KR100646313B1 - 알러지 질환 예방 및 치료용 펩티드 또는 그의 염 및 이를함유한 의약 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알러지 예방 및 치료용 펩티드 및 그의 염에 관한 것으로, 하기의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 염을 제공하고,
(a) RVSSCRGRNHIV;
(b) ETIGARWVRIE;
(c) PHVMRGGEYSGA;
(d) LVAHVGAGGVL; 및
(e) LSYLLWRSRLP
상기의 펩티드 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환 예방 및 치료용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명에서 발굴된 펩티드들은 인간 알러지 환자의 혈청과 결합하는 특성을 가지고, 세포 주 및 동물실험에서 알러지 억제 효과를 나타내어 알러지 예방이나 치료용 제제에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
알러지 질환, 펩티드, 예방, 치료, 의약 조성물
Description
도 1은 본 발명에서 사용된 무작위 펩티드 라이브러리를 대장균에 발현하기 위한 재조합 플라스미드와 이의 발현을 나타낸 모식도,
도 2는 본 발명에서 무작위 펩티드 라이브러리와 알러지 환자의 혈청을 반응시켜 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드들의 발굴과정을 나타낸 바이오패닝의 모식도,
도 3은 본 발명에서 난백(a)와 집먼지진드기(b)에 양성반응을 보이는 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드를 암호화하는 포함하는 세균에서 플라스미드를 추출한 후 PCR을 통해 상기 펩티드의 존재를 확인한 전기영동 사진,
도 4는 본 발명에서 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드를 암호화한 유전자를 포함하는 PCR 산물을 T vector에 삽입한 후 EcoRI 제한 효소로 절단하여 삽입 여부를 확인한 전기영동 사진,
도 5는 본 발명에서 트립토판에 의한 펩티드-티오레독신 융합 단백질의 발현을 검증한 웨스턴 블랏 사진,
도 6은 본 발명에서 발굴한 펩티드들를 포함한 대장균에서 알러지 환자의 혈 청과 결합함을 나타내는 ELISA의 결과 그래프,
도 7은 항원자극에 의한 베타 헥소스아미니데이즈 (b-hexosaminidase) 의 분비 효과를 나타낸 그래프,
도 8은 베타 헥소스아미니데이즈의 분비에 필요한 신호전달 분자들의 관계를 나타낸 그래프,
도 9는 본 발명의 펩티드에 의한 베타 헥소스아미니데이즈의 분비 억제효과를 나타낸 도면.
본 발명은 알러지 예방 및 치료용 펩티드 및 그의 염에 관한 것이고, 보다 상세하게는 인위적인 12량체의 무작위 펩티드 라이브러리를 이용하여 발굴한 5종으로 이루어진 군에서 적어도 한종 이상 선택된 펩티드 및 그의 염을 유효성분으로 함유한 알러지 예방 및 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
종래 알러지(allergy)를 치료하는 방법에는 알러겐(allergen) 회피요법, 항 알러지 약물사용, 특정 알러겐에 대한 면역 치료 요법 등을 사용하고 있다. 이중 가장 널리 사용되는 알러지 치료 약으로는 항 히스타민 약품과 코르티코스테로이드(corticosteroid)계통의 약품이 있다.
그러나, 지난 수 년간 다수의 약이 개발되었으나 증상을 완화하는 데 그쳐 실제로 알러지의 근본 원인에 대한 대책은 현재까지 없는 실정이다. 이에 따라 새 로운 개념의 알러지 치료 제 개발이 시급한 시점에서 새로운 개념에 따른 알러지 치료제의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
그리고 현재 개발 중이거나 종래 알러지에 대한 치료방법은 다음과 같다.
(1) 특정 알러겐 을 이용한 면역치료법(Specific allergen immunotherapy)
전통적인 면역 요법으로 알러겐(allergen)을 장기간에 걸쳐 그 양을 증가시키면서 알러지 환자에 투입하는 방법인데, 상기 방법은 알러지 성 비염의 치료에 효과를 보였고 알러지성 천식에도 효과가 있으며, 이러한 면역요법은 T 세포 반응을 Th2 유형에서 Th1으로 바꾸게 함으로 알러지 환자의 증상을 완화시키게 하고 알러겐의 특이적 Ig G 반응을 유도하는 치료방법이다.
하지만, 상기 면역 요법은 환자의 증상을 완화시킬 수는 있지만, 근본적인 치료는 되지 못한다는 문제점이 있다.
(2) 사이토카인(Cytokine) 요법
인터루킨 4(IL-4)는 IgE 항체 생성에 매우 중요한 역할을 하여, 알러지 치료의 표적 단백질로 인식되어 왔으며, 동물 모델에 따르면 IL4 수용체에 대한 항체는 각종의 알러지 질환을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이중, STAT6 (signal transducer and activator of transcription 6; 전사 인자의 일종) 결손 쥐 실험결과에 따르면 IL-4에 의한 신호전달에 결함을 보이는데, 이러한 결과를 토대로 STAT6을 표적으로 한 치료제 개발이 시도되고 있다.
이외에도 IL-5, IL-13, IL-9 등의 cytokine (사이토카인) 들을 표적으로 하는 치료제 개발이 시도되고 있다.
(3) Vaccine (백신)
바이러스(Virus) 혹은 세균에 의한 감염은 흔히 Th1 면역반응을 유발하여 알러지 반응을 억제하는 효과를 나타내는 데, 이러한 점에 착안하여 Th1 반응을 유발하는 백신의 경우 알러지를 억제 할 수 있는 효과를 나타내리라 예상된다.
이중, 결핵균의 경우 IFN-gamma, IL-12등 Th1반응을 유발하여 allergen (알러겐)에 대한 감수성을 저하시키는 역할을 할 수 있으며, 실례로 BCG 접종은 알러지 유발을 억제한다는 보고가 있다.
또한, DNA 백신이 Th1 반응을 유도한다는 여러 보고들이 있어 이를 이용한 알러지 치료제 개발이 이루어지고 있다. 실례로 베타-갈락토시데이즈 유전자가 Th1 반응을 유도한다는 보고가 있으며, 집 먼지 진드기 알러겐의 일종인 Der p5을 암호화하는 유전자의 경우 IgE 생성을 억제하고, 히스타민 분비를 억제한다는 연구결과가 있다. 그리고, 동물실험의 경우 CpG-ODN (CpG oligodeoxynucleotides)이 Th1 반응을 유발한다는 보고가 있고, CpG-ODN 의 경우에는 NK (자연살상세포;natural killer), DC(수지상 세포; Dendric cell)등을 자극하는 데, 자극 받은 DC(수지상 세포)은 MHC class II, CD80, CD86 와 같은 costimulatory molecules의 발현을 유도하고 IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alpha 등과 같은 Th1 반응을 매개하는 cytokine 들의 발현을 증가시키는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
이중, CpG-ODN이 실제로 인체 내에서 알러지 유발을 억제하는 지는 많은 연구결과를 요하나 현재 in vitro 실험결과에 따르면 인간 림프구(human lymphocytes)는 CpG-ODN 에 대한 반응이 쥐와 유사함을 보이는 것으로 알려져 CpG- ODN은 알러지 치료제로 개발이 예상된다.
(4) 항 IgE 항체 치료
가장 효과적인 알러지 치료는 IgE항체를 중화시키는 방법으로, IgE의 중화를 위해서는 수용체와 결합하는 IgE의 특정 부위에 대한 항체를 제조하는 것이 효과적인 방법이다.
