KR100606388B1 - 멕신단백질의 검출방법 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 생체시료중의 멕신단백질의 측정에 의해, 신장기능을 평가하는 방법을 제공한다. 또 본 발명은, 생체시료중의 멕신단백질의 측정에 유용한 면역학적 측정용 시약 및 키트를 제공한다.

멕신단백질, 메산기움세포, 생체시료, 표지분자, 항멕신단백질항체

Description

멕신단백질의 검출방법 및 그 용도{Method for detecting megsin protein and use thereof}

본 발명은 뇨나 혈액 등의 생체시료중에 포함되는 멕신단백질을 측정하는 것으로 된 신장기능 평가방법에 관한 것이다. 더욱이 본 발명은, 항멕신단백질항체를 포함하는 신장기능 진단용 시약에 관한 것이다.

신장의 혈액 여과작용이나 해독작용이 완전히 기능하지 않는 말기 신부전에 있어서는, 신장이식이 유일한 치료수단이지만, 일본에 있어서는, 이식신장의 공급체제가 충분히 정비되어 있다고는 말하기 어렵다. 또한, 이식요법 자체에 대한 사회적 인식도 진행되어 있지 않은 것 등으로부터, 신장 대용요법으로서는 투석요법에 의지할 수 밖에 없는 것이 현재의 상황이다.

현재, 일본의 투석환자는 약 17만명으로 추정된다. 1인당 평균적인 치료비는 연간 약 600만엔을 필요로 하여, 의료보험제도를 압박하는 커다란 원인의 하나로 되어 있다. 또한, 매주 2~3일, 1일 4~6시간을 투석치료를 위해 구속받는 것으로부터, 환자 본인의 사회활동도 크게 방해받게 된다.

신부전은, 신장질환 환자가 최종적으로 이르는 병태이다. 그 원인이나 경력은 다 똑같지는 않고, 약물중독, 감염증, 악성 종양, 당뇨병, 전신성 에리테마토데 스(SLE) 등의 본래 신장 이외의 병변에 의해, 신장장애가 발증하여 신부전에 이르는 경우도 많이 보여진다.

신장장애에 있어서는, 말기 즉 거의 신부전으로 될 때 까지 현저한 자각증상이 나타나지 않는 것으로부터, 그 발생을 간과하기 쉬워, 발증한 시점에서는 이미 신장은 회복 불가능한 손상을 입고 있는 경우가 많다. 따라서, 자각증상의 발현을 보기 전에, 가능한 한 초기 단계에서 신장장애를 발견하는 것이, 신부전으로의 이행을 막기 위해, 또한, 투석치료에 의한 보험재정 압박을 피하기 위해서도 중요하다.

종래, 신장장애를 진단하는 단서로서, 소위 검뇨에 의한 뇨단백이나 뇨침사(尿沈渣)의 검사가 널리 행해지고 있다. 그러나, 뇨단백은 정상인이더라도 과격한 운동, 정신적 스트레스, 다량의 육식, 월경전 등에서 일과성으로 증가한다. 또한, 젊은 사람에게 많이 보여지는(정상인의 0.5% 정도)기립성 단백뇨 등, 신장질환에 유래하지 않는 뇨단백도 있다. 또한 뇨로질환, 방광질환, 여성 성기질환 등에서도 뇨단백이 인정된다. 따라서, 뇨단백의 검사 만으로 신장장애를 확정진단하는 것은 곤란하다.

뇨침사는, 뇨를 원심분리하여, 그 침사를 현미경으로 관찰하는 것이지만, 적혈구침사는 정상인에게도 보이고, 신장장애 이외의 뇨로계 관련장기에 유래하는 경우도 있기 때문에, 이 또한 신장장애의 확정진단에는 불충분하다.

또한, 당뇨병성 신장병증(nephropathy)의 진단지표로서 뇨중에 누설된 알부민을 정량하여, 정상인의 정상값과 비교하여 조기의 당뇨병성 신장병증을 특정하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 뇨중의 알부민량은 정상인에게 있어서도 변동하는 것으로부터, 당뇨병성 신장병증의 정확한 병태를 파악할 수는 없다.

더욱이, 뇨성분의 혈중정체를 검사할 목적으로 혈청 크레아티닌(Cr), 혈중요소질소(BUN)의 측정 등도 행해지지만, 이들 검사도 식사의 영향을 받기 쉽다. 이와 같이, 뇨단백이나 혈청 Cr, BUN의 검사에 있어서 이상값이 나타나더라도, 그것이 반드시 신장장애에 유래하는 것이라고는 한정할 수 없고, 정상인이나 그 밖의 질환에서도 종종 이상값이 발현한다.

그 밖에, 뇨중 β₂-마이크로글로불린, N-아세틸글루코사미니다아제(NAG), IgG, 트랜스페린, 또는 인터루킨-6 등 여러 물질의 측정에 의한 신장장애의 진단이 시도되고 있지만, 신장장애의 중증도와 일치하지 않는 경우도 많아, 어느 것도 유효하지 않다.

또한, 이들 혈액성분을 뇨중에서 측정하는 방법에 대해서는, 신장 전체의 장애 또는 면역반응의 관여를 추측하는 것은 가능하지만, 신장 조직내의 장애부위를 특정하는 것은 곤란하다. 그리고, 상기에 열기한 수단 이외에는, 신장장애의 진단 및 중증도의 판정에 충분한 감도 및 특이성을 갖는 검사방법은 아직 알려져 있지 않다. 현재, 신장장애의 진단이나 중증도의 최종적 판정에는, 신장의 생체조직검사(renal biopsy)에 의한 조직학적 진단이 불가결한 것으로 되어 있다.

그러나, 신장의 생체조직검사는 침습적 검사로, 출혈, 감염 등의 합병증의 위험성이 항상 뒤따른다. 또한, 검사를 실시하기 위해서는, 전문의와 설비가 갖춰 진 시설에 입원해야만 하기 때문에, 환자에게 미치는 육체적, 사회적 부담은 무시할 수 없다.

이상과 같이, 검뇨에 의한 검사는 간편하고, 또한 다량의 검체를 처리할 수 있는 우수한 검사방법이기는 하지만, 신장장애의 확정진단이라는 관점에서는 만족할 수 있는 것은 아니다. 한편, 신장의 생체조직검사는, 신장장애의 진단, 중증도의 판정은 확실하지만, 그 이용은 극히 한정될 수 밖에 없다. 이러한 배경으로부터 검뇨의 간편함과, 신장의 생체조직검사의 정확함을 겸비한 신장장애의 진단방법이 요망되고 있었다.

그리고, 신장에 한정되지 않고 특정 조직에 특이적으로 발현하고 있는 단백질은, 종종 그 장기의 기능장애의 지표로서 사용된다. 예를 들면, LDH나 γGTP라는 효소단백질은, 간기능 마커로서 널리 이용되고 있다. 그러나 신장에 있어서는, 그 기능의 지표가 되는 신장에 특이적인 단백질의 존재는 알려져 있지 않다.

그런데, 본 발명자는, 대규모 DNA 서열결정 및 데이터베이스 해석에 의해, 메산기움세포에서 특히 강하게 발현하는 유전자로서, 멕신이라 명명한 유전자를 단리하고 있다. 그리고, 멕신의 전장 cDNA 클론이 코드하는 380개의 아미노산으로 된 신규 단백질인 멕신단백질을 취득하는 것에 성공했다. 더욱이, Swiss Prot 데이터베이스를 사용하여 FASTA 프로그램에 의한 아미노산 상동성 검색을 행한 바, 인간 멕신단백질이, SERPIN(세린 프로테아제 인히비터)슈퍼 패밀리(R.Carrell et al., Trends Biochem. Sci., 제10권, 20페이지, 1985년; R.Carrell et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 제52권, 527페이지, 1987년; E.K.O.Kruithof et al., Blood, 제86권, 4007페이지, 1995년; J.Potempa et al., J.Biol.Chem., 제269권, 15957페이지, 1994년; E.Remold-O'Donnell, FEBS Let., 제315권, 105페이지, 1993년)에 속하는 단백질인 것을 발견했다(T.Miyata et al., J.Clin.Invest., 제120권, 828-836페이지, 1998년). 그리고 이 사실을 특허출원했다(PCT출원 PCT/JP98/04269).

인간 멕신단백질은, 인간 섬유아세포, 평활근세포, 내피세포 및 케라티노사이트에서는 발현이 약하고, 메산기움세포에 있어서 특히 강하게 발현하고 있다. 또한, IgA 신장병증환자와 정상인에서 신장조직중의 멕신단백질의 발현량을 비교한 바, IgA 신장병증환자에게 있어서 멕신단백질의 발현량이 유의하게 높은 것을 발견했다. 따라서, 뇨중 또는 혈중에 존재하는 멕신단백질을 측정하는 것은, 예를 들면 IgA 신장병증 등의 메산기움세포 증식성 신장병증의 마커로서 유용하다고 생각된다. 이와 같이, 멕신단백질 유전자의 발현은 신장질환의 발증 및 그 항진에 깊이 관여하고 있을 가능성이 엿보이지만, 신장질환의 병태 진행과의 상관관계에 대해서는 명확하게 되어 있지 않았다.

발명의 개시

본 발명은, 상기와 같은 과제를 해결하여, 신장질환의 진단이나 중증도의 판정을 가능하게 하는 방법과, 그를 위한 시약, 또는 시약키트의 제공을 과제로 하고 있다.

먼저 본 발명자는, 신장장애의 확정진단 및 중증도를 판정하기 위해서는, 병 태와 밀접하게 관련된 특이적인 단백질을 측정할 필요가 있다고 생각했다. 따라서, 사구체에 존재하는 메산기움세포(mesangial cell)에 주목했다. 메산기움(mesangium)은, 신장사구체의 모세관계제(毛細管係蹄)의 소엽중심부에 위치하여, 각 소엽을 연결하는 중심이 되는 조직이다. 메산기움은 사구체 기저막에 덮여 있어, 모세관강(毛細管腔)과는 내피세포에 의해 격리되어 있는 세포(메산기움세포)와 3층으로 된 사구체 기저막 속의 내투명층과 연속하고 있는 무형물질(메산기움기질: mesangial matrix)로부터 구성되어 있다.

메산기움세포는, 신장사구체의 구조 및 기능의 유지에 중심적인 역활을 하고 있는 것이 알려져 있다. 또한 그 증식은, 사구체 신염이나 사구체 경화증 등의 사구체질환의 발증에 있어서의 주요한 요인이라고 생각되고 있다. 그리고, 메산기움세포는, 각종 신염에 있어서 장애의 표적으로 되어 있다. 예를 들면, 메산기움세포의 증식이나 세포외 메산기움기질의 축적은, 말기 신부전의 2대 원인인 만성 사구체 신염 및 당뇨병성 신장병증과 같은 여러 가지 사구체 장애를 갖는 환자에게 사구체 경화증을 초래하는 최초의 과정으로 되어 있다(D.Schlondorff, Kidney Int., 제49권, 1583-1585페이지, 1996년; R.B.Sterzel et al., Glomerular mesangial cells. Immunologic Renal Diseases, 595-626페이지, 1997년). 따라서, 메산기움세포에서 특이적으로 발현하고 있는 유전자를 찾아내어, 그 발현의 조절기구나 신장질환에 있어서의 병태와의 관련성을 명확하게 하는 것은, 메산기움세포의 생물학적 성질의 해명, 메산기움세포에 관련된 질환의 원인 구명, 더 나아가서는 메산기움세포에 관련된 질병의 치료, 진단 등에 유효하다고 생각된다.

또한, 메산기움세포의 증식이 심한 IgA 신장병증에 대해서는, 최근 스테로이드제의 유효성이 보고되어 있다(J.V.Donadio et al., J.Am.Soc.Nephrol.,제8권, 1324-1332,1997). 그러나 스테로이드제는, 한편으로 심한 부작용의 발현도 보여지는 것으로부터, 스테로이드제가 무효한 IgA 신장병증에 막연히 스테로이드제를 투여하는 것은 피해야만 한다. 따라서, 스테로이드요법에 있어서는, 메산기움세포의 증식 정도 등의 조직중상도(組織重傷度)와의 매칭이 필수로, 그 때문이라도 메산기움세포의 증식 정도를 간편하게 평가할 수 있는 신장기능 검사법이 요망되고 있었다.

본 발명자는, 신장질환의 발증 및 그 항진에 관련하여 멕신단백질 유전자의 발현이 증가하고, 그에 동반되어 멕신단백질의 산생이 증대되면, 뇨중 또는 혈중으로 멕신단백질이 누출되고, 또한 그 누출량은 병태의 진행에 따라 증가하는 것은 아닌가 생각했다. 그리고 이 메카니즘을 확인하기 위해, 여러 가지 생체시료중의 멕신단백질 농도, 또는 그 양의 측정과 비교를 시도하여, 그 측정값을 토대로 멕신단백질이 관여한 신장질환의 상태를 평가할 수 있는 것을 발견하고 본 발명에 도달했다. 즉 본 발명은, 이하의 신장기능 평가방법과, 그를 위한 시약, 또는 시약키트에 관한 것이다.

[1] 생체시료중의 멕신단백질을 측정하는 것으로 된, 신장기능 평가방법.

[2] [1]에 있어서, 생체시료중의 멕신단백질을 측정하여, 정상 시료의 멕신단백질의 측정값과 비교하는 것으로 된, 신장기능 평가방법.

[3] [1]에 있어서, 생체시료가 뇨인 신장기능 평가방법.

[4] [1]에 있어서, 생체시료중의 멕신단백질을, 항멕신단백질항체를 사용한 항원항체반응에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는, 신장기능 평가방법.

[5] [4]에 있어서, 항멕신단백질항체가 단일클론항체인, 신장기능 평가방법.

[6] 항멕신단백질항체를 포함하는 신장기능 진단용 시약.

[7] [6]에 있어서, 항멕신단백질항체가 단일클론항체인, 신장기능 진단용 시약.

[8] 고체과립의 표면에, 항멕신단백질항체를 결합한, 생체시료중에 포함되는 멕신단백질 검출용 과립.

[9] [8]에 있어서, 고체과립이 자성을 갖는 것인, 멕신단백질 검출용 과립.

[10] [8]에 있어서, 고체과립의 비중이 1 이상인, 멕신단백질 검출용 과립.

[11] [8]에 있어서, 항멕신단백질항체가 단일클론항체인, 멕신단백질 검출용 과립.

[12] 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체시료중에 포함되는 멕신단백질의 검출방법.

i) 고체과립의 표면에 제1 항멕신단백질항체를 결합한 멕신단백질 검출용 과립을 생체시료와 접촉시키는 공정

ii) 생체시료를 접촉시킨 상기 멕신단백질 검출용 과립에, 표지분자를 결합한 제2 항멕신단백질항체를 접촉시키는 공정, 및

iii) 상기 제2 항멕신단백질항체를 사이에 두고 멕신단백질과 결합하고 있는 상기 표지분자를 검출하는 공정

[13] [12]에 있어서, 제1 항멕신단백질항체 및 제2 항멕신단백질항체가 단일클론항체인 검출방법.

[14] [13]에 있어서, 제1 항멕신단백질항체 및 제2 항멕신단백질항체가 다른 인식부위를 갖는 항멕신단백질항체인 검출방법.

[15] [12]에 있어서, 생체시료가 뇨인 검출방법.

[16] [12]에 있어서, 생체시료가 혈액인 검출방법.

[17] 이하의 요소를 포함하는 멕신단백질 검출용 키트.

a) 항멕신단백질항체를 결합하기 위한 자성 고체과립,

b) 상기 자성 고체입자에 미리 고정되던가, 또는 간접적으로 고정할 수 있는 항멕신단백질항체, 및

c) 자석

[18] [17]에 있어서, 표지분자를 결합한 항멕신단백질항체를 더 포함하는, 멕신단백질 검출용 키트.

