[go: up one dir, main page]

KR100729182B1 - 로즈마리 정유 및 기존 항생제를 함유한 내성균 억제용항균 조성물 - Google Patents

로즈마리 정유 및 기존 항생제를 함유한 내성균 억제용항균 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR100729182B1
KR100729182B1 KR1020050076328A KR20050076328A KR100729182B1 KR 100729182 B1 KR100729182 B1 KR 100729182B1 KR 1020050076328 A KR1020050076328 A KR 1020050076328A KR 20050076328 A KR20050076328 A KR 20050076328A KR 100729182 B1 KR100729182 B1 KR 100729182B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
essential oil
rosemary
ccarm
mic
antibiotics
Prior art date
Application number
KR1020050076328A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070021737A (ko
Inventor
신승원
Original Assignee
덕성여자대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 덕성여자대학교 산학협력단 filed Critical 덕성여자대학교 산학협력단
Priority to KR1020050076328A priority Critical patent/KR100729182B1/ko
Publication of KR20070021737A publication Critical patent/KR20070021737A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100729182B1 publication Critical patent/KR100729182B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/22—Lamiaceae or Labiatae [Mint family], e.g. thyme, rosemary, skullcap, selfheal, lavender, perilla, pennyroyal, peppermint or spearmint
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/7036—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin having at least one amino group directly attached to the carbocyclic ring, e.g. streptomycin, gentamycin, amikacin, validamycin, fortimicins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 내성균 억제를 위한 항균조성물에 관한 것으로, 상세하게는 로즈마리 (Rosmarinus officinalis L.) 정유 (essential oil) 및 항생제의 배합 처리로 인한 효과상승을 유도하여 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis)및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)의 내성 균주에 탁월한 항균작용을 나타내는 항균조성물에 관한 것이다.
로즈마리, 정유, 항생제, 내성균, 항균조성물

