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KR100725199B1 - 에이치지에프유전자를함유하는약제 - Google Patents

에이치지에프유전자를함유하는약제 Download PDF

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KR100725199B1
KR100725199B1 KR1019980701515A KR19980701515A KR100725199B1 KR 100725199 B1 KR100725199 B1 KR 100725199B1 KR 1019980701515 A KR1019980701515 A KR 1019980701515A KR 19980701515 A KR19980701515 A KR 19980701515A KR 100725199 B1 KR100725199 B1 KR 100725199B1
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KR
South Korea
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hgf
hvj
sensitized
dna
endothelial cells
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KR1019980701515A
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류이찌 모리시따
도시오 오기하라
도시까즈 나까무라
데쓰야 도미따
다까히로 오찌
Original Assignee
안제스에무지 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 HGF 유전자를 함유하는 약제에 관한 것이다. 본 발명의 약제는 효과가 선택적으로 나타날 수 있도록 표적 기관에 국소적으로 적용시킴으로써, HGF 의 부작용을 최소화시킬 수 있다.

Description

에이치지에프 유전자를 함유하는 약제 {MEDICINE COMPRISING HGF GENE}
본 발명은 유전자 요법 등에 사용되는 약제에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 간세포 성장 인자 (HGF) 유전자를 함유하는 약제 뿐 아니라 HGF 유전자를 함유하는 리포솜에 관한 것이다.
HGF 는 다양한 약리학적 활성을 나타내는 생리 활성 펩티드이다. HGF 의 약리학적 활성은 예를 들어, 문헌 [JIKKEN-IGAKU (Experimental Medicine), Vol. 10, No. 3 (extra issue), 330-339 (1992)] 에 기재되어 있다. 그의 약리학적 활성면에 있어서, HGF 는, 간경변 또는 신장병 치료 약물; 내피세포 성장 촉진제; 항암제; 암 요법중 부작용 방지제; 폐질환, 위장 상해 또는 두부 신경 질환 치료제; 면역억제 부작용 방지제; 콜라겐 분해 촉진제; 연골 질환, 동맥성 질병, 폐섬유증, 간질환, 혈액 응고장애, 혈장 저단백증 또는 외상의 치료제; 신경 질환 개선제; 조혈 간세포 상승인자; 및 모발 성장 촉진제로써 유용한 것으로 기대된다 [일본 특허 공개 제 4-18028 호 및 제 4-49246 호, EP 492614 호, 일본 특허 공개 제 6-25010 호, WO 93/8821 호, 일본 특허 공개 제 6-172207 호, 제 7-89869 호 및 제 6-40934 호, WO 94/2165 호, 일본 특허 공개 제 6-40935 호, 제 6-56692 호 및 제 7-41429 호, WO 93/3061 호, 일본 특허 공재 제 5-213721 호 등].
유전자 요법으로써, 아데노신 디아미나제 결핍증, AIDS, 암, 농포성 섬유증 또는 혈우병 등에 대해 전세계에 걸쳐 현재 폭 넓은 연구 및 투자가 되고 있다.
그러나, HGF 유전자를 이용한 유전자 요법은 아직까지 알려진 바 없다. 상기 유전자 요법이 효과적으로 이용될 수 있는지는 아직까지 불분명하다.
본 발명에 의해 해결되어야할 문제
HGF 는 혈액중 짧은 반감기를 갖는 약물중 하나로 공지되어 있다. 당연한 결과로써, HGF 는 지속적인 국소 투여만이 되고 있다.
HGF 의 다양한 약리학적 활성면에 있어서, HGF 는 다양한 질병에 대해 폭 넓은 용도를 갖는 약물로서의 개발이 기대되고 있다. 반면, HGF 가 전신적으로 투여되는 경우, HGF 의 다양한 약리학적 활성으로 인해 부작용이 유발될 수 있다. 더불어, HGF 자체가 정맥내 투여되는 경우, HGF 는 상당량의 HGF 가 간에 잔류하여 표적 기관에 도달하는 HGF 의 양이 감소되는 결과를 나타내는 결점과 직면한다.
문제 해결 수단
본 발명은 선행 문제를 해결하고자 한다. 요약하여, 본 발명은 하기에 관한 것이다 :
(1) HGF 유전자를 함유하는 약제;
(2) HGF 유전자를 내포하는 리포솜;
(3) 센다이 (Sendai) 바이러스와 융합된 막 융합 리포솜인 (2) 에 따른 리포솜;
(4) (2) 또는 (3) 에 따른 리포솜을 함유하는 약제;
(5) 동맥성 질병 치료 용도인, (1) 또는 (4) 에 따른 약제;
(6) 연골 상해 치료 용도인, (1) 또는 (4) 에 따른 약제.
도 1 은 시험예 1 에서 일본 적혈구응집 바이러스 (Hemagglutinating virus of Japan; HVJ)-리포솜-DNA 으로 감작된 쥐 관상 내피세포중 HGF 의 발현을 나타낸다.
도 2 에서, (선) 그래프는 시험예 2에서 HVJ-리포솜-cont-감작된 내피세포로부터 HGF 의 존재 또는 부재하에서의 세포 성장률을 나타내는데, "DSF" 는 HVJ-리포솜-cont 로 감작된 내피세포군을 나타내고, "HGF" 는 예정 농도의 재조합 인간 HGF 의 존재하에 배양된 군을 의미한다. 도 2에서 바 (bar) 는 시험예 2에서 HVJ-리포솜-DNA-감작된 내피세포의 세포 성장률을 나타내는데, "DSF" 는 HVJ-리포솜-cont 로 감작된 내피세포군을 나타내고, "HGF 벡터" 는 HVJ-리포솜-DNA 로 감작된 내피세포군을 의미한다.
도 3 은 시험예 2에서 항-HGF 항체의 존재 또는 부재하에서 HVJ-리포솜-DNA 로 감작된 내피세포의 세포 성장률을 나타내고, 이중 "대조군" 은 IgG 콘트롤의 존재하에서 배양된 HVJ-리포솜-cont-감작된 내피세포군을 나타내고; "HGF" 는 IgG 콘트롤의 존재하에서 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 내피세포군을 나타내고; "HGFab" 는 토끼 항-인간 HGF 항체의 존재하에서 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 내피세포군을 나타낸다. 세포 성장률 (%) 은 대조군의 성장률을 100 으로 하는 경우 이에 상대 % 로 표현된다.