멕신단백질은, 앞서 기술한 바와 같이 인간 신장 메산기움세포에서 고도로 발현하고 있는 유전자에 의해 코드되는 단백질로서 단리되었다. 본 발명에 있어서의 멕신단백질에는, 서열번호:2에 나타내는 아미노산서열을 갖는 단백질(인간 ·멕신단백질) 뿐 아니라, 그 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 기능적으로 동등한 단백질로서는, 예를 들면 인간 이외의 종에 있어서의 멕신단백질의 호모로그(homologue)를 나타낼 수 있다. 또는, 생체시료중에 발견할 수 있어 신장기능의 지표로 하는 것이 가능하다면, 그들의 전구체나 단편 외에, 멕신단백질과 프로테아제의 복합체를 지표로 하는 것도 가능하다. 인간 이외의 종에 있어서의 멕신단백질의 호모로그는, 그 종에 있어서의 신장기능의 평가지표로 할 수 있다. 따라서, 신장기능장애의 모델에 있어서의 병태의 파악에 유용하다.

인간 이외의 종에 유래하는 멕신단백질의 호모로그는, 예를 들면 다음과 같이 하여 얻을 수 있다. 서열번호:1에 나타내는 인간의 멕신단백질을 코드하는 cDNA의 염기서열을 토대로, ORF의 전후에 디제네레이티브 프라이머(degenerative primer)를 설정하고, 이것을 이용한 PCR에 의해 호모로그의 cDNA를 증폭한다. 증폭된 cDNA가 완전장이 아닌 경우에는, 5'RACE법 등에 의해 상류의 염기서열을 더 명확하게 할 수 있다. 예를 들면 래트에 있어서는, 배양 메산기움세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 행한다. 이 때에 사용하는 디제네레이티브 프라이머로서는, 예를 들면 다음의 염기서열로 된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 이 PCR에 의해 얻어지는 클론을 서열결정하면, 래트에 있어서의 멕신단백질 호모로그의 구조 일부를 명확하게 할 수 있다.

degenerative 프라이머 FY:GTGAATGCTGTGTACTTAAAGGCAANTGN/서열번호:3

(172VNAVYFKGK180에 상당),

degenerative 프라이머 R21:AANAGRAANGGRTCNGC/서열번호:4

(R은, A 또는 G:357ADHPFLF363에 상당)

그러나 이 프라이머의 조합으로는 cDNA의 일부 밖에 증폭할 수 없기 때문에, 5'측 영역을 더 얻기 위해서는, 래트 멕신단백질의 클론 단편으로부터 유전자 특이적 프라이머를 조제하여, 재차 degenerate PCR을 행한다. 이 때에 이용하는 멕신단 백질의 N말단 부근의 아미노산서열에 상당하는 프라이머의 염기서열은 아래와 같다.

degenerative 프라이머 RM-CtermC1:ATGGCNTCNGCNGCNGCNGCNAAYGC/서열번호:5 (Y는 T 또는 C, 멕신단백질을 코드하는 서열의 N-말단에 대응한다)

RM-MR-A2:CGACCTCCAGAGGCAATTCCAGAGAGATCAGCCCTGG/서열번호:6

RM-MR-A1:GTCTTCCAAGCCTACAGATTTCAAGTGGCTCCTC/서열번호:7

(어느 것도 래트 멕신단백질 특이적 reverse 프라이머이다)

얻어진 PCR 산물을 pGEM-T-easy 벡터(Promega제)에 혼입하고, 그 염기서열을 명확하게 하면 래트의 호모로그를 코드하는 cDNA의 3'영역을 얻을 수 있다. 이렇게 해서 얻어진 염기서열을 토대로 디자인된 프라이머를 사용하여, 5'-RACE 및 3'-RACE법을 행하면, 최종적으로는 호모로그를 코드하는 cDNA 전장의 염기서열을 결정할 수 있다. 또한 래트의 경우, 5'-RACE에는, 2종의 유전자 특이적 안티센스 프라이머 RM-PRO1:GCTCAGGGCAGTGAAGATGCTCAGGGAAGA/서열번호:8 및 RM-PRO2: CTGACGTGCACAGTCACCTCGAGCACC/서열번호:9를 사용할 수 있다. 한편, 3'-RACE에는, 유전자 특이적 센스 프라이머 RM-MR-S3:GAGGTCTCAGAAGAAGGCACTGAGGCAACTGCTGCC/서열번호:10을 사용할 수 있다. 마우스 있어서도, 동일한 수법에 의해 호모로그의 단리가 가능하다. 서열번호:18(래트) 및 서열번호:20(마우스)에 나타낸 래트와 마우스에 있어서의 멕신 cDNA의 염기서열은, 이러한 수법을 토대로 명확해진 것이다.

본 발명에 있어서 사용되는 멕신단백질의 측정법은 제한되지 않는다. 예를 들면, 멕신단백질에 대한 항체와, 멕신단백질과의 면역학적 반응을 응용한 면역학 적 측정방법은 특이성과 감도면에서 우수하다. 이러한 예로서는, 면역침강, 라디오이뮤노어세이(radioimmunoassay), 면역형광분석, 엔자임이뮤노어세이 (enzymeimmunoassay), 화학발광분석, 이뮤노히스토케미스트(Immunohistochemist)분석이 포함된다. 또한 멕신단백질에 대한 항체를 이용하여, 웨스턴 블로팅법에 의해 멕신단백질을 측정하는 것도 가능하다. 또한, 이들 이뮤노어세이는, 예를 들면 면역침강과 그 후의 웨스턴 블로팅법과 같이 조합하여 사용하는 것도 가능하다. 이들 분석수단은, 해당 기술분야에 있어서 공지이다.

이뮤노히스토케미스트(면역조직염색)란, 분리한 인간의 세포 또는 그의 파쇄액, 조직 또는 그의 파쇄액, 혈청, 흉수, 복수, 안액 등에 본 발명의 항체를 반응시키고, 플루오레신이소티오시아네이트(FITC) 등의 형광물질, 퍼옥시다아제 등의 효소표지를 행한 항마우스 IgG 항체 또는 결합단편을 반응시킨 후, 현미경을 사용하여 관찰하는 방법이다. 각 표지물질은, 비오틴화한 항체에 스트렙트아비딘결합 표지물질을 결합시킴으로써 간접적으로 표지하는 것도 가능하다. 그 밖에 멕신단백질이 프로테아제 인히비터인 것으로부터, 프로테아제의 저해활성을 지표로서 검출하는 것이 가능하다. 또는, 프로테아제에 대한 친화성을 이용하여 멕신단백질의 측정을 실시할 수 있다.

멕신단백질의 면역학적인 측정방법에 필요한 항체는, 검출대상인 멕신단백질을 인식할 수 있는 것이라면, 그 유래나 조제방법은 한정되지 않는다. 따라서, 다중클론항체, 단일클론항체, 또는 그들의 혼합물 등을 이용할 수 있다. 또한, 항체분자의 가변영역을 포함하는 단편을 이용하는 것도 가능하다. 멕신단백질의 항체 는, 예를 들면 아래와 같이 하여 얻을 수 있다. 본 발명에 사용하는 항체에는, 예를 들면, 서열번호:2에 기재된 아미노산서열을 갖는 단백질에 대한 항체가 포함된다. 멕신단백질 또는 그의 부분 아미노산서열에 대한 항체(예를 들면 다중클론항체, 단일클론항체), 또는 항혈청은, 멕신단백질, 그의 부분 아미노산서열을 포함하는 올리고펩티드, 또는 c-myc-(His)₆-Tag-멕신단백질이나 MBP-멕신단백질과 같은 융합단백질을 항원으로서 사용하여, 자체 공지의 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 단일클론항체는, 후술하는 방법에 따라 제조할 수 있다. 또한 부분 아미노산서열을 갖는 합성펩티드를 면역원으로 하는 경우에는, 가능한 한 멕신단백질에 특이적으로 존재하고, 또한 친수성이 높은 부분의 아미노산서열을 이용하는 것이 일반적으로 유리하다. 이러한 아미노산서열로서는, 실시예에서 이용한 서열번호:11~서열번호:17에 나타내는 바와 같은 아미노산서열을 들 수 있다. 이들 아미노산서열 중에서도, 특히 서열번호:12(인간), 서열번호:14(인간), 또는 서열번호:17(래트)에 나타낸 아미노산서열은, 사구체조직에 대한 양호한 반응성을 가진 항체를 주었다.

본 발명의 멕신단백질, 또는 본 발명의 멕신단백질의 부분 아미노산서열을 갖는 합성펩티드는, 온혈동물에 대해 투여에 의해 항체산생이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 합성펩티드는, 소티로글로불린이나 키홀 림펫 헤모시아닌(kehole limpet hemocyanin)과 같은 담체단백질과 결합시킨 것을 면역원로서 사용한다. 투여시에 항체 산생능을 높이기 위해, 완전 프로인드 아쥬반 트나 불완전 프로인드 아쥬반트와 함께 투여할 수 있다. 투여는 통상 1∼6주 마다 1회씩, 합계 2∼10회 정도 행해진다. 사용되는 온혈동물로서는, 예를 들면 원숭이, 토끼, 개, 모르모트, 마우스, 래트, 양, 염소, 닭을 들 수 있지만, 마우스 및 래트가 바람직하게 사용된다. 단일클론항체 산생세포의 제작시에는, 항원을 면역된 온혈동물, 예를 들면 마우스로부터 항체가가 인정된 개체를 선택하여 최종면역의 2~5일 후에 비장 또는 림프절을 채취하여, 그들에 포함되는 항체 산생세포를 골수종세포와 융합시킴으로써, 단일클론항체 산생하이브리도마를 조제할 수 있다. 항혈청 중의 항체가 측정은, 예를 들면 후술하는 표지화 멕신단백질과 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합한 표지제의 활성을 측정함으로써 이루어진다.

본 발명에 의한 단일클론항체는, 멕신단백질에 특이적인 에피토프를 인식하는 것을 선택함으로써 다른 단백질과 교차하지 않는 것으로 할 수 있다. 일반적으로, 그 단백질을 구성하는 아미노산서열 중에서, 연속하는 적어도 7 이상의 아미노산잔기, 바람직하게는 10~20 아미노산의 아미노산서열에 의해 제시되는 에피토프는, 그 단백질에 고유의 에피토프를 나타낸다고 말하여지고 있다. 따라서, 예를 들면 서열번호:2(인간), 서열번호:19(래트) 및 서열번호:21(마우스)중 어느 하나에 기재된 아미노산서열로부터 선택되고, 또한 연속하는 적어도 7 아미노산 잔기로 된 아미노산서열을 갖는 펩티드에 의해 구성되는 에피토프를 인식하는 단일클론항체는, 멕신단백질 특이적인 단일클론항체라 할 수 있다. 서열번호:2, 서열번호:19(래트) 및 서열번호:21(마우스)에 기재된 아미노산서열 사이에서 보존된 아미노산서열을 선택하면, 멕신단백질 패밀리에 공통의 에피토프를 선택할 수 있다. 또한 각 서 열에 특이적인 아미노산서열을 포함하는 영역이라면, 종간(種間)의 식별이 가능한 단일클론항체를 선택할 수 있다.

항멕신단백질 단일클론항체의 분리정제는 통상의 다중클론항체의 분리정제와 동일하게 면역글로불린의 분리정제법에 따라 행해진다. 공지의 정제법으로서는, 예를 들면, 염석법, 알코올침전법, 등전점침전법, 전기영동법, 이온교환체(예를 들면 DEAE)에 의한 흡탈착법, 초원심법, 겔여과법, 항원결합고상 또는 프로틴A 또는 프로틴G 등의 활성 흡착제에 의해 항체 만을 채취하여, 결합을 해리시켜 항체를 얻는 특이적 정제법과 같은 수법을 나타낼 수 있다.

이렇게 해서 얻어진 멕신단백질을 인식하는 단일클론항체 또는 다중클론항체는, 메산기움세포에 관련된 질병의 진단 등에 이용하는 것이 가능하다. 이들 항체를 사용하여 멕신단백질을 측정하는 방법으로서는, 불용성 담체에 결합시킨 항체와, 표지분자를 결합한 표지화 항체에 의해 멕신단백질을 반응시켜 생성한 샌드위치 착체를 검출하는 샌드위치법, 또한 표지 인간뇨 유래 멕신단백질과 검체중의 인간뇨 유래 멕신단백질을 항체와 경합적으로 반응시켜, 항체와 반응한 표지항원량으로부터 검체중의 인간뇨 유래 멕신단백질을 측정하는 경합법을 이용하여 검체중의 인간뇨 유래 멕신단백질을 측정할 수 있다.

샌드위치법에 의한 인간뇨 유래 멕신단백질의 측정에 있어서는, 먼저, 고정화 항체와 인간뇨 유래 멕신단백질을 반응시킨 후, 미반응물을 세척에 의해 완전히 제거하고, 표지화 항체를 첨가하여 고정화 항체-인간뇨 유래 멕신단백질 표지화 항체를 형성시키는 2단계법 또는 고정화 항체, 표지화 항체 및 인간뇨 유래 멕신단백 질을 동시에 혼합하는 1단계법 등을 사용할 수 있다.

측정에 사용되는 불용성 담체는, 예를 들면 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리염화비닐, 폴리에스테르, 폴리아크릴산에스테르, 나일론, 폴리아세탈, 불소 수지 등의 합성 수지, 셀룰로오스, 아가로우즈 등의 다당류, 유리, 금속 등을 들 수 있다. 불용성 담체의 형상으로서는, 예를 들면 입자상, 트레이상, 구상, 섬유상, 막대상, 반상(盤狀), 용기상, 셀, 시험관 등의 여러 가지 형상을 사용할 수 있다. 항체를 흡착한 담체는, 적절히 아지화 나트륨 등의 방부제의 존재하, 냉한 곳에 보존한다.

한편, 인간 정자의 수정능을 평가하기 위한 시약으로서, 고체과립의 표면에, 선체반응 후의 인간 정자와 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 결합하여 된, 정자 수정능 검출용 과립이 알려져 있다(특허 제2651249호). 이 검출용 과립은, 선체반응 후의 인간 정자와 특이적으로 반응하는 단일클론항체를 고체과립에 결합시킨 것이다. 이것에 정자를 결합시켜, 결합한 정자를 계수(計數)함으로써, 인간 정자의 수정능을 평가할 수 있다. 방사능, 형광 등의 번잡한 측정수단을 필요로 하지 않고, 단시간에 용이하고 확실하게 수정능의 시험이 가능하다. 또한, 자성을 갖는 고체과립을 사용하는 경우는, 자석에 의해 용이하게 고체과립을 집속(集束)시킬 수 있어, 미량 샘플의 측정도 가능해진다. 본 발명자는, 이 기술을 멕신단백질의 검출에 적용함으로써, 보다 간편하고 또한 정확한 멕신단백질의 검출이 가능해지는 것을 발견하였다.

항체의 고상화는, 공지의 화학결합법 또는 물리적 흡착법을 사용할 수 있다. 화학적 결합법으로서는 예를 들면 글루타르알데히드를 사용하는 방법, N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 및 N-숙신이미딜-2-말레이미도아세테이트 등을 사용하는 말레이미드법, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산 등을 사용하는 카르보디이미드법을 들 수 있다. 그 밖에, 말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미도에스테르법, N-숙시미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온산법, 비스디아조화벤지딘법, 디팔미틸리진법을 들 수 있다. 또한, 앞서 피검출물질과 에피토프가 다른 2종류의 항체를 반응시켜 형성시킨 복합체를, 항체에 대한 제3의 항체를 상기의 방법으로 고상화시켜 두고 포착하는 것도 가능하다.

