KR100740168B1 - Monitoring Method of Polymerase Chain Reaction by Measuring Thermal Conductivity - Google Patents
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Abstract
본 발명은 열전도율 측정을 이용한 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction ; PCR)의 감시 방법 및 이를 이용한 감시 센서에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 핵산 반응액의 열전도율 차이를 비정상 열선법 등으로 실시간 측정하여 중합효소 연쇄반응의 진행 결과를 감시하는 방법 및 이를 이용한 감시 센서에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 부가적인 장비가 없이도 중합효소 연쇄반응의 결과물을 실시간으로 정확하게 측정할 수 있어 경제적이고 시간과 노동력도 효과적으로 절감시키므로 기존의 핵산 중합 반응을 이용하는 진단 방법 등에 널리 사용될 수 있다. The present invention relates to a method for monitoring a polymerase chain reaction (PCR) using a thermal conductivity measurement and a monitoring sensor using the same. More specifically, the polymerization is performed by measuring a difference in thermal conductivity of a nucleic acid reaction solution in real time by an abnormal heat ray method or the like. The present invention relates to a method for monitoring the progress of an enzyme chain reaction and a monitoring sensor using the same. The method of the present invention can accurately and accurately measure the result of a polymerase chain reaction in real time without additional equipment, and is economically effective in time and labor. It can be widely used in the diagnostic method using the existing nucleic acid polymerization reaction and so on.
Description
도 1 은 종래 중합효소 연쇄반응의 원리를 나타내는 개념도이다.1 is a conceptual diagram showing the principle of a conventional polymerase chain reaction.
도 2 는 1차원 열전도 분석을 위한 열적 흐름과 원소 상태를 나타낸 것이다.Figure 2 shows the thermal flow and elemental state for the one-dimensional thermal conductivity analysis.
도 3 은 본 발명의 열전도율을 이용한 중합효소 연쇄반응의 감시 방법을 나타내는 개념도이다.3 is a conceptual diagram showing a method for monitoring a polymerase chain reaction using the thermal conductivity of the present invention.
도 4 는 본 발명의 감시 방법에서 사용하는 열전도율 차이를 측정하는 계측 장비를 나타낸 것이다.4 shows measurement equipment for measuring the difference in thermal conductivity used in the monitoring method of the present invention.
도 5 는 기존의 실험 시료에서 중합효소 연쇄반응의 진행 여부 및 정도를 확인하는 과정을 나타낸 것이다.Figure 5 shows the process of confirming the progress and degree of the polymerase chain reaction in the existing experimental sample.
도 6 은 본 발명의 감시 방법으로 중합효소 연쇄반응의 진행 사이클에 따른 열전도율을 측정하고 음성 대조군과 비교한 결과를 나타낸 것이다. Figure 6 shows the result of measuring the thermal conductivity according to the progress cycle of the polymerase chain reaction by the monitoring method of the present invention and compared with the negative control.
본 발명은 열전도율 측정을 이용하는 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)의 감시 방법 및 이를 이용한 감시 센서에 관한 것으로서, 보다 상 세하게는 핵산 반응액의 열전도율 차이를 비정상 열선법 등으로 실시간 측정하여 중합효소 연쇄반응의 진행 결과를 감시하는 방법 및 이를 이용한 감시 센서에 관한 것이다. The present invention relates to a method for monitoring a polymerase chain reaction (PCR) using a thermal conductivity measurement and a monitoring sensor using the same, more specifically, by measuring the difference in thermal conductivity of a nucleic acid reaction solution in real time by an abnormal heat ray method or the like. The present invention relates to a method for monitoring the progress of a polymerase chain reaction and a monitoring sensor using the same.
분자 생물학(molecular biology)은 그 연구 방법의 특성상 실험이 아주 중요한 부분을 차지하고 있다. 다시 말하면 분자생물학의 발전은 실험 방법의 발달을 그 전제로 하고 있다고 할 수 있다. 그동안 여러 가지 획기적인 실험 방법들이 개발되어 과거에는 불가능했던 연구들이 이루어졌고, 그 결과 분자생물학이라는 새로운 학문이 탄생하게 되었다. 현재 여러 분야의 생물학적 연구 및 질병 진단 분야에서 분자생물학이라는 도구를 제외한다는 것은 상상하기도 힘든 일이다. 그 도구들 중 가장 중요한 것 중 하나가 중합효소 연쇄반응 (polymerse chain reaction; 이하 "PCR"이라고 약칭함)법이다.In molecular biology, experiments are an important part of the nature of the research method. In other words, the development of molecular biology presupposes the development of experimental methods. In the meantime, several groundbreaking experimental methods have been developed, and studies that were impossible in the past have been made, resulting in a new field of molecular biology. It's hard to imagine the exclusion of a tool called molecular biology in many areas of biological research and disease diagnosis. One of the most important of these tools is the polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as "PCR").
