt	5' - GAG TTC CAA ATG TCC CAG CC - 3'	Cy5
44		3'	5' - CAG AAC CAT TAG AGA CCA ATG C-3'	없슴
45	β2AR	5'-wt	5' - ACC ACG ACG TCA CGC AGC - 3'	Cy5
46		5'-mt	5' - ACC ACG ACG TCA CGC AGG - 3'	Cy5
47		3'	5' - CAG GCC AGT GAA GTG ATG AA - 3'	없슴
48	β3AR	5'-wt	5' - TCA TCG TGG CCA TCG CCT - 3'	Cy5
49		5'-mt	5' - TCA TCG TGG CCA TCG CCC - 3'	Cy5
50		3'	5' - GTC ACA CAC AGC ACG TCC AC - 3'	없슴

한 시험관 내에서 다수의 PCR 산물의 획득이 가능하도록 즉 Multiplex PCR이 가능하도록 각각의 상류와 하류 프라이머의 반응 조건을 일치되도록 하였다. 이에 본 발명은 한 시험관 내에서 P1과 P2는 6종과 P3와 P4는 8종의 PCR 산물이 생산되도록 하기 위하여, 10X PCR 완충용액(750mM Tris-Cl (pH9.0), 150mM (NH4)2SO4, 1mg/ml BSA, 25mM MgCl2), 2.5mM dNTPs, 및 각각의 성인병관련 유전자들의 중합효소 연쇄반응 부위에 대응하는 상류와 하류 프라이머(표 2)를 미리 섞어 놓은 P1, P 2, P3, P4와 Taq DNA polymerase, 10X 버퍼용액이 포함되도록 구성하였다.

유전자 증폭의 조건은 DNA 100ng/ul를 주형(template)을 사용하여 주형 2.0ul, 10×Buffer 5.0ul, P1, P2, P3 또는 P4 1.0ul, 2.5mM dNTP 4.0ul, Taq 폴리머라제 0.5ul Distilled Water 37.5ul를 넣고 total 50.0ul로 하여 기본적인 PCR mixture를 만든다. PCR amplifier를 이용하여 (9700, ABI, 미국) 94℃에서 5분 변성시키고 94℃에서 1분 58℃에서 1분 72℃에서 1분을 30회 증폭하고 72℃에서 5분간 반응시킨다.

ACE 유전자의 프라이머는 삽입유전자 유무에 따라 프라이머를 구분하였으나 실제 같은 프라이머를 사용하고 올리고염기 칩의 프로브에 의해 삽입유전자를 판정한다.

<SNPs를 검사하기 위한 올리고염기 칩>

각 성인병관련 유전자와 특이적으로 결합하는 표 1의 올리고 염기가 부착된 올리고 염기 칩.

<올리고염기 칩에 올리고염기 연결 분석 산물을 보합결합시키는 수단>

올리고염기 칩 8 well 보합결합 챔버 1개(hybridization chamber, Sigma, 미국).

500 ㎕의 보합결합 완충용액(12X SSPE, 0.9 M NaCl, 60 mM NaH2PO4, 6 mM EDTA)이 포함된 1.5 ㎖ 튜브 4개.

<증폭 산물과 올리고염기 칩의 보합결합을 탐지하는 검출수단>

보합결합이 끝난 올리고염기 칩의 세척을 위한, 3X SSPE 용액, 1X SSPE 용액

올리고염기 칩 분석을 위한 마이크로어레이 스캐너(Express, Perkin Elmer, 미국)

본 발명에 따른 올리고염기 칩 및 이를 포함한 상기의 키트를 사용하여 성인병 관련 유전자들의 SNPs 를 검사하는 방법은 (1) 검체로부터 분리한 유전자를 증폭시키는 단계; (2) 증폭 산물을 상기 올리고염기 칩에 교잡반응시키는 단계; 및 (3) 교잡반응에서 특이적으로 결합된 유전자 SNPs를 확인하는 단계를 포함한다.

성인병관련 유전자들내에 존재하는 11종의 SNPs를 올리고염기 칩으로 검사하는데 약 8시간이 소요된다.

이하 본 발명의 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

<실시예 1> 성인병관련 유전자들내에 존재하는 SNPs를 포함하는 유전자의 추출과정.

혈액검체 100ul를 Tris 용액(10mM Tris HCl, pH 8.0) 1.0ml와 함께 1분간 전도혼화한 후 3000rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 이 과정을 2번 반복하였다. 프로테나아제 K(proteinase K; 50mg/ml)와 함께 55℃에서 3시간 이상 반응시키고 10회 전도혼화한 유전자추출 용액 0.1ml를 침전물에 넣고 1분간 진탕 혼합하여 침전물과 혼합시킨 후, 100℃에서 20분간 가열하였다. 실온에서 5분간 방치한 후, 14,000rpm에 5분간 원심분리시켜서 분리된 상층액 0.1ml을 PCR에 사용하거나 사용시까지 냉장고에 보관한다.

<실시예 2> 성인병관련 유전자들내에 존재하는 SNPs를 포함하는 유전자 부위의 PCR.