표지물질은, 면역학적 측정법에 사용할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 효소, 형광물질, 발광물질, 방사성 물질, 금속킬레이트 등을 사용할 수 있다. 바람직한 표지효소로서는, 예를 들면 퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 사과산데히드로게나아제, 포도상구균뉴클레아제, 델타-5-스테로이드이소머라제, α-글리세롤포스페이트데히드로게나아제, 트리오스포스페이트이소머라제, 서양고추냉이퍼옥시다아제, 아스파라기나아제, 글루코오스옥시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트데히드로게나아제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스테라아제 등을 들 수 있다. 바람직한 형광물질로서는, 예를 들면 플루오레세인이소시아네이트, 피코빌리프로틴, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌 및 오르토프탈알데히드 등을 들 수 있다. 바람직한 발광물질로서는 이소루미놀, 루시게닌, 루미놀, 방향족아크리디니움에스테르, 이미다졸, 아크리디니움염 및 그의 수식에스테르, 루시페린, 루시페라아제 및 에쿠오린 등을 들 수 있다. 그리고 바람직한 방사성 물질로서는, ¹²⁵I, ¹²⁷I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H, ³²P, 또는 ³⁵S 등을 들 수 있다.

상기 표지물질을 항체에 결합하는 수법은 공지이다. 구체적으로는, 직접표지와 간접표지를 이용할 수 있다. 직접표지로서는, 가교제에 의해 항체, 또는 항체단편과 표지를 화학적으로 공유결합하는 방법이 일반적이다. 가교제로서는, N,N'-오르토페닐렌디말레이미드, 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산산 ·N-숙신이미드에스테르, 6-말레이미도헥산산 ·N-숙신이미드에스테르, 4,4'-디티오피리딘, 그 밖의 공지의 가교제를 이용할 수 있다. 이들 가교제와 효소 및 항체와의 반응은, 각각의 가교제의 성질에 따라 기지의 방법에 따라 행하면 좋다. 이 밖에, 항체에 비오틴, 디니트로페닐, 피리독살 또는 플루오레사민과 같은 저분자 합텐을 결합시켜 놓고, 이것을 인식하는 결합성분에 의해 간접적으로 표지하는 방법을 채용하는 것도 가능하다. 비오틴에 대해서는 아비딘이나 스트렙트아비딘이 인식 리간드로서 이용된다. 한편, 디니트로페닐, 피리독살 또는 플루오레사민에 대해서는, 이들 합텐을 인식하는 항체가 표지된다.

항체를 표지하는 경우, 서양고추냉이퍼옥시다아제를 표지화 효소로서 사용할 수 있다. 본 효소는 많은 기질과 반응할 수 있어, 과옥소산법에 의해 용이하게 항체에 결합시킬 수 있기 때문에 유리하다. 또한, 항체로서는 경우에 따라서는, 그 단편(fragment), 예를 들면 Fab', Fab, F(ab')₂를 사용한다. 또한, 다중클론항체, 단일클론항체에 관계 없이 동일한 처리에 의해 효소 표지체를 얻을 수 있다. 상기 가교제를 사용하여 얻어지는 효소 표지체는 어피니티 크로마토그래피 등의 공지의 방법으로 정제하면 더욱 감도가 높은 면역측정계가 가능해진다. 정제한 효소 표지화 항체는, 방부제로서 티메로살(Thimerosal) 등을, 그리고 안정제로서 글리세린 등을 가하여 보존한다. 표지화 항체는, 동결건조하여 냉하고 어두운 곳에 보존함으로써, 보다 장기간에 걸쳐 보존할 수 있다.

표지화제가 효소인 경우에는, 그 활성을 측정하기 위해 기질, 필요에 따라 발색제가 사용된다. 효소로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우에는, 기질용액으로서 H₂O₂를 사용하고, 발색제로서 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤조티아졸린설폰산] 암모늄염(ABTS), 5-아미노살리실산, 오르토페닐렌디아민, 4-아미노안티피린, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 등을 사용할 수 있다. 효소에 알칼리포스파타아제를 사용하는 경우는, 기질로서 오르토니트로페닐포스페이트, 파라니트로페닐인산 등을 사용할 수 있다. 효소에 β-D-갈락토시다아제를 사용하는 경우는 기질로서 플루오레세인-디-(β-D-갈락토피라노시드), 4-메틸운베리페닐-β-D-갈락토피라노시드 등을 사용할 수 있다. 본 발명은, 또한, 상술의 단일클론항체, 또는 다중클론항체를 표지하여, 또는 고상화하여 멕신단백질의 면역학적 측정용 시약으로 한 것, 더 나아가서는 이 시약에 표지검출용 지시약이나 대조시료 등을 키트화한 것을 포함하는 것이다.

본 발명에 있어서의 멕신단백질의 측정대상은, 혈장, 혈청, 혈액, 뇨, 조직액, 또는 뇌척수액 등의 체액 등, 멕신단백질, 또는 멕신단백질의 전구체나 단편을 포함하는 생체시료라면 한정되지 않는다. 이들 생체시료 중에서도 특히 뇨에 있어서는, 메산기움세포의 증식이나 활성화에 동반하여 높은 빈도로 멕신단백질이 검출되어 된다. 따라서, 뇨중 멕신단백질의 측정은, IgA 신장병증 등의 메산기움 증식성 신장병증의 마커로서 유용하다.

본 발명에 있어서 신장기능의 평가란, 신장조직을 구성하는 중요한 세포인 메산기움세포의 상태를 파악하여, 메산기움세포에 이상을 생기게 하는 신장질환의 유무, 또는 그 정도를 아는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서의 신장질환이란, 메산기움세포에 이상을 동반하는 모든 질환을 포함한다. 구체적으로는, IgA 신장병증, 급성 사구체 신염(nephritis), 둥지상 사구체 경화증, 막성 증식성 사구체 신염, 당뇨병성 신염 및 루프스신염 등을 들 수 있고, 이러한 신장질환에 의해 변화된 신장기능의 상태를 본 발명의 방법에 의해 평가할 수 있다. 본 발명에 의한 신장기능의 평가방법은, 이들 질환 중에서도 IgA 신장병증과 같은 메산기움세포 증식성 신장병증의 마커로서 특히 유용하다. 또한, 본 발명의 신장기능 평가방법은, 신장질환의 유무나 정도의 판정 외에, 치료효과의 평가나 예후의 판정에 적용할 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 신장기능의 평가방법에 의하면, 뇨단백의 검사에서 양성을 나타내는 검체에 대해 멕신단백질의 양을 측정함으로써, 메산기움세포의 증식에 기인하지 않는 급성 신우신염, 만성 신우신염, 미소변화형 네프로제증후군(nephritic syndrom), 만성 사구체 신염 및 신장아밀로이드시스 등의 질환을 제외할 수 있다.

본 발명을 토대로, 신장기능의 평가를 행하는 데에는, 신장기능을 평가할 개 체의 생체시료를 채취하여, 이것에 포함되는 멕신단백질의 농도를 앞서 기술한 바와 같은 방법을 토대로 측정한다. 그리고 바람직하게는, 농도와 체액의 체적으로부터 멕신단백질의 양을 명확하게 하여, 정상자의 값과 비교한다. 멕신단백질의 양을 구하는 데에는, 뇨를 시료로서 사용하는 경우에는, 예를 들면 1일분의 뇨를 풀(pool)하여 뇨의 양을 측정하면, 뇨에 있어서의 1일당 멕신단백질의 양을 명확하게 할 수 있다. 또한, 수시뇨를 시료로 한 경우이더라도, 크레아티닌보정에 의해 양에 상당하는 값을 추정하는 것도 가능하다. 크레아티닌보정이란, 크레아티닌의 농도를 토대로 뇨량의 변동에 의한 측정 대상성분의 희석(또는 농축)의 영향을 보정하는 수법이다. 1일당 뇨로의 크레아티닌 배설량이 일정한 것을 토대로, 크레아티닌의 농도로부터 임시뇨가 1일에 있어서의 뇨의 총배설량에 차지하는 비율을 산출하고, 동일한 뇨로부터 얻어진 측정 대상성분의 농도를 1일당 총배설량으로 환산할 수 있다. 또한 혈액에 있어서는, 체중보정 등의 신장기능 진단시에 일반적으로 사용되는 수치보정을 적용하여 양의 추정이 가능하다. 체중보정이란, 혈액을 채취한 개체의 체중으로부터 추측되는 혈액의 체적을 토대로, 혈액중성분의 양을 산출하는 방법이다.

이 밖에, 어느 한 개체에 유래하는 생체시료의 멕신단백질농도의 변동을 관찰하면, 양으로의 환산을 행하지 않고도 신장기능의 변화를 경시적으로 추적할 수 있다. 또한, 특정 종, 또는 인종 등의 집단에 있어서의 체액시료의 멕신단백질농도의 정상값을 미리 설정해 두고, 특정 개체의 멕신단백질농도(또는 양)와 비교함으로써, 신장기능의 이상의 유무를 아는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서, 생체시료로서는, 뇨나 혈액을 사용할 수 있다. 그 중에서도 뇨는, 비침습적으로 채취할 수 있고, 신장기능의 상태를 직접적으로 반영하는 바람직한 시료이다. 혈액의 채취는 약간의 침습을 동반하기는 하지만, 멕신단백질이 신장에 특이적인 단백질인 것으로부터, 그 측정값의 이상은, 신장기능의 이상과 밀접하게 관여하고 있다. 따라서, 신장기능의 지표로서 높은 특이성을 기대할 수 있다. 예를 들면, 현재 널리 행해지고 있는 뇨단백질을 지표로 하는 신장기능장애의 스크리닝에 비해, 멕신단백질을 지표로 함으로써, 보다 특이적이고 감도가 우수한 스크리닝을 기대할 수 있다. 아래에, 단일클론항체를 이용한 멕신단백질의 면역학적인 측정방법을 토대로 뇨중의 멕신단백질을 측정하여 신장기능을 평가하기 위한 구체적인 조작에 대해 상세히 설명한다.

(A) 항체의 제조

(1) 동물의 면역과 항체산생세포의 조제

동물의 면역은, 예를 들면 다음과 같이 행한다. 공지의 방법(예를 들면, T.Miyata et al., J.Clin.Invest., 제120권, 828-836페이지, 1998년)에 따라 정제한 인간 멕신단백질을 래트, 마우스 등의 포유류동물에 면역한다. 포유류동물은 세포융합할 때의 상대의 영구증식성 세포와 동계통의 동물을 사용하는 것이 바람직하다. 동물의 주령(週齡)은, 예를 들면 마우스의 경우에는 8~10주령이 적합하다. 성은 암컷 수컷 어느 것이더라도 상관 없다. 면역의 방법은, 정제한 인간 멕신단백질을 적당한 아쥬반트(예를 들면 프로인드 완전 아쥬반트 또는 수산화 알루미늄겔-백일해균 백신 등)와 혼합하여 에멀젼으로 한 후, 동물의 피하, 복강내, 정맥내 등에 투여한다. 이후, 이 면역조작을 1~2주일 간격으로 2~5회 행한다. 최종면역은, 0.5~2 ㎍의 인간 멕신단백질을 동물의 복강내에 투여함으로써 행한다. 이와 같이 하여 면역한 동물의 체액으로부터는, 다중클론항체가 얻어진다. 각 면역조작 후 3~7일 후에 안저정맥총(眼底靜脈叢)으로부터 채혈하고, 그 혈청의 항체가를 아래에 나타내는 프로틴A 로제트 어세이법(rosette assay)(Eur.J.Immunol., 제4권, 500-507페이지, 1974년)에 의해 측정하고, 항체가가 충분히 상승했을 때, 항체 또는 항체산생세포를 채취한다.

프로틴A 로제트 어세이법은, 예를 들면, 72웰의 테라사키플레이트(Falcon제)에 인간 적아구성 세포주 K562(Japanese Cancer Research Resources Bank(JCRS)제)를 코팅하고, PBS(인산이나트륨 2.90 g, 인산-칼륨 0.20 g, 염화나트륨 8 g, 염화칼륨 0.2 g, 증류수 1L)로 희석한 시료를 가하여, CO₂ 인큐베이터내에 37℃에서 30분간 방치한다. 그리고, PBS로 세척 후, 프로틴A(Amersham Pharmacia Biotech제)를 코팅한 양의 적혈구를 가하여 로제트의 형성을 현미경으로 관찰함으로써 실시된다.

상기와 같이 인간 멕신단백질로 면역한 동물로부터 항체산생세포를 채취한다. 항체산생세포는, 비장, 림프절, 말초혈 등으로부터 얻을 수 있지만, 특히 비장이 바람직하다. 예를 들면, 최종면역의 3~4일 후에 비장을 무균적으로 적출하여, Minimal Essential Medium(MEM)배지(닛스이세이야쿠제)중에서 잘게 절단하고, 핀셋으로 떼어내어, 1200 rpm ×5분간의 조건으로 원심분리시킨 후, 상청을 제거하고, 트리스-염산완충액(pH 7.65)으로 1~2분간 처리하여 적혈구를 제거하고, MEM배지에 서 3회 더 세척하여 세포융합용 비장세포를 얻는다.

(2) 영구증식성 세포의 조제

융합되는 상대쪽 영구증식성 세포에는, 영구증식성을 갖는 임의의 세포를 사용할 수 있지만, 일반적으로는 골수종세포가 사용된다. 영구증식성 세포는 항체산생세포와 동종의 동물 유래인 것을 사용하는 것이 좋다. 예를 들면 마우스의 경우, 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c)유래 골수종세포주로서 다음과 같은 세포주가 알려져 있다.

P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(Current.Topics in Microbiol.Immunol., 제81권, 1-7페이지, 1978년),

P3/NS1/1-Ag4-1(NS-1)(Eur.J.Immunol., 제6권, 511-519페이지, 1976년),

SP2/O-Ag14(SP-2)(Nature, 제276권, 269-270페이지, 1978년),

P3-X63-Ag8653(653)(J.Immunol., 제123권, 1548-1550페이지, 1979년) 및

P3-X63-Ag8(X63)(Nature, 제256권, 495-497페이지, 1975년)

이들 영구증식성 세포주는, 8-아자구아닌배지(RPMI-1640배지에 글루타민(1.5 mM), 2-메르캅토에탄올(5 ×10^-5M), 젠타마이신(10 ㎍/mL) 및 소태아혈청(FCS, CLS제)(10%)을 가한 정상배지에, 8-아자구아닌(15 ㎍/mL)을 더 가한 배지)에서 계대배양하고, 세포융합의 3~4일 전에 정상배지에 계대하여, 융합 당일 2 ×10⁷개 이상의 세포수를 확보한다.

(3) 세포융합

세포융합은 예를 들면 다음과 같이 행한다. (1)에서 얻어진 항체산생세포와 (2)에서 준비한 영구증식성 세포를 MEM배지 또는 PBS로 잘 세척하여, 세포수가 5~10:1의 비가 되도록 혼합한다. 1200 rpm ×5분간 원심분리한 후, 상청을 제거하고, 침전된 세포군을 잘 떼어낸 후, 교반하면서 37℃로 유지하면서, 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000) 1~4 g, MEM배지 1~4 mL 및 디메틸설폭시드 0.5~1.0 mL의 혼액 0.1~1.0 mL/10⁸개 세포를 가하여 세포융합을 일으킨다. 그 후, 10분 마다 MEM배지 3 mL를 수회 첨가하고, MEM배지를 전량이 50 mL이 되도록 가하여 희석하여, 세포융합을 정지시킨다. 다음에, 원심분리(1500 rpm ×5분간)하여 상청을 제거하고, 완만하게 세포를 떼어낸 후, 정상배지(RPMI-1640배지, 10% FCS) 100 mL를 가하여, 메스피펫에 의한 피펫팅으로 완만하게 세포를 현탁한다. 이 현탁액을 96웰의 배양용 플레이트에 100 μL/well 씩 분주하여, 5% CO₂ 인큐베이터중, 37℃에서 3~5일간 배양한다. 배양플레이트에 100 μL/well의 HAT배지(정상배지에 하이포크산틴(10^-4M), 티미딘(1.5 ×10^-5M) 및 아미노프테린(4 ×10^-7M)을 첨가한 배지)를 가하여, 3일간 더 배양한다. 이후 3일 마다 배양상청의 반용량을 제거하고, 새롭게 동량의 HAT배지를 가하여, 5% CO₂ 인큐베이터중, 37℃에서 약 2주간 배양한다.

