KR100700913B1

KR100700913B1 - 공초점 라만 분광법을 이용한 조직으로부터의 자기-형광신호 감소 방법

Info

Publication number: KR100700913B1
Application number: KR1020040083980A
Authority: KR
Inventors: 오칠환; 권대갑; 김효진; 박정희; 주재범; 정회일; 최정현
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2004-10-20
Filing date: 2004-10-20
Publication date: 2007-03-28
Anticipated expiration: 2024-10-20
Also published as: KR20060034935A; JP2006119138A; US20060084876A1

Abstract

본 발명은 공초점 라만 분광법을 이용한 조직으로부터의 자기-형광(Auto-fluorescence) 신호 감소 방법 및 이를 이용한 피부암 진단방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 라만 분광학(Raman spectroscopy)은 피부암의 비침투적 진단을 제공하는데 강한 가능성을 가진다. 본 발명에서는, 아미드(amide) I 모드와 PO₂- 대칭성 스트레칭 모드에서 정상 및 BCC 조직사이의 뚜렷한 라만 밴드 차이들은 이 기술이 스펙트럼 데이터의 통계적 처리가 필요없이 피부학적 진단 도구로서 사용될 강한 잠재능을 가지고 있다는 것을 보여주었다. 또한, 공초점 라만 뎁스 프로파일링(confocal Raman depth profiling) 기술을 사용하여 주변의 비-암성 조직으로부터 BCC 조직을 정확히 분별하는 것이 가능했다. 따라서, 공초점 라만 분광학은 정상 및 BCC 조직사이의 스펙트럼 차이들의 직접 관찰이 가능하기 때문에 피부학적 진단의 새로운 방법을 제공할 수 있다.

Description

공초점 라만 분광법을 이용한 조직으로부터의 자기-형광 신호 감소 방법{Method for reducing auto-fluorescence signals in confocal Raman microscopy}

도 1은 3명의 서로 다른 환자들(a, b 및 c)로부터 수집한 피부 조직에 대한 H&E 염색 절편의 현미경 이미지들이다. 어두운 청색 영역이 악성 조직(BCC)이고 밝은 친에오신(eosinophilic) 영역이 정상 조직이다.

도 2는 BCC 조직의 라만 스펙트럼들이다: (a) 비-공초점 모드 라만 스펙트럼 (b) 공초점 모드 라만 스펙트럼.

도 3은 1000-1700 cm^-1 영역에서 피부 조직의 공초점 라만 스펙트럼들이다: (a) 정상 조직의 라만 스펙트럼 (b) BCC 조직의 커브-피팅(curve-fitting) 라만 스펙트럼.

도 4는 3명의 서로 다른 환자들로부터 얻은 정상 및 악성 조직의 공초점 라만 스펙트럼들이다: (a) 정상 조직 (b) BCC 조직.

도 5는 3040 μm의 간격으로 7개의 서로 다른 스팟들에서 피부 조직(도 1(a))의 공초점 라만 프로파일이다: (a) H&E 염색된 피부조직의 확대 현미경 이미지 (b) (a)에 표시된 7개 영역에서 해당하는 라만 스펙트럼들.

도 6은 3040 μm의 간격으로 7개의 서로 다른 스팟들에서 피부 조직(도 1(b))의 공초점 라만 프로파일이다: (a) H&E 염색된 피부조직의 확대 현미경 이미지 (b) (a)에 표시된 7개 영역에서 해당하는 라만 스펙트럼들.

도 7은 3040 μm의 간격으로 7개의 서로 다른 스팟들에서 피부 조직(도 1(c))의 공초점 라만 프로파일이다: (a) H&E 염색된 피부조직의 확대 현미경 이미지 (b) (a)에 표시된 7개 영역에서 해당하는 라만 스펙트럼들.