과민성 쇼크(Anaphylactic shock)를 유발하지 않는 anti IgE-항체들이 제조 되었으며, 이러한 항체들은 IgE을 인지하나 히스타민(histamine) 분비를 초래하지 않으므로 향후 매우 효과적인 알러지 치료제로 개발될 것으로 예상된다.
현재까지 CDR(complementarity determining region) 이식 방법을 이용하여 수종의 알러지 치료용 인간화 항체가 만들어 졌고, 이러한 항체들은 IgE 생성을 선택적으로 억제하여 치료하였다.
(5) 펩티드 면역 치료
이 방법은 알러지 유발원에 의해 유도되는 CD4 T 세포 반응을 억제하는 펩티드 단편을 이용하는 방법이다.
알러겐 추출물(Allergen extracts)을 이용하는 경우 Ig E 에 의해 매개되는 과민성 쇼크반응을 야기 할 수 있는 등 그 위험성이 크나, 펩티드 단편을 이용할 경우 이러한 문제를 초래하지 않는 장점이 알려져 있기 때문이다.
실례로 고양이의 알러지 유발원인 Fel d에서 유래된 펩티드의 경우 Th2(T-helper 2) 사이토카인의 발현 수준을 감소시킴으로써 알러지 증상을 완화시킨다는 연구결과가 보고되고 있으나, 긴 펩티드들의 경우에는 부작용이 보고 되고 있어 최 근에는 비교적 짧은 펩티드(16 or 17량체의 아미노산)을 이용하는 치료 법이 활발히 개발되고 있다.
그리고, 벌의 독소(venom)에 포함되어있는 펩티드 (mast cell degranulating peptide)를 이용하여 IgE 항체가 RBL2H3 (랫의 호염기구 세포 주) 세포주의 수용체에 결합하는 것을 방해함으로써 알러지를 치료하는 시도가 이루어지고 있다.
그리고, 안젤리카(Angelica Buku 등; Peptides 22, 1993-1998, 2001)나 애나(Anna Erdei (Immunology letters 92, 39-42, 2004,) 등은 보체 (complement) 에서 유래된 펩티드들을 이용하여 항원에 의한 비반 세포의 활성화를 억제함으로써 상기 펩티드들(보체에서 유래된 펩티드들)이 알러지 치료제로서 가능성이 있음을 보여주었다.
이와타와(Iwata A)등은 자살을 억제하는 범용 케스페이즈(caspase) 억제제인 z-VAD-Fmk (N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone) 펩티드가 동물 실험모델에서 T 세포의 활성화를 억제함으로써 천식을 억제한다는 것을 밝혀냈다 (J. Immunol. 2003 170(6):3386-3391).
그리고, 상술한 바와 같이, 알러지 질환의 유발을 억제하는 물질에 대한 연구도 활발하면서, 알러지를 유발하는 물질에 대한 연구도 다음과 같이 동시에 진행되고 있다.
(1) 알러지를 유발하는 단백질의 발굴에 관한 연구현황
알러지 질환의 진단 및 치료 제 개발에 관한 연구는 알러지 를 유발하는 수 종의 식품 내 에 존재하는 단백질의 발굴을 위주로 이루어져왔다. 마오(Mao J.L.,) 등은 집 먼지 진드기인 Dermatophagoides
farinae로 부터 단백질들을 추출하여 2D-PAGE (2차원 단백질 전기영동)을 실시한 후 집 먼지 진드기에 민감한 알러지 환자의 혈청과 반응하여 Ig E 항체 반응을 유도시키는 Der f 4,5,6으로 명명된 4 종의 신규 알러지 유발 단백질들을 발굴하였다(J Allergy Clin. Immunol. 102: 631-636, 1998).
캐쉬 열매(Cashew nuts)는 접촉성, 전신성, 혹은 아토피성 피부염을 유발하는 식품으로 알려져 있는 데, 알러지를 유발하는 신규 단백질을 발굴하기 위하여 왕. F(Wang F) 등은 캐쉬 열매로 부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA 라이브러리를 제조 한 후, 이를 대장균에 발현하여 재조합 cDNA 발현 라이브러리를 제조하고 이를 캐쉬 알러지를 앓고 있는 환자의 혈청과 반응시켜 양성 반응을 보이는 플라크(plaques)을 선택하여 그 염기서열을 밝힘으로써 캐쉬 알러지를 유발하는 신규 단백질을 발굴하였다(2002, J. Allergy Clin. Immunol. 110: 160-166).
그러나, 이 신규 단백질은 50 Kd의 크기를 나타내며 Ana o1(Anacardium occidental) 으로 명명되었고, 이 단백질은 캐쉬 알러지를 앓고 있는 환자의 50%에서 발견되나 캐쉬에 저항성을 보이는 경우에도 25 % 정도의 양성률을 보이므로 진단의 적합한 표지자로 보기에는 어렵운 문제점이 있다.
참깨(Sesame seed)에 대한 알러지는 패스트푸드산업의 급속한 성장으로 인해 그 수가 날로 증가하고 있는 데, Beyer K 등은 참깨에 대한 알러지를 유발하는 단백질들을 발굴하기 위해 참깨에서 단백질을 분리한 후 2차원 전기영동 을 수행하고 이들 단백질들을 니트로셀룰로즈막에 전이한 후 참깨 알러지 환자의 혈청과 반응하 여 양성반응을 보이는 단백질들을 발굴하였다.
그리고, 2차원 전기영동 외 웨스턴 블롯 을 수행한 결과 78,52, 45,34, 29 Kd 등의 크기를 갖는 10 종의 IgE-항체 결합 단백질들을 발굴하였고 이중 45Kd 단백질의 경우 참깨 알러지 환자의 75%에서 양성반응을 보임을 밝혀내었다. 그리고, 상기 단백질을 시퀀싱(sequencing)한 결과, 7S 비실린형 글루블린(7S vicilin-type globulin)으로 밝혀졌다(J. Allergy Clin. Immunol. 110: 154-159, 2002).
땅콩(Peanut)에 대한 알러지는 소아와 어른에 호발 하는 대표적인 알러지 질환으로 예전부터 땅콩 알러지를 유발하는 단백질 발굴에 많은 연구가 진행되어왔다. 이중 폰(Pons L.,) 등은 올레오신(oleosin)이 땅콩 알러지를 유발하는 단백질임을 밝혀냈고 재조합 올레오신은 땅콩뿐만 아니라 콩 알러지 환자의 혈청과도 반응을 나타내는 것으로 알려졌다(Allergy 72: 88-93, 2002).
그리고, 퀴르스(Quirce S.,)등은 콩 알러지를 유발하는 단백질로 트립신 억제자(trypsin inhibitor)를 밝혀냈고(J. Allergy Clin. Immunol. 109(1): 178, 2002), 오가와 A(Ogawa A) 등은 콩 유래의 아토피성 피부염을 앓고 있는 환자의 혈청과 반응하는 알러지 유발 단백질을 발굴 하였는 데, 이들은 당단백질(glycoprotein)의 일종으로서 60Kd, 30Kd, 28 Kd 의 크기를 나타내는 연구결과를 발표하였으며(J.Nutri Sci. Vitaminol. 46(6):271-279, 2000), 폴트로니어리 P(Poltronieri P.,) 등은 아몬드(Prunus dulcis)에서 알러지를 유발하는 단백질들을 발굴하였는데 이들은 2S 알부민과 코글루틴 감마(conglutin gamma)임을 밝혀내었다(2002 Int. Arch. Allergy Immunol. 128(2):97-104).
또한, 오우 K(Ou K )등은 콜로칼리아류(Collocalia spp.)의 새둥지로부터 단백질을 분리 한 후, 2D-PAGE을 수행하여 이들 단백질들을 니트로셀룰로오즈막에 전이하고 이를 환자의 혈청과 반응하여 양성 반응을 보이는 단백질들을 발굴하였다.