Description

로즈마리 정유 및 기존 항생제를 함유한 내성균 억제용 항균 조성물 {Antimicrobial composition containing the essential oil of Rosmarinus officinalis L. and the conventional antibiotics}
도 1은 로즈마리 정유의 1,8-시네올 (cineol) 성분에 대한 핵자기공명 (NMR) 스펙트럼을 나타낸 도이고,
도 2는 로즈마리 정유의 1,8-시네올 성분에 대한 질량 스펙트럼을 나타낸 도이며,
도 3은 로즈마리 정유의 장뇌 (camphor) 성분에 대한 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 도이고,
도 4는 로즈마리 정유의 장뇌 성분에 대한 질량 스펙트럼을 나타낸 도이다.
항생제는 살아있는 유기물에서 추출한 것으로 다른 미생물의 생장을 억제하거나 죽이는 물질을 말한다. 페니실린을 비롯해 4천여 가지 이상의 항생제가 발견 됐고 현재 50여 종이 실제 임상에서 사용되고 있다.
1999년 6월, 한국보건사회연구원이 발표한 의약품 사용실태 조사결과에 의하면 1천 명 중 33 명이 매일 항생제를 복용하는 것으로 나타났다. 이는 OECD 회원국가의 평균치 21 명보다 월등히 높은 비율로, 약물남용이 우려할만한 수준임을 보여준다. 이 조사에 따르면 97년도 의료보험 환자 중 병,의원에서 58.9 %가 항생제를 처방받은 것으로 나타났다. 항생제 남용으로 인한 주요 부작용은 내성균의 조성, 균 교대현상, 유전자에 대한 영향 등이 있다.
1929년 페니실린의 발견과 함께 시작된 항생제 시대 (Antibiotic Era)는 각종 항생제에 대한 내성을 가진 내성균주의 발생과 함께 끝나가고 있는 것처럼 보인다.
메티실린-저항성 스타필로코커스 아우레우스 (MRSA, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)와 메티실린-저항성 스타필로코커스 에피더미디스 (MRSE, Methicillin-resistant S. epidermidis), 반코마이신-저항성 엔테로코커스 (VRE, Vancomycin-resistant Enterococcus) 및 반코마이신-저항성 스타필로코커스 아우레우스 (VRSA, Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus)로 대표되는 항생제 내성은 현시대를 항생제 발견 이전과 유사한 상태의 후항생물질 시대 (Postantibiotic Era)로 가게할 것이라는 우려를 갖게한다. 항생제의 남용이 이들 내성균주의 발생을 더욱 빈번하게 만들어 이들 “슈퍼 버그 (Superbug)"에 대해서는 더 이상 치료제가 없는 지경에 이르렀다.
특히 이들 내성 균주 중에서 가장 문제가 되고 있는 것은 스타필로코커스 아 우레우스와 스타필로코커스 에피더미디스로 이들은 정맥관 (intravenous lines) 및 카테터관 (catheter tube) 등에서 장기간 살 수 있어서, 이들에 의한 감염은 피부, 심장, 뼈, 혈류, 폐, 수술부위 등에 감염되어 환자들의 건강을 위협하고 있다. 1996년, 1997년에 미국, 유럽, 일본, 한국을 포함한 세계 여러 국가에서 내성균들에 대한 마지막 처방으로 사용되어온 반코마이신에 대한 내성균이 발견되면서 항생제에 대한 내성 문제는 점차로 심각해지고 있으며, 반코마이신을 대체할 새로운 항생제는 아직까지 개발되어 있지 못한 상황이므로 항생제 사용을 규제하여 내성을 줄이기 위한 시도로 국제기구까지 만들어져 활동을 하고 있다.
로즈마리 (Rosmarinus officinalis L.)는 꿀풀과 (Labiatae)에 속하는 지중해 원산의 상록성 목본으로, 주로 유럽남부 지방에서 재배되어 온 유럽의 전통적인 향미료 중 하나이며 1,8-시네올 (1,8-cineole), 장뇌 (camphor) 등을 주성분으로 하는 정유 및 로즈마리산 (rosmarinic acid) 등의 고미성분을 함유하고 있어 건위제, 구풍제, 소염제 및 살충제 등으로 약용되어왔다 (Bisset NG, Herbal drugs, CRC press, London, pp428-430, 2000 ; Duke JA et al., Handbook of medicinal herbs, CRC press, London, pp630-632, 2002). 근래에는 이 식물이 한국에서도 허브식물 분재용으로 다량 재배되고 있고, 로즈마리유는 아로마테라피에서 다른 종류의 아로마를 배합하여 여러 제형으로 조제되어 사용되고 있으며, 한편 로즈마리 성분의 항산화작용을 이용한 식품 보존제로의 응용도 활발히 연구되고 있다 (Choo JJ et al., Korean J. Food Culture, 16, pp134-138, 2003 ; Koleva II et al., Phytochem Anal., 13, pp8-17, 2002).
그러나, 상기 문헌의 어디에도 로즈마리의 항균활성에 의한 내성균에 의한 감염질환 예방, 개선 및 치료의 효능을 갖는 정유를 함유한 조성물에 대한 어떠한 교시나 개시된 바는 없다.
정유 (essential oil)는 합성항균제에 비하여 독성이 적고 안전한 항균제이고, 현재 임상에서 사용되는 항생제와는 전혀 다른 구조의 화합물이므로 내성균에 대한 새로운 항생제 개발의 대상으로 기대되나, 기존 항생제에 항균활성이 상대적으로 떨어지는 약점이 있어서, 정유분획이나 단일 정유 성분차원에서 실제 임상 사용 가능한 항생제로 개발된 것은 극소수에 불과하다.
