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KR100728603B1 - 단일쇄 형태변환 다형성을 이용하여 2 종 이상의 미생물에대한 항생제의 항균활성을 동시에 분석하는 방법 - Google Patents

단일쇄 형태변환 다형성을 이용하여 2 종 이상의 미생물에대한 항생제의 항균활성을 동시에 분석하는 방법 Download PDF

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KR100728603B1
KR100728603B1 KR1020050125364A KR20050125364A KR100728603B1 KR 100728603 B1 KR100728603 B1 KR 100728603B1 KR 1020050125364 A KR1020050125364 A KR 1020050125364A KR 20050125364 A KR20050125364 A KR 20050125364A KR 100728603 B1 KR100728603 B1 KR 100728603B1
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KR
South Korea
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microorganisms
microorganism
pcr
antibiotics
sscp
Prior art date
Application number
KR1020050125364A
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English (en)
Inventor
정규열
박종문
오민규
남명희
박영섭
정주희
김진
Original Assignee
학교법인 포항공과대학교
포항공과대학교 산학협력단
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Publication date
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Abstract

본 발명은 단일쇄 형태변환 다형성 (single strand conformation polymorphism; SSCP)을 이용하여 2 종 이상의 미생물에 대한 항생제의 항균활성을 동시에 분석하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 (1) 2 종 이상의 미생물을 시험하고자 하는 항생제의 존재 하에 공동 배양하는 단계; 및 (2) 얻어진 배양물의 게놈 DNA로부터 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의해 미생물에 특이적인 목적 유전자를 증폭시킨 후, 단일쇄 형태변환 다형성 전기영동을 수행하여 각 미생물의 세포 농도를 측정하는 단계를 포함하는 본 발명의 분석방법은 기존의 배지 희석법으로 측정하는 것과 동등한 결과를 제공하고, 항생제에 특이적인 미생물들의 개체수 변화를 소량의 샘플로부터 높은 정밀도와 정확도로 정량할 수 있으므로, 기존의 항균활성 분석법들을 대체할 수 있을 뿐 아니라, 새로운 항생제 및 임상진단시약의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

단일쇄 형태변환 다형성을 이용하여 2 종 이상의 미생물에 대한 항생제의 항균활성을 동시에 분석하는 방법 {METHOD FOR THE SIMULTANEOUS ANALYSIS OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ANTIMICROBIAL AGENT FOR TWO OR MORE MICROORGANISMS USING SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM}
도 1은 4 종의 미생물 (에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli); 코린박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum); 아시네토박터 칼로코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus); 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)) 각각의 16S rRNA 유전자들을 PCR (polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄 반응)-SSCP 전기영동하여 얻은 크로마토그램을 중복시킨 그래프이고,
도 2는 도 1에서 사용된 4 종 미생물들의 혼합체의 16S rRNA 유전자들을 PCR-SSCP 전기영동하여 얻은 크로마토그램이고,
도 3a 내지 3d는 도 1에서 사용된 4 종 미생물 중 1 종 미생물의 농도만을 변화시켜 혼합 배양한 혼합체의 16S rRNA 유전자들을 PCR-SSCP 전기영동하여 얻은 크로마토그램이고,
도 4a 내지 4c는 3 종의 미생물들 (에쉐리키아 콜라이, 아시네토박터 칼로코아세티쿠스 및 코린박테리움 글루타미쿰) 각각의 게놈 DNA 농도와 세포 농도의 상 관성을 보여주는 그래프이고,
도 5a 내지 5c는 도 4a 내지 4c에서 사용된 3 종의 미생물들 각각의 게놈 DNA의 PCR 산물을 PCR-SSCP 전기영동에 적용시켜 얻어진 피크 면적과 게놈 DNA 농도의 상관성을 보여주는 그래프이고,
도 6은 도 4a 내지 4c에서 사용된 3 종의 미생물들을 이용한 각각의 PCR-SSCP로부터의 피크 면적과 세포 농도 사이의 관계를 보여주는 그래프이며,
도 7a 내지 7c는 각각 아시네토박터 칼로코아세티쿠스, 에쉐리키아 콜라이 및 코린박테리움 글루타미쿰을 이용하여 16S rRNA 유전자-특이적 PCR-SSCP법과 전통적 배지희석법에 의한 카나마이신의 항균활성 분석결과를 비교한 그래프로서, ●는 미생물 혼합체에서의 PCR-SSCP법에 의한 데이터이고, ○는 각각의 미생물을 개별적으로 배양한 배지 희석법으로부터 얻어진 데이터이다.