도 4 는 시험예 3에서 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 혈관 평활근 세포 (이후, Vascular Smooth Muscle Cells; VSMCs 로 약칭) 로부터의 배양 상층액의 쥐 관상 내피세포에 대한 세포 성장 효과를 나타내는 그래프로써, "대조군" 은 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 배양 상층액이 첨가된 군을 나타내고, "HGF" 는 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 배양 상층액이 첨가된 군을 나타낸다.
도 5 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 상층액의 HGF 농도가 항-인간 HGF 항체를 이용하여 결정되는 시험예 3 에서의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에서, "비처리군" 은 비감작된 VSMCs 의 배양 상층액의 군을 나타내고; "대조군" 은 배양된 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 상층액의 군을 나타내고; "HGF" 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 상층액의 군을 나타낸다.
도 6 은 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 상층액의 HGF 농도가 항-쥐 HGF 항체를 이용하여 결정되는 시험예 3 에서의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6에서, "비처리군" 은 비감작된 VSMCs 의 배양 상층액의 군을 나타내고; "대조군" 은 배양된 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 상층액의 군을 나타내고; "HGF" 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 상층액의 군을 나타낸다.
도 7 은 시험예 4에서 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포로부터의 상층액의 쥐 관상 내피세포에 대한 세포 성장 효과를 나타내는 그래프로써, A, B 및 C 는 각각 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포의 상층액이 첨가된 군, 배양된 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 관상 내피세포의 상층액이 첨가된 군, 및 비-처리 동물의 군을 나타낸다.
도 8 은 시험예 4에서 항-HGF 항체의 존재하에 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포의 쥐 관상 내피세포에 대한 세포 성장 효과를 나타낸다. 도 8에서, A 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포로 부터의 상층액이 첨가된 군을 나타내고; B 는 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 관상 내피세포로 부터의 상층액이 첨가된 군을 나타내고; C 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포로 부터의 상층액에 항-HGF 항체가 첨가된 군을 나타내고; D 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포의 상층액에 대조 항체가 첨가된 군을 나타낸다.
도 9 는 HVJ-리포솜-DNA-감작된 인간 VSMCs 가 비감작된 인간 내피세포와 공동-배양되는 경우 시험예 5에서 내피세포의 세포 성장을 나타내는 도면이다. 도 9에서, "대조군" 은 HVJ-리포솜-cont-감작된 VSMCs 와 공동-배양된 군을 나타내고, "HGF" 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 VSMCs 로 부터의 상층액의 군을 나타낸다.
도 10 은 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 가 비감작된 쥐 관상 내피세포와 공동-배양되는 경우, 시험예 6에서 내피세포의 세포 성장을 나타낸다. 도 10에서, "대조군" 은 HVJ-리포솜-cont-감작된 VSMCs 와 공동-배양된 군을 나타내고, "HGF" 는 HVJ-리포솜-DNA-감작된 VSMCs 의 배양 상층액의 군을 나타낸다.
도 11 은 시험예 8에서 HVJ-리포솜-DNA 가 직접 주사된 쥐 심장근중 미세 혈관의 수 증가를 나타내고, "HGF" 는 HVJ-리포솜-DNA 가 직접 주사된 쥐 심장근중 미세 혈관의 수를 나타내고, "대조군" 은 HVJ-리포솜-cont 가 직접 주사된 쥐 심장근중 미세 혈관의 수를 나타낸다.
도 12 는 관절에 HVJ-리포솜-DNA 투여 3 주후, 연골-유사 세포의 발달이 시험예 9 에서 나타나는 것을 보여주는 도면이고, 이중 톨루이딘 블루-염색된 프로테오글리칸의 합성이 관찰된다.
도 13 은 관절에 HVJ-리포솜-DNA 투여 4 주후, 연골-유사 세포의 발달이 시험예 9 에서 나타나는 것을 보여주는 도면이고, 이중 톨루이딘 블루-염색된 프로테오글리칸의 합성이 관찰된다.
도 14 는 관절에 비교예 2 에서 제조된 HVJ-리포솜-DNA (TGF-β) 를 투여한 지 4 주후에도, 톨루이딘 블루-염색된 프로테오글리칸의 합성을 관찰함으로써 상기 연골-유사 세포의 발달이 시험예 9 에서 나타나지 않는다는 것을 보여주는 도면이다.
도 15 는 관절에 비교예 1 에서 제조된 HVJ-리포솜-cont 를 투여한 지 4 주후에도, 톨루이딘 블루-염색된 프로테오글리칸의 합성을 관찰함으로써 상기 연골-유사 세포의 발달이 시험예 9 에서 나타나지 않는다는 것을 보여주는 도면이다.
발명을 실현하기 위한 최량의 형태
본 발명에서 이용되는 "HGF 유전자" 는 HGF 를 발현할 수 있는 유전자를 나타낸다. 그러므로, 발현된 폴리펩티드가 실질적으로 HGF 의 것과 동일한 효과를 갖는한, HGF 유전자는 뉴클레오티드 서열의 부분 결실, 치환 또는 삽입될 수 있고, 또는 그의 5′-말단 및/또는 3′-말단에서 그와 결찰된 다른 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 HGF 유전자의 전형적인 예로는, 문헌 [Nature, 342, 440 (1989)], 일본 특허 공개 제 5-111383 호, 문헌 [Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967 (1989)] 등에 기재된 HGF 유전자가 포함된다. 상기 유전자들이 본 발명에서 사용될 수 있다.
HGF 유전자는 적절한 벡터 내로 도입되고, HGF 유전자-포함 벡터가 사용을 위해 제공된다. 예를 들어, HGF 유전자는 이후 기재되는 HGF 유전자를 갖는 바이러스 벡터의 형태로, 또는 HGF 유전자를 갖는 적절한 발현 벡터의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "약학 조성물" 은 인간 질병의 치료 또는 예방용 약제를 나타내고, 이는 HGF 의 약리학적 활성에 기인한다. 예를 들어, 상기 기재된 질병의 치료 또는 예방용 약제가 예시화된다.
