KR100721927B1

KR100721927B1 - 암조직에서 암세포를 분리하는 방법

Info

Publication number: KR100721927B1
Application number: KR1020060106722A
Authority: KR
Inventors: 최성호
Original assignee: 이수앱지스 주식회사
Priority date: 2006-10-31
Filing date: 2006-10-31
Publication date: 2007-05-28
Anticipated expiration: 2026-10-31

Abstract

본 발명은 암조직에서 암세포를 분리하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 분리된 암조직을 알코올로 전처리하고 항생제를 포함하는 세척액으로 세척하는 단계; 세정한 암조직을 항생제를 포함하는 효소혼합액에 부유시켜 암세포를 분리하는 단계; 및 세포부유액에서 비암세포를 제거하는 단계를 포함하는 암세포 분리방법에 관한 것이다.

암세포 분리법, 고형암

Description

암조직에서 암세포를 분리하는 방법{A Method of separating tumor cells from cancer tissue}

도 1 은 고형암 조직의 분리 직후 세포 부유액의 트리판 블루 염색양상을 나타내는 것으로, 도 1b는 도 1a의 점선으로 표시한 원 안의 양상을 확대한 도면으로서, 여기서 L은 살아있는 세포(living cell)를 나타내며 염색되지 않았고, D는 죽은 세포(dead cell)를 나타내는 것으로 염색되어 푸른색을 띠었으며, R은 적혈구를 나타내며 염색되지 않고, 매우 굴절되었다(highly refractive).

도 2 는 고형암 조직의 분리 직후 HE 염색(Haematoxylin & Eosin Staining) 결과를 보인다.

도 3 은 고형암 조직에 대한 피콜 밀도 구배 원심분리(Ficol Gradient Centrifuge) 결과로 고형암 조직에 존재하는 암세포 및 비암세포의 분포를 보인다.

도 4 는 고형암 조직에 대한 면역자기분리(immunomagnetic separation) 결과로 고형암 조직에서 비암세포를 제거한 결과를 보인다.

도 5 는 한국인 호발 5대 암종(위암, 폐암, 간암, 대장암, 유방암)에 대한 암종별 암세포 분리효율을 나타내는 것으로 도 5a 는 암세포 수득율을 나타내고, 도 5b는 수득된 암세포의 생존율을 나타낸다.

도 6 은 일반 고형암에 비하여 배양성공률이 저조한 대장암 조직이 본 발명에 따른 처리과정 후 배양 성공률이 증대된 결과를 보인다. ‘평균’은 대장암외 다른 고형암의 배양성공률, ‘대장암(처리전)’은 항생제를 포함하는 세척액만 사용했을 때 배양성공률, ‘대장암(처리후)’은 에탄올 전처리, 세척액, 메트로니다졸을 모두 사용하였을 때 배양성공률을 의미한다.

우리나라에서는 매년 약 9만 9천명의 새로운 암환자가 발생하고 있다(2002년 한국 중앙암등록사업). 최근 10년간 암등록 추이를 볼 때 연평균 암 발생빈도가 매년 약 5.6%씩 증가한다는 점과 2001년을 기준으로 인구 십만명당 암사망율이 일본은 238.8명, 미국은 200.5명인데 비해 한국은 123.5명에 불과하다는 점 등으로 미루어 볼 때 국내의 암 환자 발생은 앞으로도 지속적으로 증가할 것으로 추측된다.

최근 생명과학 기술이 발달함에 따라 인체암 조직 및 이로부터 분리된 암 세포를 환자의 진단, 치료, 예후판정 또는 기초적인 암 연구에 활용하려는 시도가 활발해 지고 있다. 그러나, 암조직 내에는 여러 가지 다양한 세포가 혼입되어 있어 순수한 암세포만을 분리하기 어려울뿐만 아니라 다양한 고형암 조직으로부터 충분한 양의 살아있는 암세포를 분리하는 것이 기술적인 장애가 될 수 있다. 미국의 연구진은 살아 있는 암조직에서 암세포를 하나씩 분리할 수 있는 레이저미세분리법을 쓰고 있지만 현재까지 우리나라에는 이런 기술이 없어 암세포를 실험실에서 배양, 연구하는 방법을 쓰고 있다.