본 발명은 단일쇄 형태변환 다형성 (SSCP)을 이용하여 2 종 이상의 미생물에 대한 항생제의 항균활성을 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.
"슈퍼버그"와 같이 존재하는 모든 항생제에 내성을 갖는 새로운 병원균의 출현에 대한 우려가 증가함에 따라, 새로운 항생제의 개발이 가속화되고 있다 (O'Riordan, A., et al., 2002, Ir J Med Sci. 171:42-3). 최근 몇 년 사이에, 많은 항생제 변형체들을 얻기 위한 몇몇 조합적 방법이 개발되면서, 형광 단백질 또는 형광 동시 접합법 (FISH)을 이용하여 재조합된 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시퍼레이즈 발현 균주들에 관한 연구 (Hilpert, K., et al., 2005, Nat Biotechnol. 23:1008-1012; 및 Merritt, J., et al., 2005, J Microbiol Methods 61:161-70) 및 새로운 항생제에 대한 화학적 또는 생물학적 라이브러리들이 짧은 기간 내에 구축되었다 (Rachakonda, S., et al., 2004, Curr Med Chem. 11:775-93; 및 Sorensen, O. E., et al., 2005, Comb Chem High Throughput Screen 8:273-80).
녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시퍼레이즈 발현 균주들은 아주 적은 양의 샘플만으로도 생존 세포 밀도의 온라인 정량에 성공적으로 적용되지만, 클로닝 도구가 특정 균주들에만 제한되고 각각의 목적 균주를 개별적으로 배양해야 하는 단점이 있다. 또한, 다양한 라이브러리로부터 높은 활성을 갖는 후보물질들을 선택하고 스크리닝하는 것은 배지 희석법이나 디스크 확산법과 같이 노동 집약적이고 까다로운 공정을 요구하므로, 이러한 문제점들은 효과적인 항생제 개발에 주된 장애물이 되고 있다 (Cole, A. M., et al., 2000, Biotechniques 29:822-6, 828, 830-1).
효과적으로 항생제를 개발하기 위해서는, 단순성, 민감도 및 속도를 효과적으로 조절하여 스크리닝의 노력을 줄이는 것이 매우 중요하다. 그러나 속도의 경우, 기존의 성장지연 기반의 항균활성 분석방법으로는 알짜 분석시간을 줄이기 어렵다. 따라서, 다양한 미생물들에 대한 항균효과를 병렬로 분석하는 방법을 사용함 으로써 실험 횟수를 줄이고, 결과적으로 높은 효과의 항생 후보물질을 보다 쉽게 선택하고 스크리닝할 수 있다.
단일쇄 형태변환 다형성 (SSCP)은 오리따 등 (Orita, M., et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86:2766-70)이 처음 개발하였으며, 유전자 스크리닝에 가장 흔하고, 다목적으로 쓰이는 경제적인 방법 중 하나이다. 다른 유전자형 분석법과는 달리, SSCP는 유전자 염기서열의 특이적인 위치에 관한 정확한 정보를 제공하지는 않으나, 대조군과의 비교를 통해 유전자의 돌연변이 상태를 측정할 수 있다.