1983년 이후 DNA (deoxyribonucleic acid)를 증폭하기 위해 중합효소 연쇄반응을 이용한 방법, 즉 유전자 진단 방법 중 하나로 특정 DNA 영역을 시험관 내에서 효소를 사용하여 특정 유전자를 증폭시키는 방법이 사용되어 왔다 (도 1 참조). 이는 1985년 멀리스 (Kary B. Mullis)에 의해 처음 개발되었고, 그는 이러한 PCR 에 대한 기본 개념을 제시한 공로를 인정받아 1993년에 노벨 화학상을 받았다. PCR 개발되어 보급되기 전에서는 DNA 진단을 위해서 하프로이드 (haploid) 당 30억 개의 염기쌍으로 이루어지는 사람의 게놈 DNA 를 재조합 DNA 기술을 이용하여 유전자 복제하는 과정이 필요하였다. 이러한 이유에서 대장균이나 파지에 대한 지식이 많이 필요하였으며, 시간과 노력이 많이 들어 DNA 진단이 임상적으로 널리 보급되는 데 장애가 있었다. PCR 은 이와 같은 복잡한 단계를 불과 수 시간의 효소 반응으로 바꾸었으며, 그 응용 가능성이 매우 높은 DNA 진단의 중심이 되는 기법이 되었고, 분자 생물학적인 접근을 필요로 하는 모든 생명과학 분야뿐만 아니라 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학, 고고학 및 인류학에까지 그 활용 범위를 넓혀가고 있다.Since 1983, a method using polymerase chain reaction to amplify DNA (deoxyribonucleic acid), that is, one of gene diagnosis methods, has been used to amplify specific genes using enzymes in vitro in specific DNA regions (FIG. 1). Reference). It was first developed by Kary B. Mullis in 1985 and was awarded the 1993 Nobel Prize in Chemistry for his contributions to the basic concepts of PCR. Before PCR was developed and distributed, gene genomic DNA of 3 billion base pairs per half-loid (haploid) was required for gene duplication using recombinant DNA technology. For this reason, much knowledge of E. coli or phage was required, and it took time and effort to hinder the widespread clinical diagnosis of DNA. PCR has transformed this complex step into just a few hours of enzymatic reactions, and has become the centerpiece of highly applicable DNA diagnostics, as well as medicine and science as well as all life sciences that require molecular biological approaches. It is expanding its application to agriculture, veterinary medicine, food science, environmental science, archeology and anthropology.
열전도율은 하기 수학식 1 에 나타난 바와 같이 정의되며, 이를 사용하면 여러 물질들의 열전도율을 실험적으로 측정할 수 있다.Thermal conductivity is defined as shown in
여기서, 
상기 수학식 1 로 비교적 낮은 온도 범위 내에 있는 기체에 대해서는 기체운동론 (kinetic theory of gases)을 바탕으로 한 해석적 방법을 통해 실험적으로 조사된 값을 정확하게 예측할 수 있다 (도 2 참조). 액체 및 고체에 대해서는 열전도율을 예측하는 이론들이 있기는 하지만, 일반적으로 액체 및 고체에 관련된 의문점 및 개념은 아직 명확히 해야 할 필요가 있다.
기체 내에서 열전도 기전 (mechanism)은 대단히 간단하다. 기체 분자의 운동 에너지는 그 기체의 온도에 비례하기 때문에 고온 영역에서의 분자는 저온 영역에서 보다 더 큰 속도를 갖는다. 분자들은 서로 충돌하고 에너지와 운동량을 교환하면서 계속적이고 불규칙적인 운동을 하고 있다. 분자들은 기체 내의 온도 구배의 존재 여부에도 불구하고 이러한 불규칙적인 운동을 계속하고 있다. 만약 한 분자가 고온 구역에서 저온 구역으로 움직인다면 그 분자는 저온 구역으로 운동 에너지를 운반하여 저온 구역에 있는 분자와 충돌하면서 이 에너지를 전달할 것이다. The heat conduction mechanism in the gas is very simple. Since the kinetic energy of a gas molecule is proportional to the temperature of the gas, molecules in the high temperature region have a higher velocity than in the low temperature region. The molecules are in constant and irregular motion, colliding with each other and exchanging energy and momentum. Molecules continue this irregular movement despite the presence of temperature gradients in the gas. If a molecule moves from the hot zone to the cold zone, it will carry kinetic energy into the cold zone and impinge on it, colliding with molecules in the cold zone.
한편, 액체에서 열전도 기전은 일반적으로 기체에서와 비슷하지만 분자들이 더욱 조밀하게 위치하고 있으며 분자들이 서로 충돌할 때 분자적 힘 영역 (molecular force field)이 에너지 교환에 큰 영향을 미치기 때문에 기체에서보다 더욱 복잡하다. On the other hand, the thermal conduction mechanism in liquids is generally similar to that in gas, but more complex than in gas because the molecules are located more densely and the molecular force field has a greater effect on energy exchange when they collide with each other. Do.
또한, 고체에서 열은 두 가지 방법, 즉 격자 진동 및 자유 전자에 의해 전달될 수 있다. 전기적으로 양호한 전도체에서는 더 많은 자유 전자가 고체의 격자 구조 안에서 움직이고 있고, 이들 자유 전자가 움직일 때 전하 (electric charge)를 수송할 뿐만 아니라 기체의 경우와 마찬가지로 고온 구역에서 저온 구역으로 열에너지를 운반한다. 따라서 이들 전자들을 전자가스 (electron gas)라고 부르기도 한다. 에너지는 고체의 격자 구조 안에서 진동 에너지의 형태로도 운반될 수 있다. 그러나 일반적으로 진동 에너지는 전자가 운반하는 에너지에 비해서 매우 적다. 그러므로 구리, 알루미늄 및 은과 같이 전기적으로 양호한 전도체는 양호한 열전도체라고도 할 수 있으며 좋은 전기 절연체는 좋은 단열재라고 말할 수 있다. 이에 대한 예외적인 경우로서 다이아몬드는 전기적으로는 부도체이지만, 은이나 구 리보다 열전도율이 다섯 배나 크다.In addition, heat in the solid can be transferred by two methods: lattice vibration and free electrons. In electrically good conductors, more free electrons are moving in the lattice structure of the solid, and not only transport electric charges when they move, but also heat energy from the hot zone to the cold zone as in the case of gas. Therefore, these electrons are also called electron gas. The energy can also be carried in the form of vibrational energy in the solid lattice structure. In general, however, the vibration energy is very small compared to the energy carried by the electron. Therefore, electrically good conductors such as copper, aluminum and silver can also be called good thermal conductors and good electrical insulators can be said to be good thermal insulators. An exception to this is that diamond is an electrical insulator, but five times more thermally conductive than silver or copper.