고형암 조직으로부터 살아있는 암세포를 분리하는 경우, 후속 연구로 암세포의 세포주 형성, 약제감수성(chemosensitivity) 검사, 암백신 개발 등에 세포 배양 과정이 필요할 경우가 있다. 따라서 효율적인 암세포 분리 및 이후 세포배양에의 이용 등을 위해서는 인체 조직에 존재하는 상재균에 의한 미생물 오염을 억제하고, 생존한 세포를 충분히 분리하여야 하며, 혼입된 정상세포를 제거하여야 하는 등의 과정이 필요하다.

이에 본 발명자들은 한국인의 5대 암종인 위암, 폐암, 간암, 대장/직장암, 및 유방암 조직 등으로부터 혼입된 정상세포를 제거하고 시료 내 암세포의 비율을 늘릴 수 있는 방법을 고안하였으며 미생물의 오염을 예방하기 어려운 대장, 직장암 세포의 배양효율 높이기 위한 전처리과정 및 유효 항생제 사용에 대한 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 암세포의 미생물 오염을 줄이고, 고형암 조직에서 비암세포를 효율적으로 제거하여 암세포 분리 효율이 높은 암세포 분리방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서,

(a) 분리된 고형암 조직을 알코올로 전처리하고 항생제를 포함하는 세척액으로 세정하는 단계; (b) 세정한 암조직을 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 및 엠포테리신B를 포함하는 효소혼합액에 부유시켜 암세포를 분리하는 단계; 및 (c) 상기 세포부유액에서 비암세포를 제거하는 단계를 포함하는 고형암 암세포의 분리방법을 제공한다. 더욱 바람직한 양태에서, 상기 방법은 단계(b)의 효소혼합액에 매트로니다졸을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 고형암 암세포의 분리방법을 제공한다.

본 발명에서 “고형암(Solid cancer)”이라 함은 유방 또는 전립선 등의 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하는 것으로, 액체인 혈액에 영향을 끼치는 백혈병(leukemia)과 반대되는 개념이다. 따라서, 본 발명의 고형암에는 위암, 폐암, 간암, 대장암, 직장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 난소암, 방광암, 신장암, 흑색종, 소세포 및 비소세포폐암, 육종, 신경아교종 또는 T-세포 림프종 및 B-세포 림프종 등이 포함되나 이에 제한되지는 아니한다.

상기한 본 발명의 방법에서 분리된 고형암 조직을 ‘알코올로 전처리’하는 단계는 바람직하게 70% 에탄올에 암조직을 침지시켜 조직표면을 소독하는 것을 포함한다. 종래의 암세포 분리법은, 분리된 암조직을 항생제를 포함하는 세척액(washing buffer)로 세정하기 전에 알코올 등에 의해 전처리하는 과정을 포함하지 않았다. 이후 실시예에서 입증하는 바와 같이, 본 발명의 방법에서와 같이 항생제 포함 세척액으로 세정하기 전에 알코올로 전처리하는 과정을 포함함으로써, 분 리된 암세포의 배양과정에서 오염을 방지하여 암세포의 정제율 및 수득율을 높이는 현저한 효과가 있었다.

상기 항생제를 포함하는 ‘세척액’은 종래 암세포분리시에 일반적으로 사용되는 세척액일 수 있으나, 바람직하게는 이후 설명하는 본 발명에 따른 효소혼합액에 포함되는 것과 같은 종류의 항생제인 엠포테리신B, 페니실린, 스트렙토마이신 및 겐타마이신과 같은 항생제를 포함하고, 여기에 우태아 혈청(FBS)을 더 포함하는 용액일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 엠포테리신 B가 포함된 항생제 용액(HBSS, Hank's balance salt solution, Hyclone 사)에 100U/ml 페니실린(penicillin), 100㎍/ml 스트렙토마이신(Streptomycin), 100 ug/ml 겐타마이신(gentamicin), 2.5㎍/ml 엠포테리신 B 및 10% FBS 가 포함된 용액을 단계(a)에서의 세척액으로 사용하였다.