SSCP는 돌연변이에 의한 DNA 뉴클레오티드 서열의 변화가 단일쇄 DNA의 구조적 접힘의 변화를 일으키고, 전기영동시 이동거리에 차이가 생기는 원리에 기인하고 있다. 전통적으로, SSCP는 20% 아크릴아마이드 슬랩-겔 (slab-gel)과 같은 분해도가 뛰어난 매체에 방사성 동위원소가 표지된 DNA를 전기영동하여 측정하는데, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되고 (약 14시간), 노동집약적이며, 결과가 수행자의 기술에 전적으로 의존되고, 임상 의학에 있어서 선택적이고 제한적인 응용만 가능하다는 문제점이 있다 (Kourkine, I. V., et al., 2002, Electrophoresis 23:1375-85).
최근 개발된, 50-75 ㎛의 내경을 갖는 미세관 융합 실리카 모세관을 사용한 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis)은 상기 슬랩-겔 SSCP의 실용적인 대체 방안이 되었을 뿐만 아니라, 처리량 증대, 민감도 및 재현성 향상, 전체 공정의 자동화 등을 제공하였으며, PCR (polymerase chain reaction)-SSCP를 이용한 미생물 군집 분석방법 (Lee, D. H., Y. G. Zo, et al., 1996, Appl Environ Microbiol. 62:3112-20)이 발표된 이래로 단일사슬 DNA의 분리를 위한 모세관 전기영동 SSCP를 이용한 개체수 분석은 폐수처리 공정에서의 미생물 분포측정이나 생태계에서의 개체 역학에 응용되고 있다 (Dabert, P., et al., 2005, Appl Microbiol Biotechnol. 66:575-88; 및 Khammar, N., et al., 2005, J Appl Microbiol. 98:476-90).
상기 방법을 이용하여 미생물 혼합체에서 넓은 범위의 미생물들의 개체수를 동시에 분석하기 위해서는, 가장 작은 유사성을 지닌 범위를 증폭하기 위한 프라이머의 설계를 포함한 PCR 조건들과 폴리머 젤의 농도, 온도, 완충액의 pH 등 모세관 전기영동을 수행하기 위한 여러 조건들을 조절하는 것이 매우 중요하다.
이에, 본 발명자들은 기존의 배지 희석법이나 디스크 확산법과 같은 기존의 항균효과 분석을 대체할 수 있으면서도, 간단하고 높은 민감도와 방대한 처리량을 갖는 항균활성 분석방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, SSCP를 이용하여 2 종 이상의 미생물에 대한 항생제의 항균활성을 동시에 분석하는 방법이 높은 처리효율을 갖는 항균활성 분석방법임을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 배지 희석법이나 디스크 확산법과 같은 기존의 항균효과 분석을 대체할 수 있고, 간단하고, 높은 민감도와 방대한 처리량을 갖는 항균활성 분석방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
(1) 2 종 이상의 미생물을 시험하고자 하는 항생제의 존재 하에 공동 배양하는 단계; 및
(2) 얻어진 배양물의 게놈 DNA로부터 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 미생물에 특이적인 목적 유전자를 증폭시킨 후, 단일쇄 형태변환 다형성 전기영동을 수행하여 각 미생물의 세포 농도를 측정하는 단계를 포함하는,
2 종 이상의 미생물에 대한 항생제의 항균활성을 동시에 분석하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 항균활성 분석 방법은 항생제의 항균활성을 2 종 이상의 미생물에 대해 동시에 분석하기 위해, 2 종 이상의 미생물 혼합체를 시험하고자 하는 항생제의 존재 하에 공동 배양한 후 각 미생물의 개체수 변화를 확인함으로써 각각의 미생물에 대한 항생제의 항균활성을 한번에 분석하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 상기 항생제 존재 하에 배양된 미생물들을 확인하기 위하여, 각 미생물들로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하여 항생제에 특이적인 목적 유전자를 PCR로 증폭한다.
상기 배양된 미생물들의 게놈 DNA는 당분야에 공지된 다양한 방법을 통해 분리될 수 있으며, 분리된 게놈 DNA는 각 미생물에 특이적인 목적 유전자를 증폭하기 위한 주형으로 사용된다.