지난 수십년에 걸친 분광학(spectroscopy) 기술의 발달은 암 연구의 영역에 상당한 영향을 끼쳐왔다. FT-IR, 라만(Raman) 및 공초점(confocal) 형광현미경과 같은 기술들은 암의 근원 및 진전을 밝히기 위해 사용되어 왔다 (Jackson, M. Faraday Discuss 2004, 126, 1-18 Yano et al., Analyt Biochem 2000, 287, 218-225). 이들 기술은 암 유발 세포 및 조직에서 암 및 생화적 변화의 조기 진단에도 사용되어 왔다 (Shafer-Peltier et al., J Raman Spectrosc 2002, 33, 552-563 Ling et al., Appl Spectrosc 2002, 56, 570-573). 이들 분광학 기술들 중에서, 라만 분광학(Raman spectroscopy)이 비파괴적이고 샘플 준비공정을 필요로 하지 않으며 정상 및 질병 조직의 분자구조에 대한 상세한 정보를 제공하기 때문에 의학적 진단을 위해 상당한 관심을 끌어왔다.

최근에, 온존층 파괴, 환경오염 등으로 인해 피부가 UV 조사에 과도하게 노출됨으로써 피부암의 발병이 현격히 증가하였다. 만약 초기에 검출만 되면, 피부암은 100%에 가까운 치료율을 가진다. 그러나, 불행하게도 진단이 아직도 병리학자에 의한 형태학적 관찰에 기초하고 있기 때문에, 초기 검출은 곤란하다. 두가지 일반적인 피부암이 있다: 기저세포 암종(BCC) 및 편평세포 암종(SCC). BCC 및 SCC 둘다는 비-흑색종 피부암이고 BCC는 가장 일반적인 피부 신생물(neoplasm) 이다. 주변 비-암성 조직으로부터 BCC 조직을 구별하는 것이 어렵기 때문에 BCC의 정확한 검출은 임상 피부학자들로부터 많은 관심을 끌어왔다 (Caspers et al., J Invest Dermatol 2001, 116, 434-442 Bakker Schut et al., Anal Chem 2000, 72, 6010-6018). BCC의 검출에 사용되는 일상적인 진단 기술은 생검 샘플의 병리학적 검사이다. 이것은 의심되는 이상(abnormal) 영역으로부터 조직을 제거한 다음 슬라이스하고 염색하여 병리학작들이 형태학적 이상을 동정할 수 있도록 하였다. 이 방법은 개별 병리학자의 숙련도에 따른 주관적인 판단에 의존하며, 조직의 과도한 생검을 유도할 수 있다. 따라서, 더 이상의 생검을 위한 병변(lesions)의 초기 선별 및 선택을 위한 신속하고 정확한 진단 기술이 필요하다.

라만 분광학(Raman spectroscopy)은 이런 문제점을 해결할 수 있는 잠재능을 가진다. 그것은 주변 정상 조직으로부터 BCC 조직을 구별할 수 있는 더 정확한 의학적 진단을 제공하기 위해 적용될 수 있다. 최근에, 여러 연구 그룹이 라만 분광학을 이용하여 BCC 검출을 시도하였다. Gniadecka et al. 및 Nunes et al.은 BCC와 주변 정상 조직사이를 구별하기 위해 FT-라만 분광법을 사용하였다 (Gniadecka et al., J Invest Dermatol 2004, 122, 443-449 Nunes et al., Spectroscopy 2003, 17, 597-602). Nijssen et al.은 BCC의 동결 조직 절편에서 얻은 FT-라만 스펙트럼에 기초하여 슈도-칼러(pseudo-color) 라만 지도(Raman maps)를 증명하였다 (Nijssen et al., J Invest Dermatol 2002,119, 64-69). 상기연구에서, 그들은 슈도-칼러 라만 지도가 헤마토크실린 및 에오신(H&E) 염색된 샘플의 현미경 이미지와 밀접하게 관련된다는 것을 보여주었다. FT-라만 분광학을 이용한 종래 연구에서, 장 파장 여기(excitation) 레이저(1064 nm Nd:YAG laser 또는850 nm titanium-sapphire laser)가 피부 조직으로부터의 자기-형광을 최소화하기 위해 적용되었다. 그러나, 장 파장 레이저는 단 파장 여기 레이저에 비해 약한 라만 산란 강도를 가진다. 결과적으로, 이전에 보고된 BCC 조직에 대한 라만 스펙트럼은 약한 신호-대- 노이즈 율을 보여주기 때문에 암 및 정상 조직의 라만 신호를 분별하기 위해 주 성분 분석(principal component analysis, PCA) (Nunes et al., Spectroscopy 2003, 17, 597-602), K-평균 군집 분석(K-mean clustering analysis, KCA) (Caspers et al., Biophys J 2003, 85, 572-580) 및 신경망 분석(neural networks) (Gniadecka et al., J Invest Dermatol 2004, 122, 443-449)과 같은 분광학 데이터의 통계적 처리를 필요로 하였다. 그러나, 암 진단의 실제 적용을 위해 스펙트럼 데이터의 어떤 통계적 처리도 요하지 않는 스펙트럼 차이의 직접 관찰이 필연적으로 요구된다.