본 발명에서 “효소혼합액”이라 함은 암에 걸린 인체에서 분리한 고형암 조직에서 암세포와 비암세포를 분리할 수 있는 효소와 그 밖의 분리 효율을 높일 수 있는 물질을 포함하고 있는 용액을 말한다. 바람직하게 상기 효소 혼합액에서 암세포와 비암세포를 분리할 수 있는 효소로는 콜라게나아제(collagenase), 디스파제(dispase), 프로나제(pronase), DNase 등이 포함되며(효소 조성 참고문헌: Sevin BU, Peng ZL, Perras JP, Ganjei P, Penalver M, Averette HE. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol Oncol. (1988), 31, 191-204), 분리효율을 높이는 물질로는 암세포의 오염을 예방하기 위한 물질로서 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 겐타마 이신(gentamicin), 엠포테리신B(Ampotericin B) 및 메트로니다졸(Metronidazole) 등과 같은 항생제와 암세포의 생존율을 보존하는 물질로서 FBS를 포함하는 PMI 1640과 같은 배양액일 수 있다. 분리효소혼합액에 사용하는 RPMI 1640 배양액은 DMEM, RPMI, IMDM, MEM, McCoy’s 5A 등과 같은 배양액으로 쉽게 대체하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 효소혼합액은 RPMI 1640, 콜라게나아제(collagenase), 프로나제(pronase), DNase, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 겐타마이신(gentamicin), 엠포테리신B(Ampotericin B), 메트로니다졸(Metronidazole) 및 FBS를 포함하는 배양액으로 구성되었으나, 대장암 및 직장암의 경우를 제외하면, 상기 성분 중 메트로니다졸을 포함하지 않더라도 우수한 효율로 암세포를 분리할 수 있다. 직장암, 대장암의 경우에는 특히 메트로니다졸이 포함되는 경우 암세포의 정제효율이 훨씬 높아지고 배양 성공률이 증가함을 확인하였다.

상기 효소혼합액의 각 성분 및 농도는 당업자가 필요에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 이러한 효소혼합액을 사용하여 암세포와 비암세포를 분리하는 방법에 관한 공지의 문헌을 참조할 수 있다(참고문헌 Journal of surgical oncology 40:4~7, 1989; Cancer research 43, 258~264, 1983: Amphotericin 1ug/mi;및 Cancer research 37, 3639~3643, 1977 & Eur. J Cancer 33(8) 1291~1298, 1997).본 발명에서 사용한 항생제 중 페니실린은 그람 양성 박테리아, 스트렙토마이신은 그람 양성 및 그람 음성 박테리아, 겐타마이신은 그람 양성 및 그람 음성 박테리아와 미코플라스마(mycoplasma), 엠포테리신 B는 곰팡이 및 효모에 대한 항생효과를 가지며, 이들 항생제는 동일한 작용범위를 가지고 있는 다른 항생제로의 대체가 가능하다.

구체적으로는, 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 작용 가능한 다른 항생제로는 네오마이신(Neomycin), 앰피실린(ampiciliin) 등이 있고,그람 양성 및 그람 음성 박테리아와 미코플라스마(mycoplasma)에 작용 가능한 다른 항생제로는 가나마이신(Kanamycin) 등이 있으며, 곰팡이 및 효모에 작용 가능한 항생제로는 니스타틴(Nystatin)이 있다(참고문헌 Culture of animal cells, WILEY-LISS, 4TH edition, 99 page).

고형암 조직을 외과용 수술칼로 세절한 후 상기 효소혼합액에 부유시켜 처리하면 암조직으로부터 암세포 및 비암세포가 분리되며, 이와 같이 분리된 암세포와 비암세포를 포함하는 세포부유액으로부터 비암세포를 분리할 수 있다. 본 발명에서“비암세포”라 함은 고형암조직에서 암세포를 제외한 모든 세포를 의미하며, 여기에는 혈액세포와 기타 정상세포가 포함된다. 효소혼합액으로의 처리는 효소혼합액에 암조직을 부유시켜 약 37℃, 5% CO₂ 존재하에서 암조직의 종류에 따라 12시간 내지 16시간 동안 배양(incubation)하는 것을 포함한다.