실시간 중합효소연쇄반응법 (Real time PCR)은 검사체를 확인하는 별도 추가 실험이 필요 없이 이루어질 수 있는 유용한 기술이다. 이러한 실시간 PCR 기술은 시간과 노력이 절감되는 반면에 시스템이 커지고 비용이 증가하는 단점을 가지고 있다. Real time PCR is a useful technique that can be performed without the need for additional testing to identify the test specimen. This real-time PCR technology has the disadvantage of increasing the system and cost while saving time and effort.
또한, 최근 진단 시장의 경우 새로운 기술의 개발과 더불어 기술과 정보 공유를 통해서 매년 높은 성장률을 보이고 있다. 지금까지의 추세뿐만 아니라 향후 추세 또한 가파른 성장을 보일 것이 틀림없다. 이와 더불어 초소형 기술을 대변하는 마이크로 및 나노 기술도 가파른 성장세를 보이고 있다. 따라서, 마이크로 및 나노 기술을 현재 진단 시장을 대변한다고 할 수 있는 중합효소연쇄반응법에 적용시킬 경우 큰 장점을 가질 것이라 예상할 수 있다.In addition, the recent diagnostic market shows high growth rate every year through the development of new technologies and the sharing of technology and information. In addition to the trends so far, the future trends must also show steep growth. In addition, micro and nano technologies, which represent miniature technologies, are also showing rapid growth. Therefore, it can be expected that the micro and nano technology will have a great advantage when applied to the polymerase chain reaction method that can represent the current diagnostic market.
그럼에도 불구하고 상기에서 언급한 실시간 중합효소연쇄반응법의 경우는 시스템을 작게 만들 수 있으나 그 감시 방법에 있어서는 기존에 존재하는 방법을 대체하는데 많은 어려움이 있었다 (도 3 참조). 지금까지 보고된 바에 의하면, 광학적 방법과 전기적 방법 두 가지가 있는 데, 광학적 측정 방법은 크기와 비용 면에서 단점이 있고 전기적 측정 방법은 잡음 문제 면에서 한계가 있었다. Nevertheless, the above-mentioned real-time polymerase chain reaction can make the system small, but there are many difficulties in replacing the existing method in the monitoring method (see FIG. 3). As reported so far, there are two types of optical and electrical methods. Optical measuring methods have disadvantages in size and cost, and electrical measuring methods have limitations in terms of noise problem.
이에 본 발명자들은 종래 중합효소 연쇄반응을 이용한 진단 방법을 개선하기 위하여 노력을 계속한 결과, 핵산 중합 반응액 내에 유전자가 증폭될 경우 반응액 의 물성치가 바뀌고 특히 열전도율이 변하게 되는 점에 착안하여, 핵산 반응액의 열전도율 차이를 비정상 열선법 등으로 실시간 측정하여 중합효소 연쇄반응의 진행 결과를 부가적인 장비가 없이도 실시간으로 정확하게 감시하는 방법 및 이를 이용한 감시 센서를 개발함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다. Accordingly, the present inventors have made efforts to improve a conventional diagnostic method using a polymerase chain reaction. As a result, when the gene is amplified in the nucleic acid polymerization reaction solution, the physical properties of the reaction solution are changed, and in particular, the thermal conductivity is changed. The present invention has been successfully completed by developing a method of accurately monitoring the progress of the polymerase chain reaction in real time without additional equipment by measuring the difference in thermal conductivity of the reaction solution by an abnormal hot wire method and the like, and using the same.
본 발명은 신속하고 정확하며 경제적인 각종 진단 방법에 적합한 감시 방법 및 감시 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다. An object of the present invention is to provide a monitoring method and a monitoring sensor suitable for a variety of rapid, accurate and economical diagnostic methods.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 있어서 핵산 반응액의 열전도율의 차이를 측정하는 중합효소 연쇄반응의 감시 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for monitoring the polymerase chain reaction for measuring the difference in the thermal conductivity of the nucleic acid reaction solution in the polymerase chain reaction (PCR).
또한, 본 발명은 핵산 반응액의 (1) 반응 초기 상태; 및 (2) 반응 상태 변화; 또는 기타 핵산 반응액 내의 (3) 핵산 중합체의 특성; 등을 비정상 열선법을 사용하여 열전도율의 차이를 측정하는 감시 방법을 제공한다.In addition, the present invention (1) reaction initial state of the nucleic acid reaction solution; And (2) change in reaction state; Or (3) the properties of the nucleic acid polymer in other nucleic acid reaction solutions; It provides a monitoring method for measuring the difference in thermal conductivity by using the abnormal heating method.
또한, 본 발명은 상기 감시 방법을 조직 적합성 항원의 진단, 바이러스 항원 및 항체의 검사 및 유전자형 분석 (genotyping) 등에 사용하는 용도를 제공한다. The present invention also provides the use of the monitoring method for diagnosis of histocompatibility antigens, testing of viral antigens and antibodies, genotyping, and the like.