토브(Tove L.J.E.,) 등은 집먼지 진드기에서 알러지를 유발하는 단백질을 파지 디스플레이 기술(phage display technique)을 통해 발굴하여 Ld 5,7,13으로 각각 명명하였다(Eur J. Biochem. 268 : 287-294, 2001).
상기 2D-PAGE 에 의해 발굴된 이들 신규 알러지 유발 단백질들은 알러지 질환에 대한 매우 중요한 연구자료 활용되어 진단 및 치료제 개발에 유용한 소재로 사용될 수 있을 것이다.
이에, 본 발명자는 각종 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드들을 다수 발굴하고, 상기 발굴된 펩티드의 기능을 검증함으로써 알러지 예방 및 치료용 의약 조성물로 개발하고자 하였으며, 보다 구체적으로 난백, 집머지 진드기 등에 양성 반응을 보이는 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드들을 다수 발굴하고자 하였으며, 다수 발굴된 펩티드 중 5종의 신규한 펩티드가 항알러지 반응이 나타냄을 증명하여 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 알러지 유발물질(allergen)에 양성반응을 보이는 알러지 환자의 혈청과 결합하는 짧은 아미노산 서열을 가지는 다수의 펩티드로 이루어진 군에서 적어도 한종 이상 선택된 펩티드 및 그의 염을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 펩티드 또는 그의 염을 유효성분으로 함 유하는 의약 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 그의 염을 제공한다.
(a) RVSSCRGRNHIV;
(b) ETIGARWVRIE;
(c) PHVMRGGEYSGA;
(d) LVAHVGAGGVL; 및
(e) LSYLLWRSRLP
또한, 본 발명은 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 펩티드 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환 예방 및 치료용 의약 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.
또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명은 대장균(E
coli)의 표면에 전개된 무작위 펩티드 라이브러리 (rendom peptide library)에서 난백, 집 먼지진드기 등에 양성반응을 보이는 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드를 발굴하고, 이를 생물학적인 검증을 통하여 항알러지의 특성을 갖는 신규한 펩티드 및 약제학적으로 허용이 가능한 그의 염을 결정하고, 상기 펩티드 및 그의 염을 유효성분으로 함유하는 알러지 예방 및 치료용 의약 조성물이다.
그리고, 본 발명은 알러지(allergy)를 유발하는 신규 단백질을 발굴하기 위하여, 대장균 (E. coli) 표면에 발현시킨 12량체(12 mer)의 무작위 펩티드 라이브러리를 알러지 환자의 혈청(난백, 집 먼지 진드기 등)과 반응하여 반응성을 보이는 펩티드들을 대량 발굴하고, 상기 발굴된 펩티드를 추후에 항알러지 제제로 개발하는 것이다.
이때, 본 발명에서 사용한 무작위 펩티드 라이브러리는 인위적으로 무작위로 12량체로 제조한 펩티드이기 때문에 종래 자연적인 단백질에서 유래된 알러지 혈청 결합 펩티드들과는 아미노산 서열에서 많은 차이를 보이는 신규한 펩티드이다.
또한, 본 발명은 천연물질에서 펩티드를 발굴하는 것이 아니므로, 향후 알러지 혈청 결합 펩티드 뿐만아니라 다른 단백질의 표면과 특이적인 결합을 하는 펩티드의 크기를 인위적으로 제한하여 무한하게 펩티드를 개발할 수 있다.
그리고, 본 발명에서는 공지된 바이오패닝방법(biopanning; Sidhu Phage display in pharmaceutical biotechnology, Curr Opin biotech, 11, 610∼616, 2000)을 통하여, 상기 무작위 펩티드 라이브러리(dodeca peptides)가 티오레독신 (thioredoxin)의 활성부위에 삽입된 형태로 존재하면서 티오레독신 자체는 플라겔 린(flagellin) 유전자의 불용부위에 삽입시킨 재조합 플라스미드(phagemid)를 사용하여 세균의 필리(pili) 끝부분에서 발현되게 함으로써, 알러지에 반응을 하는 펩티드의 발굴을 용이하게 한다.
그리고, 상기의 펩티드 라이브러리는 5회의 바이오패닝방법을 통해 난백, 집 먼지 진드기에 양성반응을 보이는 알러지 환자의 혈청과 반응시키고, 혈청과 반응하는 펩티드는 산성 (pH 2.2) 완충용액으로 용출하며, 용출된 용액은 중화시키고 세균용 고체 선택배지에 도말 한 후 형성되는 콜로니를 이용하여, PCR을 통해 알러지와 반응하는 펩티드를 암호화하는 유전자를 대량 수득한다.
그리고, 상기 수득한 PCR 산물은 공지의 방법에 따라 T vector 에 삽입하고 대장균에 형질전환 시키고, 형질 전환된 대장균에서 플라스미드 DNA를 역시 기지의 방법에 따라 추출하여 DNA 염기 서열을 결정함으로써 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드의 아미노산 서열을 결정한다.
그리고, 본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 총 42개의 펩티드를 발굴하였으며, 상기 발굴된 펩티드의 효능을 입증하고자 다음과 같은 공지의 방법을 사용하였다.
(1) 효소면역 측정법
먼저, 펩티드들을 암호화하는 유전자를 포함하는 세균을 이용하여 알러지 환자의 혈청과의 반응성을 ELISA (효소 면역 측정법) 방법을 통해 검증한다.
(2) 랫 호염기구 세포주
또한, 본 발명에서 발굴된 펩티드들의 항 알러지성 기능을 검증하기 위해서 알러지 반응의 모델로 잘 알려진 랫 호염기구 세포주(RBL2H3)를 이용한다.
이는 RBL2H3 세포주는 그 표면에 IgE 항체의 수용체를 갖고 있고, 상기 수용체는 항원에 의한 자극으로 서로 복합체를 이루게 되면, RBL2H3 세포 내의 입자들이 터지면서 입자 내에 포함된 베타 헥소스아미니데이즈(β-hexosaminidase)라는 효소를 분비하게 되는 데, 상기 효소의 분비가 급격히 증가하면 알러지 반응이 발생하고, 알러지 반응시 칼슘(calcium) 이온의 유입이 증가하여 타이로신 키나제의 일종인 세린/타이로신 키나제(Syk)의 활성화가 일어나서 미토젠 활성화 단백질 키나제(mitogen activated protein kinase; MAPK) 등의 키나제 활성이 연쇄적으로 일어나는 알려져 있기 때문이다.
본 발명에서는 발굴된 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드 들이 베타 헥소스아미니데이즈(b-hexosaminidase)의 분비를 억제하는지의 여부를 조사한 결과, 상기 42종의 펩티드 중 상기한 5종의 펩티드들이 농도 의존적으로 상기 효소의 분비를 억제하는 것을 입증하였다.
(3) 비반 세포주
비반 세포(mast cell)는 폐, 피부, 소장 등의 조직에서 존재하며 알러지 반응과 밀접한 관련이 있다. 비반 세포의 표면에는 IgE 항체의 수용체가 존재하며 항원에 의한 자극 시 이들 수용체들이 복합체를 형성하면서 비반 세포내의 입자들이 분비된다. 이때 입자에 포함되어있는 베타 헥소스아미니데이즈 (b-hexosaminidase) 가 분비 되고 leukotriene (류코트라이엔), histamine (히스타민) 등의 매개 물질들이 분비된다.