(4) 하이브리도마의 스크리닝 및 클로닝

융합세포가 콜로니상으로 생육하고 있는 것이 인정되는 웰에 대해서, 상청의 반용량을 제거하고, HT(HAT배지로부터 아미노프테린을 제거한 것)를 동량 가하여, 4일간 배양한다. 배양상청의 일부를 채취하여, 상술한 프로틴A 로제트 어세이법에 의해 멕신단백질에 대한 항체가를 측정한다. 항체가는, 예를 들면 멕신단백질 항원을 직접 또는 담체와 함께 흡착시킨 고상(예를 들면, 마이크로플레이트)에 하이브리도마 배양상청을 첨가하고, 다음에 방사성 물질이나 효소 등으로 표지한 항면역 글로불린항체(세포융합에 사용되는 세포가 마우스인 경우, 항마우스 면역글로불린항체가 사용된다) 또는 프로틴A를 가하여, 고상에 결합한 항멕신단백질 단일클론항체를 검출하는 방법, 항면역 글로불린항체 또는 프로틴A를 흡착시킨 고상에 하이브리도마 배양상청을 첨가하고, 방사성 물질이나 효소 등으로 표지한 멕신단백질을 가하여, 고상에 결합한 항멕신단백질 단일클론항체를 검출하는 방법 등에 의해 확인하는 것도 가능하다.

멕신단백질에 반응하는 항체의 산생이 관찰된 웰 마다, 한계희석법에 의해 클로닝을 4회 반복하여, 안정된 멕신단백질의 항체가를 나타내는 것을 항멕신단백질 단일클론항체 산생하이브리도마주로서 선택한다.

(5) 단일클론항체의 조제

상기와 같이 하여 얻어진 하이브리도마를 인 비트로 및 인 비보에서 배양함으로써 단일클론항체를 산생시킨다. 인 비보에서 배양하는 경우, 임의의 동물에 하이브리도마를 이식하지만, 세포융합에 사용한 비장세포를 채취한 동물과 동종의 동물을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 프리스탄처리(2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸-프리스탄-0.5 mL를 복강내 투여하여, 2주간 사육한다)를 한 8~10주령의 BALB/c 암컷마우스에 (4)에서 얻어진 항멕신단백질 단일클론항체 산생하이브리도마 세포의 2~4 ×10⁶개/마리 복강내 투여한다. 2~3주일에 마우스의 복강내에 단일클론항체를 고농도로 포함한 복수가 저류되어 복부가 비대해진다. 이 마우스로부터 복수를 채취하고, 원심분리(3000 rpm ×5분간)하여 고형분을 제거하여, IgG를 정제한다. 한편 하이브리도마의 인 비트로에서의 배양은, 바람직하게는 무혈청배지중에서 행해지고, 지극히 적당한 양의 항체를 그 상청에 준다. 복수나 배양상청을 50% 황산암모늄을 사용하여 염석하고, PBS로 1~2주일 투석한다. 이 투석획분을 프로틴A 세파로오스컬럼에 통과시키고, IgG획분을 모아 정제 단일클론항체를 얻는다.

항체의 아이소타입은, 오취터로니(Ouchterlony)(이중면역확산)법(면역학실험입문, 생물화학실험법 15, 학회출판센터간행, 74페이지, 1981년)에 의해 결정했다. 단백질량은 폴린법 및 280 nm에 있어서의 흡광도(1.4(OD₂₈₀)≒이뮤노글로불린 1 mg/mL)에 의해 산출한다.

(6) 단일클론항체의 특성

상기와 같이 하여 얻어진 단일클론항체의 특성은, 예를 들면, (1) 세포표면을 옥소라벨한 HSB-2, K562 등의 인간 림프구 유래의 세포주를 사용하는 면역침강반응(J.Immunol., 제138권, 2850-3855페이지, 1987년) 및 (2) 효소면역측정법(ELISA법)(J.Immunol., 제142권, 2743-2750페이지, 1989년) 등에 의해 명확하게 할 수 있다.

(7) 표지결합 단일클론항체의 제조

얻어진 정제 단일클론항체는, 글루타르알데히드법(Immunochem., 제6권, 43페 이지, 1969년), 과옥소산법(J.Histochem.Cytochem., 제22권, 1084페이지, 1974년), 말레이미드법(J.Biochem., 제79권, 233페이지, 1976년), 피리딜 ·디설피드법(Biochem.J., 제173권, 723페이지, 1978년) 등의 방법에 의해 효소표지할 수 있다.

예를 들면, 과옥소산법을 사용한 경우, 퍼옥시다아제용액(4 mg/mL)에 50 μL의 과옥소산(38.5 mg/mL)을 교반하면서 가하여, 실온에서 20분간 반응시킨 후, 1 mM 초산완충액(pH 4.5)에 치환한 PD-10(Amersham Pharmacia Biotech제)을 사용하여 완충액교환을 행한다. 다음에 0.2 M의 수산화나트륨 40 μL를 가한다. 여기에 10 mM 탄산완충액(pH 9.5)으로 투석한 단일클론항체 10 mg을 가하여, 실온에서 2시간 반응한다. 반응종료 후, 빙냉하여 100 μL의 수소화붕소나트륨용액(4 mg/mL)을 가하여 2시간 반응시킨다. 반응액을 PD-10을 사용하여 PBS로 교환한 후, 3000 rpm ×30분간 원심분리하여, 상청을 세파크릴 S200HR26×30(Amersham Pharmacia Biotech제)을 사용하여 겔 여과하고, 403 및 280 nm의 흡광도를 측정하여 표지단일클론항체의 획분을 분취한다. 얻어진 분획에 소혈청알부민(10 mg/mL)을 가하여, -20℃에서 보존하고, 사용 직전에 PBS-Tween(등록상표)20으로 희석한다.

(B) 검출용 과립의 제조

이 발명에서 사용하는 검출용 과립은, 적당한 과립, 예를 들면 크로마토용 겔에, 물리적 또는 화학적으로 항멕신단백질항체를 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 화학적으로 활성화한 과립에, 본 발명에서 사용하는 항체를 결합시키는 방법은, 결합안정성을 기대할 수 있는 것으로부터 바람직한 결합방법이다. 구체적으로 는, p-톨루엔설포닐클로라이드에 의해 토실화 활성된 과립에, 본 발명에서 사용하는 항체를 결합시키는 방법을 나타낼 수 있다.

과립으로서는, 유리, 아가로우즈, 세파로오스, 아가로우즈 충전 다공성 규조토, 친수성 공중합 아크릴겔, 폴리스티렌 등으로 된 과립이 사용된다. 자성을 갖는 과립을 사용하면, 자석 등을 사용하여 과립을 집속할 수 있기 때문에, 미량샘플의 측정이 가능해진다. 예를 들면 가자성(可磁性)물질(예를 들면 Fe₂O₃)을 코어내에 포함시킴으로써 초상자성(超常磁性)을 갖게 한 과립으로 할 수 있다. 이와 같은 과립은, 면역학적 분석용 고상으로서 시판되고 있다. 과립의 형상은 구형, 부정파쇄형 등 임의이지만, 구형이 바람직하다. 입경은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 평균입경 5~1000 ㎛를 나타낼 수 있다. 또한, 반응액의 비중(약 1) 보다도 비중이 큰 과립을 사용한 경우도 과립의 집속이 용이해져, 자성을 갖는 과립을 사용했을 때와 동일한 효과가 얻어진다. 더욱이 이런 경우, 과립을 집속하기 위한 원심분리의 조건을 완만하게 할 수 있기 때문에, 결합이 떼어지기 쉬운 항체를 사용할 때에도 유리하다.

과립으로의 항멕신단백질항체의 결합은, 직접적인 결합 뿐 아니라 간접적인 결합을 이용하는 것도 가능하다. 예를 들면, 마우스의 단일클론항체를 사용하는 경우라면 마우스의 IgG를 인식하는 항체를 과립에 결합하여, 간접적으로 과립상에 마우스의 항체를 결합할 수 있다. 이러한 항체는 2차항체라 불리고 있다. 간접적인 결합에는 2차항체 외에, 이뮤노글로불린의 정상영역을 결합하는 프로틴A나 프로틴G 의 이용, 또는 비오틴화한 항체를 아비딘을 고정한 과립으로 포착하는 방법 등을 응용하는 것도 가능하다. 상기와 같은 과립에 2차항체, 프로틴A 또는 프로틴G를 화학적으로 결합시키기에는, 과립을 활성화시킨 후 결합시키는 것이 바람직하다. 과립의 활성화는, 이 종류의 과립에 단백질을 결합시킬 때의 임의의 활성화법을 선택할 수 있다. 이러한 활성화법에는, 토실클로라이드법, 브롬시안법, 브롬아세틸법, 글루타르알데히드법 등이 있다. 활성화 과립 중에는 시판되고 있는 것도 있다. 이러한 활성화 및 활성화 과립과 2차항체, 프로틴A 또는 프로틴G 등의 단백질과의 결합은, 일반적인 방법에 의해 행할 수 있다.

또한, 이미 2차항체, 프로틴A 또는 프로틴G 등을 결합한 과립도 시판되고 있다. 시판의 과립으로서는, 예를 들면 다음과 같은 것이 알려져 있다. 일본다이날주식회사수입, 주식회사베리타스 판매의 다이나비드(등록상표)

M-450, M-280

양 항마우스 IgG 코팅타입

염소 항마우스 IgG 코팅타입

양 항래트 IgG 코팅타입

양 항집토끼 IgG 코팅타입

폴리사이언스 ·인코포레이티드제

염소 항마우스 IgG(H&L)카르복실레이트 비드

염소 항집토끼 IgG(H&L)카르복실레이트 비드

프로틴A 카르복실레이트 비드

염소 항집토끼 IgG(H&L)마이크로 마그넷 파티클

염소 항집토끼 IgG(H&L)마이크로 마그넷 파티클

프로틴A 마이크로 마그넷 파티클

양 항마우스 IgG(H&L)마이크로 마그넷 파티클

상기와 같은 과립에 본 발명에서 사용하는 항체를 결합시키기에는, 적당한 매질중에서 현탁한 과립을 단백질용액으로 처리하여 비특이적 흡착을 방지한 후, 항체를 포함하는 복수 또는 정제한 항체의 용액을 혼합한다.

(C) 검출법

본 발명의 검출법을 실시하기에는, 검사 대상자로부터 혈액 또는 뇨를 채취하여, 원심분리 후의 상청을 검체로 한다. 뇨의 원심분리는 침전을 분리하기 위해 행하는 것으로, 정치 후의 상청이나 여과에 의해 침전을 제거한 뇨시험을 이용하는 것도 가능하다. 상기와 같이 하여 제조한 검출용 과립에 희석한 검체 및 (7)에서 얻어진 표지 결합항체를 가하여, 실온에서 2시간 인큐베이션한다. 반응종료 후, 세척하고, 기질액을 가하여 발색 후, 원심분리하여 과립을 제거하고, 상청을 마이크로플레이트에 옮겨, 흡광도를 측정한다. 동일하게 정상자의 검체도 측정하여, 값을 비교한다. 값의 비교에 있어서는, 단순히 멕신단백질의 농도로서의 비교 외에, 그 개체의 체액의 체적을 곱하여 얻을 수 있는 멕신단백질의 체액중의 절대량, 또는 그것과 비슷한 보정값을 토대로 하는 비교를 행하는 것도 가능하다.

(D) 키트

상기의 시험을 실시하기 위해 필요한 재료는, 키트로서 공급할 수 있다. 이 러한 키트는, 상술한 항체를 고정화한 검출용 과립 및 자석을 포함할 수 있다. 더욱이 표지분자를 결합한 항체를 포함하는 것도 가능하다. 그 밖에, 본 발명에 의한 키트에는, 시험관, 원심관, 기타 유사한 용기, 피펫 또는 유사한 흡인기구, 또는 현미경을 포함시킬 수 있다. 또한, 표지를 검출하기 위해 필요한 효소기질, 양성이나 음성의 표준시료 등을 조합시키는 것도 가능하다. 또한 상기 검출용 과립 대신에, 그 제조원료가 되는 고체과립과 항체의 조합으로 하는 것도 가능하다. 이하, 이 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다.

도면의 간단한 설명

도1은, 멕신단백질의 부분 아미노산서열(서열번호:12)을 갖는 합성펩티드-2를 면역원으로서 얻어진 다중클론항체의 반응성을 웨스턴 블로팅법에 의해 확인한 결과를 나타내는 사진. 각 레인은, 다음의 단백질에 대응한다.

1: MBP

2: MBP-멕신단백질

3: His-멕신단백질

4: MBP-PAI II

5: CHO 세포에서 발현시킨 멕신단백질

6: 멕신단백질 유전자도입 재조합 바이러스감염 누에체액

7: 멕신단백질 유전자도입 전의 바이러스 벡터 감염 누에체액

8: 비 바이러스감염 누에체액

9: 정상 인간 혈청

도2는, 멕신단백질의 부분 아미노산서열(서열번호:13)을 갖는 합성펩티드-3를 면역원으로서 얻어진 다중클론항체의 반응성을 웨스턴 블로팅법에 의해 확인한 결과를 나타내는 사진. 각 레인은, 도1과 동일한 단백질에 대응한다.

도3은, 멕신단백질의 부분 아미노산서열(서열번호:15)을 갖는 합성펩티드-342를 면역원으로서 얻어진 다중클론항체의 반응성을 웨스턴 블로팅법에 의해 확인한 결과를 나타내는 사진. 각 레인은, 도1과 동일한 단백질에 대응한다.

도4는, MBP-멕신단백질을 면역원으로서 얻어진 다중클론항체의 반응성을 웨스턴 블로팅법에 의해 확인한 결과를 나타내는 사진. 각 레인은, 도1과 동일한 단백질에 대응한다.

도5는, ELISA에 의한 뇨중 멕신단백질의 측정결과를 나타내는 그래프. 세로축은 멕신단백질의 측정값(크레아티닌비:AU)을 나타낸다. 시료로 한 뇨는, 정상자(16예), IgA 신장병증환자(24예) 및 미소변화형 네프로제증후군 환자(24예)의 것이다.

도6은, 웨스턴 블로팅법에 의한 뇨중 멕신단백질의 측정결과를 나타내는 사진. 각 레인은, 다음의 단백질에 대응한다.

1: MBP-멕신단백질

2-5: 정상자 농축뇨

6-7: IgA 신장병증환자 농축뇨

도7은, IgA 신장병증환자의 신장조직에 대해 조직면역염색한 현미경사진을 나타낸다.

도8은, 정상의 인간 신장조직에 대해 조직면역염색한 현미경사진을 나타낸다. 배율은, I가 33배, II~IV가 80배이다.

도9는, 정상의 인간 신장, 간 및 비장조직에 대해 조직면역염색한 현미경사진을 나타낸다. 배율은, V가 33배, VI가 80배, VII 및 VIII가 40배이다.

도10은, 정상의 래트 신장, 간 및 비장조직에 래트 멕신펩티드-2항체를 사용하여 조직면역염색한 현미경사진을 나타낸다. 배율은, I 및 II가 100배, III 및 IV가 40배이다.

