KR100636653B1 - 신규한 올리보실 피크로마이신 유도체 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 올리보실 피크로마이신 유도체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 피크로마이신(pikromycin)을 생성하는 미생물[스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)]의 상동 재조합을 통하여 변이균주를 제작하고, 상기 변이균주를 배양하여 변형된 디옥시당 성분을 가진 올리보실 피크로마이신 유도체(olivosyl pikromycin derivatives)를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 올리보실 피크로마이신 유도체에 관한 것이다.
스트렙토마이세스 베네주엘래, 피크로마이신 유도체, 당, 폴리케타이드, 호스트-벡터 시스템, 조합 생합성
Description
도 1은 메티마이신 및 피크로마이신 계열의 마크로라이드의 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 TDP-D-데소사민 및 TDP-D-올리보스의 생합성에 대해 제안된 경로를 나타낸 것이다.
도 3은 야생형(a), 데소사민 생합성 클러스터 및 pikC(b), 돌연변이체 YJ003(c) 및 돌연변이체 YJ013(d)에서의 피크로마이신 유전자 클러스터를 나타낸 것이다.
도 4는 pYJ136를 나타낸 것이다.
도 5는 pYJ146를 나타낸 것이다.
도 6은 올리보실-나르보노라이드(a) 및 수산화된 올리보실-피크로마이신(b)의 MS/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
발명의 분야
본 발명은 신규한 올리보실 피크로마이신 유도체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 피크로마이신(pikromycin)을 생성하는 미생물[스트렙토마이세스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)]의 상동 재조합을 통하여 변이균주를 제작하고, 상기 변이균주를 배양하여 변형된 디옥시당 성분을 가진 올리보실 피크로마이신 유도체(olivosyl pikromycin derivatives)를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 올리보실 피크로마이신 유도체에 관한 것이다.
발명의 배경
감염성 세균들이 대부분의 항생제에 대한 내성을 획득하게 되면서, 기존 항생제에 대한 사용량이 크게 증가하였고, 이에 따라 항생제에 대해 내성을 지닌 세균들에 의한 질병의 발병 횟수는 더욱 증가하였다.
이런 이유로 기존 항생제에 대하여 내성을 갖는 세균이나 곰팡이, 바이러스, 암세포 등을 치료하기 위해, 새로운 종류의 항생제를 얻으려는 노력이 계속되고 있다. 상기 목적을 위하여 지금까지는 주로 자연계에 존재하는 미생물을 탐색하여 새로운 항생물질을 만들어내는 균주를 찾았으나, 이러한 신항생물질 탐색 과정은 그에 들어가는 시간, 노력 및 비용이 엄청나고, 또 그 외에도, 약리작용 및 독성시험까지 완료하여야만 하나의 사용 가능한 항생물질로 인정받을 수 있기 때문에 무척 까다롭고 힘든 작업인 것이 사실이다.
최근의 통계에 의하면 10,000개의 자연계 물질을 탐색하면 하나 정도만이 의약품으로 실용화될 수 있는 수준이라 한다. 따라서 많은 제약회사들이나 대학 및 연구소에서 기존의 방법과는 다른 돌파구를 기대하고 있다.
이런 돌파구의 하나로, 항생물질을 만들어내는 균주의 유전자를 조작하여 새로운 모양의 다양한 생리활성물질을 얻어내려는 방법이 시도되고 있다. 이러한 방법은 주로 폴리케타이드(polyketide) 계열의 항생물질에 이용되어 그 구조변형에 도입되고 있으며, 다양한 생합성 유전자의 조합을 통하여 다양한 구조를 생성할 수 있으므로 이를 조합 생합성(combinatorial biosynthesis)이라 부른다. 이러한 방법은 기존의 방법에 비해 탐색과정에서의 시간과 비용이 절약됨은 물론, 기존 항생제의 구조와 활성과의 관계 등을 응용하여 설계하기 때문에 생물학적 활성을 예상할 수 있어, 많은 시간과 비용을 절감할 수 있다.
폴리케타이드 계열의 화합물은 미생물로부터 생산되는 복잡한 구조의 천연 화합물(natural product)로서, 현재까지 약 10,000가지 이상의 화합물이 알려져 있다. 이로부터 주로 항암제, 항생제, 고혈압 치료제 그리고 면역억제제 등이 개발되어 왔으며, 이들은 현재 사용되고 있는 천연화합물 유래의 의약품 중 약 50%를 차지하고 있다.
조합 생합성에 의한 상기 폴리케타이드계 항생물질의 제조과정은 하기 기술한 바와 같다. 상기 폴리케타이드계 항생물질은 폴리케타이드 합성효소(polyketide synthase, PKS)라고 하는 다기능 단백질(multifunctional protein)에 의해 생합성 된다. 이러한 PKS 복합체는 연속적인 축합반응에 관여하는 여러 개의 모듈(한번의 축합반응을 책임지는 촉매 도메인들의 묶음)로 구성되어 있다.