이의 특성을 이용하여, 본 발명에서는 발굴된 상기 5종의 펩티드들이 이러한 매개 물질의 분비를 억제 하는지의 여부를 조사하고자, 해명 (guinea pig) 의 폐 조직을 기지의 방법에 따라 분리하고 분리 된 폐 조직을 콜라게나제 (collagenase), 엘라스타제 (elastase) 등의 효소로 처리 한 후, 퍼콜(percoll)을 이용한 불연속 밀도 구배로 비반 세포를 정제하고, 정제 된 비반 세포를 오발부민 (ovalbumin)에 반응을 보이는 폴리클로날 IgG 항체로 감작 시킨 다음, 오발부민으로 자극하는 실험을 수행한 결과, 오발부민에 의한 자극은 히스타민의 분비를 유도하나, 본 발명에서 발굴한 펩티드를 전 처리하면 상기 히스타민 유도 현상이 감소된다.
이 밖에, 본 발명에서 베타 헥소스아미니데이즈 (b-hexosaminidase)의 분비에 관여하는 신호전달 분자에 관한 연구도 병행하였는데, 베타 헥소스아미니데이즈 (β-hexosaminidase)의 분비에 활성산소의 생성이 수반 된다는 사실을 알아냈고, ERK, PI3 키나 제 등의 신호전달분자의 기능이 억제 되었을 때 상기 효소의 분비도 억제 됨을 알 수 있었다.
결론적으로, 본 발명에서 발굴한 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드들은알러지의 표지 효소인 베타 헥소스아미니데이즈를 농도 의존적으로 감소시키며, 알러지 반응의 매개 물질인 히스타민의 분비도 억제한다.
또한, 본 발명에서 발굴한 5종의 펩티드는 베타 헥소스아미니데이즈의 억제 효과가 기존의 항 알러지 치료 약물인 케토티펜 퓨마레니트(ketotifen fumarate)와 유사함을 갖는다.
따라서, 본 발명은 이들 펩티드들을 응용하여 알러지 예방 및 치료용 의학 조성물로서 개발할 수 있는 것이다.
이때, 상기 펩티드에서 발굴한 펩티드는 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를들어 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용한다.
좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용하는 것이 바람직하다.
그리고, 본 발명에서 발굴한 펩티드 및 그의 염을 유효성분으로 함유하는 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용하여 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리(pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다.
이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통해 약제의 투여를 의미한다.
그리고, 상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화할 수 있다.
그리고, 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 신체에서 탈감작하지 않는 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 펩티드제제류의 유효량인 체중 1㎏ 당 10∼5,000㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여한다.
한편, 본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명 법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌:A , 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D
시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글라이신: G
히스티딘: H, 이소루신: I, 루신: L, 리신: K, 메티오닌: M
페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W
티로신: Y, 발린: V
그리고, 본 발명에서 발굴된 신규 펩티드의 합성방법은 공지된 고체-상 합성 기술(Kaumaya. P. et al., Synthetic peptide vaccine:Misconceptions and problem, strategies and prospects Innovation and Perspectives in solide Phase Synthesis, Mayflower, 279∼292, 1994)을 사용하는 것이 바람직하나, 상기 펩티드를 합성할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법을 사용해도 무방하다.
이때, 신규 펩티드의 합성에 사용되는 아미노기를 갖는 불용성 수지로는 아 미노메틸수지, 메틸벤즈히드릴아민수지, 아미노메틸페녹시메틸수지 및 그의 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.
그리고, 보호 아미노산은 아르기닌의 구아니티노기용의 보호기인 Tos(토실), NOa(니트로), Mtr(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐) 및 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸클로만-6-술포닐)과, 아미노산의 α-아미노시용 보호기인 Boc(t-부틸옥시카르보닐), Fmoc(9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐)과, 메르캅토기용 보호기인 Bzl(벤질), MBzl(4-메톡시벤질), Acm(아세타미노메틸) 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.
[실시 예 1] 알러지 혈청의 진단 및 병리학적 특성
본 실시 예는 항알러지성 펩티드를 발굴하기 위해 사용되는 혈청을 준비하여 이의 진단 및 병리학적 특성을 알아보고자 하였다.
먼저, 8명으로 이루어진 알러지 환자의 혈청을 진단하여 환자별로 나눈다음, 상기 환자별로 나눈 혈청의 병리학적 특성을 아토피피부염 환자는 하기 표 1에, 천식환자는 하기 표 2에 각각 나타내었다.
이때, 난백에 반응한다 함은 검사 결과 난백에 대한 혈청 내 Ig E 항체의 수치가 대개 3이상인 것으로, 음식물 알러지 환자의 특성상 여타 음식물에도 반응함을 배제 할 수는 없으며, 집 먼지 진드기에 양성 반응을 보이는 알러지 환자의 경 우는 대개 음식물에 대한 알러지 반응을 갖고 있지 않는 것으로 분석되었다.(표 2 참조).
| 번호 | 나이 | 검사코드 | 검사결과 | 번호 | 나이 | 검사코드 | 검사결과 |
| 21 | 난백 | 45.2 | 난백 | 101 | |||
| 1 | 콩 | 101 | D.F. | 0.49 | |||
| 우유 | 101 | 총 IgE | 1156 | ||||
| D.F. | 4.13 | D.P. | 0.74 | ||||
| 총 IgE | 3041 | 밀 | 58.9 | ||||
| D.P. | 3.94 | 메밀 | 16.4 | ||||
| 밀 | 30.1 | 땅콩 | 16.9 | ||||
| 메밀 | 4.64 | 28 | 1 | 콩 | 58.4 | ||
| 땅콩 | 101 | 우유 | 2.08 | ||||
| 22 | 1 | 콩 | 48.8 | D.F. | 42.8 | ||
| 난백 | 101 | 난백 | 101 | ||||
| 우유 | 0.5 | 총 IgE | 6910 | ||||
| 총IgE | 944 | D.P. | 71.6 | ||||
| D.P. | 0 | 밀 | 101 | ||||
| 밀 | 36.2 | 메밀 | 14.4 | ||||
| 메밀 | 10.8 | 땅콩 | 69.3 | ||||
| 땅콩 | 83.6 | 토마토 | 32.3 | ||||
| D.F. | 0 | 옥수수 | 101 | ||||
| 26 | 1 | 우유 | 29.5 | 감자 | 57.1 | ||
| 콩 | 18.8 |
| 번호 | 나이 | 검사코드 | 검사결과 | 번호 | 나이 | 검사코드 | 검사결과 |
| 12 | 4 | 총 IgE | 539 | 잔디 | 0 | ||
| D.P. | 60.4 | 나무 | 0 | ||||
| D.F. | 101 | 잡초 | 0 | ||||
| 잔디 | 0 | 17 | 6 | D.F. | 101 | ||
| 나무 | 0 | D.P. | 56.7 | ||||
| 잡초 | 0 | 우유 | 0.81 | ||||
| 14 | 6 | D.F. | 101 | 총 IgE | 1144 | ||
| D.P. | 101 | 콩 | 0 | ||||
| 우유 | 0.59 | 잔디 | 0 | ||||
| 총 IgE | 1235 | 나무 | 0 | ||||
| 난백 | 1.27 | 잡초 | 0 | ||||
| 메밀 | 0 | 19 | 5 | D.F. | 76.2 | ||
| 콩 | 0 | 5 | D.P. | 16.1 | |||
| 난황 | 0 | 5 | 총 IgE | 220 |
그리고, 상기 수명의 혈청을 혼합한 혈청을 다음의 바이오패닝 실험에 사용하였다.
[실시예 2] 바이오패닝 (biopanning)
본 실시 예는 기 공지된 바이오패닝방법을 사용하여, 무작위 펩티드 라이브러리로부터 알러지 환자의 혈청과 반응하는 펩티드를 발굴하고자 하였다.