도11은, 면역침강에 의한 멕신단백질의 검출결과를 나타내는 사진.

레인1: 항멕신펩티드-2항체(-)

레인2: 항멕신펩티드-2항체(+)

레인3: 분자량 마커

도12는, 항멕신펩티드-2항체를 사용한 ELISA에 의해, CHO-멕신, 또는 MBP-멕신을 항원으로서 측정한 결과를 나타내는 그래프. 세로축은 492 nm에 있어서의 흡광도를, 가로축은 항원농도(㎍/mL)를 나타낸다.

도13은, 항멕신펩티드-4(257-272)항체를 사용한 ELISA에 의해, CHO-멕신, 또는 MBP-멕신을 항원으로서 측정한 결과를 나타내는 그래프. 세로축은 492 nm에 있어서의 흡광도를, 가로축은 항원농도(㎍/mL)를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

[실시예 1] 메산기움세포

다카라(Tokyo, Japan)로부터 구입한 인간의 메산기움세포 및 CHO(Chinese hamster ovary)세포는, 10% 소태아혈청을 포함하는 달벡코개변 이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터 속에서 배양했다. 인간의 메산기움세포는 7-10대 계대하여 이하의 실험에 사용했다.

[실시예 2] 멕신단백질의 합성펩티드에 대한 다중클론항체의 제조

다른 세르핀 패밀리와의 상동성이 낮고, 또한 친수성을 갖는 영역을 면역원으로서 이용하여, 멕신단백질에 대한 다중클론항체를 제조했다. 구체적으로는, 인간(서열번호:2) 및 래트(서열번호:19)의 멕신을 구성하는 아미노산서열로부터, 다음의 아미노산서열을 면역원으로서 선택했다.

N말단으로부터의 위치 아미노산서열 서열번호/No.

16-30 FREMDDNQGNGNVFF 11/1

72-86 SQSGLQSQLKRVFSD 12/2

339-354 ATGSNIVEKQLPQSTL 13/3

257-272 NLMEWTNPRRMTSKYV 14/4

342-356 SNIVEKQLPQSTLFR 15/342

74-87 LGLQYQLKRVLAD 16/rat1

341-354 ESNIVEKLLPESTV 17/rat2

상기 아미노산서열의 N말단(펩티드 3만 C말단)에 C를 부가한 펩티드를, 자동합성장치 모델 432A(Perkin Elmer, Foster City, CA)로 합성했다. 합성펩티드는 역상 HPLS로 정제 후, 동결건조하여 면역 및 면역학적 특이성의 확인을 위한 경합실험에 사용했다.

각 합성펩티드와 소티로글로불린(Sigma사제)을 N-(6-maleimidocaproyloxy)succinimide(도진연구소제)를 사용하여 결합시켜, 0.85% NaCl용액으로 투석 후, 아쥬반트(Difco제)와 충분히 혼합하여 유화시켜, 토끼 피하에 투여했다. 첫회 면역(20 ㎍/마리)후 3주일 후에 2회째(50 ㎍/마리)의 면역을 행하고, 이후 2주일 마다 4회면역(50, 100, 200 ㎍/마리)을 행했다. 아쥬반트는 첫회만 프로인드 완전 아쥬반트이고, 2회째 이후는 프로인드 불완전 아쥬반트를 사용했다. 41일 후, 55일 후, 채혈로 얻은 혈청이 합성펩티드와 반응하는 것을 확인하기 위해, 혈청의 항체가를 효소면역측정법(ELISA)에 의해 평가했다. 항원 50 ng/well을 고상화한 96웰 플레이트에 연속적으로 희석한 항혈청을 각 웰에 100 μL 가하여 1차 반응을 행하고, 세척 후, 2차반응으로서 HRP 결합 염소 항토끼 IgG(Cappel Product제)를 반응시켰다. 세척 후, 기질로서 오르토페닐렌디아민(와코준야쿠제)을 사용하여 발색시켜 흡광도 492 nm에서 측정하여, 항체가가 상승하고 있는 것을 확인했다.

[실시예 3] 멕신단백질의 합성펩티드에 대한 다중클론항체의 정제법

멕신단백질의 각 합성펩티드에 대한 다중클론항체는, 공지의 방법(세포공학별책 실험프로토콜시리즈 항펩티드 실험프로토콜, 슈쥰샤)에 따라 이뮤노 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제했다. 조작은, 다음과 같다. 각 합성펩티드를 FMP(2-fluoro-1-methylpyridinium toluene-4-sulfonate)활성화 셀룰로파인(세이카가쿠고교제)에 고정화 하여, 어피니티 컬럼을 제작했다. 항체는, 멕신단백질을 면역하여 항체가가 상승한 토끼혈청을 PBS(-)로 희석한 후, 펩티드컬럼을 사용하여 어피니티정제했다. 얻어진 정제항체는 웨스턴 블로팅에 의해 멕신단백질 융합단백질과 반응하는 것을 확인하여, 멕신단백질에 특이적인 것을 증명했다(도1-도4).

[실시예 4] 래트 멕신 합성펩티드에 대한 항체의 조제

각 래트 멕신 합성펩티드를 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)(Calbiochem-Novabiochem, La-Jolla, CA)과 결합시켰다. 즉, 0.05 M 인산나트륨완충액(pH 7.2)에 현탁한 KLH를, 디메틸포름아미드에 용해한 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미도에스테르(MBS)와 실온에서 30분간 교반함으로써 반응시켰다. 반응물을 0.05 M 인산나트륨완충액(pH 6.0)에 대해 투석하여, KLH-MB로 했다. 더욱이 얻어진 KLH-MB를 증류수에 현탁한 상기 펩티드와 인큐베이트했다. 반량의 0.2 M의 인산수소이나트륨을 KLH-MB에 가하여, 3시간 실온에서 교반했다. 반응 후, 인산나트륨완충액에 대해 투석하고, 마지막으로 동결건조했다.

얻어진 KLH 결합 합성펩티드를, 아쥬반트와 함께 토끼에 면역했다. 아쥬반트는 첫회만 프로인드 완전 아쥬반트(FCA)(DIFCO Laboratories, USA)이고, 2회째 이후는 프로인드 불완전 아쥬반트(DIFCO Laboratories, USA)를 사용하여 2-3주 간격으로 5회 면역했다. 프로틴A 어피니티 컬럼(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)으로 항혈청으로부터 IgG를 정제했다. 면역한 토끼로부터는 면역 전의 혈청도 채취 하여 동일하게 IgG를 정제했다.

[실시예 5] 토끼 다중클론 항멕신펩티드 IgG의 반응성의 검토

아래와 같은 각종 단백질을 항원으로서 사용하여, 멕신펩티드를 면역원으로 하는 토끼 IgG의 반응성을 확인했다. 먼저 MBP-멕신단백질과 His-멕신단백질은 다음과 같이 조제했다. 즉, 먼저 서열번호:1에 나타내는 멕신유전자의 염기서열을 토대로 그 코드영역을 PCR에 의해 증폭했다. 이 증폭산물을, 말토오스 결합단백질 융합단백질 발현용 벡터, pMAL-c(New England Biolab사)에 혼입함으로써 MBP와 멕신단백질과의 융합단백질을 발현하는 벡터를 얻었다. 이 벡터에서 대장균을 형질전환하여, 그 세포파괴액으로부터 아밀로오스 수지 등을 이용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 발현산물을 정제하여 MBP-멕신단백질로 했다. 한편 His-멕신단백질을 얻기 위해, 히스티딘 태그와의 융합단백질로서 인서트를 발현하는 벡터 ptrcHisA(Invitrogen제)에 상기 멕신유전자의 증폭산물을 혼입한 융합단백질 발현벡터를 구축했다. 이 벡터를 대장균 JM109로 형질전환하여, IPTG에서 발현을 유도 후에 세포파쇄액으로부터 니켈컬럼 등에 의해 정제한 융합단백질로서 His-멕신단백질을 얻었다.

다음에 아래와 같이 하여, CHO 세포에서 재조합 멕신을 발현시켰다. PCR을 사용한 변이도입에 의해, 멕신 cDNA의 전장 코드영역의 N말단측에 c-myc 태그 및 히스티딘 태그를 연결했다. 태그 결합 멕신 cDNA를, 포유동물 세포발현 벡터 pREP9(Invitrogen)에 클론화 했다. 6웰 플레이트에 말아 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 서 배양한 CHO 세포(10⁵세포)에, 인간 ·멕신 cDNA를 포함하는 pREP9를 LipofectAMINE시약(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)을 사용하여 형질전환했다. 안정된 형질전환체를 0.5 mg/ml의 geneticin disulfate(와코쥰야쿠제)에서 선택했다. 그리고(His)6 어피니티컬럼으로 배양상청으로부터, c-myc-히스티딘 태그 결합 멕신 재조합체(CHO 멕신)를 정제했다.

또한 멕신단백질(+)바이러스감염 누에체액이란, 공지의 방법(J.General Virology, 제78권, 3073-3080페이지, 1979)에 따라 멕신 유전자도입 바이러스를 감염시킨 누에의 체액이다. 한편, 멕신단백질(-)바이러스란, 멕신유전자를 도입하지 않은 바이러스 벡터 만을 감염시킨 누에의 체액이다. 이들 각종 멕신 재조합체의 구축에 필요한 멕신을 코드하는 유전자는, PCR에 의해 메산기움세포의 mRNA를 주형으로서 합성하는 것도 가능하고, 또한 본 발명자가 구축한 멕신유전자 클로닝 벡터(수탁번호 FERM BP-6518)로부터 얻는 것도 가능하다.

기타, 플라스미노겐 액티베이터 인히비터-1(PAI I), MBP-플라스미노겐 액티베이터 인히비터-2 융합단백질(MBP-PAI II) 등에 대한 반응성도 관찰했다. 이들 단백질은, 멕신단백질과 어느 정도의 상동성을 갖는 단백질로, 항체의 교차반응성의 확인을 목적으로서 선택했다.

MBP-멕신단백질,

His-멕신단백질,

MBP-PAI II,

PAI I,

CHO 세포에서 발현시킨 멕신단백질,

멕신단백질(+)바이러스감염 누에체액,

멕신단백질(-)바이러스감염 누에체액,

비 바이러스감염 누에체액 및

인간 혈청 알부민

각각의 단백질용액을 등량의 샘플완충액(0.25% 트리스-HCl, 2% SDS, 30% 글리세린, 10% β-메르캅토에탄올, 0.025% 브로모페놀 블루)(다이이치화학약품제)으로 처리하여, 5분간 100℃로 가열하고, 겔농도 4~20%의 그라디언트 겔(gradient gel)(다이이치화학약품제)을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법(SDS-PAGE)(Laemmli,U.K.,Nature, 제227권, 680-685페이지, 1970년)에 의해 분리했다. SDS-PAGE로 분리한 단백질을, 블로팅용액(25 mM 트리스-HCl, 192 mM 글리신, 20% 메탄올, pH 8.3)을 사용하여 100V의 정전압으로 1시간, 폴리비닐리덴디플루오리드(PVDF)막(Bio Rad제)에 블로팅을 행했다. 블로팅한 PVDF막을 증류수로 세척 후, 5% 블록 에이스의 TTBS 용액중에서 3시간 블로킹했다. 다음에, PVDF막을 TTBS(20 mM 트리스, 500 mM의 NaCl, 0.05% Tween20, pH 7.5)로 세척한 후, TTBS로 희석한 1차항체인 토끼 다중클론 항멕신펩티드 IgG의 용액과 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 다음에, 앰플리파이드 알칼리포스파타아제 이뮨 블롯 키트(Amplified Alkaline Phosphatase Immun Blot Kit)(Bio Rad제)를 사용하여 검출했다. 즉, TTBS로 희석한 비오틴 표지 염소 항토끼 IgG와 실온에서 1시간 인큐베이 트한 후, 미리 실온에서 스트렙트아비딘과 비오틴 표지 알칼리포스파타아제를 1시간 인큐베이트하여 조제한 스트렙트아비딘-비오틴 표지 알칼리포스파타아제의 컴플렉스를 반응시켰다. PVDF막을 TTBS로 세척하여, 기질(nitro blue tetrazolium과 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, p-toluidine염의 용액)과 실온에서 약 30분간 인큐베이트함으로써, 1차항체에 결합된 항체를 가시화했다. 증류수로 충분히 반응시킴으로써, 반응을 정지시켰다.

결과는 도1~도4에 나타냈다. 또한 각 도에 있어서 반응시킨 항체는, 각각 아래에 나타내는 면역원에 의해 얻어진 항체이다.

도1 면역원: 멕신펩티드-2

도2 면역원: 멕신펩티드-3

도3 면역원: 멕신펩티드-342 및

도4 면역원: MBP-멕신단백질

[실시예 6] 어피니티정제 항멕신펩티드 IgG의 효소표지

실시예 3에서 얻은 어피니티정제 항멕신펩티드 IgG를 시판의 표지 키트(AP labeling kit:Boehringer-Mannheim제)를 사용하여, 키트의 지시에 따라 알칼리포스파타아제로 표지했다. 또한, 비오틴표지는 표지 키트(ECL protein biotinylation module:Amersham Pharmacia Biotech제)를 사용하여 키트의 지시에 따라 행했다.

[실시예 7] ELISA에 의한 뇨중 멕신단백질의 측정

정상자 16명, IgA 신장병증환자 24명 및 미소변화형 네프로제증후군 환자 24명의 뇨를 원심하여, 불용물을 제거한 후, 분획분자량 5000의 한외여과막(밀리포아 제 울트라프리)을 사용하여 농축했다. 토끼 다중클론 항멕신펩티드-2의 IgG를 코팅한 96웰 ELISA용 플레이트의 각 웰에, PBS(-)를 120 μL 씩 분주 후, 농축한 뇨를 120 μL 분주하여, 4℃에서 하룻밤 방치했다. PBS(-)로 세척하여, 블록 에이스(다이니폰세이야쿠제)를 가하여 실온에서 2시간 블로킹을 한 후, 0.05%(w/w) Tween20(와코쥰야쿠제)함유 PBS(-)(Tween-PBS)로 세척하여, 알칼리포스파타아제 표지 토끼 다중클론 항멕신펩티드-1항체를 가하여, 실온에서 1시간 방치했다. Tween-PBS로 세척한 후, 발색기질용액(1 mg/mL 오르토페닐렌디아민(와코쥰야쿠제)-1 M 디에탄올아민(와코쥰야쿠제)완충액(pH 9.8))을 100 μL/well 씩 가했다. 실온에서 반응시킨 후, 1 N 수산화나트륨을 50 μL/well 씩 가하여 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices제 Spectra MAX 250)로 흡광도(405 nm)를 측정하여, 검량선으로부터 뇨중 멕신단백질농도를 구했다. 동일한 뇨시료에 대해 시판의 크레아티닌측정용 시약(다이아시약제, 자동분석기용 측정시약「다이아」-Crea)에 의해 크레아티닌농도를 구하여, 멕신단백질의 양을 크레아티닌비로 하여 보정했다. 결과를 도5에 나타낸다. 정상자와 IgA 신장병증환자 사이에는 p<0.001에서, 또한 IgA 신장병증환자와 미소변화형 네프로제증후군 환자 사이에서도 p<0.001에서 유의한 차가 인정되었다.

정상자와 IgA 신장병증환자 사이에 유의한 차가 보여진 것으로부터, 뇨중 멕신단백질을 측정함으로써 신장장애의 발생을 확인할 수 있었다. 또한, IgA 신장병증환자와 미소변화형 네프로제증후군 환자 사이에서도 유의한 차가 인정된 것으로부터, 본 발명을 토대로 뇨중 멕신단백질을 측정함으로써 양자의 식별이 가능한 것 이 명백해졌다. 이들 질환은, 공지의 스크리닝방법인 뇨단백질을 지표로 하는 방법으로는, 모두 동일하게 양성으로 되기 때문에, 식별할 수 없다.