모듈(module)을 구성하는 촉매 도메인(catalytic domain)들의 구성에 따라 폴리케타이드의 구조가 일대일로 대응하여 생합성되므로 PKS 유전자의 변형에 의하여 폴리케타이드의 구조를 변형시켜 새로운 항생제를 얻으려는 노력이 많이 이루어지고 있다. 특히, 이러한 하이브리드 항생제 연구는 최근 10년 사이에 활발하게 진행되고 있다.
그러나, 마크로라이드 계열의 항생제의 경우(예를 들어, 에리스로마이신(erythromycin)), 위에서 언급한 PKS에 의한 폴리케타이드 조합 생합성만으로는 항생물질의 생리활성을 획득할 수 없는 경우가 대부분이며, 글리코실화나 수산화과정이 포함된 후-PKS 테일러링 단계(post-PKS tailoring step)가 항생물질 생성 과정에서 반드시 필요하다.
폴리케타이드는 여러 개의 간단한 카르복실산의 축합반응에 의해 생합성되는 것으로 지방산(fatty acid)의 생합성과 매우 유사하다. 상기 기술한 바와 같이, 폴리케타이드는 여러 개의 효소활성이 하나의 단백질에 포함되어 있는 거대한 다기능 단백질인 PKS에 의해 생합성되며, 이러한 PKS 복합체는 연속적 축합반응을 관여하는 여러 개의 모듈로 구성되어 있다. 각각의 모듈은 각 카르복실산의 축합반응에 직접 관여하는 아세틸트렌스퍼라제(acyltransferase, AT), 아실 캐리어 단백질(acyl carrier protein, ACP) 및 β-케토아실 합성효소(β-ketoacyl synthase, KS) 도메인들 및 축합반응의 결과 생성되는 β-케토그룹의 환원에 관여하는 케토 리덕타제(keto reductase, KR), 디하이드라타제(dehydratase, DH) 및 에 노일 리덕타제(enoyl reductase, ER) 도메인들로 구성되어 있다.
카르복실산의 축합반응은 AT 도메인의 경우 익스텐더 유닛(extender unit)에 특이적으로 반응하여 같은 모듈의 ACP에 전달하며, 케타이드 합성은 앞 모듈의 ACP로부터 신장 체인(elongation chain)을 AT 도메인의 작용에 의해 만들어진 ACP-익스텐더 유닛에 연결해주는 과정을 통해 일어난다. 또 β-케토 그룹의 환원은 KR, DH 및 ER에 의하여 차례로 환원되며, 존재여부에 따라 각각 케톤기가 수산기로, 수산기가 에노일기로 환원되어 마지막에는 ER 도메인에 의하여 알칸 그룹만 남게 된다.
이는 척추동물의 지방산 합성효소인 타입 1 지방산 합성효소(type 1 fatty acid synthase)와 구성이 매우 유사하나, 각 모듈의 AT 도메인 특성에 따라 각 축합반응에 사용되는 익스텐더 유닛인 카르복실산의 종류가 다양하게 결정될 수 있다는 점이 다르며, 또한 각 모듈에서 환원 도메인들 (KR, DH 및 ER)이 지방산 합성효소에서처럼 모두 존재 하지 않고 모듈의 특징에 따라 부분적으로 존재하여 β-케토 그룹의 환원정도가 다르게 나타난다는 점에서 차이가 있다. 또한 전체 모듈의 수에 따라 폴리케타이드 사슬의 길이가 결정될 수 있다는 점 때문에 각각의 도메인과 모듈의 조합에 따라 무한한 구조의 폴리케타이드가 생합성될 수 있다.
실제로 폴리케타이드 항생제에는 다양한 체인길이를 가진 항생제들이 존재하며 각각의 PKS에는 해당하는 만큼의 모듈수를 가지고 있다. 에리스로마이신의 경우 6개의 모듈로 구성되어 14-멤버 링을 생산한다. 타이로신(tylosin)이나 스피라마이신(spiramycin)의 경우 7개의 모듈로 구성되어 16-멤버 링을 생산하고, 리파마이신(rifamycin)의 경우 10개의 모듈로 구성되어 거대한 크기의 폴리케타이드를 생산하기도 한다.
따라서, 자연계에 존재하지 않는 길이의 폴리케타이드 체인을 만들게 되면, 항생물질의 구조 다양화에 기여할 수 있음은 물론 새로운 항생물질을 얻는데 결정적인 역할을 할 수도 있다. 이러한 폴리케타이드 체인의 인위적인 길이 변화는 유전자 수준에서의 모듈의 삭제 및 삽입에 의해서 이루어 질 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, PKS의 모듈구성에서 첫번째 모듈이 시작되기 전에 로딩 모듈이 별도로 존재하며 로딩 모듈의 AT 도메인에서는 익스텐더 유닛과는 종류가 다른 스타터 유닛(starter unit)을 ACP에 로딩하여 폴리케타이드 체인의 앞부분을 구성하게 된다.