효소혼합액으로 처리된 상기 세포부유액으로부터 비암세포를 제거하는 단계는 피콜 밀도구배 원심분리(Ficoll gradient centrifugation) 및 항-CD45 항체 자기 비드(Anti-CD45 antibody magnetic bead)를 사용하는 것을 포함한다.

상기 “피콜 밀도구배 원심분리”란 합성 수크로스 폴리머(sucrose polymer)인 피콜의 밀도 구배를 이용한 원심분리법으로, 용액 내 다양하게 존재하는 피콜의 농도에 따른 침전과정 동안 밀도가 서로 다른 세포들이 분리될 수 있다(Katayanagi N. et al. “Flow cytometric BrdU/DNA assay for anticancer agent sensitivity test” Nippon Rinsho. 1992, 50 (10), 2386-2390; Silva S.L. et al. “A novel model for isolation of Walker’s tumoral cells using the Ficoll-Hypaque gradient” Acta Cir Bras. 2006, 21 (2), 101-105; Weisethal L.M., et al. “A novel dye exclusion method for testing in vitro chemosensitivity of human tumors” Cancer Res. 1983, 43 (2), 749-57; 및 Andreotti P.E. et al. “Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma” Cancer Res. 1995, 55 (22), 5276-5282. 참조). 본 발명에서는 이를 암세포 분리에 이용함으로써 암조직에서 암세포와 비암세포를 분리하는 효율을 현저히 높일 수 있음을 확인하였다.

상기“항-CD45 항체 자기 비드”는 항-CD45 항체를 이용한 자기 비드법으로, 여기서 자기 비드란 실리카로 코팅된 균일한 초상자성체(uniform superparamagnetic)로 1 내지 5 의 직경을 가지며, 아민(Amine), 카르복시(Carboxy), 알데히드(Aldehyde), 에폭시(Epoxy), IDA, 하이드라지드(hydrazide), DADPA 또는 실리카(Silica) 등의 다른 표면기를 가지고 있는 구슬이다. 이러한 구슬은 비특이적 결합률이 낮고, 표면적이 넓고, 분산이 잘되며, 쉽게 다룰 수 있는 성질로 인해 단백질, 항체, 탄수화물, 렉틴, 핵산 또는 작은 약물 등을 분리하는데 폭넓게 이용되고 있다.

본 발명은 특히 바람직한 양태로서, 고형암 중 대장암 또는 직장암의 조직으로부터 암세포를 높은 정제율 및 수득률로 분리하는 것을 특징으로 하는 암세포 분리방법을 제공한다. 대장, 직장암 조직에서 암세포를 분리하는 경우 다른 고형암에 비해 인체 내에 존재하는 상재균에 의해 쉽게 오염이 되는 경향이 있어 분리 배양에 어려움이 있었으나, 본 발명에서는 상기한 바와 같이 특히 알코올 전처리 및 효소혼합액에 메트로니다졸을 더 포함시킴으로써 대장암이나 직장암으로 부터도 일반 고형암 수준의 정제 효율 및 수득율로서 암세포를 배양할 수 있음을 확인하였다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 설명하기 위해 예시하는 취지일 뿐, 권리범위가 이들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안될 것이다.

< 실시예 >

세브란스 병원(연세대학교 의과대학)으로부터 얻은 한국인 호발 5대 고형암종인 위암, 폐암, 간암, 대장암, 유방암 조직에 대하여 각각 이하의 실시예에 따라 동일한 방식으로 처리하였으며, 따라서 이하의 실시예에서는 이들 암조직을 종류에 따라 구분하지 않고 모두 “고형암”이라는 용어로 통일하여 설명한다.