또한, 본 발명은 핵산 반응액의 열전도율의 차이를 측정하는 중합효소 연쇄반응의 감시 센서를 제공한다. The present invention also provides a sensor for monitoring a polymerase chain reaction for measuring a difference in thermal conductivity of a nucleic acid reaction solution.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 핵산 반응을 이용하는 각종 진단 방법에 유용하게 적용할 수 있는 감시 방법을 제공한다.The present invention provides a monitoring method that can be usefully applied to various diagnostic methods using nucleic acid reactions.
구체적으로, 본 발명은 핵산 반응액의 열전도율의 차이를 측정하는 중합효소 연쇄반응의 감시 방법을 제공한다. Specifically, the present invention provides a method for monitoring a polymerase chain reaction for measuring a difference in thermal conductivity of a nucleic acid reaction solution.
본 발명의 감시 방법은 기존의 중합효소 연쇄반응법과 실시간 중합효소연쇄반응법이 가지고 있는 기술적 한계, 즉 중합효소 연쇄반응 이후에 진행되는 일정한 과정에서 필요한 시간과 노동력을 극복하기 위한 것이다. 특히 실시간 중합효소 연쇄반응에서 사용되던 기존에 제시된 방법들에서의 다음과 같은 단점을 해결한 것이다. 첫째, 실시간 중합효소 연쇄반응의 진행 여부를 확인하는 광학적 측정 방법의 경우는 신호 처리에 대형 시스템이 추가적으로 필요하기 때문에 전체적인 반응기가 대형화할 수밖에 없었다. 둘째, 광학적 측정 방법의 대안으로 제시되었던 전기적 측정 방법의 경우는 그 유용성에도 불구하고 전기 신호에 비해서 잡음이 너무 크기 때문에 현실적인 측정에는 많은 제약을 가지고 있었다. 본 발명의 감시 방법은 이러한 문제점을 핵산 반응액의 물성치 중 하나인 열전도율을 측정하여 해결한 것이다.The monitoring method of the present invention is to overcome the technical limitations of the existing polymerase chain reaction method and real-time polymerase chain reaction method, that is, time and labor required in a certain process that proceeds after the polymerase chain reaction. In particular, the following shortcomings were solved in the existing methods used in real-time polymerase chain reaction. First, in the case of the optical measurement method for checking the progress of the real-time polymerase chain reaction, the entire reactor was inevitably enlarged because a large system was additionally required for signal processing. Second, the electrical measurement method, which has been proposed as an alternative to the optical measurement method, has many limitations for the realistic measurement because the noise is too high for the electrical signal despite its usefulness. The monitoring method of the present invention solves this problem by measuring the thermal conductivity, which is one of the physical properties of the nucleic acid reaction solution.
또한, 본 발명은 열전도율의 차이를 측정하여 핵산 중합 반응액의 초기 상태 및 상태 변화 등을 감시하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for monitoring the initial state and state change of the nucleic acid polymerization reaction solution by measuring the difference in thermal conductivity.
구체적으로, 본 발명의 감시 방법에 있어서 그 원리는 다음과 같다. 핵산 중합 반응액의 초기 상태에는 주형 DNA, 프라이머(primer), dNTP, Taq 폴리머라제 등 길이가 짧은 내용물들이 많이 포함되어 있고, 이와 같이 구성된 반응액으로 중합효소 연쇄반응을 진행시키면 목적 염기 서열이 주형 DNA 에 포함되어 있는 경우는 증폭산물(product)이 생성된다. 이 때 증폭산물은 핵산 중합 반응액의 초기 상 태에 대부분의 함유 물질들과 다르게 길이가 긴 특징을 가진다. 그 결과, 증폭산물은 브라운 운동으로 인하여 운동성을 띄게 되고 상기 반응액 내부를 자유롭게 움직인다. 반면, 반응액의 초기 함유물질들도 브라운 운동에 의해 운동성을 띄긴 하지만 상기 증폭산물이 가지는 운동성과 비교할 때 차이가 나게 된다. 따라서, 이러한 운동성의 차이가 열전도계수의 차이라는 결과로 나타나게 되는 것이다. 또한 상기 증폭산물이 증가함에 따라 반응액을 구성하는 길이가 긴 DNA 가닥들이 늘어나게 되어 고체에 해당하는 물질들이 증가하게 되는 것이다. 고체와 액체의 비율이 반응이 진행됨에 따라 바뀌게 되면 결과적으로 열전도율이 바뀌게 된다.Specifically, the principle of the monitoring method of the present invention is as follows. The initial state of the nucleic acid polymerization reaction solution contains a lot of short-length contents such as template DNA, primer, dNTP, Taq polymerase, and when the polymerase chain reaction proceeds with the reaction solution thus constructed, When contained in DNA, an amplification product is produced. In this case, the amplification product has a long length unlike most of the substances in the initial state of the nucleic acid polymerization reaction solution. As a result, the amplified product is motile due to the Brownian movement and freely moves inside the reaction solution. On the other hand, although the initial content of the reaction solution is also exhibited motility by the Brownian motion is different when compared with the motility of the amplification product. Therefore, this difference in mobility is the result of the difference in the thermal conductivity coefficient. In addition, as the amplification product increases, the length of the long DNA strands constituting the reaction solution increases, so that the material corresponding to the solid increases. If the ratio of solid and liquid changes as the reaction proceeds, the resulting thermal conductivity changes.