실시예 1에서 분리한 1개의 검체에서 추출한 유전자를 이용하여 200 ㎕ PCR 튜브 4개를 준비하고, 각각의 튜브에 100 ng 씩의 유전체를 넣었다.

4개의 튜브에 각각 10×Buffer 5.0ul, 2.5mM dNTP 4.0ul를 넣고 각 튜브에는 P1과 P3(정상 유전자 검출), P2와 P4(변이 유전자 검출) 각 1.0ul 넣은 후 0.5㎕ 씩의 Taq DNA polymerase를 첨가하여 증류수로 총 부피가 50 ㎕ 되게 하였다.

상기의 용액을 혼합하여 원심분리한 후, 자동온도 조절 장치(9700 thermal cycler, PE, 미국)에서 95℃로 4분 동안 1회 가온한 다음 95℃ 50초, 59℃ 20초, 72℃ 30초의 반복되는 과정을 30회 실시한 후, 72℃에서 3분 동안 1회 가온한 다음 4℃에 보관하였다. 이 과정에서 소요되는 시간은 2시간 30분 정도이다.

<실시예 3> 성인병관련 유전자들의 SNPs를 검사하기 위한 올리고염기 칩의 제작

우선, 성인병관련 유전자들의 정상(Normal) SNPs 검사용 프라이머 5' 말단에 Cys5 부착하였다(Metabion Co.에서 구입)

각각의 올리고염기(40 pmol/㎕) 20 ㎕에 2X spoting(12X EEPE) 용액 20 ㎕를 첨가하여 혼합하였다. 표면이 알데하이드기로 코팅된(Cell Associates Co.에서 구입) 현미경용 유리 슬라이더를 8개 구역으로 분할하여 1구역 당 20 p㏖/㎕의 농도로 맞춰진 13종의 올리고염기들을 SNP 하나당 복수로 2개씩 그리고 Cy5 양성 대조군을 마이크로어레이어 장치로 각 구역에 맞게 동일하게 부착시켰다(도 2 및 3 참조).

그 후, 상기 올리고염기 칩이 부착되어 있는 유리 슬라이드를 500 ㎖의 0.2% SDS 용액으로 2분간 2회 세척하고 증류수로 2회 세척한 후, 1.3g NaBH4와 375㎖ PBS (Phosphate Buffered Saline) 그리고 125㎖ 에탄올이 혼합된 용액에 5분간 정치한 후, 다시 0.2 % SDS 용액으로 1분간 3회 세척한 후 증류수로 1분간 2회 세척한 후 물기를 제거한 후 성인병관련 유전자들의 SNPs 검사용 올리고염기 칩으로 사용하였다.

<실시예 4> 성인병관련 유전자들의 SNPs를 검사하기 위한 올리고염기 칩과 PCR산물의 보합결합

상기 실시예 3에서 제작된 올리고염기 칩에 8 well 보합결합용 챔버(hybridization chamber, Sigma, 미국)를 밀착시켰다.

500㎕ PCR 튜브에 실시예 2에서 얻은 PCR 산물 5㎕와 12X SSPE 보합결합 완충용액 35㎕를 첨가하여 총 부피가 40㎕ 가 되게한 후, 100℃에서 5분간 가온 한 다음 얼음에 3분간 정치하였다.

이를 원심분리한 후, 올리고염기 칩의 각 well 당 상기액을 40㎕씩 주입하고, well을 테이프로 밀봉하여 증발을 방지한 후, 42℃ 가 유지되는 항온기에서 1시간 동안 보합결합시켰다.

<실시예 5> 올리고염기 칩의 세척

3X SSPE 완충용액 200 ㎖이 들어있는 용기에 보합결합 반응이 끝난 올리고염기 칩을 넣고 2분간 1회 세척하였다.

1X SSPE 완충용액 200㎖이 들어있는 용기에 옮겨 2분간 1회 세척하였다.

물기를 제거한 후 결과 확인 전까지 빛이 차단된 곳에 보관하였다.

<실시예 6> 올리고염기 칩의 판독

스케너를 649nm의 여기 파장과 670nm의 방출 파장을 검출할 수 있도록 설정한 후 세척이 끝난 올리고염기 칩을 넣어 형광물질인 Cy5(적색 형광물질)의 발색여부로 PCR 산물과 올리고염기 칩의 보합결합 여부 및 그 위치를 분석함으로서 성인병관련 유전자들의 SNPs를 판독하였다(표 3 내지 9 및 도 4 참조).

올리고 염기 칩에 의한 AGT 유전자 M235T의 SNPs 판독 결과

항 목	type	chip image
AGT	wild type
	heterotype
	mutation

표 3의 칩 항목에서 중간에 수직으로 7개의 형광을 보이는 점들은 위치를 판정하는 마커이다. 각각의 중간 마커점들을 제외한 형광을 보이는 점들은 PCR 산물들이 각각의 올리고염기 칩내의 올리고염기에 결합된 것을 나타낸다. 왼쪽의 그림에서만 형광을 보이면 정상 SNP를 나타내고, 오른쪽의 그림에서만 형광을 나타내면 돌연변이 SNP를 나타낸다. 양쪽에서 형광이 발현된 경우 정상 SNP와 돌연변이 SNP 가 혼재된 것을 나타낸다.