< 실시예 1> 암 조직의 전처리

고형암 조직을 70% 알코올(에탄올,Sigma)에 2~3초간 담가 조직표면을 소독하고, 표면 소독이 끝난 즉시, 페트리 디쉬에 옮겨 세척액A(washing media A) 20ml를 붓고 조직외부를 잘 닦아 주었다. 세척액A는 HBSS (Hank's balance salt solution, Hyclone사)에 100U/ml 페니실린(penicillin), 100㎍/ml 스트렙토마이신(Streptomycin), 100 ug/ml 겐타마이신(gentamicin), 2.5㎍/ml 엠포테리신 B 및 10% FBS 가 포함된 용액을 사용하였다(참고문헌: Sevin BU, Peng ZL, Perras JP, Ganjei P, Penalver M, Averette HE. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol Oncol. (1988), 31, 191-204).

사용된 세척액을 제거하고 새로운 세척액A로 다시 한 번 닦아주었다. 조직을 1.5ml 튜브에 들어갈 정도로 잘라 1.5ml 튜브에 담아 무게를 측정하였다. 조직을 페트리 디쉬에 다시 옮긴 후 빈 1.5ml 튜브의 무게를 측정하였다. 깨끗한 페트리 디쉬에 조직을 옮기고 1mm² 이하로 외과용 수술칼이나 수술가위로 잘게 잘라주었다.

< 실시예 2> 분리효소 혼합액 처리

실시예 1에서와 같이 전처리한 고형암 조직을 분리효소 혼합액(disaggregation enzyme cocktail) 5~10ml에 부유시켜 골고루 분포시킨 후, 37℃ 5% CO₂의 조건으로 인큐베이터에서 암조직에 종류에 따라 12시간 반응시켰다. 상기 분리효소 혼합액은 RPMI 1640 배양액에, 콜로게나아제 Ⅱ(collagenase II), 프로나 제(pronase), DNase, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 엠포테리신B(Ampotericin B), 겐타마이신 (gentamicin), 메트로니다졸(Metronidazole) 및 10% FBS가 포함된 용액을 사용하였다.

본 발명에서 실제 사용한 효소들의 농도는 0.2mg/ml collagenase II, 2.25 PUK/ml pronase, 1400 U/ml Dnase (참고문헌: Sevin BU, Peng ZL, Perras JP, Ganjei P, Penalver M, Averette HE. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol Oncol. (1988), 31, 191-204)이었고, 실제 사용한 항생제의 농도는 100U/ml 페니실린(penicillin), 100㎍/ml 스트렙토마이신(Streptomycin), 2.5㎍/ml 엠포테리신B(Ampotericin B), 100 ug/ml 겐타마이신 (gentamicin) 1㎍/ml 메트로니다졸(Metronidazole)이었다.

< 실시예 3> 암세포 회수

실시예 2에서 효소혼합액으로 처리된 암조직을 조직절편 내부의 세포가 잘 분리될 수 있도록 10ml 혈청피펫(serological pipette)으로 20회이상 피펫팅하였다. 분해시킬 암 조직이 작아 분리효소 혼합액이 적게 사용된 경우에는 세척액A를 5ml정도 첨가해서 피펫팅하였다. 세포부유액(Cell suspension)을 여과기(strainer)에 걸러 50ml 코니컬 튜브(conical tube)에 받았다. 페트리 디쉬와 여과기에 미량 존재하는 잔류세포는 새로운 세척액A로 재부유시켜 회수하였다. 펠렛(pellet)을 얻기 위하여 여과액을 500g에서 5분간 원심분리하였다. 10ml 혈청 피펫으로 상층액을 제거하고, 펠렛은 다시 세척액A 1ml로 다시 부유시켜 1.5ml 튜브에 옮긴 후, 500g 에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 얻었다. 펠렛을 적당한 부피(200~100μl)의 세척액A로 재부유하였고, 이를 트리판 블루로 염색(Trypan blue staining)하여 세포계수(cell counting)하였다.