상기 미생물들에 특이적인 목적 유전자로는 16S rRNA (ribosomal RNA) 유전자, EF-2 (translation elongation factor 2), IF-3 (translation initiation factor 3), IF-2 (translation initiation factor 2) 등이 있으며, 이 중 16S rRNA가 바람직하다. 16S rRNA는 박테리아 등 원핵생물의 리보솜 중 소단위체 (small subunit)에 존재하는 rRNA로서, 이를 암호화하는 16S rRNA 유전자는 1,500 bp 내외의 크기로 전체 원핵생물에서 동일하게 발견되는 보존 영역 (conserved region) 및 하위종 (subspecies) 수준에서 특이적으로 발견되는 가변 영역 (variable region)을 모두 가지고 있어 미생물의 동정 및 분류 등에 흔히 사용되고 있다.
상기 PCR은 PCR 산물에 포함되어 있는 목적 유전자의 개체수 측정을 용이하게 하기 위해 표지된 프라이머 (primer)의 존재 하에서 수행된다. 프라이머를 표지하는 데에는 통상적으로 사용되는 방법이 모두 사용될 수 있으며, 대표적 예로는 형광물질 또는 방사성동위원소에 의한 표지를 들 수 있다. 이 때, 상기 프라이머의 표지는 통상 5′-말단에서 수행된다.
본 발명의 실시예에서는 16S rRNA 유전자를 증폭시키기 위해, 미생물들로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 16S rRNA 유전자의 가변 영역 보존 서열에 일치하는 두 개의 프라이머, V2Forward 5'-ACTGCTGCCTCCCGTAG-3' (서열번호 1) 및 V2Reverse 5'-GGCGAACGGGTGAGTAA-3' (서열번호 2)를 사용하여 PCR을 수행하고, 이들 프라이머는 각각 5′-말단에 형광물질인 벤조플루오로트라이클로로카복시 플루오레 세인 (NDE) 및 플루오레세인의 헥사클로로 유도체 (HEX)로 표지된다.
상기 PCR 산물은 모세관 전기영동 SSCP에 의해 상기 PCR 산물에 포함되어 있는 목적유전자가 각 피크별로 분리되며, 이때 이미 알고 있는 미생물의 목적 유전자에 대해 상기 PCR 산물과 구별되는 형광으로 표지된 PCR 산물을 상기 PCR 산물에 첨가함으로써, 전기영동에 의한 각각의 피크를 용이하게 식별할 수 있다.
상기 SSCP 전기영동에서는 상기 PCR 산물을 90∼98℃, 바람직하게는 94℃에서 4분 동안 가열하여 변성시킨 후, 즉시 얼음에서 냉각시켜 고온 변성에 의해 생성된 단일쇄 DNA가 이중쇄 DNA로 다시 재결합되는 것을 막는다. 이렇게 생성된 단일쇄 DNA를 전기영동시키면 서열상의 차이가 존재하는 각각의 단일쇄 DNA는 서로 다른 이동상을 가지게 되므로, 생성된 피크를 분석함으로써 PCR 산물에 포함되어 있는 목적 유전자의 개체수를 알 수 있다.
이때 전기영동법으로는 통상의 방법 중 어느 것이라도 사용가능하지만, 분석의 민감도 및 효율성을 위해서는 모세관 전기영동을 사용하는 것이 바람직하고, 모세관은 폴리아크릴아미드 겔, 선형 아크릴아미드 겔, 폴리에틸렌옥사이드 겔 또는 비변성 실리카 등, 바람직하게는 비변성 실리카로 채워진 모세관을 사용하는 것이 좋다.
