KR100604696B1

KR100604696B1 - 신규한 커큐민 유도체

Info

Publication number: KR100604696B1
Application number: KR1020047020459A
Authority: KR
Inventors: 권호정; 심중섭; 김진희; 최승훈; 신종헌; 노정래
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2004-12-16
Filing date: 2002-06-17
Publication date: 2006-07-31
Also published as: KR20050010058A

Abstract

본 발명은 신규한 커큐민 유도체 및 약제학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 항-혈관신생 활성을 갖는 신규한 커큐민 유도체 및 비조절성 혈관신생과 연관된 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 커큐민 유도체{NOVEL CURCUMIN DERIVATIVES}

본 발명은 신규한 커큐민 유도체 및 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항-혈관신생 활성을 갖는 신규한 커큐민 유도체 및 비조절성 혈관신생과 관련된 질병의 치료 및 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

혈관신생 (angiogenesis), 즉 새로운 혈관의 성장은 배아의 발생, 상처의 치료 및 조직 또는 기관의 재생과 같은 다양한 생리적 과정에서 필수적이다. 그러나, 지속적인 비조절성 혈관신생은 류마티스 관절염, 당뇨성 망막염, 암, 혈관종 및 건선과 같은 혈관신생성 질병을 유발시킨다 (Andre, T., et al., 1998. Rev. Med. Interne. 19:904-9134; Battegay, E. J. 1995. J. Mol. Med. 73: 333-346; Carmeliet, P. and R. K. Jain. 2000. Nature 407:249-257; 및 Fidler, I. J. 2000. Cancer J. Sci. Am. 2:134-141).

상기 혈관신생 과정은 종양 사이토카인, 혈관내피세포 성장인자 (VEGF) 및 염기 섬유아세포 성장인자 (bFGF)에 의하여 내피세포의 성장을 촉진시키는 단계, 메탈로프로테아제에 의하여 세포외 기질 단백질을 분해시키는 단계, 세포막 접착분자, 내피세포 분화 및 관 형성에 의하여 매개되는 내피세포의 이동 단계와 같은 여러 단계로 구성되어 있다 (Bussolino, F. et al., 1997. Trends Biochem. Sci. 22:251-256; Kuwano, M. et al., 2001. Intern. Med. 40:565-572; 및 Risau, W. 1994. Angiogenesis and endothelial cell function. Arzneimittelforschung 44:416-417). 따라서, 상기 과정들의 저해는 혈관신생과 연관된 암 및 다른 인간의 질병의 치료를 위한 새로운 치료 전략으로서 대두되게 되었다.

상기 목적을 위하여 다양한 종류의 혈관신생 억제제가 개발이 되었다. 상기 억제제는, 자연적이거나 또는 합성된 물질로서, 단백질 분해효소 억제제, 티로신 인산화 효소의 억제제, 케모카인, 인터루킨 및 기질 단백질의 분해 절편을 포함한다 (Abedi, H. and I. Zachary. 1997. J. Biol. Chem. 272: 15442-15451; Cao, Y. 2001. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33: 357-369; Fong, T. A et al., 1999. Cancer Res. 59:99-106; 및 Kwon, H. J. et al., 2001. Acalycigorgia inermis. J. Microbiol. Biotechnol. 11:656-662). 상기 항혈관신생 분자들은 내피세포 증식, 이동, 단백질 분해활성 및 관 형성의 억제뿐만 아니라 세포 자살 (apoptosis)의 유도를 포함하는 여러 과정에 영향을 미친다 (Folkman, J. and D. Ingber. 1992. Semin. Cancer Biol. 3:89-96; Kishi, K. et al., 2000. Nippon Rinsho 58:1747-1762; 및 Marme, D. 2001. Onkologie 1:1-5). 상기 분자들의 항혈관신생성 기능은 인 비트로 및 인 비보에서 잘 연구되었는데, 몇몇 물질은 현재 임상시험을 실시하고 있다 (Deplanque, G. and A. L. Harris. 2000. Eur. J. Cancer 36:1713-1724; Liekens, S. E. D. Clercq, and J. Neyts. 2001. Biochem. Pharmacol. 61:253-270; 및 Mross, K. 2000. Drug Resist. Updat. 3: 223-235).