암 조직을 분리한 직후에 가장 많이 존재하는 비암세포는 적혈구였다. 세포 부유액을 피콜 밀도구배 원심분리하기 전에 트리판 블루로 염색한 결과를 도 1에서 보였다. 도 1b에서 나타낸 바와 같이, L은 살아있는 세포(living cell)를 나타내며 염색되지 않았고, D는 죽은 세포(dead cell)를 나타내는 것으로 염색되어 푸른색을 띠었으며, R은 적혈구를 나타내며 염색되지 않고, 매우 굴절되었다(highly refractive). 다수의 적혈구 세포와 그 보다 적은 수의 유핵세포가 관찰되었고 트리판 블루로 염색되는 죽은 세포도 존재하였다.

< 실시예 4> 적혈구 및 죽은 세포의 제거

15ml 튜브에 피콜(Ficoll, sigma H4153, density=1.077g/ml)을 2ml 담고 그 위에 준비된 세포 부유액 3ml를 패스처 피펫(pasture pipette)이나 P1000 피펫맨을 이용하여 튜브 벽면을 따라 조심스럽게 흐르도록 하였다. 이 때 튜브 하나에는 8× 10⁶개 정도의 세포가 적당하고, 그 이상일 경우에는 튜브수를 늘려 나누어 담아, 상온에서 400g로 15분간 원심 분리하였다. 피펫맨 또는 패스처 피펫으로 인터페이스(interface)를 조심스럽게 취해서 15ml 튜브에 옮기고, 수득량을 높이기 위해 세척액A 및 피콜의 경계면 위, 아래층을 조금씩 취하였다. 튜브를 세척액A로 채워 흔 들어 세척한 후 500g에서 5분간 원심 분리하였다. 펠렛은 다시 세척액 1ml로 재부유하여 1.5ml 튜브에 옮긴 후 500g에서 5분간 원심분리하여 얻은 펠렛을 적당한 부피(200~1000μl)의 세척액A로 재부유하여 트리판 블루로 염색하고 세포계수하였다.

피콜 밀도구배 원심분리(1.077g/ml)를 사용하여 혼입되어 있던 적혈구의 95%이상을 유핵세포층으로부터 제거할 수 있으며, 배양을 위한 전처리 과정에서 발생하는 세포 조각 및 죽은 세포의 제거에도 도움이 되었다.

< 실시예 5> 비암세포의 제거

암 조직내 암세포 및 비암세포의 비율과 분포를 조사하기 위하여 고형암 조직에 속하는 위암조직을 분리한 뒤 세포부유액을 이용하여 시토신(cytosin, Thermo shandon) 슬라이드를 제작하고 HE 염색(Haematoxylin & Eosin Staining)을 시행하였다. 염색된 유핵세포는 암세포 및 비암세포 여부, 세포유형 등을 병리과전문의가 판독하였고, 세포의 크기는 Image Pro을 이용하여 분류하였다. 그 결과 전체 세포의 58%가 비암세포였으며 암조직에 흔하게 혼입되는 비암세포는 적혈구, 림프구, 포식세포(macrophage), 분류하기 곤란한 세포, 중성구(neutrophil), 섬유모세포(fibroblast) 순이었다(도 2).