상기 SSCP 전기영동에서 얻어진 각 피크를 분석하면, 미생물의 세포 농도는 측정된 게놈 DNA의 농도와 정비례하고, 측정된 게놈 DNA의 농도는 SSCP에 의해 생성된 목적 유전자의 피크 면적과 정비례한다. 따라서, 각 미생물에 특이적인 목적 유전자에 해당하는 피크 면적을 계산함으로써, 세포의 농도를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 미생물들에 대한 항균활성 동시 분석을 상용 항생제에 적용하면, 얻어진 항생제의 최소저해 농도값은 기존의 배지 희석법을 사용하여 얻어진 최소저해 농도값과 거의 유사하다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 항생제의 활성분석에도 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 항균활성 동시 분석방법은 임상분야에 있어서 다양한 진단에 효과적일 수 있다. 일반적으로 항생제의 항균 활성은 환자에게 투여 후 증상 발현 여부를 통해서만 확인할 수 있으므로, 이 때문에 종종 환자들에게 항생제를 과다투여하게 된다. 그러나, 본 발명의 항균활성 동시 분석방법을 사용하면, 만성적인 감염성 질환자의 예후를 분석할 수 있으며, 이는 환자의 상태에 관한 보다 자세한 정보를 공급하고 결과적으로 환자에게 적절한 치료를 제공하는데 도움을 줄 수 있다.
따라서, 단일쇄 형태변환 다형성을 이용하여 단순하면서도 민감도가 높은 본 발명의 분석방법은, 기존의 항균활성 분석법들을 대체할 수 있을 뿐 아니라, 감염성 질병에 대한 예후 분석에도 사용될 수 있으므로, 새로운 항생제 및 임상진단시약의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 비교예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 각 미생물에 대한 PCR-SSCP 모세관 전기영동
<1-1> 게놈 DNA의 분리
스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, KCTC 1916), 아시네토박터 칼로코아세티쿠스 (Acinetobacter calocoaceticus, KCTC 2357), 코린박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum, KCTC 3317) 및 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli K12, ATCC 19215) 를 각각 LB (Luria-Bertani) 배지 1.5 ㎖가 들어있는 테스트 튜브에 넣어 30℃에서 밤새 배양하였다.
배양된 세포들을 회수하기 위해, 배양액을 VS-15000CF 원심분리기 (비젼과학주식회사, 한국)를 이용하여 8,000 rpm에서 3 분간 원심분리한 후, 상등액을 제거한 다음, Micro-12 원심분리기 (한일과학산업주식회사, 한국)를 이용하여 13,000 rpm에서 15 초간 원심분리하여 상등액을 가능한 많이 제거하였다. 회수된 세포들의 게놈 DNA를 G-스핀TM 게놈 DNA 분리 킷트 (인트론 바이오테크놀로지 주식회사, 한국)를 이용하여 분리하였다.
구체적으로, 상기 게놈 DNA 분리 킷트 제조사의 지시에 따라, 회수된 세포들을 1 ㎎/㎖ RNA 분해효소가 포함된 예비 완충액 50 ㎕에 부유시키고, 라이소자임 용액 (100 ㎎/㎖) 3 ㎕을 첨가하여 37℃에서 15 분간 배양한 다음, 2.1 ㎍/㎖ RNase A 및 0.4 ㎍/㎖ 프로테아제 K를 함유하는 G-완충액 250 ㎕를 첨가하여 65℃에서 15 분간 배양하였다. 추가 정제를 위해 상기 배양액에 바인딩 완충액 250 ㎕ 을 첨가하여 컬럼으로 옮긴 다음, 2 회의 세척 및 용리 (elution)를 반복하여 순수한 게놈 DNA를 얻었다.
<1-2> PCR
상기 <1-1>에서 분리된 게놈 DNA에서 목적 유전자 부위를 증폭하기 위하여, 다카라 바이오메디컬사 (일본)의 PCR 프리믹스 (perfect PreMix), 바이오 라드사 (미국)의 마이사이클러 써멀 사이클러 (mycycler thermal cycler) 및 어플라이드 바이오 시스템즈 코리아사 (한국)에서 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
먼저, 게놈 DNA의 16S rRNA 유전자의 가변 영역 및 보존 영역에 각각 일치하면서, 각각의 5′-말단에 벤조플루오로트라이클로로카복시 플루오레세인 (NDE) 및 플루오레세인의 헥사클로로 유도체 (HEX)로 표지된 두 개의 프라이머, V2Forward 5'-ACTGCTGCCTCCCGTAG-3' (서열번호 1) 및 V2Reverse 5'-GGCGAACGGGTGAGTAA-3' (서열번호 2) 각 0.4 ㎕, 주형으로서 상기 <1-1>에서 분리한 게놈 DNA 0.2 ㎕을 0.2 mM dNTP, 2 mM 염화마그네슘 및 1.5 units/10 ㎕ 의 Taq 중합효소가 함유된 프리믹스에 첨가한 다음, PCR 기기를 이용하여 95℃에서 30 초, 55℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초간 30회 반복 반응시키고, 최종적으로 72℃에서 7 분간 증폭시켰다.