먼저, 쥐(Mouse)의 Ig G (임뮤노글보불린 G)항체를 포함하는 세파로스(sepharose) 비드 100㎕에 쥐 항-인간 Ig E 항체(Mouse Anti-Human Ig E antibody; Fc 수용체에 특이적 항체) 10㎕를 400㎕의 PBS 완충용액(1% BSA 포함)에 넣어서 록커(loccker)에서 1시간 반응시켰다. 그리고, 반응 후 PBS완충용액 (500㎕)를 넣어서 잘 섞어주고 4℃ 2000rpm 조건에서 5 분간 원심 분리하여 상등 액을 버리고 PBS 완충 용액으로 씻어주었다.
그리고, 블라킹(blocking) 완충용액(1X PBS, 0.05% Tween 20, 2%BSA)를 500㎕넣고 록커에서 1시간 반응시키고, PBS 완충용액으로 씻어 준 다음 여러 환자의 혈청을 포함한 알러지 환자의 혈청을 200㎕넣고 록커에서 1시간 반응시킨 후 PBS 완충용액으로 씻어주었다. 그리고, 12량체의 무작위 펩티드 라이브러리(random peptide library; 12-mer peptides) 100㎕를 넣고 록커에서 1시간 반응시키고, 증류수와 PBS 완충용액으로 각각 1회 씻어준 후, 세척 액 (5mM Tris-Cl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)으로 5회 씻어주고 마지막으로 다시 증류수와 PBS 완충용액으로 각각 1회 씻어주었다.
그런다음, 알러지 환자의 혈청에 결합된 펩티드들의 용출을 위해 용출 완충용액(0.1M HCl, 0.1% BSA pH2.2) 100㎕를 넣고 용출 시키고, 용출된 용출액을 중화용액(2M Tris base)으로 중화 시키고 대장균용 고체 배지(LB/Amp)에 도말(smear)하 였다(도 1 및 도 2 참조).
그리고, 상기 고체 배지에 형성된 콜로니는 하기 실시 예 3에 사용하였다.
[실시 예 3] 콜로니 PCR(중합효소연쇄상반응), T-vector 클로닝. 유전자의 발현 유도, 염기서열분석
본 실시 예는 실시 예 2에서 수득된 콜로니는 펩티드-티오레독신 융합 DNA를 발현하는 세균으로서, 상기 콜로니를 PCR 반응하여 알러지 환자의 혈청에 결합된 펩티드들(peptides)의 존재와 그 서열을 알고자 하였다.
(1) PCR
우선 수집된 상기 콜로니를 1㎖의 증류수에 풀어놓고 열처리 (95℃ 에서 5분간)를 한 후 그 중 1 ㎕를 취하고, DNA 주형으로 하여 PCR 반응을 수행하였다. 이때, PCR 반응은 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 에서 1분으로 하였고, PCR 반응은 30 사이클(cycle)로 하였다. 그리고, PCR 반응에 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같이 하였다.
정 방향 프라이머: 5'-ATTCACCTGACTGACGAC-3'
역 방향 프라이머: 5'-CCCTGATATTCGTCAGCG-3'
또한, PCR 반응에 사용된 혼합물의 조성은 다음과 같이 하였다.
반응 혼합물:50㎕, DNA 주형: 1㎕, 10 X PCR 완충용액: 5㎕,
100 mM dNTPs: 5㎕, 정방향 프라이머: 1 ㎕, 역방향 프라이머: 1㎕
멸균 증류수: 46㎕, Taq 중합효소: 1㎕
그런다음, PCR 반응 산물 50㎕ 중에서 1㎕를 취하여 2% 아가로스 겔에 로딩 하여 전기영동을 수행하였다.
이의 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 177 bp의 산물이 난백(a)과 집먼지 진드기(b)에 양성반응을 보이는 알러지 환자의 혈청과 반응하는 펩티드를 암호화하는 유전자 염기서열(36 bp)을 포함하는 것을 알 수 있었다.
이는 세균 표면에 전개된 형태로서 티오레독 유전자의 불용부분에 삽입되어 peptide를 암호화하는 유전자외에 그 밖의 부분도 증폭하게 되기 때문이다.
(2) T-벡터 클로닝
그리고, 상기 전기영동에서 분리된 밴드를 잘라서 기 공지의 방법에 따라 DNA를 용출하고, 용출된 DNA를 T vector 에 삽입한 다음, 삽입된 DNA를 포함하는 T vector를 제한효소인 EcoRI으로 잘라서 DNA 삽입이 정상적으로 이루어 졌는지를 확인한 결과, 도 4에 도시된 바와같이, 정상적으로 삽입되었음을 알 수 있었다.
이때, T vector 에 펩티드를 암호화 하는 유전자를 삽입하는 반응은 다음과 같이 수행하였다.
T-Vector 클로닝; 결찰 완충용액 A(Ligation buffer A) 1㎕, 결찰완충용액(Ligation buffer) 1㎕, yT&A 클로닝 벡터(yT&A cloning vector) 2㎕, PCR 산물 1∼3㎕, T4 DNA 리가제 1㎕를 잘 섞어 준 후, 상온에서 20분동안 반응 시키고, 대장균 DH5α(E-
coli DH5α)인 competent cell에 형질전환(transformation)을 시킨 후 100mM의 IPTG 100㎕, X-gal(50 mg/㎖) 20㎕를 깔아둔 LB/Ampicillin 아가 플레이트에 도말하고, 16 시간 정도 배양 한 후 백색 콜로니(colony)를 선택하였다.
그리고, 기 공지지된 방법에 따라 상기 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출 하여 알러지 환자의 혈청과 반응하는 펩티드의 삽입(insert) 여부를 확인한 다음, 그 염기서열을 확인하였다.
그리고, T-벡터에 삽입된 펩티드들을 암호화하는 유전자의 염기서열은 자동화된 ABI377 시퀀서 를 이용하여 확인하였으며, 이때 사용된 프라이머는 5'-ATTCACCTGACTGACGAC-3'를 사용하였다.
(3) 웨스턴 블롯(western blot)
또한, 본 발굴에서 발굴된 펩티드 들을 암호화하는 유전자들의 발현유도를 보기 위해, 먼저, 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 세균을 트립토판 유무의 배지에서 배양하였다. 이는 도 1에 도시된 재조합 플라스미드에 근거하여 대장균의 트립토판 억제성 오페론의 작용을 이용한 것이다.
그리고, 배양된 대장균에서 발현된 단백질을 웨스턴 블롯을 다음과 같이 수행하여 페티드의 발현유무를 확인하였다.
상기 펩티드들을 암호화하는 유전자를 포함하는 세균을 RM 배지에서 16 시간 정도 배양 한 후, 이중 40㎕를 트립토판 (100㎕/㎖)이 포함된 IMC 배지 2㎖에 넣고 유전자 발현을 유도하였다.