따라서, 스타터 유닛의 변경은 항생물질의 구조에 영향을 미쳐 새로운 구조의 항생물질을 수득할 수 있게 한다. 스타터 유닛으로는 프로피오닐-코에이(propionyl-CoA), 아세틸-코에이(acetyl-CoA), 디하이드록시사이클로헥서닐-코에이(dihydroxycyclohexenyl-CoA) 등이 있으며, 특이적으로 리파마이신의 경우엔 3-아미노-5-하이드록시벤조익산(AHBA)를 스타터 유닛으로 사용한다. 이러한 스타터 유닛은 로딩 모듈의 AT 도메인에 특이적으로 반응하기 때문에 로딩 모듈의 AT 도메인을 다른 종류의 스타터 유닛에 특이적인 AT 도메인으로 치환시킴으로써 폴리케타이드 체인의 종류를 변형시켜 줄 수 있다.
폴리케타이드 체인은 각 모듈을 지날 때마다 2개의 탄소가 추가된다. 하나의 탄소에는 케톤기가 붙어 있어 β-카르보닐 프로세싱(β-carbonyl processing) 과정 에 의한 환원정도에 따라 구조를 다양화시킬 수 있으며, 나머지 하나의 탄소는 익스텐더 유닛의 변화에 의하여 다양한 사이드 체인을 붙일 수 있다. 익스텐더 유닛에는 말로닐-코에이(malonyl-CoA), 메틸말로닐-코에이(methylmalonyl-CoA), 에틸말로닐-코에이(ethylmalonyl-CoA) 등이 있으며 , 말로닐-코에이가 이용될 경우 사이드 체인은 붙지 않고, 메틸말로닐-코에이가 붙는 경우 메틸기가 붙으며, 에틸말로닐-코에이가 붙는 경우 에틸기가 사이드 체인이 된다. 이론적으로는 각각의 모듈에 존재하는 AT 도메인이 각각의 익스텐더 유닛에 특이적으로 반응하므로 각각의 모듈의 AT 도메인 스와핑(swapping)에 의하여 모든 종류의 사이드 체인을 바꿔줄 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, 모듈을 지날 때 마다 확장되는 2개의 탄소중 하나는 케톤기가 붙어 있는 카르보닐 탄소이다. 각각의 모듈에 존재하는 KR, DH 및 ER 도메인의 조합에 의하여 케톤기의 환원정도가 결정된다. 모듈에 β-탄소케톤 processing 과정에 이용되는 KR, DH 및 ER 도메인이 모두 존재하지 않는 경우 케톤기(=O)가 그대로 남아 있게 되고, KR 도메인만 존재하는 경우는 수산기(-OH)가 생성되며, KR-DH 도메인이 존재하는 경우는 이중결합이, KR-DH-ER 도메인이 모두 존재하는 경우는 케톤이 모두 환원되어 사이드 체인이 전혀 없는 알칸의 형태가 된다. 따라서 이론적으로 KR, DH 및 ER 도메인의 삽입, 삭제, 치환, 제거 등의 방법을 통해 3가지 형태의 환원정도를 모두 만들 수 있다.
상기 기술한 방법들을 통해서, 이론적으로는 폴리케타이드 화합물(케톤기가 붙어있는 체인으로 이루어진 화합물)이라고 부를 수 있는 거의 모든 화합물들을 조 합 생합성할 수 있다. 우선 모듈수의 변화를 통하여 모노-케타이드에서부터 시작하여 6-, 7- 및 8-케타이드에 이르기까지 다양한 크기의 폴리케타이드를 합성할 수 있고, 각각의 모듈에 추가되는 2개의 탄소에서, 하나는 사이드 체인의 변화에 의해서, 또 다른 하나는 케톤기의 환원 정도의 변화를 통해서 구조를 다양화할 수 있다. 또한 로딩 모듈에서는 스타터 유닛의 변화를 통해서 구조의 변화에 기여할 수 있다.
하지만 이러한 조합 생합성 과정은 거대 PKS 단백질의 3차 구조와 PKS 단백질 간의 상호변화 등으로 인해 하이브리드 PKS 유전자들이 언제나 기능을 하는 PKS 단백질을 만들어 내지는 못한다는 어려움이 있다. 따라서 활성을 지닌 하이브리드 PKS를 만들어 내는 일은 많은 노력과 시간이 요구된다고 할 수 있다.
최근 연구에 의하면, 피크로마이신을 생산하는 방선균의 일종인 Sterptomyces venezuelae 균주는 도메인 스키핑(domain skipping)이라는 새로운 기작에 의하여 하나의 PKS 유전자 클러스터로부터 다양한 크기의 폴리케타이드 항생제를 생산한다고 알려져 있다. S. venezuelae 균주의 피크로마이신 생합성 시스템은 10-디옥시메티노라이드 및 나르보노라이드로부터 각각 유래된 메티노마이신 및 피크로마이신 계열의 마크로라이드를 포함하여 별개의 두 마크로라이드 항생제 그룹을 생산할 수 있는 천연적인 능력 때문에 주목을 받고 있다. 도 1은 메티마이신 및 피크로마이신 계열의 마크로라이드의 구조식을 나타낸 것이다.