본 발명의 감시 방법은 기존의 중합효소 연쇄반응의 진행 과정을 확인하는 데 사용되는 것이 바람직하고, 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time polymerase chain reaction; real time PCR)의 진행 과정을 확인하는 데 사용되는 것이 더욱 바람직하다. 이 때 상기 중합효소 연쇄반응은 보통 30회 이상 50회 이하 이내에서 진행되고, 열전도율은 5회 반복 사이클 단위로 반복 측정되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 열전도율의 차이는 비정상 열선법을 사용하여 측정하는 것이 바람직하다 (도 4 참조). The monitoring method of the present invention is preferably used to confirm the progress of the existing polymerase chain reaction, and is used to confirm the progress of the real time polymerase chain reaction (real time PCR). More preferred. At this time, the polymerase chain reaction is usually carried out within 30 to 50 times, the thermal conductivity is preferably measured repeatedly in units of 5 repeat cycles. In addition, it is preferable to measure the difference of the said thermal conductivity using the abnormal heat wire method (refer FIG. 4).
또한, 본 발명은 핵산 중합체의 특성을 열전도율의 차이를 측정하여 확인하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method of confirming the properties of a nucleic acid polymer by measuring the difference in thermal conductivity.
본 발명의 감시 방법은 상기 중합효소 연쇄반응을 포함하여 기타 핵산 중합 반응이 관여하는 모든 과정 등에 사용되어 반응의 진행 여부 및 반응 정도 등을 판단하는 데 유용하게 사용될 수 있다. The monitoring method of the present invention can be usefully used to determine whether the reaction proceeds, the degree of reaction, etc. to be used in all processes including the polymerase chain reaction and other nucleic acid polymerization reactions.
또한, 본 발명의 감시 방법은 열전도율의 차이를 측정하지만, 이외에도 기존의 광학적 측정 방법 및 전기적 측정 방법 등을 추가적으로 또는 보완적으로 함께 사용할 수 있다. In addition, although the monitoring method of the present invention measures the difference in thermal conductivity, in addition to the conventional optical measurement method and electrical measurement method, etc. may be additionally or complementarily used together.
또한, 본 발명의 감시 방법은 상기 중합효소 연쇄반응으로 HLA-B 엑손 2 항원 등을 포함한 조직 적합성 항원을 판단하는 데 사용되는 것이 바람직하다. 상기 감시 방법은 핵산 반응액의 상태를 신속하고 정확하게 예상하여 각종 장기 이식에 필요한 조직 적합성의 판단 방법 등으로 널리 적용될 수 있다. In addition, the monitoring method of the present invention is preferably used to determine histocompatibility antigens including the HLA-
본 발명의 열전도율 측정을 통한 실시간 중합효소 연쇄반응법은 다음과 같은 장점을 가진다.Real-time polymerase chain reaction method through the thermal conductivity measurement of the present invention has the following advantages.
먼저, 본 발명의 방법은 초소형 중합효소 연쇄반응 기술을 이용하여 충분히 실행이 가능하므로 기존의 장비들을 그대로 사용할 수 있다. 이로 인해 부가적인 장비의 구매가 필요하지 않아 경제적인 면에서 큰 장점을 가진다. 이 점은 현재 시판되는 실시간 중합효소 연쇄반응법에서 필요로 하는 광학적 시스템을 사용하지 않으므로 가격이 저렴하고 측정 시스템의 크기가 작아지게 하는 장점도 얻을 수 있게 한다. First, the method of the present invention can be fully implemented using the micropolymerase chain reaction technology so that the existing equipment can be used as it is. Because of this, there is no need to purchase additional equipment has a great advantage in terms of economics. This makes it possible to obtain the advantages of low cost and small size of the measurement system because it does not use the optical system required by the real-time polymerase chain reaction method currently available.
둘째, 상기 중합효소 연쇄반응의 진행이 끝난 다음 별도의 확인 과정이 필요하지 않으므로 시간과 노동력도 효과적으로 절감할 수 있다. 기존에 중합효소 연쇄반응은 전기영동 및 관찰 (transillumination) 과정을 거쳐야만 그 결과를 확인할 수 있었지만, 본 발명의 확인 방법을 사용하면 핵산 반응액의 물성치를 실시간으로 측정할 수 있기 때문에 별도 추가 과정이 필요 없고 반응 여부를 확인하는 즉 시 반응을 진행시킬지 여부를 결정할 수 있으므로 추가적인 시간과 노력을 효과적으로 줄일 수 있다. Secondly, after the polymerase chain reaction is finished, a separate confirmation process is not required, so that time and labor can be effectively reduced. Previously, the polymerase chain reaction could be confirmed only through electrophoresis and transillumination, but the additional method is required because the confirmation method of the present invention can measure the physical properties of the nucleic acid reaction solution in real time. And the ability to determine whether or not to proceed with the reaction as soon as possible, effectively reducing additional time and effort.
셋째, 핵산 반응액의 열전도율 차이만을 측정하므로 전기적인 신호를 측정하는 데 있어 발생되는 잡음을 제거하는 독립적인 측정이 가능한 장점을 가진다. 기존의 실시간 중합효소 연쇄반응법을 대체하던 전기적인 신호를 이용하는 방법과는 명확히 구별되는 반응액의 물성치인 기계적 성질을 측정하기 때문에 간단한 소형 시스템만으로도 반응 결과를 정확하게 측정할 수 있다.Third, since only the difference in thermal conductivity of the nucleic acid reaction solution is measured, an independent measurement to remove noise generated in measuring an electrical signal is possible. Since the mechanical properties, which are the physical properties of the reaction solution, are clearly distinguished from the methods using the electrical signals, which have been replaced by the conventional real-time polymerase chain reaction method, the reaction result can be accurately measured by a simple small system.