본 발명에서는, 514.5 nm의 단 파장 아르곤 이온 레이저를 사용한 공초점(confocal) 라만 기술을 BCC의 피부학적 진단에 적용하였다. 라만 신호를 강하게 방해하는 자기-형광을 효과적으로 제거하기 위해, 공초점 기술을 사용하였다. 공초 점 라만 현미경은 형광의 우수한 거부능을 가졌다고 알려졌다. 이는 레이저가 작은 점에 초점을 맞추기 때문에 샘플링 부피에서 레이저 플럭스가 일반적인 라만 분광법에서 종종 요구되는 시간의 분획내에 형광을 제거할 정도로 충분히 높게 된다는 사실에 기인한다. 둘째로, 여기 전자가 그 슬릿을 따라 한 분자에서 다른 분자로 이동할 수 있기 때문에 초점 부피외의 분자는 형광 광자를 방출할 수 있다. 이들 광자는 공초점 슬릿에 의해 봉쇄된다. 공초점 라만 현미경을 사용하여 조사된 10개의 BCC 샘플들에 대해 정상 및 암 조직사이의 일관된 스펙트럼 차이들이 관찰되었다. 또한, 공초점 라만 뎁스 프로파일링을 수행하여 주변 비-암성 조직으로부터 BCC를 분별하였다. 외과 수술에서 제거할 영역을 결정하는 것은 중요하다. 본 발명을 통하여, 전암 및 비암성 병변에 대한 직접 진단 도구로서 사용될 수 있는 공초점 라만 현미경의 가능성을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 공초점 기술을 이용하여 라만 신호를 강하게 방해하는 자기-형광을 효과적으로 제거하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 공초점 라만 분광학을 이용한 피부암의 비침투적 진단방법을 제공하는데 있다.