또한 크레아티닌보정을 행하지 않는 뇨중 멕신단백질농도의 비교에서는, 신장질환 환자에서 높은 값으로 되는 경향은 보이지만, 이번과 같은 적은 수의 예에 의해 통계학상의 유의한 차를 증명하는 것은 곤란하다고 생각되었다. 따라서, 수시뇨중의 멕신단백질의 측정을 토대로 본 발명을 실시하는 경우에는, 크레아티닌보정 등의 수법에 의해 양의 비교를 행하는 것이 바람직하다고 생각된다.

[실시예 8] 뇨중 멕신단백질의 웨스턴 블로팅에 의한 검출과 정량

정상자 8명, IgA 신장병증환자 9명의 수시뇨를 원심하여, 불용물을 제거한 후, 분획분자량 5000의 한외 여과막(밀리포아제 울트라프리)을 사용하여 농축했다. 농축뇨와 등량의 샘플완충제(0.25% 트리스-HCl, 2% SDS, 30% 글리세린, 10% β-메르캅토에탄올, 0.025% 브로모페놀 블루)(다이이치화학약품제)로 처리하고, 5분간 100℃에서 가열하여, 겔농도 4~20%의 그라디언트 겔(다이이치화학약품제)을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법(SDS-PAGE)(Laemmli, U.K.(1970)Nature 227, 680-685)에 의해 분리했다. SDS-PAGE로 분리한 단백질을, 블로팅용액(25 mM 트리스-HCl, 192 mM 글리신, 20% 메탄올, pH 8.3)을 사용하여 100V의 정전압으로 1시간, 폴리비닐리덴디플루오리드(PVDF)막(Bio Rad제)에 블로팅을 행했다. 블로팅한 PVDF막을 증류수로 세척 후, 5% 블록 에이스의 TTBS 용액중에서 3시간 블로킹했다. 다음에, PVDF막을 TTBS(20 mM 트리스, 500 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH 7.5)로 세척한 후, TTBS로 희석한 1차항체인 토끼 다중클론 항멕신펩티드 IgG의 용액과 4℃ 에서 하룻밤 반응시켰다.

다음에, 앰플리파이드 알칼리포스파타아제 이뮨 블롯 키트(Bio Rad제)를 사용하여 검출을 행했다. 즉, TTBS로 희석한 비오틴표지 염소 항토끼 IgG와 실온에서 1시간 인큐베이트한 후, 미리 실온에서 스트렙트아비딘과 비오틴표지 알칼리포스파타아제를 1시간 인큐베이트하여 조제한 스트렙트아비딘-비오틴표지 알칼리포스파타아제의 컴플렉스를 반응시켰다. PVDF막을 TTBS로 세척하여, 기질(nitro blue tetrazolium과 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, p-toluidine염의 용액)과 실온에서 약 30분간 인큐베이트함으로써, 1차항체에 결합된 항체를 가시화했다. 증류수로 충분히 반응시킴으로써, 반응을 정지시켰다. 가시화한 밴드에 대해서는, 전기영동 화상처리장치(아토제 AE-6920M-05형)와 영동 ·스포트 화상해석 소프트웨어(아토제 AE-6920WSE/MSE)를 사용하여 정량을 행했다. 결과(전기영동상)는 도6에 나타내었다. 또한, 화상해석장치에 의한 측정결과는 아래에 나타내는 바와 같다. 정상자의 농축뇨에 비해 IgA 신장병증환자의 농축뇨에서 농도가 짙은 밴드가 확인되었다. 그리고 이 밴드의 농도를 정량함으로써, 멕신단백질의 정량이 가능한 것이 확인되었다.

화상해석장치에 의한 측정결과

레인 측정결과

1 분자량 마커

2 8.5

3 5.2

4 13.8

5 4.8

6 32.8

7 15.1

[실시예 9] 검출용 과립의 제조

시판의 자성 과립에, 항멕신펩티드 IgG를, 항마우스 IgG 항체를 사이에 두고 결합시킴으로써, 본 발명에 의한 검출용 과립을 제조했다. 조작은 다음과 같다. 과립으로서 다이나비드(등록상표) M-450 토실 액티베이티드(토실활성화된 균일한 상자화(常磁化) 폴리스티렌과립:일본다이날제)를 사용하여, 그 1 mM 염산현탁액을 무균증류수로 1회 세척하고, 다시 0.2 M 붕산완충액(pH 9.5)으로 세척했다. 다음에 항멕신펩티드 IgG 항체를 0.2 M 붕산완충액(pH 9.5)에 150 ㎍/ml의 농도에 용해한 액을, 등용량의 활성화 과립현탁액에 가했다(항체/과립=75 ㎍/15 mg). 천천히 교반하면서 22℃에서 24시간 인큐베이트했다. 자석을 사용하여 항체결합과립을 모아, 자석에 과립을 붙인 채 상청을 제거하고,

(1) 5 mL의 0.1 M PBS(pH 7.0)로 10분간,

(2) 5 mL의 1 M 에탄올아민-염산(pH 9.5)으로 2시간,

(3) 0.1 M 염화나트륨, 0.1% 소혈청알부민(BSA) 및 0.1% Tween20을 함유하는 0.05 M 트리스(pH 7.5)의 5 mL로 12시간 및

(4) Tween20을 포함하지 않는 (3)의 완충액 5 mL로 2시간의 순서로 세척했다. 세척 후, 자석으로 과립을 모아, 상청을 버리고, 10% 블록 에이스 함유 PBS(- )/BSA에 약 4 ×10⁸과립/mL(30 mg/mL)의 농도에 현탁했다. 얻어진 IgG 결합과립은, 4℃에서 적어도 6개월간은 안정하다.

[실시예 10] 자기과립법에 의한 뇨중 멕신단백질의 측정

정상자 12예 및 각종 신장질환 환자 24예의 수시뇨시료에 대해, 멕신단백질의 농도를 실시예 9에서 준비한 항체결합 과립을 이용하는 자기과립법에 의해 측정했다. 신장질환 환자 24예의 내역은, IgA 신장병증 12예, 미소변화형 네프로제증후군 12예이다. 뇨시료는 -80℃에 보존하고, 측정시에 해동하여 3000 rpm으로 5분 원심분리한 후의 상청을 시료로서 사용했다. 측정조작은 다음과 같다.

1차항체(토끼 다중클론 항멕신펩티드-2항체를 결합한 자기과립 50만개를 미리 블록 에이스(다이니폰세이야쿠제)로 블로킹한 튜브(1.5 mL)에 넣었다. 이 튜브에 각 뇨시료 500 μL와 PBS(-)로 희석한 알칼리포스파타아제 표지 토끼 다중클론 항멕신펩티드-1항체를 등량 가하여, 회전시키면서 실온에서 2시간 반응시켰다. 다음에, 3000 rpm으로 5분 원심 후, 자석으로 과립을 고정하면서 상청을 버리고, 세척액인 0.05%(w/v)Tween20(와코쥰야쿠제)함유 PBS(-)(pH 7.4)(Tween-PBS)를 1 mL 가하고 교반하여 세척했다. 이 세척조작을 합계 4회 행한 후, 기질액 100 μL를 가하여 교반하면서 20~30분 반응시켰다. 기질액에는, 1 mg/mL 오르토페닐렌디아민(와코쥰야쿠제)의 1 M 디에탄올아민(와코쥰야쿠제)완충액(pH 9.8)을 사용했다. 반응종료 후, 1 N 수산화나트륨 50 μL를 가하여 반응을 정지하고, 흡광도(405 nm)를 측정하여, 검량선으로부터 뇨중 멕신단백질의 농도를 산출했다. 동일한 뇨시료에 대 해 실시예 7과 동일하게 크레아티닌농도를 구하여, 멕신단백질의 농도를 크레아티닌비로 하여 보정했다.

측정결과, 뇨중 멕신단백질의 측정값(크레아티닌보정값:AU)은, 정상자에 비해 IgA 신장병증환자에 있어서 높은 값에 분포한다. 또한, IgA 신장병증환자와 미소변화형 네프로제증후군에서는, IgA 신장병증환자에 있어서 높은 값으로 되었다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 신장장애의 판정 뿐 아니라, 신장질환의 병태의 확정이 가능해지는 것이 명확해졌다.

[실시예 11] 멕신펩티드항체를 이용한 신장조직에 대한 면역조직염색

(이뮤노히스토케미스트)

동의를 얻은 3명의 IgA 신장병증환자(남성 2예, 여성 1예:연령 21~48세)로부터 신장조직을 채취했다. 또한 신장 암환자로부터 외과적으로 절제한 신장조직으로부터, 암에 침범되지 않은 조직을 채취하여 정상 신장조직 표본으로 했다. 정상 신장조직을 제공한 환자는, 뇨에 이상이 없는 것으로 하고, 조직학적으로는 사구체의 이상을 동반하는 것을 제외했다. 신장 이외의 장기에 대해서도, 동의를 얻은 환자에 의해 제공된 것을 대조로서 준비했다. 래트에 대해서는, 정상의 위스터계 래트(수컷 8주령)로부터 신장을 비롯한 각 장기를 채취했다.

신장조직은, 일반적인 방법에 따라, 동결조직 포매제(O.C.T.compound)를 사용하여 포매했다. 이 동결 포매조직으로부터 크리오스타트(cryostat)를 사용하여 4 ㎛의 동결조각을 제작했다. 이 동결조각을 3-아미노프로필트리에톡시실란(Sigma제)으로 코팅한 슬라이드상에 마운팅했다(4% 파라포름알데히드 고정, 15분).

동결조각을 0.5%의 Tween20을 함유하는 PBS로 세척하여, 4%의 탈지우유(skim milk)로 블로킹 후, 4℃의 가습 챔버내에서 항멕신펩티드-2항체 및 항멕신펩티드-4항체와 하룻밤 인큐베이트했다. 조직조각을 세척하여, 1:100으로 희석한 퍼옥시다아제 표지 염소 항토끼 IgG 항체(DAKO제)를 사용하여 실온에서 2시간 인큐베이트했다. 퍼옥시다아제의 검출에는, 0.003%의 과산화수소수를 함유하는 3,3'-디아미노벤지딘용액을 사용했다. 세포핵은, 헤마톡시린으로 염색했다. 헤마톡시린/에오신염색은, 공지의 방법에 의해 실시했다.

IgA 신장병증환자의 신장조직에 대해 조직면역염색한 현미경사진(Nikon제 ECLIPSE E400:배율 80배)을 도7에 나타낸다. 도에서 명백한 바와 같이, 인간 신장사구체조직에 본 발명의 펩티드항체에서 염색되는 부위가 존재하고, 특히, 메산기움세포체내 및 메산기움기질에 현저한 양성 염색이 인정되었지만, 뇨세관에는 인정되지 않았다.

인간 멕신펩티드-2항체(도8-I 및 도8-II), 또는 인간 멕신펩티드-4항체(도9-V 및 도9-VI)에 의해 인간 신장조직의 사구체가 염색되었다. 특히, 메산기움영역에 현저한 양성 염색이 인정되었다. 한편, 인간 멕신펩티드-4항체에 의해 신장조직의 간극부(도8-I), 인간 멕신펩티드-2항체에 의해 간(도9-VII), 비장(도9-VIII), 췌장, 심장, 또는 대동맥조직은 염색되지 않았다(데이터는 나타내지 않는다). 과잉량의 멕신펩티드-2의 존재에 의해 완전히 염색이 저지된 것으로부터, 면역염색의 특이성을 확인할 수 있었다(도8-IV). 면역 전의 토끼 IgG에서는 면역반응은 확인할 수 없었다(도8-III). 또한, 멕신펩티드-2항체 및 멕신펩티드-4항체에 대해, 멕신펩 티드-1이나 멕신펩티드-3에 대한 항체에서는, 인간 신장조직의 사구체에 특이적인 면역염색은 행할 수 없었다(데이터는 나타내지 않는다).

멕신단백질의 면역염색은, 래트의 신장조직의 사구체에서도 양성을 인정했다(래트 멕신펩티드-2;도10-I). 신간질(腎間質), 간(도10-III), 또는 비장(도10-IV)조직에서는 반응이 보이지 않았다. 래트 신장조직에 대한 면역학적인 반응은, 항체를 미리 래트 멕신펩티드-2와 인큐베이트함으로써 저지되었다(도10-II). 면역 전의 토끼 IgG, 또는 래트 멕신펩티드-1에 대한 항체에서는, 면역반응은 확인할 수 없었다(데이터는 나타내지 않는다).

[실시예 12] 면역침강

인간 메산기움세포중의 멕신단백질의 존재를 확인하기 위해, [³⁵S]메티오닌을 사용한 면역침강(T.Minori. et al., J.Biol.Chem., 제259권, 560페이지, 1984년)을 행하고, 얻어진 면역복합체를 SDS-PAGE 및 오토라디오그래피에 의해 분석하여, 멕신단백질의 검출을 시도했다.

먼저, 메산기움세포를 표지 배양중(DMEM: 10% 비동화 소태아혈청 및 [³⁵S]메티오닌(3.7 Mbq/mL)을 첨가한 것), 5% CO₂ 배양기에서 37℃, 16시간 인큐베이션하여, 전체 단백질성분을 표지했다.

다음에, 세포를 냉 PBS로 세척하고, 1% Triton X-100, 1% 소헤모글로빈, 1 mM 요오드아세트아미드, 0.2 U/mL 아프로티닌(aprotinin) 및 1 mM의 PMSF(페닐메탄설포닐플루오리드)를 함유하는 TSA(트리스-염산완충액(pH 8.0), 0.14 M 염화나트 륨, 0.025% 아지화 나트륨(sodium azide)) 200 μL로 현탁했다. 4℃에서 1시간 방치 후, 4℃, 100000 ×g으로 1시간 원심하여, 라이세트(lysate)를 얻었다.

이 방사성 표지된 항원(10⁵-10⁶ cpm)과 실시예 2 및 3에서 얻어진 항멕신펩티드-2 다중클론항체 1 μL(0.7 mg/mL)를 4℃에서 90분간 인큐베이트했다.

프로틴G-세파로오스(Pharmacia Biotech제)를 사용하여, 4℃에서 90분간 더 인큐베이션하여, 면역복합체를 침전시켰다. 그리고, 0.1% Triton X-100 및 0.1% 소 헤모글로빈을 함유하는 TSA로 3회 세척 후, 0.05 M 트리스-염산완충액(pH 6.8)으로 세척했다.

세척 면역침강물을 30 μL의 샘플완충제(0.5 M 트리스-염산완충액(pH 6.8), 10% SDS, β-메르캅토에탄올, 글리세롤, 1% BPB)에 재현탁한 후, 5분간 끓였다. 보텍스 믹서(vortex mixer)를 사용하여 현탁 후, 200 ×g으로 1분간 원심한다. 상청에 대해서, 일반적인 방법에 의해 SDS 전기영동 및 오토라디오그래피에 의해 분석했다. 분자량 마커에는, ¹⁴C-메틸화 단백질혼합물을 사용했다(Amersham International제: 분자량 220, 97.4, 66, 46, 30 kDa). 결과를 도11에 나타낸다. 분자량 50 kDa 부근(레인2의 meg으로 나타낸 밴드)에, 항멕신펩티드-2항체에 의해 특이적으로 인식되는 폴리펩티드를 확인할 수 있었다.

[실시예 13] ELISA에 의한 멕신의 측정

CHO 세포에서 발현시킨 멕신단백질(CHO-멕신단백질: T.Miyata et al., J.Clin.Invest., 제120권, 828-836페이지, 1998년, PCT출원 PCT/JP98/04269) 및 실 시예 5에 기재된 MBP-멕신단백질에 대해 ELISA분석을 시도했다.