올리고 염기 칩에 의한 ACE 유전자 삽입유전자의 판독 결과

ACE	no insertion
ACE	insertion

표 4의 칩 항목에서 중간에 수직으로 7개의 형광을 보이는 점들은 위치를 판정하는 마커이다. 각각의 중간 마커점들을 제외한 형광을 보이는 점들은 PCR 산물들이 각각의 올리고염기 칩내의 올리고염기에 결합된 것을 나타낸다. 양쪽에서 형광을 나타내서 좌하부터 네 번째 위치에 점들이 보이면 삽입염기가 없는 것이고 동일하게 형광을 나타내고 좌하부터 세 번째 위치에 점들이 보이면 삽입유전자가 있는 것이다.

본 발명의 올리고염기 칩에 있어서 ACE만이 삽입유전자를 검사하고 나머지 10종의 유전자는 표 3에 보이는 형식을 따른다.

올리고 염기 칩에 의한 고혈압관련 유전자 SNPs의 판독 결과

질 환	항 목	type	chip image
고혈압	AGT	wild type
		heterotype
		mutation
	ATR1	wt
		hetero.
		mt
	ACE	no insertion
	ACE	insertion

올리고 염기 칩에 의한 동맥경화증관련 유전자 SNPs의 판독 결과

질 환	항 목	type	chip image
동맥경화증	MTHFR	wt
		heterotype
		mutation
	PAI-1	wt
		hetero.
		mt
	eNOS	wt
		hetero.
		mt

올리고 염기 칩에 의한 당뇨합병증·알츠하이머 관련 유전자 SNPs의 판독 결과

질 환	항 목	type	chip image
당뇨합병증.알츠 하이머	APOE-1 (4H)	wt
		hetero.
		mt
	APOE-2 (2H)	wt
		hetero.
		mt

올리고 염기 칩에 의한 골다공증 관련 유전자 SNPs의 판독 결과

질환	항목	type	chip image
골다공증	ER	wt
		hetero.
		mt
	VDR	wt
		hetero.
		mt

올리고 염기 칩에 의한 비만 관련 유전자 SNPs의 판독 결과

질환	항목	type	chip image
비만증	b2AR	wt
		hetero.
		mt
	b3AR	wt
		hetero.
		mt

상기의 결과에서 본 바와 같이, 본 발명인 올리고염기 칩을 이용한 성인병관련 유전자들(AGT, ACE, ATR1, ER, VDR ApoE, eNOS, MTHFR, PAI-1, β2AR, β3AR)의 SNPs 검사 방법에 사용되는 올리고염기 칩과 시약들을 키트화 하면 대량의 검체에 대한 SNPs 검사를 많은 시간과 노력 없이 매우 손쉽게 할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 올리고염기 칩, 이를 포함한 성인병관련 유전자의 SNPs 검사키트 각각의 SNPs를 민감도와 특이도가 높고 정확하게 판독할 수 있었으며, 또한 SNPs를 검사할 검체를 PCR 과정으로 증폭시키는 과정에 서부터 올리고염기 칩으로 SNPs를 판독하기까지 약 8시간 내로 신속하게 검사할 수 있다.

또한 본 발명은 다른 유전자의 SNPs 검사에 응용하는 것이 가능하므로 각종 약물 대사 또는 다른 질환과 관련된 다른 유전자들의 SNPs 검사에도 이용할 수 있는 산업적으로 매우 유용한 SNPs 검사 방법이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열 1 내지 서열 13의 올리고염기가 부착된 성인병관련 유전자의 SNPs 검사용 올리고염기 칩.
(ⅰ)서열 1 내지 서열 13의 올리고염기가 부착된 올리고염기 칩;

(ⅱ)검체로부터 분리한 유전자를 증폭시키는 수단; 및

(ⅲ)증폭 산물과 올리고염기 칩의 보합결합을 탐지하는 검출수단을 포함하고, (ⅳ) 또한 선택적으로 검체로부터 유전자를 추출하는 수단을 더 포함하는 성인병관련 유전자의 SNPs 검사 키트.
제2 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 수단은 서열 14 내지 서열 50의 프라이머를 포함하는 성인병관련 유전자의 SNPs 검사 키트.
제3 항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응에 이용되는 프라이머는 서열 14 내지 서열 50의 프라이머를 포함하는 성인병관련 유전자의 SNPs 검사 키트.
(ⅰ) 검체로부터 분리한 유전자를 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭시키는 단계; (ⅱ) 증폭 산물을 서열 1 내지 서열 13의 올리고염기가 부착된 올리고염기 칩에 교잡반응시키는 단계; 및 (ⅲ) 교잡반응에서 특이적으로 결합된 유전자 SNPs 를 확인하는 단계를 포함하는 성인병관련 유전자 SNPs 검사방법.