라만 분광학(Raman spectroscopy)은 피부암의 비침투적 진단을 제공하는데 강한 가능성을 가진다. 본 발명에서는, 공초점(confocal) 라만 현미경을 가장 일반적인 피부암인 기저세포 암종(basal cell carcinoma, BCC)의 피부학적 진단에 적용 하였다. 일상적인 생검법을 사용하여 10명의 BCC 환자들로부터 조직을 얻어 공초점 라만 측정에 사용하였다. 라만 신호를 방해하는 조직으로부터의 자기-형광(Auto-fluorescence) 신호가 공초점 슬릿 조정(confocal slit adjustment)을 사용하여 크게 감소되었다. 아미드(amide) I 모드와 PO₂- 대칭성 스트레칭 모드에서 정상 및 BCC 조직사이의 뚜렷한 라만 밴드 차이들은 이 기술이 스펙트럼 데이터의 통계적 처리가 필요없이 피부학적 진단 도구로서 사용될 강한 잠재능을 가지고 있다는 것을 보여주었다. 또한, 공초점 라만 뎁스 프로파일링(confocal Raman depth profiling) 기술을 사용하여 주변의 비-암성 조직으로부터 BCC 조직을 정확히 분별하는 것이 가능했다. 따라서, 공초점 라만 분광학은 정상 및 BCC 조직사이의 스펙트럼 차이들의 직접 관찰이 가능하기 때문에 피부학적 진단의 새로운 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부암 진단을 위한 라만 분광법에서 공초점 슬릿 조정을 사용하여 라만 신호를 방해하는 조직으로부터의 자기-형광(Auto-fluorescence) 신호를 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 공초점 라만 분광법은 당업계에서 상업적으로 입수가능한 Renishaw 2000 Raman microscope system과 같은 공초점이 가능한 라만 현미경을 사용하여 제공된 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. 공초점 분광법(Confocal spectroscopy)은 샘플의 한정된 특정 영역(well-defined regions)으로부터 스펙트럼이 수집될 수 있도록 하는 기술이다. 공초점 작동 모드로 세팅되면 관심 영역 (region of interest)으로부터의 광(light)만 허용(accept)되는 반면, 주변 초점외(out-of-focus) 영역으로부터의 광은 거절(reject)된다. 공초점 모드에서 공간적 해상도(spatial resolution)가 개선되다. 공간적 해상도는 수평 해상도(lateral resolution) 및 초점 깊이(depth of focus)의 두개의 성분을 가진다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 공초점 슬릿 조정은 2 슬릿 공초점 정렬(two-slit confocal arrangement)을 사용하여 제1 공초점 슬릿은 10-20 μm의 폭으로 세팅하고 제 2슬릿은 스펙트로미터 슬릿에 수직으로 정렬된 CCD 검출기상의 두개의 픽셀 로우(pixel rows)로부터 가상 제2 슬릿을 만드는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 아미드(amide) I 모드, 아미드(amide) III 모드와 PO₂- 대칭성 스트레칭 모드에서 정상 및 피부암 조직사이의 뚜렷한 라만 밴드 차이들을 스펙트럼 데이터의 통계적 처리 없이 검출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 공초점 라만 뎁스 프로파일링(confocal Raman depth profiling) 기술을 사용하여 주변의 비-암성 조직으로부터 피부암 조직을 정확히 분별하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 공초점 라만 분광법을 이용한 피부암의 진단 방법에서 있어서, 공초점 슬릿 조정을 사용하여 라만 신호를 방해하는 조직으로부터의 자기-형광(Auto-fluorescence) 신호를 감소시키는 것을 특징으로 하는 피부암 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부암은 기저세포 암종(BCC)와 편평세포 암종(SCC) 와 같은 어떤 피부암일수도 있으나, 바람직하게는 기저세포 암종(BCC)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 정상 및 피부암 조직사이의 스펙트럼 차이를 스펙트럼 데이터의 통계적 처리 없이 직접적 관찰함으로써 진단하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 스펙트럼에서 라만 시프트(Raman shift) 1000-1700 cm^-1 영역의 강도(intensity) 변화를 관찰하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 아미드(amide) I 모드, 아미드(amide) III 모드와 PO₂- 대칭성 스트레칭 모드에서 정상 및 피부암 조직사이의 뚜렷한 라만 밴드 차이들을 검출하는 것을 특징으로 한다. 상기 아미드(amide) I 및 III 모드에서는 주로 정상/암 조직간의 단백질 아마이드 구조 변화 를 검출하고 PO₂- 대칭성 스트레칭 모드에서는 주로 정상/암 조직간의 인지질과 핵산 구조 변화를 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 아미드(amide) I 모드는 라만 시프트(Raman shift) 1580-1610 cm^-1 영역에서, 아미드(amide) III 모드는 라만 시프트 1320-1340 cm^-1 영역에서, PO₂- 대칭성 스트레칭 모드는 라만 시프트 1030-1060 cm^-1 영역에서 라만 밴드가 발견되는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 아미드(amide) I 모드는 정상 조직의 경우 1630-1660 cm^-1영역에서 관측되었으나 암 조직의 경우에는 피크가 완만해지고 세기는 증가하는 동시에 피크의 위치가 1580-1610 cm^-1 영역으로 이동하는 현상이 발견되었다. 반면, 아미드(amide) III 모드는 정상 조직에서는 1290-1310 cm^-1영역에서 관측되었으나 암 조직으로 갈 경우 피크의 위치가 오히려 높은 에너지 영역으로 이동하여 1320-1340 cm^-1영역에서 발견되었다. PO₂- 대칭성 스트레칭 모드의 경우에는 정상 조직에서는 1070-1100 cm^-1영역에서 관측되었으나 암 조직의 경우에는 1030-1060 cm^-1 영역에서 발견되어 아미드 I 모드와 마찬가지로 피크가 30-40 cm^-1 정도 에너지가 낮은 영역으로 이동하였으며 피크의 세기는 작아지고 완만해지는 경향성을 보였다. 이러한 피부 조직의 라만 피크 변화는 피부암 조직의 단백질의 구조변환에 의한 것으로 판단된다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 공초점 라만 뎁스 프로파일링(confocal Raman depth profiling) 기술을 사용하여 주변의 비-암성 조직으로부터 피부암 조 직을 정확히 분별하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 공초점 라만 뎁스 프로파일링은 수행하는 것을 특징으로 한다. 이 프로파일링 기술은 1-2 μm 정도의 초점 크기를 가지는 레이저 광을 30-40 μm 간격으로 연속 주사하여 정상 조직과 암 조직의 라만 산란 시그널 차이를 측정한 후, 이를 토대로 암의 유무를 판별하는 방법으로 레이저 광의 주사 조건과 검출 조건을 최적화함으로써 미세 조직의 정상/암 조직의 진단에 적용될 수 있을 것으로 판단된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 피부 조직 제조 (Skin tissue preparations)