이에 본 발명자는 로즈마리 정유 및 기존 시판중인 항생제의 배합처리로 인한 효과상승을 유도하여 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피무리움 (Samonella typhimurium), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 균주의 내성균에 대한 탁월한 항균활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 탁월한 항균활성을 지닌 로즈마리 정유 및 항생제 배합물을 함유하는 항균 조성물을 제공하는것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 로즈마리 (Rosmarinus officinalis L.) 정유 및 항생제 배합물을 유효성분으로 함유하는 약제내성균에 대한 항균조성물을 제공한다.
본원에서 정의되는 로즈마리 정유와 배합 가능한 항생제로는 노플록사신 (norfloxacin), 옥사실린 (oxacillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 카나마이신(kanamycin), 에리스로마이신(erythromycin) 등이 있으며, 로즈마리 정유와 상기 항생제를 1: 1 내지 10배의 중량비, 바람직하게는 1: 1~ 2배의 중량비로 배합함이 바람직하다.
본원에서 정의되는 상기 약제내성균들로는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피무리움 (Samonella typhimurium), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)등을 포함한다.
상기 약제내성균이 내성을 가지는 약제는 메티실린 (methicillin), 페니실린 (penicillin), 반코마이신 (vancomycin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 노플록사신 (norfloxacin), 카나마이신 (kanamycin) 등의 항생제를 포함한다.
또한 본 발명의 로즈마리 정유를 유효성분으로 하는 내성균주 예방 및 치료를 위한 항균보조제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 로즈마리 정유는 하기와 같이 수득될 수 있다.
본 발명의 로즈마리를 수확하여 신선한 상태의 잎과 어린 줄기 부위를 잘게 마쇄하여 로즈마리 시료 중량의 약 1 내지 40배, 바람직하게는 약 1 내지 30배에 달하는 부피의 물, 에탄올 및 메탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1: 0.1 내지 1: 10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 증류수로 약 50 ℃ 내지 120 ℃, 대기압 (1기압) 내지 2기압에서 약 1시간 내지 1일, 바람직하게는 3시간 내지 6시간 동안 수증기 증류, 열수추출, 환류 순환 추출 또는 압력추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 수증기 증류하여 감압여과, 농축하여 로즈마리 정유를 수득할 수 있다.
본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 로즈마리 정유 및 항생제 배합물을 유효성분으로 함유하는 항균조성물을 제공한다.
상기 항균조성물은 스타필로코커스 아우레우스에 항균활성을 나타내었다.
본 발명의 배합물은 상기 세균의 내성균주의 감염에 의한 질환인 피부 농양(skin abscesses), 폐혈증 (septicaemia), 폐렴 (pneumonia), 골수염 (osteomyelitis), 심내막염 (endocarditis), 요로감염증 등을 포함한 표재성 혹은 심재성 화농성 감염 등의 치료용 약학조성물로 사용될 수 있다.
또한, 로즈마리는 오랫동안 생약 및 식용으로 사용되어왔으므로 이들로부터 추출된 본 발명의 정유 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.
상기 본 발명의 항균조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 배합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.
본 발명의 로즈마리 정유를 포함하는 항균조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 로즈마리 정유 및 항생제 배합물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 로즈마리 정유 및 항생제 배합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 로즈마리 정유 및 항생제 배합물을 포함하는 항균조성물은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 로즈마리 정유는 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 로즈마리 정유 및 항생제 배합물을 포함하는 항균 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 로즈마리 ( Rosmarinus officinalis L.) 정유 성분의 추출
경기도 소재 허브농장에서 재배한 신선한 상태의 로즈마리의 지상부 (잎 및 어린 줄기)를 동시 증기 증류-추출 장치 (simultaneous steam distillation - extraction apparatus, SDE)에서 증류수를 추출용매로 가하여 5시간 수증기 증류한 후 에테르를 포집용매로 가하여 정유를 수득하였으며, 정유 수득률은 평균 0.59 % (w/w) 였다.