세척액B(washing buffer B, 1X Phosphate-Buffered Saline pH7.4 (Gibco), 0.5% BSA 및 2mM EDTA를 포함하는 용액)로 세포를 1회 세척하고, 세포 10⁷개 당 80 μl의 세척 완충액으로 재부유하였고, 10⁷개 이하의 세포에 대해서도 80 μl의 세 척액B를 사용하였다. 세포부유액 80 μl당 20μl의 MACS 항-CD45 비드(beads)를 넣고 잘 섞은 후, 6~12℃에서 15분간 배양하였다. 배양시 냉장고에 두고 1~2회 반전(inversion)시켰다. 혼합액(mixture) 총부피의 10~20배에 해당하는 세척액B를 첨가하여 세척하고, 원심분리는 300g에서 10분동안 시행하여 상층액에 존재하는 미결합 비드를 제거하였다. 원심분리 후 상층액은 제거하고 펠렛은 500μl의 세척 완충액으로 재부유하였다. MACS 멀티스탠드(Multistand)를 알코올로 소독한 후 클린 벤치 안에 넣고, OctoMACS 분리기(separator)도 소독하여 멀티스탠드에 부착시켰다. 분리기 아래에는 컬럼(column)을 통해 나오는 단편(fraction)을 받을 수 있도록 선반(rack)과 적당한 부피의 1.5ml 튜브를 준비하였다. MS 컬럼을 분리기에 끼운 후, 세척 완충액을 500μl정도 흘려주면서 프리웨팅(prewetting) 시켰다. 이후 앞서 준비한 세포부유액을 컬럼에 흘려주었다. 넣어준 세포부유액이 다 빠져 나오면 세척액B를 500μl씩 3회 정도 흘려주면서 컬럼 내에 비드가 결합하지 않은 세포를 음성 선택(negative selection)하였고, 음성 선택 대상인 단편을 모두 모아 500g에서 원심 분리하여 펠렛을 얻었다. 펠렛을 적당한 부피(200~1000μl)의 세척액A로 재부유하여 트리판 블루로 염색하고 세포계수하였다.

피콜 밀도구배 원심분리로 단핵세포 층으로부터 다핵백혈구(polymorphonuclear leukocyte)를 분리할 수 있었다. 외과적으로 적출된 고형암 조직에서 피콜 밀도구배 원심분리 전후의 암 세포 비율을 조사한 결과 암세포의 비율이 평균 40.9%에서 45.6%로 증가됨을 관찰하였다(도 3). 흔하게 혼입되는 정상세포는 적혈구, 백혈구, 대식세포, 분류하기 곤란한 정상세포, 중성구, 섬유모세포 순이었다.

암조직에 혼입되어 있는 대부분의 정상세포가 혈액에서 유래한 세포임에 착안하여 유핵세포(nucleated blood) 표면에 발현되는 CD45에 대한 항체에 자기 비드(magnetic bead)를 결합시킨 제품을 사용하여 해당 정상세포를 음성 선택한 결과, 18개의 고형암 조직에서 암세포 비율을 평균 21.7% 증가 시킬 수 있었다. 그러나 조직 내 암세포 비율이 낮은 경우(20% 미만)는 피콜 밀도구배 원심분리 및 면역자기 분리(immunomagnetic separation)를 시행한 후에도 암세포 비율이 증가하는 정도가 경미하였다(도 4). 이와 같은 결과는 암 조직이 채취되는 단계가 매우 중요하다는 것을 의미하는 것이다.

상기와 같은 실시예에 따른 결과로, 한국인 호발 5대 암종에서 암종별 분리효율은 도5a에 나타난 바와 같이, 위암(n=129)에서 mg 당 50,000 개의 세포를, 폐암(n=67)에서는 mg 당 약 38,000 개의 세포, 간암(n=15)에서는 mg 당 약 49000 개의 세포, 대장암(n=26)에서는 mg 당 약 31000 개의 세포, 및 유방암(n=75)에서 mg 당 약 15000 개의 세포를 얻을 수 있었으며, 또한 도5b에 나타난 바와 같이, 이들 분리된 암세포의 생존율이 위암 92.2%(n=129), 폐암 94.9%(n=67), 간암 93.7%(n=15), 대장암 91.9%(n=26), 및 유방암 92.4%(n=75)로 나타나 기존의 방법에 비해 현저히 개선된 분리 효율(수득률) 및 분리된 세포의 생존율을 나타냄을 알 수 있었다.