피크로마이신 PKS는 6개의 모듈로 구성되어 있는데 폴리케타이드 체인 형성과정 중 도메인 스키핑 기작에 의해 6번째 모듈을 스키핑하게 되는데 이때 12-멤버 링이 만들어지게 되며, 도메인 스키핑 기작을 거치지 않는 경우 신장 체인이 6번째 모듈을 거치게 되어 14-멤버 링이 형성되게 된다. 이러한 특징은 한번의 PKS 유전자 조작으로 두 가지 길이의 항생물질을 만들 수 있음을 의미하는 것으로, 활성을 지닌 하이브리드 PKS를 만들어 내는 일이 쉽지 않다는 측면에서 보았을 때 매우 효율적인 폴리케타이드 생산 시스템이라고 할 수 있다.
상기 PKS의 조작에 의하여 자연계에는 존재하지 않는 거의 대부분의 다양한 구조로 된 폴리케타이드 화합물을 합성할 수 있음을 보았다. 하지만 마크로라이드 계열 항생제의 경우, 후-PKS 테일러링 단계가 존재하는데, 이를 거치지 않은 폴리케타이드 화합물은 실제 항생물질로서의 활성이 거의 없는 것으로 알려져 있다. 현재까지의 연구는 대부분 폴리케타이드 화합물의 구조 다양화에 초점이 맞추어져 있어 PKS 재조합을 통한 새로운 구조의 조합 생합성 된 폴리케타이드를 합성하는 방향으로 이루어졌으나, 최근 이렇게 합성된 항생물질에 생리활성을 불어넣으면서 더욱 다양한 구조를 만들 수 있는 후-PKS 경로에 많은 관심이 집중되고 있다.
폴리케타이드 화합물에 항생물질로서의 활성을 주는 가장 중요한 후-PKS 경로는 글리코실화 과정이라 불리는 단계인데 항생물질에 당을 붙여주는 단계이며, 이는 또한 폴리케타이드 화합물의 다양한 위치에 다양한 당을 붙임으로써 구조의 다양화에도 기여할 수 있다. 당 성분은 항생물질과 대상 세포간의 인지에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Weymouth-Wilson, A.C., Nat. Prod. Rep., 14:99, 1997; Kirschning, A., et al., Topics Curr. Chem., 188:1, 1997). 후-PKS 테일러링 단계에는 글리코실화 과정 이외에도 수산화 과정이라 하여 폴리케타이드 화합물에 수 산기를 붙여주는 단계가 존재하는데, 이 단계에 의해서 폴리케타이드 화합물은 항생물질로서의 활성이 더욱 증가되거나, 또는 하나의 계통에서 서로 다른 항생물질을 만들어 낼 수 있는 역할을 한다. 이 수산화 과정 또한 폴리케타이드 화합물의 구조 및 생리활성의 다양화에 많은 기여를 하고 있다.
상기 글리코실화 과정은 폴리케타이드 화합물이 생리 활성을 나타내도록 하는데 매우 중요한 과정이다 (Mndez, C. and Salas, J.A., Trends Biotechnol. 11:449, 2001; Rix, U. et al.,
Nat. Prod. Rep., 19:542, 2002). 폴리케타이드 화합물에 붙는 당에는 주로 D-데소사민(D-desosamine), D-마이카미노스(D-mycaminose), D-올리보스(D-olivose), L-로디노스(L-Rhodinose), L-(클라디노스L-cladinose) 등이 있으며 그 밖에도 다양한 당이 붙는 것으로 알려져 있다. 이러한 특징은 에리스로마이신이외의 대부분의 항생물질 생산 균주에서 발견되며, 대부분 기질-특이적 글리코실트랜스퍼라제(substrate-specific glycosyltransferase)를 가지고 있다. 이런 이유로 PKS 조작에 의해 생합성된 하이브리드 폴리케타이드의 글리코실화 과정에는 야생형(wild-type) 구조와는 많은 차이가 있기 때문에 당을 붙이는데 사용이 거의 불가능하다.
하지만 최근 연구에 의하면 피크로마이신 및 메티마이신을 동시에 생성하는 Streptomyces venezuelae라는 방선균은 피크로마이신과 메티마이신을 글리코실화시키는 글리코실트랜스퍼라제가 한 종류로서 DesⅦ으로 알려져 있으며, 이 효소는 두 기질에 모두 작용하여 당을 붙여주는 역할을 한다고 알려져 있다. 이러한 DesⅦ의 특징은 기질의 구조에 덜 민감하다는 것을 뜻하는 것으로 하이브리드 PKS에 의해 조합 생합성된 다양한 구조의 폴리케타이드 화합물에 당을 붙일 수 있는 가능성을 제시하고 있다 (Mndez, C. and Salas, J.A., Trends Biotechnol. 11:449, 2001; Rix, U. et al.,
Nat. Prod. Rep., 19:542, 2002).
그뿐 아니라 DesⅦ은 피크로마이신이나 메티마이신에 붙여주는 D-데소사민 이외에 다른 종류의 당도 폴리케타이드 화합물에 붙여줄 수 있는 능력이 있는데, 이는 당에 의하여 새로운 구조의 폴리케타이드 화합물을 만들어 낼 수 있는 가능성을 제시하고 있다.