피부 조직 샘플을 대한민국 고려대학병원의 피부과에서 얻었다. 공초점 라만(confocal Raman) 측정에 사용된 BCC 조직은 10명의 환자로부터 일반 생검법으로 얻었다. 크로스-섹션 20 μm 두께를 -20℃에서 미세절편기(microtome)로 자르고, 동결 절편을 사용전까지 액체 질소에 보관하였다. 두개의 박막 절편을 시험을 위해 잘랐다. 한 절편은 공초점 라만 프로파일링(confocal Raman profiling) 실험에 사용하고, 다른 한 절편은 H&E로 염색하여 일반 암진단을 위한 전문 병리학자에게 보내졌다. H&E 절편은 또한 비염색된 절편에서 서로다른 피부-층사이의 경계를 위치화하는 Raman reference로 사용되었다. 본 발명에서, BCC 조직의 세가지 다른 영역에 대한 특징적 라만 스펙트럼이 보여진다.

실시예 2: 공초점 라만 측정 (Confocal Raman measurements)

공초점 라만 측정은 Renishaw 2000 Raman microscope system을 사용하여 수행하였다. λ=514.5 nm 에서 작동하는 Spectra Physics 아르곤 이온 레이저가 약 20 mW 레이저 파워의 여기(excitation) 공급원으로 사용되었다. 레일레이(Rayleigh) 선은 콜렉션 통로에 위치한 홀로그래픽 노치 필터(holographic notch filter)에 의해 수집된 라만 산란으로부터 제거되었다. 라만 산란은 4 cm^-1의 스펙트럼 해상도로 전하결합소자(CCD) 카메라를 사용하여 검출하였다. 피부 조직 샘플의 광학 이미지를 얻기 위하여 광학 현미경에 추가적 CCD 카메라를 장착하였다. 비초점 레이저 빔으로부터 백그라운드 라만 산란을 줄이기 위해 2 슬릿 공초점 정렬(two-slit confocal arrangement)을 사용하였다. 모든 라만 스펙트럼은 초점외 신호를 제거하기 위해 공초점 모드로 측정하였다 (Lee, M.; Lee, J. P.; Rhee, H.; Choo, J.; Ghai, Y. G.; Lee, E. K. J Raman Spectrosc 2003, 34, 737-742). 라만 시스템에서, 핀홀(pinhole)의 기능은 입사 슬릿(entrance slit)과 CCD 검출기의 픽셀(pixels)의 협동으로 대체되었다. 제1 공초점 슬릿은 15 μm의 폭으로 세팅되었다. 그 다음 스펙트로미터 슬릿에 수직으로 정렬된 가상 제2 슬릿을 만드는 CCD 검출기상의 두개의 픽셀 로우(pixel rows)로부터 신호를 수집하였다. 이 경우, 피부 조직 샘플의 어떤 초점외 영역으로 인한 일탈(stray) 백그라운드 광이 효과적으로 제거되었다.

실험결과 (RESULTS AND DISCUSSION)

도 1은 세가지 다른 피부암 환자로 얻은 H&E 염색된 조직의 현미경 이미지를 보여준다. 어두운 영역이 BCC 조직이고 밝은 영역이 정상 조직이다. 생검 샘플의 이러한 생리학적 시험은 BCC의 라막 분광학적 동정의 표준을 제공한다. 라만 측정에서 공초점 기술의 필요성을 확인하기 위하여, BCC의 라만 스펙트럼을 두가지 다른 모드, 비-공초점 모드와 공초점 모드를 사용하여 측정하였다.