<1-3> SSCP 모세관 전기영동
상기 <1-2>에서 얻은 PCR 산물 1.5 ㎕, 탈이온화된 포름아마이드 (어플라이드 바이오시스템즈사, 미국) 17.7 ㎕ 및 0.3 N 수산화나트륨 0.8 ㎕를 0.5 ㎖ 튜브에서 혼합한 후, 95℃에서 4 분간 가열하여 변성시킨 다음, 즉시 얼음에서 냉각시켰다.
상기와 같이 준비된 DNA 시료는, 변성되지 않은 고분자 매트릭스로서 3.5% 진스캔 폴리머 (어플라이드 바이오시스템즈사)가 채워진 47 ㎝ X 50 ㎜의 모세관 및 10% 글리세롤이 함유된 1 X TBE 완충액 (89 mM 트리스-보레이트, 2 mM EDTA) 을 사용하여 ABI 프리즘 310 유전자 분석기 (어플라이드 바이오시스템즈사, 미국)를 통해 모세관 전기영동되었으며, 전기영동의 조건은 다음과 같다:
주사전압: 15.0 ㎸;
전기영동 전압 : 13.0 ㎸;
시린지 펌프 시간: 210 초;
온도: 30℃; 및
수집시간: 30분.
상기에서 전기영동된 DNA는 동일 분석기 내에서 자동적으로 진스캔 분석 소프트웨어 (어플라이드 바이오시스템즈사)에 의해 분석되었으며, 이를 통해 얻어진 각 DNA에 대한 크로마토그램을 도 1에 중복하여 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 하나의 주 피크와 여러 군소 피크들이 모든 미생 물에서 관찰되었는데, 이는 각 미생물의 16S rRNA 유전자로부터 얻어진 단일쇄 PCR 산물이 SSCP 모세관 전기영동의 조건 하에서 독자적인 구조를 형성하기 때문이다. 이러한 결과는 16S rRNA 유전자에 특이적인 PCR-SSCP 크로마토그램이 각 미생물의 동정에 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 2 : 미생물 혼합체에 대한 PCR-SSCP 모세관 전기영동
각 미생물들이 혼합되어 있을 때에도 16S rRNA 유전자에 특이적인 PCR-SSCP 크로마토그램이 여전히 같은 위치에서 유지되는 지를 확인하기 위해, 실시예 1에서 사용된 4 종의 미생물들을 혼합 배양한 다음, 이들로부터 게놈 DNA를 분리한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여, 미생물들의 혼합체로부터 얻어진 SSCP의 크로마토그램을 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 미생물들의 혼합체로부터 얻어진 각 피크의 위치는 각 미생물을 개별적으로 배양하여 얻은 도 1a의 피크와 거의 동일하였다.
실시예 3 : 미생물의 세포 농도 변화에 대한 PCR-SSCP 모세관 전기영동
농도가 다른 미생물들이 혼합되어 있을 때에도 16S rRNA 유전자에 특이적인 PCR-SSCP 크로마토그램을 통해 특정 미생물을 선별할 수 있는지를 확인하기 위해, 실시예 1에서 사용된 4 종의 미생물들을 혼합 배양할 때, 1 종 미생물의 농도만을 달리하여 혼합 배양한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여, 미 생물들의 혼합체로부터 얻어진 크로마토그램을 도 3a 내지 3d에 나타내었으며, 이때 농도를 변화시킨 미생물의 각 농도는 다음과 같다.