96웰 ELISA용 플레이트에 50 mM의 탄산완충액(pH 9.6)으로 단계희석한 정제 CHO-멕신단백질용액(50 μL/well)을 가하여, 4℃에서 하룻밤 방치했다. PBS로 세척 후, 블록 에이스(다이니폰세이야쿠제)를 가하여(350 μL/well) 실온에서 2시간 블로킹한 후, 0.05%의 Tween20 함유 PBS(Tween-PBS)로 세척했다. 다음에 실시예 2 및 3에서 얻어진 항멕신펩티드-2 다중클론항체 및 항멕신펩티드-4 다중클론항체를 Tween-PBS로 희석한 액을 50 μL/well 씩 가하여, 실온에서 1시간 방치했다. Tween-PBS로 세척한 후, 비오틴 표지 항토끼 IgG(Cappel제)를 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 방치 후, Tween-PBS로 세척했다.

각 웰에 퍼옥시다아제 표지 스트렙트아비딘용액(Amersham제)을 가하여, 실온에서 1시간 방치했다. Tween-PBS로 세척 후, 100 μL/well의 오르토페닐렌디아민 발색기질용액(0.009% 과산화수소수 함유 구연산-인산완충액(pH 5.0)에 오르토페닐렌디아민을 0.04%의 농도가 되도록 용해한 액)을 첨가했다. 실온, 어두운 곳에서 10~30분간 반응시킨 후, 2 M 황산 50 μL/well을 가하여 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더(Japan Molecular Devices제:SPECTRAmax250)로 492 nm에 있어서의 흡광도를 측정했다.

MBP-멕신단백질에 대해서도 동일하게 조작했다. 결과를 도12(멕신펩티드-2항체) 및 도13(멕신펩티드-4항체)에 나타낸다. 그 결과, 펩티드-2항체 및 펩티드-4항체가 농도의존적으로 멕신단백질과 특이적으로 반응하는 것이 명백해졌다. 대조로서 측정한 CHO의 배양상청이나 MBP에서는, 반응성은 보이지 않았다.

본 발명에 의하면, 신장의 생체조직검사와 같은 침습성이 높은 검사가 아니라, 뇨나 혈액과 같은 비침습성 재료에 의해 신장기능의 평가를 가능하게 한다. 인 비트로에서의 간단한 신장기능의 평가가 실현된 것에 의해, 보다 많은 실험 대상자에 대해, 신속하고 또한 저렴하게 검사서비스를 제공할 수 있다. 신장질환에는, 조기에 발견하여 인공투석치료의 개시를 조금이라도 늦추는 것이 요망되어지는 경우도 많다. 따라서, 본 발명은 단순히 실험 대상자의 부담을 경감하는 것 뿐 아니라, 간편한 검사수법에 의한 신장기능 평가방법의 제공을 통하여, 보다 많은 투석치료 예비군의 발견과 감시를 가능하게 하는 것이다. 또한 뇨중이나 혈중과 같은 생체시료중에 발견되는 멕신단백질은, 신장기능을 반영하는 우수한 지표로, 그 평가에 있어서는 높은 신뢰성을 기대할 수 있다.

특히, 본 발명에 의해 제공되는 멕신단백질의 면역학적 검출방법 및 그를 위한 키트는, 자성 과립담체가 채용한 조작성이 우수한 수법이다. 이와 같은 검출방법에 의해, 보다 신속하고 정확한 멕신단백질의 측정이 가능해진다. 또한 메산기움세포의 증식정도를 파악할 수 있는 것으로부터, IgA 신장병증의 치료에 사용되는 스테로이드요법의 도입시기나 계속할지 여부의 판단도 용이해진다.