정유의 조성은 기체크로마토그래피 (GC, Gas Chromatography ; Hewlett-Packard 6890 GC, USA)와 기체크로마토그래프-질량분석기 (GS-MSD , Gas chromatography - mass selective detector ; Hewlett-Packard 5973 MSD, USA)에 10 %　용액 (에테르)을 1 ㎕씩 주입하여 하기와 같은 조건에서 분석하였다. 측정된 각 피크 (peak)의 질량 스펙트럼 (mass spectrum)은 컴퓨터에 저장된 질량 수치 (mass data ; PBM Search of Library file : Data : Wiley L.)와 비교하여 구조를 동정하였다.
column : Ultra-2 (50 m × 0.2 ㎜ × 0.11 ㎛) capillary column
column temperature : 50 ℃ (10 min), 2 ℃/min (50-200 ℃)
detector temperature : 250 ℃
injector temperature : 230 ℃
carrier gas : He (1 ㎖/min)
실시예 2. 배합물의 제조
2-1. 정유 성분 분리 및 항생제
실시예 1에서 수득한 로즈마리 정유를 실리카겔 (silicagel 60N, Kanto chemical co., Japan) 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 1,8-시네올 (1,8-Cineole)과 장뇌 (camphor) 성분을 분리하였으며, 이때 디클로로메탄-헥산 구배 (dichloromethane-hexane gradient)를 용매로 사용하여 용출된 30개의 분획 중 7 내지 9번 분획 (cineol fraction)과 12 내지 14번 분획(camphor fraction)을 모아 컬럼 크로마토그래피를 반복한 후 세파덱스 LH-20 (Sephadex LH-20, Amersham, Sweden)로 정제하였다. 분리한 성분은 표준품 (Sigma, USA)과 질량 분석 (Mass Spectrometry, 5973 MS, Agilent, USA) 및 핵자기공명 (NMR; Nuclear Magnetic Resonance, 300MHz, Bruker,Germany)을 이용한 구조분석을 통해 비교, 확인한 후 실험에 사용하였다 (도 1 내지 4 참조).
상기 분석 결과 1,8-시네올 (1,8-cineole)과 장뇌 (camphor)가 각각 48 % 및 33.7 %로 나타나 알려진 바대로 이들이 로즈마리 정유의 주성분인 것을 확인하였다.
2-2. 항생제와의 배합
옥사실린 (Oxacillin ; 01002, oxacillin sodium salt monohydrate) 및 노플록사신 (norfloxacin ; N9890)은 시그마사 (Sigma-Korea Chemicla Co.)에서 구입하였으며, 에리스로마이신 (erythromycin)은 한국 애보트 주식회사의 에리스로신 주사 (500 ㎎/vial)를 사용하였다.
실시예 2-1의 로즈마리 정유를 1:1 (중량 %)의 배합비로 각각 배합하여 (이하 정유 및 옥사실린 배합물은 RO-O, 정유 및 노플록사신 배합물은 R O-N로 명명함), 하기 실험예의 시료로 사용하였다.
참고예 1. 사용균주
스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus ; ATCC 29213, CCARM 3511, CCARM 3523), 살모넬라 엔테리티디스 (S. enteritidis ; KCCM 12021, CCARM 8010, CCARM 8011), 살모넬라 티피무리움 (S. typhimurium ; KCCM 11862, CCARM 8007, CCARM 8009), 스트렙토코커스 뉴모니아 (S. pneumoniae ; CCARM 4009, CCARM 4010, CCARM 4059)를 한국미생물보존센터 (KCCM)과 항생제내성균주은행 (CCARM)에서 분양받았다.
실험예 1. 액체배지 희석법에 의한 항균력 측정
스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus ; ATCC 29213, CCARM 3511, CCARM 3523), 살모넬라 엔테리티디스 (S. enteritidis ; KCCM 12021, CCARM 8010, CCARM 8011), 살모넬라 티피무리움 (S. typhimurium ; KCCM 11862, CCARM 8007, CCARM 8009)을 뮬러-힌튼 Ⅰ (Mueller-Hinton Ⅰ) 액체배지 (BD Biosciences, USA)에 현탁한 후 표준탁도액 (0.5 McFarland standard)와 같은 탁도로 조정된 균액을 제조하여 균의 농도가 약 1×104-105 CFU/㎖가 되게 만들어서 액체배지 희석법 (broth dilution method)에 의한 항균력 실험에 사용하였다. 스트렙토코커스 뉴모니아 (S.pneumoniae ; CCARM 4009, CCARM 4010, CCARM 4059)는 5 % 양혈 한천 플레이트 (sheep blood agar plate) 위에 발라 36 ℃에서 계대 배양하고, 이것을 5 % 양혈 (sheep blood)를 포함한 뮬러-힌튼 Ⅱ(Mueller-Hinton Ⅱ) 액체배지에 현탁한 후 표준탁도액 (0.5 McFarland standard)와 같은 탁도로 조정된 균액을 제조하여 균의 농도가 약 1×104-105 CFU/㎖가 되게 만들어서 액체배지 희석법 (broth dilution method)에 의한 항균력 실험에 사용하였다.