도 2는 상기 두가지 모드, 비-공초점를 사용하여 측정된 BCC 조직의 라만 스펙트럼의 비교를 보여준다(도 2a는 비-공초점 모드 및 도 2b는 공초점 모드). 형광 간섭(fluorescence interference)은 비-공초점 모드 라만 스펙트럼에서 매우 높았다. 이에 반해, 어떤 비초점 산란 신호를 제거하기 위해 15 μm 폭 공초점 핀홀을 사용했을 때 공초점 모드 스펙트럼에서 BCC 조직으로부터의 간섭 신호가 크게 감소하였다. 따라서, 공초점 기술은 조직으로부터의 자체-형광 신호(auto-fluorescence signals)를 줄이는데 매우 효과적이다.

도 3은 도 1a에 도시된 피부 샘플에 대한 공초점 라만 스펙트럼을 보여준다. 공초점 라만 현미경에 의해 정상 및 BCC 조직간에 명확한 구별이 보여졌다. 이들 스펙트럼의 많은 차이점들은 1000-1700 cm^-1 영역의 강도(intensity) 변화에서 일어난다. 먼저 연구에서(Nijssen et al., J Invest Dermatol 2002, 119, 64-69 Gniadecka et al., J Invest Dermatol 2004, 122, 443-449; Gniadecka et al., J. Photochem Photobio 1997, 66, 418-423; Gniadecka et al., J. Raman Spectrosc 1997, 28, 125-129 Nunes et al., Spectroscopy 2003, 17, 597-602), 아미드 (amide) III 모드의 경우 1250-1350 cm^-1 영역에서 PO₂- 스트레칭 모드의 경우 1000-1100 cm^-1 영역에서 정상 및 BCC 조직사이에 약한 스펙트럼 차이가 발견되었다. 그러나, 본 발명의 공초점 라만 스펙트럼의 경우, 이 영역에서 4개의 특징적 라만 밴드에서 명확한 스펙트럼 차이가 발견되었다. 도 3에서 보여지듯이, 어떤 통계적 처리 없이 스펙트럼으로부터 시각적 진단을 하는 것이 가능하다. 두개의 라만 스펙트럼사이의 더 상세한 비교를 위하여, BCC 조직의 라만 밴드를 정규분포 곡선-피팅 분석(Gaussian curve-fitting analysis)를 사용하여 분해하였다. 1000-1100 cm^-1 영역에서의 밴드의 넓은 중첩을 표 1에 나열한 3개의 특징적 밴드로 분해하였다. 라만 스펙트럼에서, BCC 조직의 경우 1656 cm^-1에서의 아미드(amide) I 밴드가 더 낮은 주파수로 이동(shift)되고 그 밴드 폭은 크게 넓어진 반면에, 1302 cm^-1에서의 아미드(amide) III 밴드는 더 높은 주파수로 이동되고 그 강도는 감소하였다. 이들 결과는 Gniadecka et al.에 의해 보고된 종래 라만 데이터와 유사하나(J Invest Dermatol 2004, 122, 443-449 J. Photochem Photobio 1997, 66, 418-423; J. Raman Spectrosc 1997, 28, 125-129), 본 발명의 공초점 스펙트럼은 정상 및 BCC 조직사이에 더 뚜렷한 차이들을 보여준다. 아미드 I 및 아미드 III 모드에서 라만 밴드 변화들은 정상 및 BCC 조직사이에 단백질의 2차 구조 변화와 밀접하게 관련되어 있다. 지방(lipids) 및 단백질(proteins)에 대한 1441 cm^-1에서의 CH₂ 변 형 모드는 고주파로 이동되었고 그 강도는 감소하였다. 인지질(phospholipids) 및 핵산(nucleic acids)에 대한 1085 cm^-1에서의 PO₂- 대칭성 스트레칭 모드는 저주파로 이동되었고 그 강도는 크게 감소하였다.