에쉐리키아 콜라이 (도 3a): 0, 9.68E+07, 3.92E+08, 8.84E+08, 1.38E+09 및 1.87E+09;
아시네토박터 칼로코아세티쿠스 (도 3b): 0, 7.72E+06, 4.93E+07, 1.19E+08, 1.88E+08 및 2.57E+08;
코린박테리움 글루타미쿰 (도 3c): 0, 0, 9.50E+07, 2.60E+08, 4.25E+08 및 5.90E+08; 및
스타필로코쿠스 아우레우스 (도 3d): 1.67E+09) 및 2.25E+09.
도 3a 내지 3d에 나타난 바와 같이, 어떤 미생물의 세포 농도가 변하면, 다른 피크들과는 다르게 오직 하나의 피크 범위가 변하였으며, 각 피크의 위치는 도 1과 거의 동일하였다. 따라서, 본 발명의 PCR-SSCP는 미생물 혼합체에서 특정 미생물의 세포 농도를 정량하는데 사용될 수 있음을 알 수 있다.
시험예 1 : PCR-SSCP 모세관 전기영동을 이용한 세포 농도의 추정
<1-1> 세포 농도와 게놈 DNA 농도와의 관계 측정
게놈 DNA 내의 16S rRNA 농도를 정량하기 위해, 실시예 1과 동일한 방법으로 에쉐리키아 콜라이, 아시네토박터 칼로코아세티쿠스 및 코린박테리움 글루타미쿰을 각각 다른 농도로 배양하고 게놈 DNA를 분리한 다음, 260 nm에서의 흡광도를 이용하여 각 게놈 DNA의 농도를 측정하였다. 얻어진 데이터로부터 최소자승법에 의해 세포 농도와 게놈 DNA 농도 사이의 관계 방정식 및 상관 계수를 얻었으며, 그 결과를 도 4a 내지 4c에 나타내었으며, 각 미생물의 농도는 다음과 같다.
에쉐리키아 콜라이: 6.7E+08, 3.3E+08, 1.3E+08, 6.7E+07, 4.5E+07, 3.3E+07, 1.3E+07 및 6.7E+06 cfu/㎖;
아시네토박터 칼로코아세티쿠스: 2.5E+08, 1.3E+08, 5.0E+07, 2.5E+07, 1.7E+07, 1.3E+07, 5.0E+06 및 2.5E+06 cfu/㎖; 및
코린박테리움 글루타미쿰: 2.8E+08, 1.4E+08, 5.6E+07, 2.8E+07, 1.9E+07, 1.4E+07, 5.6E+06 및 2.8E+06 cfu/㎖.
도 4a 내지 4c에 나타난 바와 같이, 게놈 DNA의 농도는 세포 농도와 정비례하였다. 이로부터, 세포의 농도는 게놈 DNA의 농도를 통해 측정될 수 있음을 알 수 있다.
<1-2> 게놈 DNA 농도와 이의 PCR 산물 농도와의 관계 측정
각 미생물의 PCR 산물의 농도는 SSCP 크로마토그램의 피크 면적으로 표현되므로, 각 미생물별로 각기 다른 세포 농도로부터 얻어진 상기 <1-1>의 게놈 DNA를 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR-SSCP의 크로마토그램을 얻은 다음, 각 피크의 면적을 계산하였다. 얻어진 데이터로부터 최소자승법에 의해 피크 면적과 게놈 DNA 농도 사이의 관계 방정식 및 상관 계수를 얻었으며, 그 결과를 도 5a 내지 5c에 나타내었다.
도 5a 내지 5c에 나타난 바와 같이, 게놈 DNA의 농도는 피크 면적과 정비례하였다. 또한, 낮은 게놈 DNA 농도에서 피크 면적과의 높은 선형성이 관찰되었으므로, 세포 농도의 적절한 측정을 위해서는 게놈 DNA 농도를 조절하는 것이 합리적임을 알 수 있다.