로즈마리 정유와 1,8-시네올 (1,8-cineole) 및 장뇌 (camphor)를 에탄올과 2 % 의 트윈 80 (Tween 80)을 가하여 현탁시킨 후 무균 여과하여, 최고 농도 50 ㎎/㎖에서 최저농도가 0.78 ㎎/㎖에 이르도록 단계적으로 희석하여 96 웰 플레이트 (well plate)의 각 웰 (well)에 100 ㎕씩 주입한 후 균액을 100 ㎕씩 첨가하였다. 이것을 진탕배양기 (shaking incubator)에서 36 ℃, 100 rpm의 조건에서 24시간 배양한 후, 육안으로 관찰하여 균의 성장이 억제된 최저농도를 최소억제농도 (MIC, minimal inhibitory concentration)로 정하였다.
노플록사신 (norfloxacin)은 디메틸술폭시화물 (dimethylsulfoxide, DMSO)을 용매로 하여 2 ㎎/㎖부터 8 단계까지의 배수 희석액을 제조하여, 각각 한 농도의 샘플을 각 웰 마다 5 ㎕씩을 주입하고, 균액 100 ㎕, 배지 95 ㎕를 첨가하고, 정유와 같은 조건에서 배양하였다. 사용한 용매와 트윈 80 (Tween 80)이 시료의 항균력에 영향을 미치지 않았음을 대조실험을 통해 확인하였다. 이어서 균의 생장이 저지 된 각각의 웰로부터 50 ㎕을 취하고 액체배지 150 ㎕를 가한 후 다시 24시간 배양하여 균의 생장이 관찰되지 않은 최소 살균 농도 (MBC ; minimal bacterial concentration)로 하였다.
옥사실린 (oxacillin)은 뮬러-힌튼 Ⅰ (Mueller-Hinton Ⅰ) 액체배지로 희석하여 같은 방법으로 실험하였다.
스타필로코커스 아우레우스 3종 균주에 대한 최소억제농도 (MIC)와 균의 생장이 관찰되지 않은 최소 농도 (MBC)는 하기의 표 1에 나타난 바와 같다. 실험균주 중 ATCC 29213은 노플록사신, 옥사실린 및 에리스로마이신에 대해 모두 감수성을 나타내었고, CCARM 3511은 노플록사신에 대한 감수성을, 옥사실린에 대해서는 중간정도의 내성을, 에리스로마이신에 대해서는 강한 내성을 나타내어 64.0 ㎍/㎖에서도 균의 생장이 억제되지 않았다. 한편 CCARM 3523은 노플록사신에 대해 강력한 내성을, 옥사실린과 에리스로마이신에 대해서는 MIC가 16.0 ㎍/㎖로 중간정도의 내성을 가지고 있음이 확인되었다. 이와 같이 항생제에 대해 각기 현저히 다른 감수성을 가진 3종의 스타필로코커스 아우레우스 균주는 로즈마리 정유 분획 또는 정유의 주성분인 1,8-시네올, 장뇌 및 알파-피넨에 대해서는 균주에 따른 별다른 감수성의 차이를 나타내지 않아서, 이들 정유로 항생제 감수성 균주 뿐 아니라 내성균도 억제할 수 있음을 보여주었다. 한편 로즈마리 정유 구성성분 중 하나인 캄페네는 3종 균주 모두에 대해 MIC가 32 이상으로 나타나 균 억제작용이 약하거나 없는 것으로 나타났다. 또한 로즈마리 정유 분획은 MIC가 2.0 mg/㎖로 비교 실험한 정유의 다른 성분보다도 강한 항균작용을 나타냈는데, 이것은 현재의 실험만으로는 설명할 수 없는 특이한 결과이나, 알려진바대로 (Cassella S et al., Int . J. Aromather ., 12, pp2-15, 2002) 이 정유분획을 구성하는 정유성분들의 혼합상태에서의 상승효과일 것이다. 정유의 최소살균농도 (MBC)는 약 2 내지 12배로 경우에 따라 큰 차이를 나타냈다.
Sample (㎎/㎖) 스타필로코커스 아우레우스 균주 (S. aureus strains)
ATCC 29213 CCARM 3511 CCARM 3523
로즈마리 정유 MIC 2.0 2.0 2.0
MBC 32.0 32.0 32.0
1,8-시네올 MIC 16.0 16.0 16.0
MBC 32.0 32.0 32.0
장뇌 MIC 4.0 4.0 8.0
MBC 16.0 16.0 16.0
알파-피넨 MIC 8.0 8.0 16.0
MBC 16.0 16.0 32.0
캄페네 MIC >32.0 >32.0 >32.0
MBC >32.0 >32.0 >32.0
노플록사신 (×10-3) MIC 4.0 4.0 >64.0
MBC 4.0 >64.0 >64.0
옥사실린 (×10-3) MIC 4.0 16.0 16.0
MBC 4.0 16.0 16.0
에리스로마이신 (×10-6) MIC 0.25 >64.0 16.0
MBC 0.25 >64.0 16.0
스타필로코커스 아우레우스의 경우와 달리 스트렙토코커스 뉴모니아에 대한 로즈마리의 항균활성은 하기의 표 2에서 나타난 바와 같이 균주에 따라 현저한 차이를 나타냈다. 실험에 사용한 3종 항생제에 모두 감수성을 나타내는 스트렙토코커스 뉴모니아 49619 및 옥사실린과 에리스로마이신의 2종 항생제에 대해서만 내성인 CCARM 4009와 3종 항생제 모두에 내성을 나타내는 CCARM 4015 균주에 대한 로즈마리 정유분획의 MIC는 12배 정도의 차이를 보였다. 또한 이 정유 주성분인 1,8-시네올, 알파-피넨에 대한 감수성에 있어서도 상기와 유사한 경향이 나타났다.
Sample (㎎/㎖) 스트렙토코커스 뉴모니아 균주 (S. pneumoniae strains)
KCCM 49619 CCARM 4009 CCARM 4015
로즈마리 정유 MIC 1.0 1.0 16.0
MBC 32.0 32.0 32.0
1,8-시네올 MIC 4.0 4.0 8.0
MBC 32.0 32.0 32.0
장뇌 MIC 2.0 1.0 2.0
MBC 8.0 8.0 >32.0
알파-피넨 MIC 2.0 2.0 32.0
MBC 4.0 4.0 >32.0
캄페네 MIC >32.0 >32.0 >32.0
MBC >32.0 >32.0 >32.0
노플록사신 (×10-3) MIC 4.0 4.0 >64.0
MBC 8.0 4.0 >64.0
옥사실린 (×10-3) MIC 4.0 >16.0 >16.0
MBC 4.0 >16.0 >16.0
에리스로마이신 (×10-6) MIC 0.5 >1024.0 >1024.0
MBC 0.5 >1024.0 >1024.0