울금 (Curcuma longa)의 근경에 존재하는 천연물인 커큐민은 강력한 화학예방제 (chemopreventive agent)로서 국립 암 연구소에 의하여 화학예방용으로 임상 1 단계를 실시 중이다 (Kelloff, G. J. et al., J. Cell Biochem. 1996, 26(suppl), 54). 커큐민은 피부, 전위 (forestomach), 십이지장, 및 결장 발암과 같은 넓은 범위의 종양 형태에 대하여 강력한 항-발암활성을 나타낸다 (Rao, C. V. et al., Cancer Res. 1995, 55, 259; Huang, M. T. et al., Carcinogenesis 1995, 16, 2493; Huang, M. T. et al., Cancer Res. 1994, 54, 5841; 및 Conney, et al., Adv. Enzyme Regul. 1991, 31, 385). 커큐민의 넓은 범위의 항발암활성은 부분적으로 혈관신생 억제에 기인하는 것으로 추정된다 (Mohan, R. et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 10405 및 Thaloor, D. et al., Cell Growth & Differ. 1998, 9, 305). 커큐민 및 데메톡식커큐민 (DC) 및 테트라히드로커큐민 (THC)와 같은 이의 일부 유도체는 강력한 혈관신생 억제제로 알려져 있다 (Arbiser, J. L. et al., Mol. Med. 1998, 4, 376). 커큐민의 쥐 대사물 (murine metabolite)인 DC 및 THC는 상당한 각막혈관신생의 억제를 보여주었으나, 그 활성은 커큐민보다는 못하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌이 참조되고 그 인용이 괄호 안에 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 신규한 커큐민 유도체에 대하여 예의 연구 노력한 결과, 항혈관신생 활성이 있는 다양한 유도체를 합성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 커큐민 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 비조절성 혈관신행과 연관된 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 울금으로부터 커큐민 및 이의 유도체를 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 첨부된 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 화학식 Ⅰ로 표시되는 커큐민 유도체를 제공한다:

상기 화학식에서 R₁은 H 또는 1-4 탄소원자의 저급 알킬기, R₂는 H 또는 1-4 탄소원자의 저급 알콕시기, R₃은 H 또는 1-4 탄소원자의 저급 알콕시기, R₄는 H 또는 1-4 탄소원자의 저급 알킬기 그리고 R₅ 및 R₆모두는 질소 또는 산소원자이며; R ₅ 및 R₆모두가질소 원자인 경우, R₅ 및 R₆ 각각은 -OR₇로 치환되며 R₇은 수소, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬이고, 또는 R₅ 및 R₆은 히드라진기를 갖는 고리를 형성하고 R₅ 및 R₆은 비치환되거나 독립적으로 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알카릴 또는 아랄킬로 치환되고; R₁이 H인 경우 R₂는 메톡시가 아니며, R₃은 수소 또는 메톡시기가 아니고, R₄는 수소가 아니며, R₅ 및 R₆은 산소가 아니다.

본 발명의 발명자는 혈관신생, 세포 특이성, 독성 등 약물의 선도 화합물을 선택하는 데 중요한 요소에 대한 활성을 실험하면서 신규한 커큐민 유도체를 합성하고자 노력하였다.

본 발명의 유도체는 커큐민의 메틸화 유도체, 옥심 유도체 그리고 히드라진 유도체이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유도체는 다음의 화학식 Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ 및 Ⅵ 중 어느 하나로 표시된다:

상기 화학식에서 R₂ 및 R₃은 화학식 Ⅰ에서와 동일하다.

보다 바람직하게는 화학식 Ⅰ, Ⅳ 및 Ⅵ에서 R₂ 및 R₃은 독립적으로 H 또는 메톡시기를 표시한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 커큐민 유도체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 수용 가능한 담체를 포함하는 비조절성 혈관신생과 연관된 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의하여 치료 또는 예방되는 비조절성 혈관신생과 연관된 질병은 류마티스 관절염, 당뇨성 망막염, 암, 혈관종 및 건선이다. 보다 바람직하게는 비조절성 혈관신생과 연관된 질병은 암이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에서 커큐민 유도체는 히드라지노커큐민이다. 보다 바람직하게는 상기 히드라지노커큐민은 다음의 화학식 Ⅳ로 표시된다:

상기 화학식에서 R₂ 및 R₃은 화학식 I에서와 동일하다.

본 발명의 화학식 Ⅳ의 히드라지노커큐민에서, 보다 유익하게는, R₂ 및 R₃은 독립적으로 H 또는 메톡시기를 표시한다. 보다 바람직하게는 화학식 Ⅳ에서 R₂ 및 R₃ 모두는 메톡시기이다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 약제학적으로 수용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 향료, 향수 및 윤활제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 음식, 투여 시간, 환자의 상태, 약물 조합, 반응 감응성 및 병의 정도와 같은 요인들에 의해 다양하다. 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태 등으로 제조될 수 있다. 이때 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 일릭서제, 과립제, 정제, 캅셀제, 리니먼트제, 로션, 및 연고제 형태일 수도 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 55-65℃ 열처리 하에서 2-5시간 동안 울금을 70-98% 메탄올 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 울금 (Curcuma aromatica)으로부터 커큐민 및 이의 유도체의 추출방법을 제공한다.