여섯 개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) desⅠ 내지 desⅥ은 데소사민 생합성에 관여하는 것으로 추정되며, 최근 데소사민 생합성 경로에 대한 가설이 제기되었다 (Zhao, L. et al., J. Am. Chem. Soc., 120:10256, 1998; Zhao, L., et al., J. Am. Chem. Soc. 120:12159, 1998; Zhao, L., et al., J Am Chem Soc.,
123:7909, 2001). 뿐만 아니라, D-올리보스의 생합성에 대한 이종기원의(heterologous) 디옥시당 경로의 가설도 제기되었다. 도 2는 상기 두 가설에 대한 TDP-D-데소사민 및 TDP-D-올리보스의 생합성에 대해 제안된 경로를 나타낸 것이다.
수산화 과정은 항생물질의 활성을 더욱 다양하게 하고, 또한 항생물질 구조를 더욱 다양하게 만들어 내는 역할을 한다. 특히 수산화 과정에서 수산기는 모듈을 지날 때 마다 확장되는 두개의 탄소 중에서 환원 정도에 따라 수산기가 붙을 수 있는 카르보닐 탄소에 붙는 것이 아니라 메틸기나 에틸기인 사이드 체인만 붙을 수 있는 부분에 이루어진다. 이와 같은 특징은 PKS의 재조합만으로는 만들 수 없는 새 로운 구조를 후-PKS 테일러링 단계에서 얻을 수 있음을 나타낸다.
기존에 알려져 있던 효소들(예를 들어, 에리스로마이신의 EryF 및 EryK, 마이시나마이신의 MycG, 라파마이신의 RapN, 올린도마이신의 OleP 등)도 하이브리드 PKS에 의한 조합 생합성 폴리케타이드 화합물에 수산기를 붙여주는 역할을 담당하지 못한다.
하지만 최근 연구에 의하면, 피크로마이신과 메티마이신을 생산하는 S. venezuelae의 경우 12-멤버 링 구조를 한 메티마이신과 14-멤버 링 구조를 한 피크로마이신 두 종류의 항생제를 생산하면서도 생합성 경로에서 오직 한 개의 p450 하이드록시라제(hydroxylase)인 PikC만이 존재하는 것으로 알려졌다. 또한 pikC로 명명된 이 하이드록시라제를 분리하여 기질 특이성을 조사한 결과, 두 가지 다른 크기의 마크로락톤을 기질로 받아들이고 두 가지 다른 위치를 수산화시키는 것으로 밝혀졌다.
이와 같은 PikC의 넓은 기질 및 위치 특이성(broad substrate and regio-specificity)은 기존의 폴리케타이드 변형 효소들의 엄격히 제한된 기질특이성과는 매우 다른 특성이며, PKS 조합에 의해 생산된 다양한 구조의 폴리케타이드 화합물에 적용할 수 있는 가능성을 제시하고 있다. PikC 같은 효소를 이용하여, 이제까지 시도되지 않았던 다양한 항생제에 수산기를 붙여 주어 좀더 다양한 구조의 항생제들을 많이 만들어 낼 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 피크로마이신을 생성하는 미생물의 상동 재조합을 통한 변이균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 신규 올리보실 피크로마이신 유도체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규 올리보실 피크로마이신 유도체를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 desⅦ, desⅧ, oleV, oleW 및 urdR을 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 하기 구조식 1로 표시되는 올리보실 피크로마이신 유도체의 제조방법을 제공한다.
[구조식 1]
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pYJ146인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 형질전환에 사용된 미생물은 본래의 전체 des 클러스터를 결실시킨 다음, des Ⅲ, desⅣ 및 desR를 삽입한 스트렙토마이세스 베네주앨레(Streptomyces venezuelae) YJ013인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 구조식 1로 표시되는 올리보실 피크로마이신 유도체를 제공한다.
본 발명에서는 올리보실 피크노마이신 유도체를 수득하기 위하여, 먼저 des 클러스터 결실을 위한 플라스미드를 제조하였다. 상기 플라스미드는 카나마이신 내성 유전자와 aphⅡ를 가지고 있으며, 전체 des 클러스터 대신에 상기 des 클러스터의 업스트림(upstream)과 다운스트림(downstream) 양측면에 위치한 DNA 단편(flanking DNA fragment)을 가지도록 제조하였다. 상기 결실 플라스미드로 스트렙토마이세스 베내주앨래(Streptomyces venezuelae ATCC 15439)를 형질전환하여 데소사민 생합성이 결실된 결실 돌연변이체(YJ003)를 제조하였다. 디옥시당의 생합성 및 글리코실화를 위하여, desⅢ, desⅣ 및 desR을 포함하는 플라스미드(pYJ136, 도 4)와 desⅦ, desⅧ, oleV, oleW 및 urdR을 포함하는 플라스미드(pYJ146, 도 5)를 각각 제작하였다.