살모넬라 엔테리디티스 균주는 양성대조군으로 스트렙토마이신과 카나마이신을 사용했는데, 하기의 표 3에 나타난 바와 같이 스트렙토마이신에 대해 감수성을 나타내는 ATCC 12201과 내성균주인 CCARM 8007 및 CCARM 8009의 로즈마리 정유에 대한 감수성에는 큰 차이가 없었으며, 대체로 스타필로코커스 아우레우스나 스트렙토코커스 뉴모니아의 경우에 비해 전반적으로 높은 MIC를 나타냈다.
Sample (㎎/㎖) 살모넬라 엔테리티디스 균주 (S. enteriditis strains)
ATCC 12201 CCARM 8007 CCARM 8009
로즈마리 정유 MIC 8.0 4.0 4.0
MBC 8.0 8.0 8.0
1,8-시네올 MIC 8.0 8.0 8.0
MBC 8.0 16.0 8.0
장뇌 MIC 4.0 4.0 8.0
MBC 4.0 4.0 4.0
알파-피넨 MIC 8.0 8.0 8.0
MBC >32.0 >32.0 >32.0
캄페네 MIC >32.0 >32.0 >32.0
MBC >32.0 >32.0 >32.0
스트렙토마이신 (×10-3) MIC 2.0 >128.0 >128.0
MBC 2.0 >128.0 >128.0
카나마이신 (×10-3) MIC 2.0 4.0 1.0
MBC 2.0 4.0 1.0
하기의 표 4에 나타난 바와 같이, 살모넬라 티피무리움 균주는 살모넬라 엔테리티디스 균주에 비해 로즈마리 정유에 대해 상대적으로 높은 감수성을 나타냈는데, 스트렙토마이신 및 카나마이신에 대한 내성균주와 감수성 균주를 비교했을 때, 감수성 균주인 ATCC 11862가 내성균주인 CCARM 8010 및 CCARM 8011에 비해 2 내지 4배 정도 높은 감수성을 나타냈다.
Sample (㎎/㎖) 살모넬라 티피무리움 균주 (S. typhimurium strains)
ATCC 11862 CCARM 8010 CCARM 8011
로즈마리 정유 MIC 1.0 4.0 4.0
MBC 2.0 8.0 8.0
1,8-시네올 MIC 0.5 2.0 1.0
MBC 1.0 2.0 1.0
장뇌 MIC 4.0 4.0 2.0
MBC 4.0 8.0 4.0
알파-피넨 MIC 8.0 16.0 16.0
MBC >32.0 >32.0 >32.0
캄페네 MIC >32.0 >32.0 >32.0
MBC >32.0 >32.0 >32.0
스트렙토마이신 (×10-3) MIC 64.0 128.0 >128.0
MBC 64.0 128.0 >128.0
카나마이신 (×10-3) MIC 8.0 8.0 >64.0
MBC 8.0 8.0 >64.0
실험예 2. 장기판 마이크로타이터 실험 (checkerboard microtiter test)에 의한 병용효과 실험
96 웰 플레이트 (well plate)의 각 웰 (well)의 가로방향으로 최고농도 50 ㎎/㎖ 내지 최저농도가 0.78 ㎎/㎖에 이르도록 2 % 트윈 80 (Tween 80)을 포함한 배지로 단계적으로 희석한 로즈마리 정유 50 ㎕를 넣고 세로방향으로는 이와 유사한 방법으로 노플록사신 또는 옥사실린을 99 % 디메틸술폭시화물에 녹인 배수 희석액을 제조하여, 각각 한 농도의 샘플을 각 웰마다 5 ㎕씩 첨가하였다. 여기에 0.5 Mcfarland의 탁도로 조절한 스타필로코커스 아우레우스 각 균주 (strain)의 현탁액 145 ㎕를 가하고, 상기와 같은 조건으로 배양한 후 균이 억제된 최소농도의 배합비율을 관찰하였다. 가장 효율적으로 나타난 배합농도의 결과를 하기의 수학식 1에 대입하여 분획 억제 농도 (FIC, fractional inhibiting concentration)을 산출하여 분획 억제 농도 지수 (FICI ; FIC index)가 0.5 보다 작거나 같을 때 상승효과 (potentiating effect)가 있는 것으로, 0.5 내지 4 사이면 상가효과 (additive effect)로, 4보다 클 때 길항효과 (antagonistic effect)로 판정하였다.
Figure 112005045761338-pat00001
Figure 112005045761338-pat00002
Figure 112005045761338-pat00003
하기의 표 5에 나타난 바와 같이, 로즈마리 정유와 노플록사신 또는 옥사실린과의 병용시 상가작용 또는 현저한 상승작용이 나타났다. 특히 로즈마리유와 옥사실린 병용시의 FICI가 0.375로 노플록사신과의 병용시의 FICI의 0.5 보다 낮아 병용에 의한 효력상승이 더욱 크게 나타났다.
Combinations CCARM 3511 CCARM 3523
FIC FICI FIC FICI
RO-N 0.5 0.25 0.5
0.5 0.25
RO-O 0.5 0.625 0.125 0.375
0.125 0.25
하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 2-2의 배합물 RO-O 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 2-2의 배합물 RO-O 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 2-2의 배합물 RO-O 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 2-2의 배합물 RO-O 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 2-2의 배합물 RO-O 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
본 발명의 로즈마리 정유 및 항생제 배합물을 함유한 항균조성물은 세균의 항생제 감수성 및 내성 균주 모두에 항균작용을 나타내므로, 로즈마리 정유를 기존의 항생제와 같이 처리할 경우 약제내성균주 억제 및 균 확산방지용 항균조성물로 사용할 수 있다.