본 발명에 따르면, HGF 유전자는 세포 내로 도입되고, 세포내에서 HGF 는 발현되어 약리학적 작용을 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 약제는 HGF 자체가 유효한 질병에 효과적으로 이용될 수 있다.
HGF 유전자가, 예를 들어, 세포 내로 도입되는 경우, 이후 실시예에서 증명되는 바와 같이, 혈관 내피세포의 성장이 가속화되는 한편, 혈관 평활근의 바람직하지 않은 성장은 가속화되지 않는다. 더욱이, 이후 실시예에서 증명되는 바와 같이, HGF 유전자가 쥐를 이용한 체내 동물 시험으로 심장에 도입되는 경우, 혈관형성이 관찰된다. 그러므로, HGF 유전자는 동맥성 질병, 특히, 혈관 평활근 세포의 비정상적인 증식을 주로 포함하는 장애 (예를 들어, 경피 경내강 관상 혈관성형술 (PTCA) 후 재발협착증, 동맥경화증, 말초 순환 부전증 등) 에 의해서 유발되는 각종 질병의 치료 및 예방, 및 심근경색, 심근, 말초 혈관협착, 심부전증 등과 같은 질병의 치료 및 예방에 효과적이다. HGF 가 혈관 내피세포의 증식을 촉진하지만 혈관 평활근 세포의 성장은 촉진하지 않기 때문에, 상기 언급된 바와 같은 질병의 치료 및 예방에 HGF 그 자체로 또한 유용하다. HGF 유전자의 약리학적 효과는 HGF 그 자체의 약리학적 효과에 기인한 것이다.
이후 실시예에서 증명되는 바와 같이, HGF 유전자의 관절로 도입은 동맥 연골 세포의 치유를 촉진함으로써 프로테오글리칸-합성 세포의 증식을 촉진하게 된다. 그러므로, HGF 유전자는, 골형성 이상, 변성관절염, 변성 추간판증, 골절 치유 및 수복 부전증, 운동에 의한 외상, 열쇠 천공병 등과 같은 각종 연골 상해의 예방 및 치료에 효과적이다. HGF 는 연골 세포의 치유 및 성장을 촉진하기 때문에, 상기 기재된 질병의 치료 및 예방을 위해서 HGF 자체가 유용하다. HGF 유전자의 효과는 HGF 자체의 효과에 근거한다.
"리포솜" 은 내부의 수성 분획을 감싸고 있는 지질 이중층의 봉합 운반체이다. 지질 이중막 구조는 특히 생물학적 막과 매우 유사한 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 리포솜을 제조하기 위해서, 인지질이 이용된다. 인지질의 전형적인 예는, 레시틴, 리소레시틴 등과 같은 포스파티딜콜린; 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜산 등과 같은 산성 인지질; 또는 상기 산성 인지질의 아실기(들)를 라우로일, 미리스토일, 올레오일 등으로 치환시켜 수득된 인지질; 및 포스파티딜에탄올아민, 스핑고미엘린 등과 같은 스핑고인지질이다. 콜레스테롤과 같은 중성 지질이 또한 상기 인지질에 첨가될 수 있다. 리포솜은 정상적인 세포막에서의 지질과 같은 천연 발생 물질로 부터 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 HGF 유전자를 함유하는 리포솜은, 예를 들어, HGF 유전자를 함유하는 용액중 정제 인지질의 박층을 현탁시킨 다음 현탁액을 초음파법과 같은 통상적인 방법으로 처리함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 HGF 유전자를 함유하는 리포솜은 바이러스 등과 적절하게 융합되어 막 융합 리포솜을 형성할 수 있다. 상기 경우에 있어서, 예를 들어, 자외선 조사 등을 통해 바이러스를 불활성화시키는 것이 바람직하다. 막 융합 리포솜의 특히 바람직한 예는 센다이 바이러스 (일본 적혈구응집 바이러스: HVJ) 와 융합된 막 융합 리포솜이다. 막 융합 리포솜은 문헌 [NIKKEI Science, 1994 년 4 월, p 32-28], 문헌 [J. Biol. Chem., 266 (6), 3361-3364 (1991)] 등에 기재된 바와 같은 방법으로 생성될 수 있다. 보다 상세하게는, HVJ-융합 리포솜 (HVJ-리포솜) 이, 예를 들어, 자외선 조사 등으로 불활성화된 정제 HVJ 를 HGF 유전자 벡터를 함유하는 리포솜 현탁액과 혼합시키고, 혼합액을 부드럽게 진탕시킨 다음 수크로스 밀도 구배 원심분리에 의해서 미결합 HVJ 를 제거함으로써 제조될 수 있다. 리포솜은 표적세포에 대해 친화성을 갖는 물질에 결합되어 표적세포로의 유전자 도입의 효율성을 향상시킬 수 있다. 표적세포에 대해 친화성을 갖는 물질의 예로는 항체, 수용체 등과 같은 리간드가 포함된다.
세포로 HGF 유전자의 도입을 위해서, 통상적인 방법이 이용되는데, 이는 바이러스 벡터를 통한 도입 및 기타 방법 [NIKKEI Science, 1994 년 4 월, p 20-45; GEKKAN YAKUJI, 36 (1), 23-48 (1994) 및 상기 문헌내에서 인용된 참고문헌] 으로 대략 분류된다. 양 방법 모두 본 발명의 약제 제조를 위해 이용 가능하다.
바이러스 벡터를 이용하는 전자 방법은 HGF 유전자를, 예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 벡시니아 바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스 바이러스 또는 기타 RNA 바이러스 내로 삽입시키는 단계로 이루어진다. 상기 바이러스 중, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스가 도입을 위해 이용되는 것이 특히 바람직하다.
다른 방법의 예로는 리포솜 방법, 리포펙틴 (lipofectin) 방법, 마이크로인젝션 방법, 인산칼슘 방법, 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법이 포함된다. 상기 방법들 중, 리포솜 방법이 특히 바람직하다.
약제로서 HGF 유전자의 실제적인 용도를 위해서, HGF 를 인체에 직접 주입하는 것이 유리하다 (생체내 방법). 이와는 달리, 특정 세포를 사람으로 부터 수합하고, HGF 유전자를 이어서 생체 밖에서 세포 내로 도입하여 HGF 유전자-도입된 세포를 생체로 되돌려보낸다 (생체외 방법). 상기 방법들은 문헌 [NIKKEI Science, 1994 년 4 월, p 20-45], 문헌 [GEKKAN-YAKUJI, 36 (1), 23-48 (1994)] 및 상기 문헌내에서 인용된 참고문헌들에 기재되어 있다. 상기 방법중 어느 것이 치료될 질병, 표적 기관 등에 따라서 적절하게 선택되고 본 발명의 약제 조성물에 적용된다.
생체내 방법은 비용이 적고, 덜 수고스러우므로 생체외 방법 보다 더 편리하지만, 후자 방법은 세포로의 HGF 유전자 도입의 더 높은 효율성을 제공한다.