그리고, 발현이 유도된 세균용액을 15,000 rpm 에서 20초간 원심 분리하여 침전물을 얻고 침전물에 기 공지된 시료 완충용액을 넣고 5분간 끓이고, 시료 완충용액에 녹여져 있는 단백질을 10% 의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 로딩하여 나이트로셀룰로스막(membrane)에 전이하였다(tranfer). 막에 전이된 단백질은 기지의 방법에 따라 염색(ponceau S 염색법)하여 단백질의 전달여부를 확인한 다음, 상기 막에 블로킹 용액(TBS-T, 3% BSA)을 넣어 상온에서 1시간 반응을 하고 세척 용액으로 5분간 4회를 하여 총 20분간 세척을 하였다. 이 후 막 에 항 티오레독신 항체(1:5,000 희석)를 넣고 1시간 반응시키고 전술한 방법으로 세척하고, 알칼라인포스파테이즈가 붙어있는 2차 항체(anti Ig G- alkaline phosphatase, 1:10,000 희석)를 넣고 1시간동안 반응을 시키고 다시 전술한 방법에 따라 세척하였다. 세척 후 원하는 단백질을 보기 위해서 알칼라인 포스파테이즈 완충용액에 NBT (nitroblue tetrazolium; 나이트로블루테트라졸리움) 132㎕와 BCIP (bromochloro indolyl phosphate; 브로모 클로로 인돌릴 포스페이트) 66㎕를 차례로 넣어 발색 반응을 확인하여 펩티드의 발현 유무를 알 수 있게 하였다.
이의 결과, 도 5 에 도시된 바와 같이, 펩티드들을 암호화하는 유전자들은 트립토판에 의해 그 발현이 티오레독신과 융합된 펩티드 형태(70kd)로 유도됨을 알 수 있었다.
이때, 도 5에서 + 부호는 트립토판의 처리를 나타낸 것이고, - 부호는 트립토판을 넣지 않은 나타낸 것이다.
그리고, 상술한 방법에 의해서 발굴된 펩티드의 아미노산 서열에서 난백에 대한 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드와 먼지 진드기에 대한 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드를 각각 하기 표 3과 4에 나타내었다.
| 펩티드 명 | 아미노산 서열 |
| 1 | QQWKRIPAGSAA |
| 2 | IGNVSGVINGMG |
| 3 | CGLEGRDLHVCQ |
| 4 | RLIWISKREPDS |
| 5 | AGRNAYMGKKCA |
| 6 | PSLACSGNRGW |
| 7 | QFARDYGTRLV |
| 8 | RARSGLSGAS |
| 9 | IRCRDFAAIGHQ |
| 10 | PWYQAFLVRGPG |
| 11 | WIRVKAYGWE |
| 12 | RRRPPSGHTGR |
| 13 | PKYCGVWCLGEV |
| 14 | SILKQTAGWR |
| 15 | RVVRYDADFWI |
| 16 | KVSGRGARKEAK |
| 17 | AVKGGAECASN |
| 18 | GRRLSTSGPGL |
| 19 | VGEGCVGRNA |
| 20 | GKADCTTSGTV |
| 21 | NMWGHLMGRLA |
| 22 | VLVLLLLEPRT |
| 23 | DMAGVRGSSQR |
| 24 | DTTTPLRGAVG |
| 25 | LSYLLWRSRLP |
| 26 | LVAHVGAGGVL |
| 27 | GFWCRRSGLVGV |
| 펩티드 명 | 아미노산 서열 |
| 28 | PFPIRDGVQGP |
| 29 | LERVSPRSRLE |
| 30 | TSTIHPATGRR |
| 31 | VRGEIRNSIIQ |
| 32 | GTSRPCAPTLG |
| 33 | RVSSCRGRTHIV |
| 34 | RVSWCSGRTHIV |
| 35 | RVSSCRGRNHIV |
| 36 | ACKSSGGNGRVV |
| 37 | NSGQLNELALDH |
| 38 | PARLSGWYSR |
| 39 | ETIAGRWVRIE |
| 40 | TGRLLFHTDPVA |
| 41 | AVRASDQGIH |
| 42 | PHVMRGGEYSGA |
[실시 예 4] 효소면역 측정법 (ELISA)
본 실시 예는 상기 실시 예에서 발굴한 펩티드들이 실제로 알러지 환자의 혈청과 결합하는지의 여부를 효소면역측정법을 통해 검증하고자 하였다.
먼저, RM base 배지 2㎖에 바이오패닝을 통해 얻은 알러지 환자의 혈청과 결합하는 펩티드들을 암호화하는 유전자를 포함하는 콜로니를 접종해 놓고 37℃ 에서 12 시간 배양하고, 다시 20㎕/㎖의 농도로 트립토판을 넣어준 IMC 유도 배지에 상기 RM base 배지에서 키운 세포 40㎕를 넣어 37℃ 에서 16 시간 정도 배양하였다.
그리고, 배양 후 에펜돌프 튜브에 1 X109 개의 세포를 넣고 13,000 rpm에서 30초간 원심분리를 하고, 원심 분리 후 상등 액을 버리고 침강물에 PBS 완충용액 1㎖을 넣어 볼텍싱(voltexing)을 한 후 알러지 환자의 혈청을 10㎕씩 넣고 록커에서 25 분간 반응을 시키고, 반응 후 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침강물(pellet)에 PBS완충용액 1㎖을 넣어 볼텍싱을 하고 다시 1분간 원심분리한 다음, 침강물에 다시 PBS 완충용액 1㎖을 넣고 0.5㎕의 비오틴-결합- 쥐-항인간 Ig E 항체(biotin-conjugated-mouse anti human Ig E antibody)를 넣고 록커에서 25 분간 반응하고 원심분리하였다.
그리고, 상등액을 버리고 침강물에 다시 1㎖의 PBS 완충용액을 넣고 (스트렙트아비딘-호스라디시퍼옥시데이즈(streptavidin-horse radish peroxidase; HRP) 0.5㎕씩을 넣고 록커에서 25 분간 반응한 후, 원심분리를 수행하여 그 상등액을 버리고 침강물에 PBS 완충 용액을 다시 넣고 각각의 샘플을 96 웰 플레이트(well plate)에 분주하고 TMB 용액 (100㎕)을 넣고 색깔 변화를 관찰하였다.
그리고, 2M 인산(phosphoric acid)을 이용하여 반응을 정지 시키고 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
이때, 알러지 반응에 대한 양성 반응의 기준은 그 O.D.(광학밀도) 값이 정상인의 평균값 + 2 S.D. (표준편차)를 초과 할 때로 정의하였다.
그리고, 본 발명에서 난백에 양성인 알러지 환자의 경우 난백에 특이적인 IgE 항체의 수치가 대개 3 이상인 경우로 정의하였고, 그 외 집 먼지 진드기, 콩 등에 대해서도 동일한 기준을 적용하였다.
이의 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 바이오패닝 에 사용한 혈청은 난백, 집 먼지 진드기 등에 양성 반응을 보인 알러지 환자의 혈청들로서 난백 알러지 환자의 경우 항원 특이적 IgE 수치가 대개 3 이상으로 나타났으며, 집 먼지 진드기에 양성을 보이는 알러지 환자의 혈청 역시 항원 특이적 IgE 수치가 대개 3 이상인 것을 알 수 있었다. 이중 하기의 7개 펩티드들 중 EIGARWVRIE, RVSSCRGRNHIV, PHVMRGGEYSGA은 집 먼지진드기에 양성반응을 보이는 알러지 환자의 혈청에 결합하는 펩티드들이고, 나머지는 난백에 양성반응을 보이는 알러지 환자의 혈청에 결합하는 펩티드들이다.
따라서, 본 발명의 바이오패닝을 통해 발굴된 펩티드들은 알러지 환자의 혈청과 반응함을 알 수 있었다.
[실시 예 4] 베타 헥소스아미니데이즈 (b-hexosaminidase) 분비 분석
본 실시 예에서는 바이오 패닝을 통해 그 아미노 산 서열이 결정된 펩티드들을 자동 펩티드 합성기를 통해 합성하여 알러지의 표지 효소인 베타 헥소스아미니 데이즈(β-hexosaminidase)의 분비 억제를 유발 하는지의 여부를 기지의 방법에 따라 수행하였다.