일반적으로, 천연물 소스로부터의 추출은 저급 알킬 알코올, 클로로포름, 디클로로메탄올 및 저급 알킬 폴리올과 같은 적당한 유기용매를 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 추출에는 메탄올을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 가장 바람직한 구현예에 따르면, 추출 방법은 60℃ 열처리 하에서 3 시간 동안 울금을 95% 메탄올 용액과 접촉시키는 단계를 포함한다. 추출을 위한 이러한 조건은 생리적으로 활성을 갖는 성분의 최종 수율의 관점에서 최적 조건이다.

상기 방법을 통하여, 커큐민 및 데메톡시커큐민 및 비스데메톡시커큐민과 같은 이의 유도체의 혼합물을 얻을 수 있다.

이하 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 첨부된 청구의 범위에 따라 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 제한하는 것은 아니다.

도 1은 종래의 방법에 비하여 개선된 수율로서 DC (데메톡시커큐민)을 울금으로부터 정제하는 방법을 요약한 것이다.

도 2는 DC 또는 HC (히드라지노커큐민)의 세포독성을 보여준다.

패널 A는 HUVECS의 생존성에 대한 DC의 영향을 나타낸다. 24-웰 배양 플레이트를 젤라틴 (2%)으로 피복하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 투여량-의존적으로 DC를 처리하고 72 시간 배양하였다. 그 다음, 세포를 트리판 블루 분석법으로 분석하였다. 데이터는 두 벌의 다른 실험의 평균 SE를 나타낸다.

패널 B는 관-형성된 내피세포에 대한 HC의 인 비트로 독성을 평가하기 위한 트리판 블루 염색의 결과를 보여준다. 세포독성제인 사투로스포린을 인 비트로 독성의 표지로 사용하였다.

도 3은 DC 또는 HC에 의한 미세관 형성의 억제를 보여준다. 패널 A에서 HUVEC를 마트리켈 피복된 웰상에 1x10⁵ 세포/웰의 밀도로 bFGF (염기 섬유아세포 성장 인자) 존재 또는 부재 하에서 접종하였다. HUVECs를 bFGF로 자극하고 5 μM DC를 처리하였다. 약물 처리 후 18 시간 경과 시점에서 사진촬영을 하였다. 각각의 시료는 2 반복으로 분석하였다.

도 4는 다양한 세포주의 성장에 대한 HC의 효과를 보여준다.

세포 성장을 MTT 색도계 분석법으로 측정하였다. 데이터는 세 벌의 독립적인 실험의 평균 SE를 나타낸다.

도 5는 내피 세포 침투에 대한 HC의 억제 효과를 나타낸다. 혈청없는 배지 (대조군)에 접종한 혈청-고갈된 BAECs 또는 HC의 존재 또는 부재 하에서 bFGF를 처리한 혈청-고갈된 BAECs를 침투 분석에 사용하였다. A, 데이터는 세 벌의 독립적인 실험의 평균 S.E.를 나타낸다. B, 침투한 세포의 현미경을 통한 관찰결과(x 100 배).

실시예 I: 울금으로부터 데메톡시커큐민 (DC)의 추출 및 정제

I-1: 울금으로부터 DC의 추출 방법

I-1-a: 추출 용매에 따른 DC 함량의 분석

울금 (20g)에서 다량의 DC를 효과적으로 추출하기 위해서 용매 종류에 따른 DC의 함량을 조사하였다. 메탄올(85%)과 에탄올(85%), 메탄올: 다이클로로메탄올 (1:1) (Planta Medica 66(2000) 396-398)에 울금을 5일 동안 냉침시켜 울금의 구성 성분을 추출한 후, DC의 함량을 HPLC로 분석하였다.

그 결과 이 중 메탄올(85%)을 바람직한 용매로 선택하였다.

추출 용매의 종류에 따른 DC의 함량

울금의 구성 성분	메탄올(85%)	에탄올(85%)	메탄올:디클로로메탄올(1:1)
커큐민(CUR)	235 ㎎	176 ㎎	59 ㎎
데메톡시커큐민(DC)	118 ㎎	106 ㎎	47 ㎎
비스데메톡시커큐민(BDC)	147 ㎎	129 ㎎	105 ㎎

I-1-b: 열 처리 유무에 따른 DC의 함량 분석

각각의 추출용매에서 2-5시간 동안 55-65℃로 열 처리를 한 경우 추출된 DC의 함량을 조사하였다. 그 결과, 열 처리한 메탄올(85%)에서 DC의 함량이 가장 높았다. 열 처리를 하지 않은 경우, DC의 함량은 메탄올(85%) 사용시 118 ㎎ 이고, 열처리를 실시한 경우 347 ㎎이었다. 에탄올을 사용한 경우도 열 처리를 하는 경우, DC가 보다 다량 추출되었다.