그리고, 상기 돌연변이체 YJ003을 숙주세포로 하여 pYJ136으로 형질전환 하고, pYJ146으로 보완(complementation)하였다. 이와 같은 방법을 숙주세포-벡터 시스템이라고 한다. 그런 다음, 상기 플라스미드들이 발현할 수 있는 조건하에서 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하여, 이온화-질량/질량분석계(electrospray ionization-mass/mass spectrometry)와 결합 된 액체 크로마토그래피(LC/ESI-MS/MS)로 분석하였다. 그 결과, 상기 호스트-벡터 시스템을 통해 합성된 올리보실 나르보노라이드의 존재를 확인할 수 있었고, 이 화합물의 C-10 및 C-12 위치가 시토크롬 P450 하이드록시라제(PikC)에 의해 수산화가 이루어진 올리보실 피크노라이드 유도체를 수득할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1:
박테리아 계통, 배양 조건 및 DNA 조작
돌연변이 계통의 제조에 사용한 야생형 스트렙토마이세스 베내주앨래(Streptomyces venezuelae ATCC 15439)의 피크로마이신 유전자 클러스터 및 데소사민 유전자 클러스터는 각각 도 3a 및 3b에 표시된 바와 같다. S. venezuelae 형질전환체는 적절한 항생제, 아프라마이신(apramycin, 0.5㎎/㎖), 카나마이신(kanamycin, 1㎎/㎖), 또는 티오스트렙톤(thiostrepton, 0.5㎎/㎖) 1㎖을 첨가한 R2YE 아가 플레이트(Keiser et al., Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, 2000)로 선별하였다. SGGP 액체 배지(Lambalot & Cane, J. Antibiot.(Tokyo), 45:1981, 1992)는 S. venezuelae 증식(propagation)에 사용하였다.
플라스미드를 포함한 S. venezuelae는 적절한 항생제 또는 조합된 항생제(아프라마이신 25㎎/ℓ, 카나마이신 50㎎/ℓ, 티오스트렙톤 25㎎/ℓ)가 첨가된 고체 SPA 배지(효모 추출물 1g/ℓ, 소 추출물 1g/ℓ, 트립토스(tryptose) 2g/ℓ, 글루코스 10g/ℓ, 황산 제1철(ferrous sulfate) 미량, 아가 15g/ℓ)상에서 성장하였다.
대장균(E. coli) DH10b[(주)Bioflow]는 DNA 조작을 위한 숙주세포로 사용하였다. E. coli 및 Streptomyces 계통에서의 DNA 분리 및 조작은 공인된 과정을 통해 수행하였다 (Keiser et al., Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, 2000, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Haber, 1998). 리트머스28(litmus28, New England Biolabs), pUC119 및 pGEM3(Novagen)은 서브클로닝(subcloning)에 사용하였다.
PCR은 pfu 중합효소(pfu polymerase, Stratagene)를 사용하여 수행하였다. 서던 블럿 하이브리다이제이션(Southern blot hybridization)은 DIG 라벨링(DIG labeling) 및 검출 키트(Roche)에서 추천한 방법에 따라 수행하였다.
실시예 2:
des
클러스터-결실 돌연변이체의 제조
S. venezuelae 에서의 유전자 결실/교체를 위하여, 복제 플라스미드-매개 상종 재조합(replicative plasmid-mediated homologous recombination) 접근법을 사용하였다 (Xue et al., PNAS USA, 95:12111, 1998). des 클러스터 결실을 위한 플라스미드는 카나마이신 내성 유전자, aphⅡ(Ward et al., Mol. Gen. Genet., 203:468, 1986)를 가지고 있으며, 전체 des 클러스터 대신에 상기 des 클러스터의 업스트림(upstream)과 다운스트림(downstream) 양측면에 위치한 DNA 단편(flanking DNA fragment)을 가지도록 제조하였다(도 3c).
유전자 교체를 위한 구성체(construct)는 원형질체 형질전환(protoplast transformation)을 통해 S. venezuelae로 삽입된 pKC1139(Bierman, M. et al., Gene, 116:43-9, 1992)를 사용하여 제조하였다. 스트렙토마이세스 베내주앨래(S. venezuelae ATCC 15439)를 상기 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환하였다. 각 형질전환체로부터 얻어진 포자는 카나마이신 선별 아가 플레이트에서 배양하고, 사이클(cycle)은 재조합 가능성을 증대시키기 위하여 3번 반복하였다. 카나마이신-저항성 및 아프라마이신-민감성 표현형을 얻기 위해 목표 유전자를 aphⅡ로 교체한 이중 교차(crossover)를 선별 및 스크린하고, 돌연변이 유전자형을 게놈 DNA 서던 블럿 하이브리다이제이션으로 확인하였다.
des 결실 플라스미드(pYJ100)를 제조하기 위하여, SphⅠ으로 자른 S. venezuelae 게놈 DNA를 주형(template)으로 하고, 사용한 5'-des 클러스터 측면에 위치한 부분을 가진 1kb HindⅢ-PstⅠ단편은 서열 1 및 2를 프라이머로 사용하고, 3'-des 클러스터 측면에 위치한 부분을 가진 1kb KpnⅠ-EcoRⅠ단편은 서열 3 및 4를 프라이머로 사용하여, PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 반응성분은 주형 DNA 100ng, 각 프라이머 30pmol, pfu DNA polymerase 2.5unit, 각 dNTP 2mM, Tris-HCl 20mM, (NH4)2SO4 10mM, KCl 10mM, Triton X-100 1%, BSA 1mg/ml, MgSO
4 20mM 및 DMSO 10%로, 이들을 섞어서 총 부피가 50㎕가 되도록 하였다.