[표 1] 주변 정상 및 BCC 조직의 공초점 라만 주파수

a Assigned frequencies based on curve-fitting analysis

도 4는 도 1에서 세명의 서로다른 환자로부터의 정상 및 BCC 피부 조직에 대한 라만 스펙트럼을 보여준다. 세명의 다른 환자들의 정상 조직에 대한 라만 스펙트럼은 서로 그리고 종래 보고된 것과 매우 유사하였다. 세명의 환자로부터 BCC 조직의 라만 스펙트럼은 또한 매우 양호한 재현성(reproducibility)을 보여주었다. 정상과 BCC 조직사이의 직접적 차이들을 도 4에서 볼 수 있다. 특히, BCC 조직에서 아미드 III 밴드의 증강과 PO₂- 스트레칭 밴드의 소멸은 피부암 진단에 사용될 수 있다.

피부학적 진단에서 또 다른 주요한 요인은 라만 분광학을 이용하여 BCC가 주변 비종양 조직으로부터 얼마나 정확히 구별될 수 있는가이다(Kaminaka et al., J Raman Spectrosc 2001, 32, 139-141; Kaminaka et al., J Raman Spectrosc 2002, 33, 498-502). 라만 분광학은 생검 영역의 선별 및 선택을 위한 신속하고 정확한 진단 도구로 사용될 잠재성을 가지고 있다. 이를 확인하기 위해, 본 발명자들은 BCC 및 주변 조직에 대한 공초점 라만 깊이(depth) 프로파일링을 수행하였다. 도 5는 도 1a에서 H&E 염색된 조직의 확대된 현미경 이미지와 3040 μm의 간격으로 10개의 연속적 스팟(spots)에서의 그 공초점 라만 스펙트럼을 보여준다. 정상 및 BCC 영역 사이의 차이를 라만 측정을 위한 동결 조직의 이미지로는 볼 수 없으므로, H&E 염색된 이미지를 레퍼런스(reference)로 사용하였다. 1085 cm^-1를 중심으로 한 강한 PO₂- 대칭성 스트레칭 밴드가 정상 상피 (A 및 B) 및 진피 (I 및 J) 영역에서 관찰되었다 (도 5). 한편, 1589 cm^-1를 중심으로 한 강한 아미드 I 밴드가 BCC (D, E, F 및 G) 영역에서 관찰되었다. 정상 및 BCC 조직사이의 경계상에서는 (C 및 H), 중간 강도의 PO₂- 밴드가 관찰되었다.

피부학적 진단을 위한 공초점 라만 기술의 재현성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 도 1에서 다른 피부 조직들에 대해서도 공초점 라만 프로파일링 실험을 수행하였다. 도 6은 도 1b에서 두번째 피부 조직 샘플에 대한 라만 프로파일링 데이터를 보여준다. 이 경우 첫번째 게이스와 매우 유사한 라만 밴드의 패턴이 관찰 되었다. 상피 영역에서 (A, B 및 C), 강한 BCC 아미드 I 밴드가 관찰되지 않았고 정상 조직의 특징적인 강한 PO₂-밴드가 발견되었다. 그러나, BCC 영역 (D, E, F, G, H 및 I)의 경우, 강한 아미드 I 밴드가 관찰되었으나 정상조직의 강한 PO₂- 밴드도 또한 몇몇 케이스 (D, F, G 및 H)에서 발견되었다. H&E 염색된 이미지를 대응하는 라만 스펙트럼과 비교하였을 때, BCC가 균질적으로 전이되지(homogeneously metastasized) 않은 것으로 나타났다. 진피 영역에서 마지막 스펙트럼 (J)은 비종양 조직의 특징적인 라만 밴드들을 보여준다.

도 7은 도 1c에서의 샘플에 대한 스펙트럼을 보여준다. 진피 영역 (A, H, I, J and K)에서, 정상 조직의 전형적인 라만 스펙트럼이 보여지며, BCC 진피 영역 (D, E, F and G)에서 BCC 조직의 특징적인 라만 밴드들이 관찰되었다. 그러나, 이 샘플에서 정상과 BCC 조직사이의 경계상에서(B 및 C) 혼합된 라만 밴드들이 관찰되는 것이 흥미롭다. A 에서 D로 관찰된 스펙트럼 변화는 정상 조직에 대한 아미드 I 밴드가 BCC 조직에 대한 밴드로 이동된 것을 보여준다. 조직의 정상쪽으로부터 암쪽으로의 PO₂- 및 아미드 III 밴드의 명백한 강도 변화도 또한 볼 수 있다. 이들 결과는 인간 피부 조직에 공초점 라만 깊이 프로파일링 기술을 적용함으로써 주변 비종양 조직으로부터 암 조직을 정확하게 결정하는 것이 가능하다는 것을 보여준다.