본 발명의 약제를 생체내 방법에 의해 투여하는 경우, 약제는 치료될 질병, 표적 기관 등에 대해 적절한 임의 경로를 통해 투여될 수 있다. 약제는 정맥내, 동맥내, 피하내, 근육내 등으로 투여되거나, 또는 질병의 목적 기관, 예를 들어, 신장, 간, 폐, 뇌, 신경 등에 직접 투여될 수 있다. 목적 부위로의 직접 투여는 표적 기관을 선택적으로 치료할 수 있다. 예를 들어, PTCA 후 재발협착증에 대해 유전자를 이용한 유전자 요법에 있어서, 조성물은 동맥내로 투여될 수 있다 [JIKKEN-IGAKU, 12 (extra issue 15), 1298-1933 (1994)]. 바람직하게는, 본 발명의 약제는 PTCA 에 사용된 기구의 끝에 피복되어 혈관에 대해 끝을 마찰시킴으로써, 약제가 혈관 내피세포 및 혈관 평활근 세포로 직접 주입될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이 생체외 방법이 HGF 유전자를 도입시키기 위해 사용되는 경우, 인간 세포 (예를 들어, 림프구 또는 조혈 간세포) 를 통상적인 방법으로 수합하여 수합된 세포를 유전자 도입을 위해 본 발명의 약제로 감작시킨다. 그후 HGF-생성 세포를 인간으로 역삽입시킨다.
약제가 생체내 방법으로 투여되는 경우, 약제는, 액제 형태를 포함하여, 각종 형태로 제조될 수 있다. 일반적으로, 약제는 바람직하게는 유효성분으로서 HGF 유전자를 함유하는 주사액으로 제조될 수 있다. 필요에 따라서, 통상적인 담체가 조성물에 첨가될 수 있다. 주사액은 통상적인 방법, 예를 들어, HGF 유전자를 적절한 용매 (예를 들어, 멸균수, 완충용액, 생리식염수 등) 중에 용해시켜, 멸균을 위해 필터 등을 통해 여과시키고, 멸균 용기내에 용액을 충진시킴으로써 제조될 수 있다. 약제는 HGF 유전자 그 자체 대신에 HGF 유전자-도입된 바이러스 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 그 안에 포매된 HGF 유전자를 함유하는 리포솜 (또는 HVJ-리포솜) 이 이용되는 경우, 약제는 현탁액, 동결 제제, 원심 농축된 동결 제제 등과 같은 리포솜 제제의 형태일 수 있다.
약제내 HGF 유전자 함량은 치료될 질병, 표적 기관, 환자의 연령 또는 체중 등에 따라서 적절하게 다양할 수 있다. 그러나, HGF 유전자로서 계산되는 경우 0.0001 mg ∼ 100 mg, 바람직하게는 0.001 mg ∼ 10 mg 의 투여량으로 투여되는 것이 적절하다. 투여량은 수일 또는 수개월로 분량될 수 있다.
이후, 본 발명은 실시예를 참고로 하여 보다 상세하게 기재될 것이지만 이에 국한되지는 않는다. 하기 실시예에서 사용되는 물질 및 방법들을 하기에 개괄한다.
물질 및 방법
(1) HGF 발현 벡터
HGF 발현 벡터는 인간 HGF cDNA [2.2 kb, Biochem. Biophys. Res. Commun., 172, 321-327 (1990); 일본 특허 공개 제 5-111383 호] 를 pUC-SRα 발현 벡터 [FEBS, 333, 61-66 (1993)] 의 EcoRI 및 NotI 위치 사이에 삽입시킴으로써 제조되었다. 상기 플라스미드 벡터에 있어서, HGF cDNA 의 전사는 SRa 프로모터에 의해서 조절된다 [Nature, 342, 440-443 (1989)].
(2) 세포 배양
쥐 관상 내피세포를 생후 8 주된 스프라그-다우리 (SD) 쥐의 효소 절단된 심장으로 부터 밀도구배 원심분리법에 의해서 단리시킨다 [Transplantation, 57, 1653-1660 (1994)]. 쥐 대동맥 혈관 평활근 세포 (VSMCs) 를 생후 12 주 SD 쥐로 부터 효소 처리법에 의해 수득한다 [J. Clin. Invest., 93, 355-360 (1994)]. 상기 세포를 10 % (vol/vol) 소 태아 혈청, 페니실린 (100 U/ml) 및 스트렙토마이신 (100 μg/ml) 이 공급된 DMEM 배지중에서 유지시킨다. 세포를 37 ℃ 인 가습된 95 % 공기- 5 % CO2 대기하에서 배양시킨다. 배양 배지를 2 일-간격으로 일상 교환한다. 면역병리학적 및 형태학적 관찰은 상기 세포들이 각각 내피세포 및 평활근 세포인 것을 밝혀준다.
인간 대동맥 내피세포 (5 경로) 및 인간 VSMCs (5 경로) 를 구라보사 (Kurabo Co.) 로 부터 수득한다. 내피세포를 5 % 소 태아 혈청, 표피 성장 인자 (10 ng/ml), 기본 섬유아세포 성장 인자 (2 ng/ml) 및 덱사메타손 (1 μM) 이 공급된 MCDB131 배지내에서 상기 방법과 유사한 방법으로 배양시킨다.
정지 상태인 내피세포를 문헌 [J. Clin. Invest., 86, 1690-1697 (1990), ibid., 94, 824-829 (1994)] 에 기재된 방법에 따라서 제조한다.
(3) HVJ-리포솜 내로 HGF 유전자의 생체외 감염
내피세포 또는 VSMCs 를 세포수가 106 인 6-웰 플레이트상에서 감작을 위해 접종하여 증식시켜 80 % 군집에 도달시킨다. 세포를 2 mM 염화칼슘이 공급된 균형염류용액 (137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 10 mM 트리스-HCl, pH 7.6; 이후, "BSS" 로 약칭) 으로 3 회 세척한다. 이후 실시예 1 에서 수득되는 HVJ-리포솜-DNA (2.5 mg 의 지질 및 10 mg 의 포매된 DNA 함유) 용액 1 ml, 또는 이후 비교예 1 에서 수득되는 HVJ-리포솜-cont 의 용액 1 ml 을 세포에 첨가한다. 생성된 혼합물을 4 ℃ 에서 5 분간 배양하고 37 ℃ 에서 30 분간 더 배양한다. 세포를 세척하여 CO2 배양기내 10 % 소 혈청을 함유하는 신선한 배지중에서 유지시킨다.
(4) 내피세포 및 VSMCs 에서 HGF 농도 검정
감작된 내피세포 및 VSMCs 로 부터 생성되는 HGF 의 농도를 ELISA 로 검정한다. 즉, 쥐 또는 인간 내피세포 또는 VSMCs 를 세포 밀도 5 × 104 세포/cm2 인 6-웰 플레이트 (Corning 제) 상에 접종한 다음, 24 시간 동안 배양시킨다. 배지를 감작 24 시간 후 보충하고, 48 시간 더 배양시킨다. HGF 가 방출되었는지를 알아보기 위해서, 감작된 세포 (감작 48 시간 후) 를 세척하고 5 × 10-7 M 인슐린, 5 μg/ml 트랜스페린 및 0.2 mM 아스코베이트를 함유하는 무혈청 배지 1 ml 에 첨가한다. 24 시간 후, 배양 배지를 수합하여, 600 g 에서 10 분간 원심분리시킨 다음 -20 ℃ 에서 보관한다.
배지중 HGF 농도를 항-쥐 HGF 항체 또는 항-인간 HGF 항체를 이용한 효소 면역검정에 의해 측정한다 [Exp. Cell Res., 210, 326-335 (1994); Jpn. J. Cancer Res., 83, 1262-1266 (1992)]. 토끼 항-쥐 또는 항-인간 HGF IgG 를 4 ℃ 에서 15 시간 동안 96-웰 플레이트 (Corning 제) 상에 피복시킨다. 3 % 소 혈청 알부민-함유 PBS (인산염 완충 식염수) 로 차단시킨 후, 배양 배지를 각 웰에 첨가하고, 25 ℃ 에서 2 시간 동안 배양을 수행한다. 각 웰을 0.025 % 트윈을 함유하는 PBS (PBS-트윈) 으로 3 회 세척한 후, 비오틴화 토끼 항-쥐 HGF IgG 또는 항-인간 HGF IgG 를 각 웰에 첨가한 다음 25 ℃ 에서 2 시간 동안 배양시킨다. PBS-트윈으로 세척한 후, 각 웰을 호스 래디쉬 퍼옥시다제-결합된 스트렙토아비딘-비오틴 복합체 (PBS-트윈 용액) 와 함께 배양시킨다. 거기에 기질 용액 (2.5 mM o-페닐렌디아민, 100 mM 인산나트륨, 50 mM 시트르산염 및 0.015 % 과산화수소 함유) 을 첨가하여 효소 반응을 개시한다.