이외에도, 본 발명의 감시 방법은 핵산 중합 반응이 관여하는 각종 진단 방법에 포함되어 각종 질병들을 신속하고 정확하게 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 감시 방법은 바이러스 항원 및 항체의 검사 및 유전자형 분석 (genotyping) 검사 등을 수행하는 데 사용하는 것이 바람직하다. In addition, the monitoring method of the present invention may be included in various diagnostic methods involving a nucleic acid polymerization reaction, and may be usefully used to quickly and accurately diagnose various diseases. In particular, the monitoring method of the present invention is preferably used to perform viral antigen and antibody tests and genotyping tests.
또한, 본 발명은 핵산 반응액의 열전도율의 차이를 측정하는 중합효소 연쇄반응의 감시 센서를 제공한다.The present invention also provides a sensor for monitoring a polymerase chain reaction for measuring a difference in thermal conductivity of a nucleic acid reaction solution.
본 발명의 감시 센서는 열선에 일정한 열유속을 공급하고, 시간에 따른 열선의 저항 변화를 측정하여 열선의 온도-저항 특성으로부터 유체의 열전도율을 구하는 통상적인 비정상 열선법에 사용되는 센서인 것을 특징으로 하며, 중합효소 연쇄반응에 있어서 핵산 반응액의 열전도율의 차이를 측정하는데 사용되는 것이 바람직하고, 이외에도 DNA 를 포함한 핵산의 농도 측정 등에 사용될 수 있다.Surveillance sensor of the present invention is characterized in that the sensor used in the normal abnormal hot wire method to supply a constant heat flux to the hot wire, and to measure the change in resistance of the hot wire over time to obtain the thermal conductivity of the fluid from the temperature-resistance characteristics of the hot wire In addition, it is preferable to be used to measure the difference of the thermal conductivity of a nucleic acid reaction liquid in a polymerase chain reaction, and can also be used for measuring the density | concentration of nucleic acid containing DNA.
그러므로 본 발명의 감시 방법 및 감시 센서는 기존의 기술들과 비교하여 그들이 해결하지 못한 시스템의 크기 문제 그리고 신호 처리 시간 및 정확도를 해결함으로써 초소형 실시간 중합효소 연쇄반응법의 실현 가능성을 제시하여 이를 이용 한 기술 및 시스템은 향후 진단 시장 및 생명공학 분야에서 중요한 역할을 할 것이라고 기대된다.Therefore, the monitoring method and the monitoring sensor of the present invention show the feasibility of real time miniaturization polymerase chain reaction by solving the size problem of the system and the signal processing time and accuracy which are not solved compared to the existing technologies. Technology and systems are expected to play an important role in future diagnostic markets and biotechnology.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. 비정상 상태의 열전도 해석Example 1. Analysis of thermal conductivity in an abnormal state
먼저 본 발명의 확인 과정을 설명하는 기본 원리는 다음과 같다. 중합효소 연쇄반응에서 반응액의 초기 상태는 dNTP, Taq 폴리머라제 등 아주 짧은 길이의 단위체들을 많이 포함하고, 이후 주형 DNA (template DNA)에 목적 염기서열 (target sequence)이 포함되어 있는 경우 반응이 진행되면서 결과물 (product)이 생성되는 데, 이 때 상기에서 언급한 바와 같이 반응액의 물성치가 변화하게 된다. First, the basic principle for explaining the verification process of the present invention is as follows. In the polymerase chain reaction, the initial state of the reaction solution includes many short-length units such as dNTP and Taq polymerase, and then the reaction proceeds when the template DNA contains the target sequence. As a result, a product is produced, in which the physical properties of the reaction solution change as mentioned above.
본 발명에서는 상기 중합효소 연쇄반응의 진행으로 인한 반응액의 물성치 변화를 비정상 열선법을 사용하여 측정하였다. 고체와 접하고 있는 주위의 온도환경이 갑자기 변화하면 어느 정도 시간이 흐른 뒤에야 비로소 고체 내부의 온도가 일정하게 유지되는 평형상태에 이르게 된다. 이러한 평형 상태를 정상 상태 (steady-state)라고 부르는데, 정상 상태의 온도 분포와 열 전달은 쉽게 예측이 가능하다. 그러나 평형 상태에 도달하기 전까지의 과정은 시간에 따라 내부 에너지가 변하는 과도적 가열 또는 냉각이 일어나기 때문에, 정상 상태적 해석 방법으로는 해석하는 것이 어렵다. 따라서 이를 예측하기 위해서는 물리적 상황이 명백하게 비정상 열전달 과정에 적합하도록 경계 조건 또한 조절되어야 한다. 실제 시스템에서도 해석이 반드시 필요한 수많은 가열과 냉각 과정이 빈번하게 발생하고, 이를 검증해내는 것이 필요하다. In the present invention, the change in the physical properties of the reaction solution due to the progress of the polymerase chain reaction was measured using the abnormal hot wire method. Sudden changes in the ambient temperature surrounding the solid will lead to equilibrium, where the temperature inside the solid remains constant only after some time. This equilibrium state is called steady-state, and the steady-state temperature distribution and heat transfer are easily predictable. However, the process until reaching equilibrium is difficult to interpret by the steady-state analysis method because the transient heating or cooling occurs when the internal energy changes with time. Therefore, to predict this, boundary conditions must also be adjusted so that the physical situation is obviously suitable for the abnormal heat transfer process. In a real system, many heating and cooling processes that require analysis occur frequently and need to be verified.