Claims (4)

  1. 로즈마리 (Rosmarinus officinalis L.) 정유 및 옥사실린(oxacillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 카나마이신(kanamycin) 배합물(로즈마리 정유:항생제=1:1~2 중량비)을 유효성분으로 함유하는 약제내성균인 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)에 대한 항균조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
KR1020050076328A 2005-08-19 2005-08-19 로즈마리 정유 및 기존 항생제를 함유한 내성균 억제용항균 조성물 KR100729182B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050076328A KR100729182B1 (ko) 2005-08-19 2005-08-19 로즈마리 정유 및 기존 항생제를 함유한 내성균 억제용항균 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050076328A KR100729182B1 (ko) 2005-08-19 2005-08-19 로즈마리 정유 및 기존 항생제를 함유한 내성균 억제용항균 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070021737A KR20070021737A (ko) 2007-02-23
KR100729182B1 true KR100729182B1 (ko) 2007-06-19

Family

ID=41633615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050076328A KR100729182B1 (ko) 2005-08-19 2005-08-19 로즈마리 정유 및 기존 항생제를 함유한 내성균 억제용항균 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100729182B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102117693B1 (ko) 2018-12-10 2020-06-03 주식회사 제이스에프아이 로즈마리, 계피 및 지방산을 포함하는 복합 천연 항균제 및 그 제조방법
WO2021040267A1 (ko) 2019-08-29 2021-03-04 유씨엘 주식회사 로즈마리로부터 카페인산과 로즈마린산을 추출하는 방법

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102104837B1 (ko) * 2018-09-14 2020-04-29 대한민국(환경부 국립생물자원관장) 크로톤 포일라네이 추출물을 이용한 항균용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Food Protection 2005 Apr; 68(4); p.790-795;
Phytochemistry, 65(2004), p.3249-3254, Moyosoluwa Oluwatuyi 외, "Antibacterial and resistance modifying activity of Rosmarinus officinalis"