서열 1 (forward): 5'-GGCAAGCTTAGCGGGGCGACTGGCGTGCCCACT-3'
서열 2 (reverse): 5'-GGTCTGCAGTCACCGTGGGTTCTGCCATCTCTT-3'
서열 3 (forward): 5'-GCTGGTACCGGATGTTCCCTCCGGGCCACCGTC-3'
서열 4 (reverse): 5'-TGAGAATTCCCTCGCCGTCCTGCCCGCGCTTGG-3'
실시예 3:
돌연변이체 계통 스트렙토마이세스 베내주앨래 YJ013의 제조
S. venezuelae 에서의 유전자 교체를 위하여, ermE * 프로모터,
desⅢ, desⅣ 및 desR로 클로닝된 통합 플라스미드(integrative plasmid) pSET152를 사용하였다(도 3d). SphⅠ으로 자른 S. venezuelae 게놈 DNA를 주형(template)으로 하고, desⅢ를 포함하는 HindⅢ-SphⅠ단편은 서열 5 및 6을 프라이머로 사용하고, desⅣ를 포함하는 XbaⅠ-Hind Ⅲ 단편은 서열 7 및 8을 프라이머로 사용하고, desR을 포함하는 BamHⅠ-SphⅠ단편은 서열 9 및 10을 프라이머로 사용하여, 상기 실시예 2와 동일한 조건에서 PCR을 수행하였다.
서열 5 (forward): 5'-GGTAAGCTTAACGCGTCGGCCGCGAGGTGCCCT-3'
서열 6 (reverse): 5'-GCGGCATGCTAACTCGCCACGCCGACCGTTATC-3'
서열 7 (forward): 5'-AAGTCTAGATGAGGTCGAGGAAGGGGACGCGGG-3'
서열 8 (reverse): 5'-GACAAGCTTACCCACACCGCGACCTACAGCGCG-3'
서열 9 (forward): 5'-GGAGGATCCGGGTGCACCAAGCAAAGAGAGAGA-3'
서열 10 (reverse): 5'-GGCGCATGCTCACCAGACGTTGACCGTGGCGCT-3'
PCR로 증폭된 상기 유전자들은 pYJ136(도 4)이라 불리는 XbaⅠ/BamHⅠ으로 잘려진 pSET152로 서브클론하였다. 아프라마이신 선별 플레이트에서 한 사이클의 성장만 했다는 것을 제외하고는 상기 기술된 방법에 따른 pYJ136의 형질전환을 수행하여 바람직한 삽입을 포함하는 단일교차 돌연변이체(YJ013)를 제조하였다. 본 발명에서 사용된 계통들은 하기 표 1에 정리하였다.
| 유전자 | 미생물 | 항생제 | 당 경로 | 예상 기능 |
| des Ⅲ | S. venezuelae | 피크로마이신 | D-데소사민 | 글루코스-1-포스페이트 티미디릴 트랜스퍼라제 |
| des Ⅳ | S. venezuelae | 피크로마이신 | D-데소사민 | 글루코스-4,6-디하이드라타제 |
| des Ⅶ | S. venezuelae | 피크로마이신 | D-데소사민 | 글리코실 트랜스퍼라제 |
| des Ⅷ | S. venezuelae | 피크로마이신 | D-데소사민 | 미상 |
| des R | S. venezuelae | 피크로마이신 | D-데소사민 | β-글루코시다제 |
| ole V | S. antibioticuous | 올린도마이신 | L-올린드로스 | 2,3-디하이드라타제 |
| ole W | S. antibioticuous | 올린도마이신 | L-올린드로스 | 3-케토리덕타제 |
| urd R | S. Fradiae | 유르다마이신 A | D-올리보스 | 4-테토리덕타제 |
실시예 4:
돌연변이체 계통 스트렙토마이세스 베내주앨레 YJ013의 보완
올리보스 생합성 및 글리코실화를 위하여, desⅦ, desⅧ, oleV, oleW 및 urdR을 포함하는 플라스미드를 제작하였다. S. venezuelae 게놈 DNA를 주형으로 하고, desⅦ 를 포함하는 BamHⅠ-XbaⅠ단편은 서열 11 및 12를 프라이머로 사용하고, desⅧ 를 포함하는 XbaⅠ-XbaⅠ 단편은 서열 13 및 14를 프라이머로 사용하여, 상기 실시예 2와 동일한 조건에서 PCR을 수행하였다.
서열 11 (forward): 5'-CGCGGATCCACCGGCAAGGAAGGACACGACGCC-3'
서열 12 (reverse): 5'-GGGTCTAGATCAGTGCCGGGCGTCGGCCGGCGG-3'
서열 13 (forward): 5'-CGTTCTAGACCCGACCAGCCTTATCGAAGGAGC-3'
서열 14 (reverse): 5'-CGTTCTAGAGGTCCGAGCCGTCCGGTCCGTCCG-3'
S. antibioticus Tu99 게놈 DNA를 주형으로 하고, oleV 를 포함하는 XbaⅠ-PstⅠ단편은 서열 15 및 16를 프라이머로 사용하고, oleW 를 포함하는 PstⅠ-Sph
Ⅰ 단편은 서열 17 및 18를 프라이머로 사용하여, 상기 실시예 2와 동일한 조건에서 PCR을 수행하였다.