실시예 2: 조직적합성 항원 HLA-B 엑손 2 를 이용한 열전도 해석Example 2: Thermal conductivity analysis using histocompatibility antigen HLA-
본 발명에서는 조직적합성 항원의 유전자를 증폭시키는 과정을 비정상 상태의 열전도 해석법을 이용하여 분석, 확인하였다. 조직적합성 항원 (human leukocyte antigens; HLAs)은 사람의 주조직적합성 복합체 (major histocompatibility complex : MHC) 유전자에 의해 생성되는 당단백 분자로서 인체 내 모든 조직세포의 표면에 발현되고 백혈구 및 혈소판 등 혈액세포에도 발현된다. 즉 조직적합성 검사는 혈액형과 같이 적혈구 세포의 형이 아닌 백혈구 세포의 형을 알아보는 것이라 할 수 있다. 조직적합성 항원은 개개인이 가지고 있는 유전적 배경에 따라 수만 가지의 항원 조합으로 구성되어 있으며 골수이식, 장기 이식 및 친자확인 검사 등을 포함하여 장기를 이식했을 때 거부되지 않고 기능을 유지해 나갈 수 있는지 없는지 그 가능성을 판단하는 데 있어 대단히 중요한 것이다. 이와 같은 조직적합성 항원을 인간의 경우에는 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigens)라고 부르는 것이다. In the present invention, the process of amplifying the gene of the histocompatibility antigen was analyzed and confirmed by using an abnormal state thermal conductivity analysis method. Human leukocyte antigens (HLAs) are glycoprotein molecules produced by the major histocompatibility complex (MHC) gene and are expressed on the surface of all tissue cells in the human body and on blood cells such as leukocytes and platelets. do. In other words, histocompatibility testing can be said to determine the type of white blood cells, not the type of red blood cells, such as blood types. Histocompatibility antigens consist of tens of thousands of antigen combinations, depending on the individual's genetic background and whether they can continue to function when transplanted, including bone marrow transplantation, organ transplantation and paternity tests. It is very important to judge the possibility. Such histocompatibility antigens are called human leukocyte antigens in humans.
이러한 조직적합성 항원 검사에서 사용하는 판단 기준은 HLA 의 완전일치, 반일치 및 불일치의 3가지 조합으로 구성된다. 구체적으로 부모와 자식 간에는 조 직적합성 항원이 반드시 반일치하고, 형제 간에는 완전일치가 될 확률이 25%, 반일치가 될 확률 50%, 불일치가 될 확률이 25% 이다. 그러나 비혈연간에는 HLA가 일치될 가능성을 찾기가 매우 어렵다. 특히 장기이식에서는 Class Ⅱ의 HLA-DR 중요한 역할을 하는 데, Class Ⅱ의 HLA-DR 에서 1개 이상만이라도 적합하면 이식 수술을 시행한다. The criteria used in these histocompatibility antigen tests consist of three combinations of complete, half-matched and inconsistent HLA. Specifically, the antigens that are compatible with the body must be half-matched between the parent and the child, and there is a 25% chance of perfect match between the siblings, 50% chance of being half-matched, and 25% chance of inconsistency. However, it is very difficult to find the possibility of HLA match between non-blood years. Especially in organ transplantation, HLA-DR of Class II plays an important role. If only one or more of Class II HLA-DR is suitable, transplantation is performed.
본 발명에서는 목적 유전자로서 조직적합성 유전자인 HLA-B 엑손 2 (HLA-B exon 2; 456 bp)을 선택하여 중합효소 연쇄반응의 진행 여부를 확인하는데 사용하였다. In the present invention, HLA-B exon 2 (456 bp), a histocompatibility gene, was selected as a target gene and used to confirm the progress of the polymerase chain reaction.
도 5 에서 나타난 바와 같이, 상기에서 사용한 조직적합성 유전자의 주형 DNA 가 정확한지 여부를 먼저 확인하였다. 실제 혈액에서 추출한 조직적합성 유전자의 주형 DNA 는 크기가 상당히 크므로 추출하는 과정에서 보통 40 kbp 정도로 잘라서 분리하였다. 그 결과 도 5 에서 상기 유전자에 해당하는 밴드가 40 kbp 크기 근처에서 확인되므로 상기 주형 DNA는 중합효소 연쇄반응에 적합하도록 추출된 것을 확인할 수 있었다. 상기에서 분리된 주형 DNA 는 효소를 사용하여 일정 길이로 잘라주게 되는 데, 이 때 해당 부위가 잘라지기도 하지만 주형 DNA 를 임의적으로 잘라주기 때문에 상기 해당 부위가 충분히 존재하게 되고 실제 중합효소 연쇄반응이 진행될 때는 전혀 문제가 되지 않는다. As shown in Figure 5, it was first confirmed whether the template DNA of the tissue compatible gene used above is correct. Since the template DNA of histocompatibility genes extracted from blood is quite large in size, they are usually cut to about 40 kbp during extraction. As a result, since the band corresponding to the gene in Figure 5 is confirmed near the size of 40 kbp, it was confirmed that the template DNA was extracted to be suitable for the polymerase chain reaction. The isolated template DNA is cut to a certain length by using an enzyme. At this time, the site is cut, but since the template DNA is arbitrarily cut, the corresponding site is sufficiently present and the actual polymerase chain reaction will proceed. It doesn't matter at all.