또한, 항 알러지 성 약물인 케토티펜 퓨마레이트(ketotifen fumrate)를 항원 자극 전에 전 처리 하여 헥소스아미니데이즈의 분비 억제를 유발 하는지의 여부를 조사 하였다.
베타 헥소스아미니데이즈의 분비 억제 효과를 알아내기 위해서는 다음과 같은 방법을 수행하였다.
먼저, 2%의 BSA 용액을 96-웰 플레이트(96-well plate)에 2시간동안 반응시켜 각 웰을 코팅하고, 각 웰당 2 ×105 개의 세포주(RBL2H3)를 분주하였다.
그리고, 다음날 항DNP IgE 항체(Anti DNP Ig E antiboy;100 ng/㎖)를 RBL2H3 세포주에 12∼16 시간동안 감작하였다. 감작 후 배지를 석션(sucking) 하고 PBS 완충용액으로 1회 씻어주고, 티로드 완충용액(Tyrode's buffer; 119 mM NaCl, 4.74 mM KCl, 2.54 mM CaCl2, 1.19 mM MgSO4, 1.19 mM KH2PO4, 10 mM HEPES, 5mM glucose, 0.1% BSA, pH7.3) 100㎕를 넣어주고 15 분간 배양하였다. 배양 후 펩티드 100㎕를 넣어주고 15 분간 배양 한 후, DNP-HSA(100 ng/㎖)로 처리 하고 1 시간 배양하였다. 배양 후 상등액 80㎕를 취해서 다른 96 웰 플레이트에 넣고 동일한 볼륨의 기질 용액(0.2M citrate, 1mM 4-methylumberliferyl-N-acetyl-b-D-glucosamine, pH4.5)을 넣어주고 1시간 반응하였고, 1 시간 반응 하는 동안 남은 세포는 스크레이퍼(scraper)로 긁어 eppendorf tube에 넣고 분해 완충용액(lysis buffer; 1% Triton X-100 in 1X PBS)로 처리하고, 4℃ 12,000 g 조건에서 5 분간 원심 분리하여 그 상등액을 새로운 96웰 플레이트에 넣은 다음, 기질 반응을 중지시키기 위해 정지액(sodium bicarbonate pH 10.0) 100㎕를 넣어주고 5 분간 반응한 후 흡광도를 405nm 에서 측정하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명에서 사용된 RBL2H3 세포주(랫 호염기구 세포 주, 105/well)) 을 DNP(디나이트로페놀)에 특이적인 항 IgE 항체(100 ng/㎖)로 감작 시키고 다양한 농도의 항원 (DNP-HSA; 0.1, 1, 10, 100ng/㎖)로 자극한 후 베타 헥소스아미니데이즈 (b-hexosaminidase)의 분비 정도를 측정한 결과, 상기 효소의 분비정도는 항원의 농도에 비례하였으며, 항원이 농도가 100 ng/㎖에서 최대의 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
또한, 본 발명에서는 Ig E 항체 와 항원인 DNP-HSA(DNP-dinitrophenyl-human serum albumin)가 서로 결합한다는 사실을 ElISA(효소면역측정법)에 의해 확인하였다(데이터 미제시).
그리고, 도 8은 항원 자극에 의한 베타 헥소스아미니데이즈의 분비에 필요한 신호 전달 분자들의 규명을 위한 실험으로, 우선, RBL2H3 세포를 anti IgE 항체(100 ng/㎖)로 16 시간 동안 감작 시킨 후 각종 신호 전달 저해제(LY294002, PD98059, N-acetyl-L-cystein,)을 시간 별로 처리한후, 항원(DNP-HSA 100ng/㎖)을 15 분간 넣고 배양하고, 베타 헥소스아미니데이즈 (b-hexosaminidase)의 분비정도를 기 공지된 방법에 따라 측정하였다.
이때, N-acetyl L-cystein은 활성산소의 생성을 억제하고, PD98059는 키나제의 일종인 ERK(extracellular regulated kinase)의 인산화를 억제하고, LY294002 역시 키나제의 일종인 PI3키나제 기능을 억제하는 물질이다(도 8 참조).
도 8에 도시된 바와 같이, RBL2H3 세포주는 베타 헥소스아미니데이의 분비를 위해 ERK, PI3 키나제 등의 신호전달 물질을 필요로 하며 활성산소의 생성과 밀접한 관계를 있음을 알 수 있었다. 특히 ERK는 세포의 성장, 분화 등에 중요한 역할을 담당하는 키나제이며, PI3 키나제 역시 세포의 성장, 분환, 혈관 신생 등에 중요한 역할을 담당하여 상기 영역으로 확장할 수 있을 것으로 예상된다.
이때, 항원의 농도는 100 ng/㎖ 로 고정하여 사용하였다.
그리고, 도 9는 본 발명에서 발굴된 펩티드가 RBL2H3 세포주를 이용한 실험에서 항원자극에 의한 베타 헥소스아미니데이즈 (b-hexosaminidase) 분비에 미치는 영향을 조사한 것으로, RBL2H3 세포주를 전술한 anti IgE 항체(100 ng/㎖)로 16시간동안 감작 한 후, 케토티펜 푸마레이트(항 알러지 약물) 혹은 펩티드로 15 분간 전 처리하였다. 그러면서 항원 (DNP-HSA 100 ng/㎖)으로 15 분간 자극을 준 후 기지의 방법에 따라 베타 헥소스아미니데이즈 (b-hexosaminidase) 분비 정도를 측정 하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, 케토티펜 푸마레이트(100 μM)의 경우 예상대로 베타 헥소스아미니데이즈(β-hexosaminidase) 분비를 억제함을 알 수 있었다.
이때, 상기 도 9에 사용된 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같았다.
RVV: RVVRYDADFWI
RVSS: RVSSCRGRNHIV
ETI: ETIGARWVRIE
PHV: PHVMRGGEYSGA
LVA: LVAHVGAGGVL
GFW: GFWCRRSGLVGV
TDG: TDGVTYTNDCL
LSY: LSYLLWRSRLP
또한, 상기 펩티드 중 5종의 펩티드들(RVSS, ETI, PHV, LVA, LSY)은 항원 자극에 의한 베타 헥소스아미니데이즈의 분비를 명백히 억제함을 알 수 있었고, 기존의 항 알러지 약물인 케토티펜 푸마레이트와 유사한 정도의 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
이때, 도 9에서 *는 통계적 유의성을 나타낸 것으로, 본 발명에서는 최소 3번 이상의 독립적인 실험을 수행하였고, 통계적인 유의성을 별표 (*)로 표시하였다. 통계처리는 student's T test를 이용하여 수행하였다.
또한, 상기 5종의 펩티드들은 100℃에서 최대의 효과를 나타냄을 알 수 있었다 (데이터 미 제시).
[실시 예 5] 해명으로부터 비반 세포의 분리 및 히스타민 (histamine) 분비 측정
히스타민(분자량: 111)은 아미노산인 히스티딘의 탈 카복실 화에 의해 생성되는 물질로서 포유동물의 조직에 광범위하게 분포하는 것으로, 히스타민은 즉각적 인 면역과민 반응을 매개하는 물질로서 비반 세포(mast cell) 및 호염기구 세포 등에 과량 존재하다가 알러지 유발물질에 의해 분비되는 데, 알러지 유발물질들은 호 염기구 세포 등에서 분비되는 히스타민의 양을 통해서 동정될 수 있다.
이와같은 공지된 방법을 이용하여, 본 발명에서 발굴된 펩티드들의 항 알러지성 효과를 동물모델을 이용하여 히스타민 분비를 측정함으로써, 그 여부를 확인하고자 하였다.