시스템에 1 M 황산을 첨가함으로써 반응을 종료시킨다. 490 nm 에서 흡광도를 측정한다. 항-인간 HGF 항체는 인간 HGF 와만 교차-반응하며 쥐 HGF 에는 반응하지 않는다. 항-쥐 HGF 항체는 쥐 HGF 와만 교차-반응하고 인간 HGF 에는 반응하지 않는다.
(5) HGF
이용된 인간 및 쥐 재조합 HGFs 를 인간 또는 쥐 HGF cDNA 를 포함하는 발현 플라스미드로 감염시킨 CHO 세포 또는 C-127 세포의 배양액으로 부터 정제한다 [Cell, 77, 261-271 (1994); J. Clin. Invest., 93, 355-360 (1994)].
(6) 통계 분석
모든 실험을 3 회 이상 반복한다. 측정된 데이타를 평균 ± 표준오차로 나타낸다. 측정된 데이타의 통계 분석은 던칸 테스트 (Duncan's test) 에 따라서 행하여진다.
(7) 헤마톡실린-에소신 (HE) 염색 및 아잔 염색
유전자 도입 10 일 후, HGF 유전자-도입된 쥐를 헤파린화 생리식염수를 관류시켜 희생시킨다. 이어서, 4 % 파라포름알데히드 PBS 용액으로 하룻밤 동안 고정시킨다. 고정 후, 조직을 파라핀중에 포매시킨다. 슬라이드를 제조하고 통상적인 방법으로 HE 및 아잔으로 염색한다. 슬라이드를 현미경으로 조사하여 모세혈관의 수를 측정한다.
실시예 1
HGF 발현벡터를 함유하는 HVJ-리포솜의 제조
포스파티딜세린, 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤을 1 : 4.8 : 2 의 중량비로 테트라히드로푸란과 혼합시킨다. 회전식 증발기를 통해 테트라히드로푸란을 증류 제거함으로써, 지질 혼합물 (10 mg) 을 용기벽상에 침전시킨다. 소 흉선으로 부터 정제된 고이동기 (high mobility group) (HMG) 1 핵단백질 96 μg 을 플라스미드 DNA (300 μg) 의 BBS (200 μl) 용액과 20 ℃ 에서 1 시간 동안 혼합시키고, 혼합물을 상기 수득된 지질 혼합물에 첨가한다. 생성된 리포솜-DNA-HMG 1 착물 현탁액을 볼텍스 (vortex) 를 사용하여 혼합시키고, 3 초간 초음파처리한 다음 30 분간 진탕시킨다.
정제된 HVJ (균주 Z) 를 사용 직전에 3 분간 UV 조사 (110 erg/mm2 sec) 하여 불활성화시킨다. BSS 를 첨가하고 상기 수득된 리포솜 현탁액 (0.5 ml, 10 mg 의 지질 함유) 및 HVJ (20,000 적혈구 응집 단위체) 와 혼합하여 전체 부피를 4 ml 로 만든다. 혼합물을 4 ℃ 에서 10 분간 배양시키고 37 ℃ 에서 30 분간 더 부드럽게 진탕시킨다. 미반응된 HVJ 를 수크로스 밀도구배 원심분리에 의해서 HVJ-리포솜으로 부터 제거한다. 즉, 수크로스 밀도구배중 상층을 수합하여 HGF 발현벡터를 함유하는 (10 μg/ml 의 HGF 발현벡터 함유) HVJ-리포솜을 얻는다. HGF 발현벡터를 함유하는 HVJ-리포솜을 이후 HVJ-리포솜-DNA 로 칭한다.
실시예 2
HGF 발현벡터를 함유하는 HVJ-리포솜을 쥐에 투여
HGF 발현벡터를 함유하는 HVJ-리포솜은, 64 μg 의 HMG 1 핵단백질 및 200 μg 의 플라스미드 DNA 를 이용하여, 상기 실시예에 기재된 바와 같은 방법으로 제조된다. BSS 를 첨가하고 리포솜 현탁액 (0.5 ml, 10 mg 의 지질 함유) 및 HVJ (35,000 적혈구 응집 단위체) 와 혼합하여 전체 부피를 2 ml 로 만든다.
SD 쥐 (체중 400 - 500 g; Japan Charles River 판매) 를, 소듐 펜토바비탈 (0.1 ml/100 mg) 을 복강내 투여하여 마취시키고, 항온시키면서 자동 호흡기로 호흡시킨다. 쥐의 왼쪽면에 흉강삽관술을 수행한다. HVJ-리포솜-DNA 또는 HVJ-리포솜-cont (20 μl) 을 30 G 주사기를 이용하여 심장 위쪽을 통해 조심스레 직접 주사한다.
비교예 1
HGF 발현벡터를 함유하지 않는 HVJ-리포솜의 제조
HGF 유전자를 포함하지 않는 벡터를 실시예 1 에 기재된 바와 동일한 방법으로 처리하여 HGF 발현벡터를 함유하지 않는 HVJ-리포솜을 제조한다. HGF 발현벡터를 함유하지 않는 HVJ-리포솜이후 HVJ-리포솜-cont 로 칭한다.
비교예 2
인간 TGF-β 발현벡터를 함유하는 HVJ-리포솜의 제조
인간 TGF-β 발현벡터를 함유하는 HVJ-리포솜을 인간 TGF-β 발현벡터를 이용하는 것을 제외하고 실시예 1 과 유사한 방법으로 제조한다.
인간 TGF-β 발현벡터를 함유하는 HVJ-리포솜을 이후 HVJ-리포솜-DNA (TGF-β) 로 칭한다.
시험예 1
HVJ-리포솜-DNA 로 감작된 쥐 관상 내피세포에서의 HGF 의 발현
HVJ-리포솜-DNA (리포솜중 HGF 발현벡터의 농도: 10 μg/ml) 로 쥐 관상 내피세포 (세포수: 106) 를 감작시킨다. HGF 생성을 ELISA 로 측정한다. 대조군으로서, HVJ-리포솜-cont 를 이용하여 유사한 시험을 수행한다. HGF 생성은 또한 비감작된 쥐 관상 내피세포 (비처리군) 상에서 측정된다. 결과를 도 1 (n = 6) 에 나타내고, "HGF" 는 HVJ-리포솜-DNA 로 감작된 쥐 관상 내피세포군을 나타낸다.
도 1 에 나타낸 바와 같이, HVJ-리포솜-DNA 로 감작된 쥐 관상 내피세포는 높은 수준으로 HGF 를 생성 분비한다. 반면, HGF 생성은 자연상태의 군 또는 HVJ-리포솜-cont 로 감작된 쥐 관상 내피세포의 군 중 어느 것에서도 실질적으로 관찰되지 않는다.
시험되는 군에서 세포수는 HGF 발현군이 상당히 높은 세포수를 나타낸다는 것을 보여준다.
시험예 2
내피세포의 증식에 대한 감작된 HGF 발현벡터의 효과
인간 내피세포를 HVJ-리포솜-cont 로 감작시킨다. 감작된 세포를 첨가된 외인성 재조합 인간 HGF (1, 10 및 100 ng/ml) 의 부재 또는 존재하에서 배양시키고 세포 성장률 (%) 을 측정한다. 결과를 도 2 에 나타내고 ((선) 그래프, n = 6), "DSF" 는 HVJ-리포솜-cont 으로 감작된 내피세포의 군을 나타내고 "HGF" 는 일정 농도에서 재조합 인간 HGF 의 존재하에서 배양된 군을 나타낸다 (DSF 에 대해, *: P < 0.05, **: P < 0.01).
도 2 에 나타낸 (선) 그래프는 내피세포의 성장이 외부 첨가된 HGF 에 의해 촉진된다는 것을 나타낸다.
HVJ-리포솜-DNA (농도: 10 μg/ml) 으로 감작된 내피세포를 유사하게 배양하고, 증가된 세포를 세어 세포 성장률 (%) 을 측정한다. 대조군으로서, HVJ-리포솜-cont 으로 감작된 내피세포를 또한 배양하고, 증가된 세포를 세어 세포 성장률 (%) 을 측정한다. 결과를 도 2 에 나타내고 (바, n = 6), "DSF" 는 HVJ-리포솜-cont 로 감작된 내피세포군을 나타내고, "HGF" 는 HVJ-리포솜-DNA 으로 감작된 내피세포군을 나타낸다 (DSF 에 대해 **: P < 0.01, HGF 에 대해 #: P < 0.05, 100 ng/ml).