SEQUENCE LISTING <110> KUROKAWA, Kiyoshi MIYATA, Toshio Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. <120> A method of Detecting the Megsin Protein, and Use Thereof. <130> F2-101DP1PCT <140> <141> <150> JP 1999-75305 <151> 1999-03-19 <150> JP 1999-306623 <151> 1999-10-28 <160> 21 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1143 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1140) <300> <302> A mesangium-predominant gene, megsin, is a new serpin upregulated in IgA nephropathy. <303> J. Clin. Invest. <304> 120 <305> 4 <306> 828-836 <307> 1998-8-15 <400> 1 atg gcc tcc ctt gct gca gca aat gca gag ttt tgc ttc aac ctg ttc 48 Met Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asn Ala Glu Phe Cys Phe Asn Leu Phe 1 5 10 15 aga gag atg gat gac aat caa gga aat gga aat gtg ttc ttt tcc tct 96 Arg Glu Met Asp Asp Asn Gln Gly Asn Gly Asn Val Phe Phe Ser Ser 20 25 30 ctg agc ctc ttc gct gcc ctg gcc ctg gtc cgc ttg ggc gct caa gat 144 Leu Ser Leu Phe Ala Ala Leu Ala Leu Val Arg Leu Gly Ala Gln Asp 35 40 45 gac tcc ctc tct cag att gat aag ttg ctt cat gtt aac act gcc tca 192 Asp Ser Leu Ser Gln Ile Asp Lys Leu Leu His Val Asn Thr Ala Ser 50 55 60 gga tat gga aac tct tct aat agt cag tca ggg ctc cag tct caa ctg 240 Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Asn Ser Gln Ser Gly Leu Gln Ser Gln Leu 65 70 75 80 aaa aga gtt ttt tct gat ata aat gca tcc cac aag gat tat gat ctc 288 Lys Arg Val Phe Ser Asp Ile Asn Ala Ser His Lys Asp Tyr Asp Leu 85 90 95 agc att gtg aat ggg ctt ttt gct gaa aaa gtg tat ggc ttt cat aag 336 Ser Ile Val Asn Gly Leu Phe Ala Glu Lys Val Tyr Gly Phe His Lys 100 105 110 gac tac att gag tgt gcc gaa aaa tta tac gat gcc aaa gtg gag cga 384 Asp Tyr Ile Glu Cys Ala Glu Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Val Glu Arg 115 120 125 gtt gac ttt acg aat cat tta gaa gac act aga cgt aat att aat aag 432 Val Asp Phe Thr Asn His Leu Glu Asp Thr Arg Arg Asn Ile Asn Lys 130 135 140 tgg gtt gaa aat gaa aca cat ggc aaa atc aag aac gtg att ggt gaa 480 Trp Val Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Asn Val Ile Gly Glu 145 150 155 160 ggt ggc ata agc tca tct gct gta atg gtg ctg gtg aat gct gtg tac 528 Gly Gly Ile Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr 165 170 175 ttc aaa ggc aag tgg caa tca gcc ttc acc aag agc gaa acc ata aat 576 Phe Lys Gly Lys Trp Gln Ser Ala Phe Thr Lys Ser Glu Thr Ile Asn 180 185 190 tgc cat ttc aaa tct ccc aag tgc tct ggg aag gca gtc gcc atg atg 624 Cys His Phe Lys Ser Pro Lys Cys Ser Gly Lys Ala Val Ala Met Met 195 200 205 cat cag gaa cgg aag ttc aat ttg tct gtt att gag gac cca tca atg 672 His Gln Glu Arg Lys Phe Asn Leu Ser Val Ile Glu Asp Pro Ser Met 210 215 220 aag att ctt gag ctc aga tac aat ggt ggc ata aac atg tac gtt ctg 720 Lys Ile Leu Glu Leu Arg Tyr Asn Gly Gly Ile Asn Met Tyr Val Leu 225 230 235 240 ctg cct gag aat gac ctc tct gaa att gaa aac aaa ctg acc ttt cag 768 Leu Pro Glu Asn Asp Leu Ser Glu Ile Glu Asn Lys Leu Thr Phe Gln 245 250 255 aat cta atg gaa tgg acc aat cca agg cga atg acc tct aag tat gtt 816 Asn Leu Met Glu Trp Thr Asn Pro Arg Arg Met Thr Ser Lys Tyr Val 260 265 270 gag gta ttt ttt cct cag ttc aag ata gag aag aat tat gaa atg aaa 864 Glu Val Phe Phe Pro Gln Phe Lys Ile Glu Lys Asn Tyr Glu Met Lys 275 280 285 caa tat ttg aga gcc cta ggg ctg aaa gat atc ttt gat gaa tcc aaa 912 Gln Tyr Leu Arg Ala Leu Gly Leu Lys Asp Ile Phe Asp Glu Ser Lys 290 295 300 gca gat ctc tct ggg att gct tcg ggg ggt cgt ctg tat ata tca agg 960 Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Ser Arg 305 310 315 320 atg atg cac aaa tct tac ata gag gtc act gag gag ggc acc gag gct 1008 Met Met His Lys Ser Tyr Ile Glu Val Thr Glu Glu Gly Thr Glu Ala 325 330 335 act gct gcc aca gga agt aat att gta gaa aag caa ctc cct cag tcc 1056 Thr Ala Ala Thr Gly Ser Asn Ile Val Glu Lys Gln Leu Pro Gln Ser 340 345 350 acg ctg ttt aga gct gac cac cca ttc cta ttt gtt atc agg aag gat 1104 Thr Leu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Val Ile Arg Lys Asp 355 360 365 gac atc atc tta ttc agt ggc aaa gtt tct tgc cct tga 1143 Asp Ile Ile Leu Phe Ser Gly Lys Val Ser Cys Pro 370 375 380 <210> 2 <211> 380 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asn Ala Glu Phe Cys Phe Asn Leu Phe 1 5 10 15 Arg Glu Met Asp Asp Asn Gln Gly Asn Gly Asn Val Phe Phe Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ala Ala Leu Ala Leu Val Arg Leu Gly Ala Gln Asp 35 40 45 Asp Ser Leu Ser Gln Ile Asp Lys Leu Leu His Val Asn Thr Ala Ser 50 55 60 Gly Tyr Gly Asn Ser Ser Asn Ser Gln Ser Gly Leu Gln Ser Gln Leu 65 70 75 80 Lys Arg Val Phe Ser Asp Ile Asn Ala Ser His Lys Asp Tyr Asp Leu 85 90 95 Ser Ile Val Asn Gly Leu Phe Ala Glu Lys Val Tyr Gly Phe His Lys 100 105 110 Asp Tyr Ile Glu Cys Ala Glu Lys Leu Tyr Asp Ala Lys Val Glu Arg 115 120 125 Val Asp Phe Thr Asn His Leu Glu Asp Thr Arg Arg Asn Ile Asn Lys 130 135 140 Trp Val Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Asn Val Ile Gly Glu 145 150 155 160 Gly Gly Ile Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr 165 170 175 Phe Lys Gly Lys Trp Gln Ser Ala Phe Thr Lys Ser Glu Thr Ile Asn 180 185 190 Cys His Phe Lys Ser Pro Lys Cys Ser Gly Lys Ala Val Ala Met Met 195 200 205 His Gln Glu Arg Lys Phe Asn Leu Ser Val Ile Glu Asp Pro Ser Met 210 215 220 Lys Ile Leu Glu Leu Arg Tyr Asn Gly Gly Ile Asn Met Tyr Val Leu 225 230 235 240 Leu Pro Glu Asn Asp Leu Ser Glu Ile Glu Asn Lys Leu Thr Phe Gln 245 250 255 Asn Leu Met Glu Trp Thr Asn Pro Arg Arg Met Thr Ser Lys Tyr Val 260 265 270 Glu Val Phe Phe Pro Gln Phe Lys Ile Glu Lys Asn Tyr Glu Met Lys 275 280 285 Gln Tyr Leu Arg Ala Leu Gly Leu Lys Asp Ile Phe Asp Glu Ser Lys 290 295 300 Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Ile Ser Arg 305 310 315 320 Met Met His Lys Ser Tyr Ile Glu Val Thr Glu Glu Gly Thr Glu Ala 325 330 335 Thr Ala Ala Thr Gly Ser Asn Ile Val Glu Lys Gln Leu Pro Gln Ser 340 345 350 Thr Leu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Val Ile Arg Lys Asp 355 360 365 Asp Ile Ile Leu Phe Ser Gly Lys Val Ser Cys Pro 370 375 380 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized degenerative primer sequence <400> 3 gtgaatgctg tgtacttaaa ggcaantgn 29 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized degenerative primer sequence <400> 4 aanagraang grtcngc 17 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized degenerative primer sequence <400> 5 atggcntcn gcngcngcng cnaaygc 27 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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synthesized domain peptide of human megsin <400> 15 Ser Asn Ile Val Glu Lys Gln Leu Pro Gln Ser Thr Leu Phe Arg 1 5 10 15 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized domain peptide of human megsin <400> 16 Leu Gly Leu Gln Tyr Gln Leu Lys Arg Val Leu Ala Asp 1 5 10 <210> 17 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized domain peptide of human megsin <400> 17 Glu Ser Asn Ile Val Glu Lys Leu Leu Pro Glu Ser Thr Val 1 5 10 <210> 18 <211> 1229 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (8)..(1147) <300> <310> PCT/JP98/04269 <311> 1998-09-22 <400> 18 tttcaaa atg gcc tcc ctt gct gca gca aat gca gaa ttt ggc ttc gac 49 Met Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asn Ala Glu Phe Gly Phe Asp 1 5 10 tta ttc aga gag atg gat agt agt caa gga aac gga aat gta ttc ttc 97 Leu Phe Arg Glu Met Asp Ser Ser Gln Gly Asn Gly Asn Val Phe Phe 15 20 25 30 tct tcc ctg agc atc ttc act gcc ctg agc cta atc cgt ttg ggt gct 145 Ser Ser Leu Ser Ile Phe Thr Ala Leu Ser Leu Ile Arg Leu Gly Ala 35 40 45 cga ggt gac tgt nnn cgt cag att gac aag gcc ctg cac ttt atc tcc 193 Arg Gly Asp Cys Xaa Arg Gln Ile Asp Lys Ala Leu His Phe Ile Ser 50 55 60 cca tca aga caa ggg aat tca tcg aac agt cag cta gga ctg caa tat 241 Pro Ser Arg Gln Gly Asn Ser Ser Asn Ser Gln Leu Gly Leu Gln Tyr 65 70 75 caa ttg aaa aga gtt ctt gct gac ata aac tca tct cat aag gat nnn 289 Gln Leu Lys Arg Val Leu Ala Asp Ile Asn Ser Ser His Lys Asp Xaa 80 85 90 aaa ctc agc att gcc aat gga gtt ttt gca gag aaa gta ttt gat ttt 337 Lys Leu Ser Ile Ala Asn Gly Val Phe Ala Glu Lys Val Phe Asp Phe 95 100 105 110 cat aag agc tat atg gag tgt gct gaa aac tta tac aat gct aaa gtg 385 His Lys Ser Tyr Met Glu Cys Ala Glu Asn Leu Tyr Asn Ala Lys Val 115 120 125 gaa aga gtt gat ttt aca aat gat ata caa gaa acc aga ttt aaa att 433 Glu Arg Val Asp Phe Thr Asn Asp Ile Gln Glu Thr Arg Phe Lys Ile 130 135 140 aat aaa tgg att gaa aat gaa aca cat ggc aaa atc aag aag gtg ttg 481 Asn Lys Trp Ile Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Lys Val Leu 145 150 155 ggg gac agc agc ctc agc tca tca gct gtc atg gtg cta gtg aat gct 529 Gly Asp Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val Asn Ala 160 165 170 gtt tac ttc aaa ggc aag tgg aaa tcg gcc ttc acc aag agt gat acc 577 Val Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Lys Ser Ala Phe Thr Lys Ser Asp Thr 175 180 185 190 ctc agt tgc cat ttc agg tct ccc agc ggt cct gga aaa gca gtt aat 625 Leu Ser Cys His Phe Arg Ser Pro Ser Gly Pro Gly Lys Ala Val Asn 195 200 205 atg atg cat caa gaa cgg agg ttc aat ttg tct acc att cag gag cca 673 Met Met His Gln Glu Arg Arg Phe Asn Leu Ser Thr Ile Gln Glu Pro 210 215 220 cca atg cag att ctt gag cta caa tat cat ggt ggc ata agc atg tac 721 Pro Met Gln Ile Leu Glu Leu Gln Tyr His Gly Gly Ile Ser Met Tyr 225 230 235 atc atg ttg ccc gag gat gac cta tcc gaa att gaa agc aag ctg agt 769 Ile Met Leu Pro Glu Asp Asp Leu Ser Glu Ile Glu Ser Lys Leu Ser 240 245 250 ttc cag aat cta atg gac tgg aca aat agc agg aag atg aaa tct cag 817 Phe Gln Asn Leu Met Asp Trp Thr Asn Ser Arg Lys Met Lys Ser Gln 255 260 265 270 tat gtg aat gtg ttt ctc ccc cag ttc aag ata gag aaa gat tat gaa 865 Tyr Val Asn Val Phe Leu Pro Gln Phe Lys Ile Glu Lys Asp Tyr Glu 275 280 285 atg agg agc cac ttg aaa tct gta ggc ttg gaa gac atc ttt gtt gag 913 Met Arg Ser His Leu Lys Ser Val Gly Leu Glu Asp Ile Phe Val Glu 290 295 300 tcc agg gct gat ctg tct gga att gcc tct gga ggt cgt ctc tat gta 961 Ser Arg Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Val 305 310 315 tca aag cta atg cac aag tcc ctc ata gag gtc tca gaa gaa ggc acc 1009 Ser Lys Leu Met His Lys Ser Leu Ile Glu Val Ser Glu Glu Gly Thr 320 325 330 gag gca act gct gcc aca gaa agt aac atc gtt gaa aag cta ctt cct 1057 Glu Ala Thr Ala Ala Thr Glu Ser Asn Ile Val Glu Lys Leu Leu Pro 335 340 345 350 gaa tcc acg gtg ttc aga gct gac cgc ccc ttt ctg ttt gtc att agg 1105 Glu Ser Thr Val Phe Arg Ala Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val Ile Arg 355 360 365 aag aat ggc atc atc tta ttt act ggc aaa gtc tcg tgt cct 1147 Lys Asn Gly Ile Ile Leu Phe Thr Gly Lys Val Ser Cys Pro 370 375 380 tgaaattcta tttggttttc catacactaa caggcatgaa gaaacatcat aagtgaatag 1207 aattgtaatt ggaagtacat gg 1229 <210> 19 <211> 380 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 19 Met Ala Ser Leu Ala Ala Ala Asn Ala Glu Phe Gly Phe Asp Leu Phe 1 5 10 15 Arg Glu Met Asp Ser Ser Gln Gly Asn Gly Asn Val Phe Phe Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ile Phe Thr Ala Leu Ser Leu Ile Arg Leu Gly Ala Arg Gly 35 40 45 Asp Cys Xaa Arg Gln Ile Asp Lys Ala Leu His Phe Ile Ser Pro Ser 50 55 60 Arg Gln Gly Asn Ser Ser Asn Ser Gln Leu Gly Leu Gln Tyr Gln Leu 65 70 75 80 Lys Arg Val Leu Ala Asp Ile Asn Ser Ser His Lys Asp Xaa Lys Leu 85 90 95 Ser Ile Ala Asn Gly Val Phe Ala Glu Lys Val Phe Asp Phe His Lys 100 105 110 Ser Tyr Met Glu Cys Ala Glu Asn Leu Tyr Asn Ala Lys Val Glu Arg 115 120 125 Val Asp Phe Thr Asn Asp Ile Gln Glu Thr Arg Phe Lys Ile Asn Lys 130 135 140 Trp Ile Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Lys Val Leu Gly Asp 145 150 155 160 Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val Asn Ala Val Tyr 165 170 175 Phe Lys Gly Lys Trp Lys Ser Ala Phe Thr Lys Ser Asp Thr Leu Ser 180 185 190 Cys His Phe Arg Ser Pro Ser Gly Pro Gly Lys Ala Val Asn Met Met 195 200 205 His Gln Glu Arg Arg Phe Asn Leu Ser Thr Ile Gln Glu Pro Pro Met 210 215 220 Gln Ile Leu Glu Leu Gln Tyr His Gly Gly Ile Ser Met Tyr Ile Met 225 230 235 240 Leu Pro Glu Asp Asp Leu Ser Glu Ile Glu Ser Lys Leu Ser Phe Gln 245 250 255 Asn Leu Met Asp Trp Thr Asn Ser Arg Lys Met Lys Ser Gln Tyr Val 260 265 270 Asn Val Phe Leu Pro Gln Phe Lys Ile Glu Lys Asp Tyr Glu Met Arg 275 280 285 Ser His Leu Lys Ser Val Gly Leu Glu Asp Ile Phe Val Glu Ser Arg 290 295 300 Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Val Ser Lys 305 310 315 320 Leu Met His Lys Ser Leu Ile Glu Val Ser Glu Glu Gly Thr Glu Ala 325 330 335 Thr Ala Ala Thr Glu Ser Asn Ile Val Glu Lys Leu Leu Pro Glu Ser 340 345 350 Thr Val Phe Arg Ala Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val Ile Arg Lys Asn 355 360 365 Gly Ile Ile Leu Phe Thr Gly Lys Val Ser Cys Pro 370 375 380 <210> 20 <211> 1147 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1104) <300> <310> PCT/JP98/04269 <311> 1998-09-22 <400> 20 ttc gac tta ttc aga gag atg gat agt agc caa gga aat gga aat gta 48 Phe Asp Leu Phe Arg Glu Met Asp Ser Ser Gln Gly Asn Gly Asn Val 1 5 10 15 ttc ttc tct tcc ctg agc atc ttc act gcc ctg acc cta atc cgt ctg 96 Phe Phe Ser Ser Leu Ser Ile Phe Thr Ala Leu Thr Leu Ile Arg Leu 20 25 30 ggt gct cga ggt gac tgt gca cgt cag att gac aag gca ctg cac ttt 144 Gly Ala Arg Gly Asp Cys Ala Arg Gln Ile Asp Lys Ala Leu His Phe 35 40 45 aac ata cca tca aga caa gga aac tca tct aat aat cag cca gga ctt 192 Asn Ile Pro Ser Arg Gln Gly Asn Ser Ser Asn Asn Gln Pro Gly Leu 50 55 60 cag tat caa ttg aaa aga gtt ctt gct gac ata aac tca tct cat aag 240 Gln Tyr Gln Leu Lys Arg Val Leu Ala Asp Ile Asn Ser Ser His Lys 65 70 75 80 gat tat gaa ctc agc att gcc act gga gtt ttt gca gaa aaa gtc tat 288 Asp Tyr Glu Leu Ser Ile Ala Thr Gly Val Phe Ala Glu Lys Val Tyr 85 90 95 gac ttt cat aag aac tac att gag tgt gct gaa aac tta tac aat gct 336 Asp Phe His Lys Asn Tyr Ile Glu Cys Ala Glu Asn Leu Tyr Asn Ala 100 105 110 aaa gtg gaa aga gtt gac ttc aca aat gat gta caa gat acc aga ttt 384 Lys Val Glu Arg Val Asp Phe Thr Asn Asp Val Gln Asp Thr Arg Phe 115 120 125 aaa att aat aaa tgg att gaa aat gag aca cat gga aag atc aag aag 432 Lys Ile Asn Lys Trp Ile Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Lys 130 135 140 gtg ttg ggc gac agc agc ctc agc tcg tcg gct gtc atg gtg ctg gtg 480 Val Leu Gly Asp Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val 145 150 155 160 aac gct gtt tac ttc aaa ggc aaa tgg aaa tcg gcc ttc acc aag act 528 Asn Ala Val Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Lys Ser Ala Phe Thr Lys Thr 165 170 175 gat acc ctc agt tgc cgt ttt agg tct ccc acg tgt cct gga aaa gta 576 Asp Thr Leu Ser Cys Arg Phe Arg Ser Pro Thr Cys Pro Gly Lys Val 180 185 190 gtt aat atg atg cat caa gaa cgg cgg ttc aat ttg tct acc att cag 624 Val Asn Met Met His Gln Glu Arg Arg Phe Asn Leu Ser Thr Ile Gln 195 200 205 cag cca cca atg cag gtt ctt gag ctc caa tat cat ggt ggc ata agc 672 Gln Pro Pro Met Gln Val Leu Glu Leu Gln Tyr His Gly Gly Ile Ser 210 215 220 atg tac att atg ctg cct gag gat ggc cta tgt gaa att gaa agc aag 720 Met Tyr Ile Met Leu Pro Glu Asp Gly Leu Cys Glu Ile Glu Ser Lys 225 230 235 240 ctg agt ttc cag aat ctg atg gac tgg acc aat agg agg aaa atg aaa 768 Leu Ser Phe Gln Asn Leu Met Asp Trp Thr Asn Arg Arg Lys Met Lys 245 250 255 tct cag tat gtg aac gtg ttt ctc ccc cag ttc aag ata gag aag aat 816 Ser Gln Tyr Val Asn Val Phe Leu Pro Gln Phe Lys Ile Glu Lys Asn 260 265 270 tat gaa atg acg cac cac ttg aaa tcc tta ggc ttg aaa gat atc ttt 864 Tyr Glu Met Thr His His Leu Lys Ser Leu Gly Leu Lys Asp Ile Phe 275 280 285 gat gag tcc agt gca gat ctc tct gga att gcc tct gga ggt cgt ctc 912 Asp Glu Ser Ser Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu 290 295 300 tac gta tca aag cta atg cac aag tca ttc ata gag gtc tca gag gag 960 Tyr Val Ser Lys Leu Met His Lys Ser Phe Ile Glu Val Ser Glu Glu 305 310 315 320 ggc act gaa gcc act gct gcc aca gaa aat aac att gtt gaa aag cag 1008 Gly Thr Glu Ala Thr Ala Ala Thr Glu Asn Asn Ile Val Glu Lys Gln 325 330 335 ctt cct gag tcc aca gtg ttc aga gcc gac cgc ccc ttt ctg ttt gtc 1056 Leu Pro Glu Ser Thr Val Phe Arg Ala Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val 340 345 350 atc aag aag aat gac atc atc tta ttt act ggc aaa gtc tct tgt cct 1104 Ile Lys Lys Asn Asp Ile Ile Leu Phe Thr Gly Lys Val Ser Cys Pro 355 360 365 tgaaattcga tttggtttcc tatacagtaa caggcatcaa gaa 1147 <210> 21 <211> 368 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Phe Asp Leu Phe Arg Glu Met Asp Ser Ser Gln Gly Asn Gly Asn Val 1 5 10 15 Phe Phe Ser Ser Leu Ser Ile Phe Thr Ala Leu Thr Leu Ile Arg Leu 20 25 30 Gly Ala Arg Gly Asp Cys Ala Arg Gln Ile Asp Lys Ala Leu His Phe 35 40 45 Asn Ile Pro Ser Arg Gln Gly Asn Ser Ser Asn Asn Gln Pro Gly Leu 50 55 60 Gln Tyr Gln Leu Lys Arg Val Leu Ala Asp Ile Asn Ser Ser His Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Glu Leu Ser Ile Ala Thr Gly Val Phe Ala Glu Lys Val Tyr 85 90 95 Asp Phe His Lys Asn Tyr Ile Glu Cys Ala Glu Asn Leu Tyr Asn Ala 100 105 110 Lys Val Glu Arg Val Asp Phe Thr Asn Asp Val Gln Asp Thr Arg Phe 115 120 125 Lys Ile Asn Lys Trp Ile Glu Asn Glu Thr His Gly Lys Ile Lys Lys 130 135 140 Val Leu Gly Asp Ser Ser Leu Ser Ser Ser Ala Val Met Val Leu Val 145 150 155 160 Asn Ala Val Tyr Phe Lys Gly Lys Trp Lys Ser Ala Phe Thr Lys Thr 165 170 175 Asp Thr Leu Ser Cys Arg Phe Arg Ser Pro Thr Cys Pro Gly Lys Val 180 185 190 Val Asn Met Met His Gln Glu Arg Arg Phe Asn Leu Ser Thr Ile Gln 195 200 205 Gln Pro Pro Met Gln Val Leu Glu Leu Gln Tyr His Gly Gly Ile Ser 210 215 220 Met Tyr Ile Met Leu Pro Glu Asp Gly Leu Cys Glu Ile Glu Ser Lys 225 230 235 240 Leu Ser Phe Gln Asn Leu Met Asp Trp Thr Asn Arg Arg Lys Met Lys 245 250 255 Ser Gln Tyr Val Asn Val Phe Leu Pro Gln Phe Lys Ile Glu Lys Asn 260 265 270 Tyr Glu Met Thr His His Leu Lys Ser Leu Gly Leu Lys Asp Ile Phe 275 280 285 Asp Glu Ser Ser Ala Asp Leu Ser Gly Ile Ala Ser Gly Gly Arg Leu 290 295 300 Tyr Val Ser Lys Leu Met His Lys Ser Phe Ile Glu Val Ser Glu Glu 305 310 315 320 Gly Thr Glu Ala Thr Ala Ala Thr Glu Asn Asn Ile Val Glu Lys Gln 325 330 335 Leu Pro Glu Ser Thr Val Phe Arg Ala Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val 340 345 350 Ile Lys Lys Asn Asp Ile Ile Leu Phe Thr Gly Lys Val Ser Cys Pro 355 360 365

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6. 항멕신단백질항체를 포함하는 신장기능 진단용 시약으로서, 상기 시약이 뇨시료중의 멕신을 측정하기 위한 시약.
7. 제6항에 있어서, 항멕신단백질항체가 단일클론항체인 신장기능 진단용 시약.
8. 고체과립의 표면에, 항멕신단백질항체를 결합한, 농축되지 않은 뇨시료중에 포함되는 멕신단백질 검출용 과립.
9. 제8항에 있어서, 고체과립이 자성을 갖는 것인 멕신단백질 검출용 과립.
10. 제8항에 있어서, 고체과립의 비중이 1 이상인 멕신단백질 검출용 과립.
11. 제8항에 있어서, 항멕신단백질항체가 단일클론항체인 멕신단백질 검출용 과립.
12. 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체시료중에 포함되는 멕신단백질의 검출방법.

    i) 고체과립의 표면에 제1 항멕신단백질항체를 결합한 멕신단백질 검출용 과립을 생체시료와 접촉시키는 공정

    ii) 생체시료를 접촉시킨 상기 멕신단백질 검출용 과립에, 표지분자를 결합한 제2 항멕신단백질항체를 접촉시키는 공정, 및

    iii) 상기 제2 항멕신단백질항체를 사이에 두고 멕신단백질과 결합하고 있는 상기 표지분자를 검출하는 공정
13. 제12항에 있어서, 제1 항멕신단백질항체 및 제2 항멕신단백질항체가 단일클론항체인 검출방법.
14. 제13항에 있어서, 제1 항멕신단백질항체 및 제2 항멕신단백질항체가 각각 서로 다른 인식부위를 갖는 항멕신단백질항체인 검출방법.
15. 제12항에 있어서, 생체시료가 뇨인 검출방법.
16. 제12항에 있어서, 생체시료가 혈액인 검출방법.
17. 이하의 요소를 포함하는, 농축되지 않은 뇨시료중에 포함되는 멕신단백질 검출용 키트.

    a) 항멕신단백질항체를 결합하기 위한 자성 고체과립,

    b) 상기 자성 고체입자에 미리 고정되던가, 또는 간접적으로 고정할 수 있는 항멕신단백질항체 및

    c) 자석
18. 제17항에 있어서, 표지분자를 결합한 항멕신단백질항체를 더 포함하는, 멕신단백질 검출용 키트.

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