서열 15 (forward): 5'-CCGCCTTCTAGAGGGAATCGCGGAAGCGGCCGG-3'
서열 16 (reverse): 5'-CCTTCGCTGCAGTCAGCTCAGGCTGGATGCAGGC-3'
서열 17 (forward): 5'-CTTGGCCTGCAGAAGGGAACCCCATGCCCTCCC-3'
서열 18 (reverse): 5'-ACGGCCGCATGCTCAGCACCAGCGCACCCGCGC-3'
urdR 를 포함하는 SphⅠ-HindⅢ 단편은 서열 19 및 20을 프라이머로 사용하고, S. fradiae 게놈 DNA를 주형으로 하여 상기 실시예 2와 동일한 조건에서 PCR을 수행하였다.
서열 19 (forward): 5'-TGTCACGCATGCACAGAGATCCAGGACGACGCA-3'
서열 20 (reverse): 5'-GGGCTTAAGCTTTCAGATACGGACGGCGGAGGT-3'
상기 플라스미드들의 형질전환체는 티오스트렙톤 선별배지에서 배양함으로써 선별하였다.
실시예 5:
폴리케타이드 유도체의 생성 및 분석
S. venezuelae 야생형(wild type) 계통 및 돌연변이체들을 적절한 항생제 선별을 위해 3~4일 동안 37℃에서 SPA 고체 배지에 배양하였다. 아가 플레이트 상에서 성장한 배양균을 주사위 모양으로 잘라 배양균 부피의 2배에 해당하는 메탄올로 추출하였다. 상기 추출물을 30℃에서 회전식 농축증발기(rotary evaporator)로 여과하고 증발시킨 다음, 동일 부피의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)에 다시 용해하고 증류수로 수세하였다. 수세한 추출물은 그 다음 단계인 분석에 사용하기 위해 메탄올에 농축하였다.
농축된 용매 추출물의 분주액(aliquot) 5㎕를 전기분사 이온화-질량/질량분석계(electrospray ionization-mass/mass spectrometry)와 결합된 액체 크로마토그래피(LC/ESI-MS/MS)로 분석하였다. LC 분석은, 10mM 암모늄 아세테이트(ammonium acetate) 버퍼(pH 8.0)에 20%~80%의 유기시안화물(acetonitrile) 구배(gradient)가 형성된 25cm x 4.6mm 왓쳐스 120 ODS-BP(5㎛) 컬럼을 사용하여 유속 1ml/min에서 워터스 (Milford, MA, USA) 모델 2690 분리모듈로 수행하였다.
상기 유출물은, 약 200㎕/min으로 마이크로매스(Beverly, MA) 콰트로 LC 상단계 탠덤 사중극자 질량 분석계(Micromass Quattro LC triple tandem quadrupole mass spectrometer)로 향하게 하면서, ESI 계면에 도달하기 전에 1:5로 분리하였다. 질량 분석계 데이타는 분열된 특이적인 모질량(parent mass)을 스캐닝하는 동안 양이온 형태로 수집하였다.
예상된 올리보실 유도체에 대한 분석결과는 도 6에 나타난 바와 같다. 상기 올리보실 나르보노라이드는 보유시간(retention time)이 42.0분이고, 모 피크(parent peak, Na+ 형태)는 m/z 505.4이며, 분열 피크(fragmentation peak)는 m/z 375.4인 것으로 나타났다(도 6a). 상기 두 피크간의 차이 130은 자연적인 올리보스 잔기의 손실에 해당하는 것이다. C-10 및 C-12에 수산기가 붙은 올리보실 피크노마이신 유도체는 보유시간이 29.4분이며, 모피크(Na+ 형태)는 m/z 521.8이며, 분열 피크는 m/z 391.5인 것으로 나타났다(도 6b).
이상, 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 스트렙토마이세스 베네주앨레에서 호스트-벡터 시스템을 통해 새로운 항생물질의 조합 생합성을 가능케 함으로써, 신규한 항생물질을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 의하면, 마크로라이드-저항성 미생물 병원균(macrolide-resistance microbial pathogen)의 증가 및 진행 중인 신규 항균성 의약(antimicrobial drug)의 개발에 유용한 폴리케타이드를 제공할 수 있다. 또한, 기존의 항생제에 대해 내성을 지닌 세균들에 의한 질병을 치료하는데 있어 효과적인 항생물질을 합성할 수 있으므로 생물의약분야에 유용하다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (4)
- desⅦ, desⅧ, oleV, oleW 및 urdR을 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 하기 구조식 1로 표시되는 올리보실 피크로마이신 유도체의 제조방법:[구조식 1]
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pYJ146인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 형질전환에 사용된 미생물은 본래의 전체 des 클러스터를 결실시킨 다음, desⅢ, desⅣ 및 desR를 삽입한 스트렙토마이세스 베네주앨래(Streptomyces venezuelae) YJ013인 것을 특징으로 하는 방법.
- 하기 구조식 1로 표시되는 올리보실 피크로마이신 유도체:[구조식 1]
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