도 2 에 나타낸 바로 부터 알 수 있듯이, 결과는 HVJ-리포솜-DNA-감작된 내피세포의 성장률이 대조군의 성장률 보다 상당히 더 높고, 외부 첨가된 HGF 의 성장률과 비교할 때 조차도 훨씬 높다는 것을 나타낸다.
상기 언급된 HVJ-리포솜-DNA 으로 감작된 내피세포를 토끼 항-인간 HGF 항체의 존재 또는 부재하에서 배양한다. 증가된 세포를 세어 세포 성장률을 측정한다. 대조군으로서, HVJ-리포솜-cont 으로 감작된 내피세포를 배양하고, 증가된 세포를 유사한 방법으로 세어 세포 성장률을 측정한다. 토끼 항-인간 HGF 항체 (10 μg/ml) 을 문헌 [Jpn. J. Cancer Res., 83, 1262-1266 (1992)] 에 기재된 방법에 의해 정제한다. 상기 항체는 10 μg/ml 의 농도에서 10 ng/ml 의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다. 항-인간 HGF 항체는 인간 HGF 와만 교차-반응하고 쥐 HGF 와는 반응하지 않는 반면, 항-쥐 HGF 항체는 쥐 HGF 와만 교차-반응하고 인간 HGF 와는 반응하지 않는다. 보통 토끼 혈청 IgG (10 μg/ml) 가 대조군으로써 사용된다.
결과를 도 3 (n = 6) 에 나타내고, 이중 "대조군" 은 IgG 콘트롤의 존재하에서 배양된 HVJ-리포솜-cont-감작된 내피세포의 군을 나타내고; "HGF" 는 IgG 콘트롤의 존재하에서 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 내피세포의 군을 나타내고; "HGFab" 는 토끼 항-인간 HGF 항체의 존재하에서 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 내피세포의 군을 나타낸다. 세포 성장률 (%) 은 대조군의 성장률을 100 으로 하는 경우 상대적인 % 로 표현된다 (대조군에 대해서 *: P < 0.01, HGF 에 대해서 #: P < 0.05). 도 3 에 나타낸 바와 같이, HVJ-리포솜-DNA-감작된 내피세포의 성장은 항-인간 HGF 항체의 존재하에서 지체되므로, 세포 성장률은 실질적으로 대조군의 성장률과 동일하다. 상기 결과는 HGF 가 내피세포의 성장 인자라는 것을 명백하게 증명한다.
시험예 3
배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 상층액의 쥐 관상 내피세포에 대한 영향
배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 상층액을 정지상인 쥐 관상 내피세포 배양 시스템 (세포수 : 105) 에 첨가한다. 3 일간 배양을 수행한 후, 증가된 내피세포의 수를 측정한다. 대조군으로서, 배양된 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 VSMCs 의 상층액을 상기 기재된 바와 유사한 방법으로 처리하고, 증가된 내피세포를 상기 기재된 바와 같이 센다. 결과를 도 4 (n = 6) 에 나타내고, 이중, "대조군" 은 배양된 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 상층액이 첨가된 군을 나타내고, "HGF" 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 의 상층액이 첨가된 군을 나타낸다.
도 4 에 나타낸 바와 같이, 내피세포수의 상당한 증가는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 의 상층액이 첨가된 군에서 나타난다.
상기 기재된 바와 같이 HVJ-리포솜-DNA 또는 HVJ-리포솜-cont 로 감작된 쥐 VSMCs 의 배양 상층액중 HGF 의 농도를 항-인간 HGF 항체 및 항-쥐 HGF 항체를 이용하는 ELISA 로 검정한다. 비감작된 VSMCs 의 배양 상층액중 HGF 농도를 또한 검정한다 (비처리군).
항-인간 HGF 항체 및 항-쥐 HGF 항체를 이용하여 수득된 결과를 도 5 및 도 6 (양 시험에서 n = 6) 에 각각 나타낸다. 도면에서, "대조군" 은 배양된 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 VSMCs 로부터의 상층액군을 나타내고; "HGF" 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 로 부터의 상층액의 군을 나타낸다.
도 5 에 나타낸 바와 같이, HGF 는 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 의 상층액에서 검출되고, HGF 농도는 대조군 보다 상당히 더 높다.
도 6 은 또한 쥐 HGF 가 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 의 상층액에서 또한 검출되고, HGF 농도는 대조군 보다 상당히 더 높다.
도 5 및 도 6 에서 관찰되는 바와 같이, 자연본래의 군 및 대조군의 상층액 모두에서, HGF 는 ELISA 에 의해 검출가능한 양으로 존재하지 않는다.
시험예 4
배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포 상층액의 쥐 관상 내피세포에 대한 영향
배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포의 상층액을 정지상인 쥐 관상 내피세포 배양 시스템 (세포수 : 105) 에 첨가한다. 3 일간 배양한 후, 증가된 내피세포의 수를 측정한다. 대조군으로서, 내피세포를, HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 관상 내피세포의 배양 상층액을 이용하여, 유사한 방법으로 배양하고, 증가된 내피세포를 센다. 결과를 도 7 에 나타내고, 이중, A, B 및 C 는 각각 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포로의 배양 상층액이 첨가된 군 (n = 8), HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 관상 내피세포의 배양 상층액이 첨가된 군 (n = 8), 및 비처리군 (n = 15) 을 나타낸다.
도 7 에 나타낸 바와 같이, 내피세포수의 상당한 증가는 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포로의 배양 상층액이 첨가된 군에서 나타나는 반면, 대조군에서, 세포수는 거의 비처리군과 동일하다 (대조군: 0.117 ± 0.002, A 군 : 0.148 ± 0.03, P < 0.01).