<1-3> 세포 농도와 피크 면적과의 관계 측정
상기 <1-2>에서 얻은 피크 면적에 해당하는 각 미생물의 세포 농도를 계산하여 피크 면적과 세포 농도 사이의 관계를 비교하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 세포 농도는 피크 면적과 정비례하였으므로, 세포의 농도를 SSCP 전기영동에 의해 쉽게 측정할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 16S rRNA의 양과 게놈 DNA 양이 각 미생물 별로 차이가 있으므로, 세포 농도의 피크 면적에 대한 의존성은 각 미생물에 따라 달라졌다. 그러나, 일반적으로 측정된 세포 농도의 범위 내에서, 세포 농도는 SSCP 전기영동의 피크 면적을 통하여 쉽게 계산될 수 있었다. 이러한 결과는 16S rRNA에 특이적인 PCR-SSCP가 미생물 혼합체에 있어서의 미생물 분포의 정량을 위한 유용한 도구임을 보여준다.
시험예 2 : PCR-SSCP를 이용한 2 종 이상의 미생물에서의 항균효과 동시 분석
상기 시험예 1에서 사용한 3 종의 미생물들을 포함하는 미생물 혼합체가 각 미생물들에 대한 항균활성을 동시에 분석하기 위해 사용되었다. 항균활성의 척도로 흔히 사용되는 최소저해농도 (MIC)를 각 미생물을 대상으로 측정하였다.
상기 미생물 혼합체를 0.5, 1, 5, 10, 20, 50 및 100 ㎍/㎖ 농도의 카나마이신, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신과 함께 LB 배지 1.5 ㎖에서 배양한 다음, 각 미생물의 농도를 상기 시험예 1과 같이, 16S rRNA에 특이적인 PCR-SSCP 방법으로 측정하였다. 항생제가 없는 배지에서 배양한 세포의 농도도 같은 방법으로 측정하여, 배지 내에 특정 양의 항생제가 있을 때의 세포 농도를 항생제가 없을 때의 세포 농도와 비교한 상대적 세포 농도를 구한 후, 이로부터 최소저해농도 (MIC)를 구하였다.
또한, 본 발명에 따른 세포 농도 측정 방법을 기존 배지 희석법과 비교하기 위해서, 상기와 동일하게 항생제가 들어있는 동일한 배양 조건에서 각각의 미생물을 분리해서 개별적으로 배양한 다음, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 각 세포 농도를 계산하고, 이로부터 최소저해농도 (MIC)를 구하여 도 7a 내지 7c 및 표 1에 나타내었다.
Figure 112005074143929-pat00001
상기 표 1 및 도 7a 내지 7c에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 미생물 혼합체를 사용한 PCR-SSCP 방법은 기존의 배지 희석법에 의해 얻은 것과 거의 동일한 상대적 세포 농도 및 MIC 값을 제공하므로 기존의 항균효과 측정법을 대체할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 2 종 이상의 미생물에 대한 항생제의 항균활성의 동시 분석방법은 단일쇄 형태변환 다형성을 이용하여 단순하면서도 민감도가 높은 분석방법을 제공하므로, 기존의 항균활성 분석법들을 대체할 수 있을 뿐 아니라, 감염성 질병에 대한 예후 분석에도 사용될 수 있으므로, 새로운 항생제 및 임상진단시약의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. (1) 2 종 이상의 미생물을 시험하고자 하는 항생제의 존재 하에 공동 배양하는 단계; 및
    (2) 얻어진 배양물의 게놈 DNA로부터 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 각 미생물의 16S rRNA (ribosomal RNA) 유전자를 증폭시킨 후, 단일쇄 형태변환 다형성 전기영동을 수행하여 각 미생물의 세포 농도를 측정하는 단계를 포함하는,
    2 종 이상의 미생물에 대한 항생제의 항균활성을 동시에 분석하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 단계 (2)의 PCR이 형광물질 또는 방사성 동위원소에 의해 표지된 각 미생물의 16S rRNA 유전자의 가변 영역 보존 서열에 일치하는 프라이머 쌍의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 프라이머쌍이 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 전기영동이 모세관 전기영동인 것을 특징으로 하는 방법.
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