도 5 의 레인 1 ~ 4 번은 조성을 맞춰서 중합효소 연쇄반응을 반복 실험한 결과를 나타낸 것이다. 본 발명에서 사용한 조직적합성 항원 HLA-B 엑손 2 에 해당하는 밴드 위치 456 bp 가 반복적으로 나타나고 있으므로 중합효소 연쇄반응은 문 제없이 진행되는 것을 알 수 있었다.
또한, 음성 대조군으로서 주형 DNA 를 첨가하지 않고 중합효소 연쇄반응을 진행시킨 경우는 실제 주형 DNA 를 첨가한 경우와 동일한 위치에서 밴드가 생기지 않았다. 따라서 상기 실험을 통해서 HLA-B 엑손 2 에 해당하는 염기서열이 없을 때 비특이적으로 중합효소 연쇄반응이 실행되지 않는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 5 에서 음성 대조군의 경우 100 bp 위치에서 밴드가 희미하게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 원래는 주형 DNA 를 넣지 않았기 때문에 증폭 산물을 의미하는 밴드가 나타나지 않아야 하지만, 이와 같이 희미하게 나타난 것은 실제 다른 반응 조성물을 동일하게 넣어주면 프라이머 간의 결합을 통해서 100 bp 크기 정도의 얇은 밴드가 나타나는 것으로 판단되었다. In addition, when the polymerase chain reaction proceeded without adding the template DNA as a negative control, no band was formed at the same position as when the template DNA was actually added. Therefore, the experiment showed that the polymerase chain reaction was not carried out nonspecifically when there was no nucleotide sequence corresponding to HLA-
실시예 3: 중합효소 연쇄반응의 진행에 따른 열전도율의 변화 측정Example 3 Measurement of Changes in Thermal Conductivity with Progress of Polymerase Chain Reaction
또한 도 6 에 나타난 바와 같이, 이 실험에서는 실제 중합효소 연쇄반응의 진행 과정에 따라서 측정되는 열전도율 값을 비교하였다. 도 6 에서는 첫 째, 열전도율을 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응의 확인이 가능하다는 점을 관찰할 수 있었다. 구체적으로, 도 6 의 중합효소 연쇄반응을 나타내는 그래프는 실제 유전자 증폭이 진행되면서 열전도율 값도 완만하게 증가되는 것을 확인시켜주었다. 이에 반해서 음성 대조군, 즉 주형 DNA 를 넣지 않고 중합효소 연쇄반응을 실행시킨 경우는 열전도율 값이 증가하지 않고 일정한 그래프의 형태 또는 함수의 형태를 나타내고 있었고 그 일정한 값에서 크게 변화가 없는 것을 알 수 있었다. 둘째, 도 4 에서 확인할 수 있는 사실로서 중합효소 연쇄반응이 35 사이클 이상 넘어갈 경우 열전도율 값이 포화 상태 (saturation)에 이르는 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 포화 상태는 더 이상 중합효소 연쇄반응의 결과물이 생성되지 않는다는 의미이고, 이는 dNTP 및 결과물 생성에 필요한 재료들이 줄어들고 중합효소 연쇄반응의 결과물이 너무 많이 증폭돼서 새로운 결과물의 생성이 방해를 받기 때문이다. 이러한 점은 기존의 실시간 중합효소 연쇄반응에서도 관찰되는 사실과 일치하는 실제와 같은 현상이다.In addition, as shown in Figure 6, in this experiment was compared the thermal conductivity values measured according to the progress of the actual polymerase chain reaction. In Figure 6, first, it was observed that the real-time polymerase chain reaction can be confirmed using the thermal conductivity. Specifically, the graph showing the polymerase chain reaction of FIG. 6 confirmed that the thermal conductivity gradually increased as the actual gene amplification proceeded. On the contrary, when the polymerase chain reaction was carried out without the negative control, that is, the template DNA, the thermal conductivity did not increase and showed a constant graph or function, and the constant did not change significantly. Second, as can be seen in FIG. 4, when the polymerase chain reaction exceeds 35 cycles, the thermal conductivity value reaches saturation. This saturation means that the output of the polymerase chain reaction is no longer produced, because the dNTP and the materials needed to produce the product are reduced and the output of the polymerase chain reaction is amplified too much, which prevents the production of new products. to be. This is a realistic phenomenon that is consistent with the facts observed in the existing real-time polymerase chain reaction.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 핵산 반응액의 열전도율을 비정상 열선법 등으로 실시간 측정하여 중합효소 연쇄반응의 진행 결과를 확인하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 감시 방법은 부가적인 장비가 없이도 중합효소 연쇄반응의 결과물을 실시간으로 정확하게 측정할 수 있어 경제적이고 시간과 노동력도 효과적으로 절감시키므로 기존의 핵산 반응으로 이용하는 진단 방법 등에 널리 적용될 수 있다. As described above, the present invention relates to a method for confirming the progress of the polymerase chain reaction by measuring the thermal conductivity of the nucleic acid reaction solution in real time by an abnormal hot wire method or the like, and the monitoring method of the present invention is polymerized without additional equipment. As the result of enzyme chain reaction can be accurately measured in real time, it is economical and effectively saves time and labor, so it can be widely applied to the diagnostic method using the existing nucleic acid reaction.
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2006
- 2006-02-14 KR KR1020060014183A patent/KR100740168B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
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