다음으로, 항-HGF 항체가 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포의 배양 상층액에 첨가된다. 증가된 내피세포의 수를 상기 기재된 바와 같이 조사한다. 결과를 도 8 (n = 8) 에 나타내고, 이중 A 는 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포의 배양 상층액이 첨가된 군을 나타내고; B 는 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 관상 내피세포의 배양 상층액이 첨가된 군을 나타내고; C 는 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포의 배양 상층액에 항-HGF 항체를 첨가한 군을 나타내고; D 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포로 부터의 상층액에 대조 항체를 첨가한 군을 나타낸다.
도 8, A 및 C 에 나타낸 바와 같이, HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포의 배양 상층액의 세포 성장 촉진 활성은 항-HGF 항체의 첨가로 인해 완전히 사라진다. 결과는 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 관상 내피세포의 배양 상층액의 세포 성장 촉진 활성이 HGF 에 의해 기인된 것임을 밝혀주고 있다.
시험예 5
HVJ-리포솜-DNA-감작된 인간 VSMCs 의 인간 내피세포에 대한 영향
인간 VSMCs 를 세포 배양 삽입물 (Coaster 사제, 구멍 직경 0.45 μm) 상에 접종한 다음, 이를 10 % 소 혈청이 공급된 DMEM 배지에서 성장시킨다. 반면, 인간 내피세포를 6-웰 플레이트상에 접종하고 10 % 소 혈청이 공급된 DMEM 배지중에서 유지시킨다. VSMCs 가 증식하여 80 % 군집에 도달했을때, VSMCs 를 4 ℃ 에서 5 분간 배양시키고, HVJ-리포솜-DNA (리포솜중 DNA 함량 : 10 μg) 또는 HVJ-리포솜-cont 와 함께 37 ℃ 에서 30 분간 배양시킨다. 감작후, 감작된 VSMCs 를 함유하는 삽입물을 정지 상태인 인간 내피세포를 함유하는 각 웰에 첨가한다. VSMCs 및 내피세포를 0.5 % 소 혈청이 공급된 DMEM 배지중에서 3 일간 공동 배양시킨다. 이후, WST-세포 카운터 키트 (Wako Co. 제) 로 세포수를 측정한다. 결과를 도 9 (n = 6) 에 나타낸다. 도면에서, "대조군" 은 HVJ-리포솜-cont-감작된 VSMCs 와 공동 배양된 군을 나타내고, 및 "HGF" 는 배양된 HVJ-리포솜-DNA-감작된 VSMCs 로 부터의 상층액의 군을 나타낸다.
도 9 에 나타낸 결과는 HVJ-리포솜-DNA 으로 감작된 인간 VSMCs 가 정지상인 비감작된 인간 내피세포의 성장을 상당히 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다.
시험예 6
HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 의 쥐 관상 내피세포에 대한 영향
HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs (세포수 : 106) 를 정지상인 쥐 관상 내피세포 (세포수: 105)와 함께 정지상에서 3 일간 공동 배양시킨다. 그후, 증가된 내피세포의 수를 조사한다. 대조군으로서, 내피세포를 HVJ-리포솜-cont-감작된 쥐 VSMCs 를 이용하여 유사한 방법으로 공동 배양시키고, 증가된 내피세포를 측정한다. 결과를 도 10 (n = 6) 에 나타내고, 이중 "대조군" 은 HVJ-리포솜-DNA 로 감작된 쥐 VSMCs 군을 나타내고, 및 "HGF" 는 HVJ-리포솜-cont 으로 감작된 쥐 VSMCs 군을 나타낸다.
도 10 에 나타낸 바와 같이, 내피세포의 성장은 HVJ-리포솜-DNA-감작된 쥐 VSMCs 로 부터 방출되는 HGF 에 의해 자극되며, 증가된 세포수가 관찰된다 (대조군: 0.126 ± 0.006, HGF 군: 0.156 ± 0.01, P < 0.05).
시험예 7
HVJ-리포솜-DNA 로 감작된 쥐 VSMCs 의 성장
HVJ-리포솜-DNA 로 감작된 쥐 VSMCs 및 HVJ-리포솜-cont 로 감작된 쥐 VSMCs 를 각각 배양하여 증가된 세포수를 비교한다. HVJ-리포솜-DNA 를 사용한 감작은 세포 성장에 전혀 영향을 주지 않는다. 결과는 HGF 가 VSMCs 에 대해 세포 성장 촉진 효과을 갖지 않는다는 것을 나타낸다.
시험예 8
HVJ-리포솜-DNA 를 직접 주사한 쥐 심장 근육에서 혈관형성의 유도
HVJ-리포솜-DNA 를 직접 주사한 쥐 심장 근육, HVJ-리포솜-cont 를 직접 주사한 쥐 심장 근육 및 쥐의 비처리 심장 근육을 각각 HE 및 아잔으로 염색하고, 현미경으로 조사하여 미세혈관의 수를 측정한다. 결과를 도 11 에 나타내고, 이중 "HGF" 는 HVJ-리포솜-DNA 를 직접 주사한 쥐 심장 근육에서의 미세혈관의 수를 나타내고, "대조군" 은 HVJ-리포솜-cont 를 직접 주사한 쥐 심장 근육에서의 미세혈관의 수를 나타낸다.
도 11 로 부터 알 수 있는 바와 같이, 미세한 혈관의 수는, HVJ-리포솜-cont 를 직접 주사한 쥐 심장 근육 및 쥐의 비처리 심장 근육과 비교하여, HVJ-리포솜-DNA 를 직접 주사한 쥐 심장 근육에서 상당히 증가한다. 상기 결과는 내피세포 성장 활성을 갖는 HGF 가 생체내 혈관형성 활성을 나타낸다는 것을 밝혀준다.
시험예 9
관절에 HVJ-리포솜-DNA 를 직접 주입함으로써 관절연골의 치유
생후 10 주된 피셔 쥐를 직경 1.8 mm 의 키르쉬너 와이어를 이용하여 연골하를 통해 대퇴 관절사이를 상해한다. 수술 1 주일 후, 실시예 1 에서 제조된 HVJ-리포솜-DNA (100 μl/무릎) 을 관절에 직접 주입시킨다. 대조군으로서, 비교예 1 에서 제조된 HVJ-리포솜-cont 및 비교예 2 에서 제조된 HVJ-리포솜-DNA (TGF-β) 를 관절에 동량으로 직접 투여한다. 상기 유전자 등을 주입한 지 1, 3 및 4 주 후에 쥐를 희생시켜 치유된 부위를 조직학적으로 관찰한다.
도 12 에 나타낸 바와 같이, 결과는, 연골-유사 세포의 발달을 나타내면서, 톨루이딘 블루로 염색된 프로테오글리칸의 합성이 HVJ-리포솜-DNA 를 관절에 투여한 지 3 주후에 관찰되는 것을 보여준다. 또한, 도 13 에 나타낸 바와 같이, HVJ-리포솜-DNA 를 관절에 투여한 지 4 주후, 연골-유사 세포가 발달된 부위가 더욱 확장되는 경향이 관찰되고, 여기에서 프로테오글리칸의 합성이 확인되었다.
도 14 에 나타낸 바와 같이, 비교예 2 에서 제조된 HVJ-리포솜-DNA (TGF-β) 를 관절에 주사한 경우, 상기 연골-유사 세포의 발달은 투여 4 주후에도 관찰되지 않는다. 더욱이, 도 15 에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 에서 제조된 HVJ-리포솜-cont 를 관절에 주사하는 경우, 상기 연골-유사 세포의 발달은 투여한 지 4 주후에도 관찰되지 않았다.
본 발명의 약제는, HGF 그 자체와 비교하여, 지속적인 치료 효과를 제공한다. 더구나, 본 발명의 약제는 효과가 선택적으로 나타날 수 있도록 표적 기관에 국소적으로 적용시키므로써, HGF 의 부작용을 최소화시킬 수 있다.