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102117693B1 (ko) 2018-12-10 2020-06-03 주식회사 제이스에프아이 로즈마리, 계피 및 지방산을 포함하는 복합 천연 항균제 및 그 제조방법
WO2021040267A1 (ko) 2019-08-29 2021-03-04 유씨엘 주식회사 로즈마리로부터 카페인산과 로즈마린산을 추출하는 방법
US12251412B2 (en) 2019-08-29 2025-03-18 Ucl Co. Ltd. Method of extracting caffeic acid and rosemarinic acid from rosemary

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070021737A (ko) 2007-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Soltani et al. A review of the phytochemistry and antimicrobial properties of Origanum vulgare L. and subspecies
Henciya et al. Biopharmaceutical potentials of prosopis spp.(mimosaceae, leguminosa)
Nabavi et al. Pharmacological effects of Capparis spinosa L.
US10780173B2 (en) Natural preservatives and antimicrobial agents, including compositions thereof
Parameswari et al. In vitro anti-inflammatory and antimicrobial potential of leaf extract from Artemisia nilagirica (Clarke) Pamp
Tahir et al. Phytochemistry and pharmacological profile of traditionally used medicinal plant Hyssop (Hyssopus officinalis L.)
Gupta et al. Withania coagulans Dunal (paneer doda): A review
Shahid et al. Ethnobotanical studies on Berberis aristata DC. root extracts
Bankole et al. Synergistic antimicrobial activities of phytoestrogens in crude extracts of two sesame species against some common pathogenic microorganisms
Tshivhandekano et al. Chemical compositions and antimicrobial activities of Athrixia phylicoides DC.(bush tea), Monsonia burkeana (special tea) and synergistic effects of both combined herbal teas
US12161686B2 (en) Natural preservatives and antimicrobial agents, including compositions thereof
Martinez et al. Anti-infectious activity in the anthemideae tribe
Ukande et al. Review on pharmacological potentials of Prosopis juliflora
Randjelović et al. The benefits of Salvia sclarea L. ethanolic extracts on gastrointestinal and respiratory spasms
KR100729182B1 (ko) 로즈마리 정유 및 기존 항생제를 함유한 내성균 억제용항균 조성물
KR102468406B1 (ko) 대마 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 및 항바이러스 조성물
Sujatha et al. Bioactive screening and antimicrobial activity of flowers from the selected three medicinal plants on chosen microbes
Prabakaran et al. Antibacterial activity of the whole plant of Caralluma nilagiriana Kumari et Subba Rao–an endemic medicinal plant species
Opara et al. Preliminary phytochemical screening and antibacterial activities of leaf extracts of Terminalia catappa
KR101625891B1 (ko) 수련 추출물을 유효성분으로 포함하는 정족수 인식 억제용 조성물 또는 항균용 조성물
Teuscher et al. Natural Poisons and Venoms: Plant Toxins: Polyketides, Phenylpropanoids and Further Compounds
KR102054122B1 (ko) 풍미가 증진된 발효 천마 및 그 제조방법
Sabri et al. Chromolaena odorata: A review of its antimicrobial activity and its application in medicine
KR101739122B1 (ko) 항생제 내성을 가진 균까지 광범위한 항균 활성을 보이는 항균용 조성물
KR20130048109A (ko) 부처손 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 폐렴 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20050819

PA0201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20060825

Patent event code: PE09021S01D

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20070124

Patent event code: PE09021S01D

PG1501 Laying open of application
E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20070531

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20070611

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20070611

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
G170 Re-publication after modification of scope of protection [patent]
PG1701 Publication of correction
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20100422

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20110330

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20120611

Start annual number: 6

End annual number: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130530

Year of fee payment: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20130530

Start annual number: 7

End annual number: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140514

Year of fee payment: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20140514

Start annual number: 8

End annual number: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150610

Year of fee payment: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20150610

Start annual number: 9

End annual number: 9

PC1903 Unpaid annual fee

Termination category: Default of registration fee

Termination date: 20170203

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170206

Year of fee payment: 10

PR0401 Registration of restoration

Patent event code: PR04011E01D

Patent event date: 20170203

Comment text: Registration of Restoration

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20170206

Start annual number: 10

End annual number: 10

R401 Registration of restoration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200422

Start annual number: 14

End annual number: 14

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20210317

Start annual number: 15

End annual number: 15

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230315

Start annual number: 17

End annual number: 17