라만 분광학은 정상 주변 조직으로부터 BCC 조직을 분별하기 위해 널리 사용되어 왔다. 종래 연구에서는, 인간 조직으로부터의 자기-형광(auto-fluorescence)을 최소화하기 위해 장파장 근적외선 레이저를 사용한 FT-라만 분광학 기술이 적용 되었다. 그러나, 이 경우 스펙트럼을 장시간동안 축척시켜도 약한 산란 효율 때문에 라만 강도가 비교적 약했다. 결과적으로, PCA 분석 또는 신경망을 이용한 수집된 라만 데이터의 통계적 처리가 정상 조직으로부터 BCC 조직을 분별하기 위해 필요하였다. 본 발명에서는, 514.5 nm 아르곤 이온 레이저를 이용한 공초점 라만 분광학이 BCC의 진단에 성공적으로 적용될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 조직으로부터의 면외(out-of-plane) 자기-형광 신호들은 공초점 기술에 의해 효율적으로 제거될 수 있었다. 특히, 아미드 I 모드와 PO₂- 대칭성 스트레칭 모드의 경우 정상 및 BCC 조직사이의 뚜렷한 라만 밴드 차이들은 이 공초점 라만 기술이 어떤 데이터의 통계적 처리가 필요없이 피부학적 진단 도구로서 강력한 잠재성을 가진다는 것을 보여준다.

생검의 선별과 선택을 위한 신속하고 정확한 BCC 진단 도구는 Moh's 미세도식 수술법(Moh's micrographic surgery)에 중요하다. 따라서, 공초점 라만 깊이 프로파일링은 건강한 주변 조직으로부터 BCC 영역을 정확하게 결정하기 위해사용될 수 있으며, 이는 주변의 비종양 조직으로부터 암 영역을 정확히 분별하는 것을 가능케 한다. 경계선(borderline) 부근의 정상 및 BCC 조직의 혼합된 아미드 I 밴드뿐만 아니라, BCC 영역내에서 비균질적 전이로 인한 정상 조직의 PO₂- 밴드의 불규칙한 패턴들도 검출될 수 있었다. 본 발명자들은 본 발명의 공초점 라만 프로파일링 기술이 피부학적 진단 도구로서 강력한 성능을 가진다는 것을 밝혀냈다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 라만 분광학(Raman spectroscopy)은 피부암의 비침투적 진단을 제공하는데 강한 가능성을 가진다. 본 발명에서는, 아미드(amide) I 모드와 PO₂- 대칭성 스트레칭 모드에서 정상 및 BCC 조직사이의 뚜렷한 라만 밴드 차이들은 이 기술이 스펙트럼 데이터의 통계적 처리가 필요없이 피부학적 진단 도구로서 사용될 강한 잠재능을 가지고 있다는 것을 보여주었다. 또한, 공초점 라만 뎁스 프로파일링(confocal Raman depth profiling) 기술을 사용하여 주변의 비-암성 조직으로부터 BCC 조직을 정확히 분별하는 것이 가능했다. 따라서, 공초점 라만 분광학은 정상 및 BCC 조직사이의 스펙트럼 차이들의 직접 관찰이 가능하기 때문에 피부학적 진단의 새로운 방법을 제공할 수 있다.

Claims

라만 분광법에 있어서 2 슬릿 공초점 정렬(two-slit confocal arrangement)을 사용하여 제1 공초점 슬릿은 10 - 20 μm의 폭으로 세팅하고 제 2슬릿은 스펙트로미터 슬릿에 수직으로 정렬된 CCD 검출기상의 두개의 픽셀 로우(pixel rows)로부터 가상 제2 슬릿을 만드는 것을 특징으로 하는 라만 신호를 방해하는 조직으로부터의 자기-형광(Auto-fluorescence) 신호를 감소시키는 방법.
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