Claims (6)

  1. HGF 유전자를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 하는 근육내 투여용 의약으로서, 동맥질환을 치료하기 위한 의약.
  2. 제 1 항에 있어서, 발현벡터가 HGF 유전자를 포함하는 바이러스 발현벡터 및 HGF 유전자를 포함하는 비바이러스 발현벡터로부터 선택되는 의약.
  3. 제 2 항에 있어서, 비바이러스 발현벡터는 리포솜에 포매(embedding)되어 있고, 또한 상기 리포솜의 막은 불활성화된 센다이 바이러스에 융합될 수도 있는 의약.
  4. HGF 유전자를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 하는 근육내 투여용 의약으로서, 표적조직에서 혈관 평활근 세포를 증식시키지 않고 혈관내피세포를 증식시키기 위한 것으로서, 혈관확장술(PTCA)후의 재협착, 동맥경화증, 말초순환부전, 심근경색, 심근증, 말초성 혈관폐색증 또는 심부전을 치료하기 위한 의약.
  5. 제 4 항에 있어서 발현벡터가 리포솜에 포매된 비바이러스 발현벡터이고, 또한 상기 리포솜의 막은 불활성화된 센다이 바이러스에 융합될 수도 있는 의약.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 동맥질환이 혈관확장술(PTCA)후의 재협착, 동맥경화증, 말초순환부전, 심근경색, 심근증, 말초성 혈관폐색증 또는 심부전인 의약.
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Appeal identifier: 2004101004491

J2X1 Appeal (before the patent court)

Free format text: APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

Free format text: TRIAL NUMBER: 2006201000282; APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL

PJ2001 Appeal

Patent event date: 20051201

Comment text: Trial Decision on Objection to Decision on Refusal

Patent event code: PJ20011S01I

Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

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Appeal identifier: 2006201000282

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J302 Written judgement (patent court)

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Appeal identifier: 2006201000282

Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

PJ2201 Remand (intellectual property tribunal)

Patent event code: PJ22012S01I

Comment text: Written Judgment (Patent Court)

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Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

Appeal identifier: 2006131000055

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J301 Trial decision

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PJ1301 Trial decision

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Patent event date: 20070302

Comment text: Trial Decision on Final Judgment on Revocation

Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

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Appeal identifier: 2006131000055

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Patent event code: PS07011S01I

Comment text: Notice of Trial Decision (Remand of Revocation)

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