또한, 다른 고형암과 비교한 대장암 조직에서의 배양 성공률의 증대를 도6에서 보였다. 통상적인 암세포 배양법을 이용하여, 본 발명의 방법에 따라 분리된 암 세포와 기존의 방법으로 분리된 암세포의 배양 성공률을 비교해 보았는데, 본 발명의 방법에 따라 분리된 대장암 외 다른 고형암 세포의 배양 성공률은 95% 로 나타났다. 또한, 항생제를 포함한 세척액만 사용한 기존의 대장암 세포 분리에 따른 배양 성공률이 57% 인 것에 반해, 에탄올 전처리를 포함한 본원 실시예에 따라 분리한 대장암 세포의 배양 성공률은 94%로 나타나, 본 발명의 방법에 따라 암세포를 분리하는 경우, 일반 고형암 뿐 아니라 대장암이나 직장암과 같이 그 특성상 높은 정제율의 기대가 어려워 이후 높은 배양 성공률 또한 기대할 수 없었던 암조직에서도 높은 분리 및 정제 효율 뿐 아니라, 그에 따른 이후의 높은 배양 성공률을 보장할 수 있음을 알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 암세포 분리방법은 분리된 고형암 조직을 알코올로 전처리하고 항생제를 포함하는 세척액으로 세정하는 단계; 세정한 암조직을 항생제를 포함하는 효소혼합액에 부유시켜 암세포를 분리하는 단계; 및 상기 세포부유액에서 비암세포를 제거하는 단계를 포함함에 따라 암세포 분리 수득율이 기존 방법들에 비하여 우수하고 분리된 암세포의 배양시 오염 억제율이 높아, 암환자에 대한 암진단, 치료, 예후판정과 기초적인 암연구에 폭넓게 이용될 수 있으며, 이는 특히 기존에 암조직의 특성상 높은 정제율과 수득율을 기대할 수 없었던 대장암이나 직장암의 경우에도 동일하게 적용될 수 있어 매우 효과적인 방법이다.

Claims

분리된 고형암 조직을 알코올로 전처리하고 항생제를 포함하는 세척액으로 세정하는 단계; 세정한 암조직을 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 및 엠포테리신B를 포함하는 효소혼합액에 부유시켜 암세포를 분리하는 단계; 및 세포부유액에서 혈액세포 및 정상세포를 제거하는 단계를 포함하는 고형암 암세포의 분리방법.
제1항에 있어서, 효소혼합액이 메트로니다졸을 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 알코올로 암조직을 전처리하는 단계는 70% 에탄올에 암조직을 침지시켜 조직표면을 소독하는 것을 특징으로 하는 암세포 분리방법.
제1항에 있어서, 상기 효소혼합액은 배양액에 콜라게나아제 Ⅱ(collagenase II), 디스파제(dispase), 프로나제(pronase), DNase, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 겐타마이신(gentamicin), 엠포테리신B(Ampotericin B), 메트로니다졸(Metronidazole) 및 FBS가 포함된 용액인 암세포 분리방법.
제4항에 있어서, 상기 효소혼합액은 배양액에 0.05 내지 0.8 mg/ml 콜라게나아제Ⅱ(collagenase II), 1 내지 5 PUK/ml pronase, 600 내지 2000 U/ml DNase, 50 내지 200 U/ml 페니실린(penicillin), 50 내지 200 ㎍/ml 스트렙토마이신(Streptomycin), 50 내지 200 ug/ml 겐타마이신 (gentamicin), 0.5 내지 5 ㎍/ml 엠포테리신B(Ampotericin B), 1㎍/ml 메트로니다졸(Metronidazole) 및 10 % FBS가 포함된 용액인 암세포 분리방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 배양액은 DMEM, RPMI, IMDM, MEM 및 McCoy’s 5A로 이루어진 군에서 선택되어진 하나 이상의 배양액인 방법.
제1항에 있어서, 혈액세포 및 정상세포를 제거하는 단계는 피콜 밀도구배 원심분리(Ficoll gradient centrifugation) 및 항-CD45 항체 자기 비드(Anti-CD45 antibody magnetic bead)를 사용하는 것을 특징으로 하는 암세포 분리방법.
제1항 내지 제5항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 처리하는 암조직은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 직장암, 유방암, 전립선암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 난소암, 방광암, 신장암, 흑색종, 소세포 및 비소세포폐암, 육종, 신경아교종 또는 T-세포 림프종 및 B-세포 림프종 조직인 암세포 분리방법.
제2항 내지 제5항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 처리하는 암조직은 대장암 또는 직장암 조직인 암세포 분리방법.