먼저, 본 발명에서는 해명(Hartley albmno female guinea pig)을 사용하였고 그 체중은 대략 200-250g정도 였다. 그리고, 상기 해명으로부터의 비반 세포의 분리는 공지된 방법에 따라 다음과 같이 수행하였다(Ro 등 Journal of Pharamcology and Experimental Therapeutics 292 (1) 114-121, 2000).
10마리의 해명으로부터 폐 조직을 기지의 방법에 따라 분리하였는 데, 이때 해명은 마취하지 않은 상태로 뇌진탕을 유발하여 죽게 한다.
해명으로부터 얻은 폐 조직을 50 ㎖의 티로드 완충용액(137 nM NaCl, 0.36 nM NaH2PO4, 2.6nM KCl, 1nM CaCl2, 1.5nM MgCl2, 119nM NaHCO3, 5.5nM glucose, 1g/l gelatin, pH7.4)으로 관류 시킨 후 기도와 혈관을 제거하였다. 이후 폐 조직을 맥웨인 조직 분쇄시(Mcllwain tissue chopper)로 잘게 썰고, 잘게 썬 폐 조직을 콜라게나제(125 U/g 조직)와 엘라스타제(5 U/g 조직)로 3회 처리를 각각 15,15,25 분으로 하였다. 그리고, 폐 조직을 구성하는 세포들이 밖으로 분리되는데 이들 세포들을 nytex 망 (100 ㎛)으로 여과시킨 후, 티로드 완충용액으로 씻어주었다.
그리고, 상기 세포들을 퍼콜(percoll) 용액(밀도, 1.045g/㎖)위에 붓고 800 g 에서 20 분간 원심분리를 하고, 비반 세포를 포함하는 침강세포들(pellet)을 xl티로드 완충용액에 현탁 시키고 불연속 퍼콜 밀도 구배를 통해 정제하였다.
이때, 밀도구배를 통해 원심분리를 800g 에서 20분간 수행 한 후 비반세포의 밀도에 해당하는 밴드를 잘라서 티로드 완충용액으로 씻어주어 비반 세포를 준비하였다.
그리고, 상기의 방법에 따라 정제된 비반 세포에 항 OVA 항체(anti-ovalbumin antibody)를 세포 106 당 1㎖을 넣어 37℃ 에서 2시간 반응하여 감작 시킨 후, 비반세포들을 티로드 완충용액으로 씻어주고 항원 (0.1 ㎍/ml ovalbumin) 으로 10 분간 자극하고 반응을 중단하였다.
그리고, 원심 분리를 수행하여 그 상등액을 취하여 항원에 의해 분비된 히스타민(histamine)의 양을 측정하였다.
이때, 히스타민 분비 측정은 자동 형광분석계를 이용하여 수행하였는 데, 이의 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이, ETIGARWVRIE과 RVVRYDAFWI의 펩티드가 해명 모델에서 히스타민 분비 억제 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
| 분비된 양(ng) | 분비 정도(%) | 억제 정도(%) | |
| 자연적 분비량(ng) | 43.27 | 3.19 | |
| 총 분비량(ng) | 1451.96 | ||
| 오발부민*ovalbimin) | 489.63 | 31.54 | |
| DMSO | 468.22 | 30.01 | 4.82 |
| RVSSCRGRNHIV | 474.36 | 30.45 | 3.44 |
| LVAHVGAGGVL | 467.82 | 29.98 | 4.91 |
| ETIGARWVRIE | 400 | 25.16 | 20.21 |
| PHVMRGGEYSGA | 469.79 | 30.12 | 4.47 |
| RVVRYDAD FWI | 329.42 | 20.14 | 36.13 |
이때, 분비 억제 정도가 20% 를 넘을 경우, 그 억제 정도는 유의한 것으로 보았으며, 측정치는 3번 수행하여 그 평균값을 산출 한 것을 나타내었다.
이와같이, 본 발명에서 발굴한 5개의 펩티드는 RBL2H3 세포주를 이용하여 베타 헥소스아미니데이즈의 분비를 측정 한 결과에서는 5종의 펩티드가 분비를 억제한 것으로 나타냈으나 해명을 이용한 실험에서는 2종 만이 히스타민 분비를 억제한 것으로 나타냈는데, 이는 본 실시 예에서 알러지 반응을 유발하는데 사용한 항체, 항원이 RBL2H3 세포주에서 사용한 것과 서로 다르기 때문으로 판단된다.
하지만, 본 발명에서 발굴한 5개의 펩티드는 종래 항알러지성 펩티드의 아미노산 서열과는 전혀 다른 서열을 가지고 있는 신규한 펩티드로 그 효과도 기존의 제제와 큰 차이가 없기 때문에, 향후 알러지 예방 및 치료용 의약 조성물로 개발할 수 있을 것으로 예상된다.
또한, 본 발명에서 발굴한 5개의 펩티드의 정보를 간략하게 다음과 같다.
펩타이드번호 25 의 정보:
(i) 서열의 특징:
a) 서열의 길이: 11
b) 서열의 형: 아미노산
c) 형태: 직쇄성
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ⅲ) 아미노산 서열:1 LSYLLWRSRLP 11
펩타이드번호 26 의 정보:
(i) 서열의 특징:
a) 서열의 길이: 11
b) 서열의 형: 아미노산
c) 형태: 직쇄성
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ⅲ) 아미노산 서열: 1 LVAHVGAGGVL 11
펩타이드번호 35 의 정보:
(i) 서열의 특징:
a) 서열의 길이: 12
b) 서열의 형: 아미노산
c) 형태: 직쇄성
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ⅲ) 아미노산 서열: 1 RVSSCRGRNHIV 12
펩타이드번호 39 의 정보:
(i) 서열의 특징
a) 서열의 길이: 11
b) 서열의 형: 아미노산
c) 형태: 직쇄성
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ⅲ) 아미노산 서열: 1 ETIGARWVRIE 11
펩타이드번호 42 의 정보:
(i) 서열의 특징:
a) 서열의 길이: 12
b) 서열의 형: 아미노산
c) 형태: 직쇄성
(ii) 서열의 종류: 펩티드
(ⅲ) 아미노산 서열: 1 PHVMRGGEYSGA 12
상술한 바와 같이, 본 발명에서 발굴된 펩티드들은 인간 알러지 환자의 혈청과 결합하는 특성을 가지고, 세포 주 및 동물실험에서 알러지 억제 효과를 나타내어 알러지 예방이나 치료용 제제에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명에서 발굴된 펩티드들은 혼합된 형태로서 이용 시 알러지 진단에도 사용할 수 있다.
Claims (4)
- 하기의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드 또는 그의 염.(a) RVSSCRGRNHIV;(b) ETIGARWVRIE;(c) PHVMRGGEYSGA;(d) LVAHVGAGGVL; 및(e) LSYLLWRSRLP
- 제 1 항 기재의 펩티드 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 알러지 질환 예방 및 치료용 의약 조성물.
- 제 2 항에 있어서,상기 알러지 질환은 천식, 아토피성피부염, 두드러기 또는 알러지성 비염 질환인것을 특징으로 하는 알러지 예방 및 치료용 의약 조성물.
- 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,상기 조성물에 단백질, 당질, 완충제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 안정제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 알러지 예방 및 치료용 의약 조 성물.
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| JPH08151396A (ja) * | 1994-11-28 | 1996-06-11 | Teijin Ltd | Ｈｌａ結合性オリゴペプチド及びそれを含有する免疫調節剤 |
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2004
- 2004-12-31 KR KR1020040118510A patent/KR100646313B1/ko not_active Expired - Fee Related
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