열 처리 유무에 따른 DC의 함량

열 처리를 안하는 경우
울금의 구성 성분	메탄올(85%)	에탄올(85%)	메탄올 : 디클로로메탄올(1:1)
CUR	235 ㎎	176 ㎎	59 ㎎
DC	118 ㎎	106 ㎎	47 ㎎
BDC	147 ㎎	129 ㎎	105 ㎎
열 처리 하는 경우(2-5h, 55-65℃)
울금의 구성 성분	메탄올(85%)	에탄올(85%)	메탄올 : 디클로로메탄올(1:1)
CUR	753 ㎎	588 ㎎	71 ㎎
DC	347 ㎎	235 ㎎	47 ㎎
BDC	459 ㎎	353 ㎎	106 ㎎

I-1-c: 메탄올의 비율에 따른 DC의 함량 분석

100%에서 70% 농도의 메탄올을 사용하여 메탄올의 비율에 따른 DC의 함량을 HPLC로 측정한 결과, 메탄올 95%이 가장 많은 DC를 추출할 수 있는 바람직한 메탄올 비율이었다.

상기 결과에 따르면, 메탄올 농도 70-98%, 55-65℃의 온도 하에서 2-5 시간 열처리할 경우, 통상적인 5일간의 냉침에 의한 방법에 비교하여 약 1.5배 이상의 DC를 추출할 수 있다.

더욱이, 메탄올 95%로 3 시간 동안 열 처리(60℃)하는 방법이 울금으로부터 DC를 가장 효율적으로 추출할 수 있는 조건으로 밝혀졌다.

메탄올의 비율에 따른 DC의 함량

울금의구성 성분	메탄올 함량
	100%	95%	90%	85%	80%	70%
CUR	764 ㎎	765 ㎎	735 ㎎	753 ㎎	712 ㎎	694 ㎎
DC	294 ㎎	359 ㎎	353 ㎎	347 ㎎	341 ㎎	335 ㎎
BDC	353 ㎎	471 ㎎	459 ㎎	459 ㎎	459 ㎎	459 ㎎

실시예 Ⅱ: 생리학적 활성 물질의 분리 및 정제

DC를 울금으로부터 제조하였다. 요컨대, 60℃에서 3 시간 동안 95% 메탄올로 종양성 근경을 추출하고, 감압농축하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 여과하고, 헥산:클로로포름:메탄올 (3:9:1)을 사용하여 실리카겔 (70-230 메쉬) 컬럼 크로마토그래피 (Ψ 6x17 ㎝)로 분리하였다. 얻어진 분획 중 생리학적 활성을 갖는 분획은 동일한 용매을 사용하여 실리카겔 (70-230 메쉬) 컬럼 크로마토그래피 (Ψ 3x15 ㎝)로 보다 더 분리하였다.

활성 분획은 헥산:클로로포름:메탄올=3:9:1을 사용하여 분취 박층 크로마토그래피 (실리카겔 60 F₂₅₄)로 보다 더 정제하였다. 활성 화합물의 최종 정제를 HPLC (SHIMAZU, 0.1% 트리플루오로아세트산:아세토니트릴 = 40:60, 유속: 1 ㎖/min)을 사용하여 활성 화합물을 최종적으로 정제하였다. DC의 화학 구조 및 분자량을 Mass 및 ¹H-NMR (500 MHz), ¹³C-NMR (250 MHz) 분광광도계를 통하여 분석하였다. 상기 과정을 도 1에 요약하였다.

실시예 Ⅲ: DC의 디메틸화

5 ㎎의 DC (14.7 μmol)을 0.5 ㎖의 아세톤에 용해하고, 18.3 ㎕의 메틸요오다이드 (294 μmol) 및 20.3 ㎎의 K₂CO₃ (147 μmol)을 첨가한 후 12시간 동안 교반하면서 반응시켰다. TLC와 HPLC의 분석을 통하여 디메틸화 DC 2 ㎎을 분리하였다.

ESI-MS 및 ¹H-NMR을 통해 디메틸화 DC의 분자량및 화학식를 확인하였다: M.W. 365; 화학식: C₂₂H₂₁O₅ ; 최대 흡광도: 200 nm, 430 nm 및 노란색 화합물.

실시예 Ⅳ: DC의 옥심 유도체

10 ㎎의 DC (29.4 μmol)을 1 ㎖의 메탄올에 용해하고, 10.81 ㎎의 벤질 하이드록실아민 (67.75 μmol) 및 9.4 ㎕의 트리에틸아민 (67.75 μmol)을 첨가한 후 12시간 동안 가열 하에서 교반하면서 반응시켰다. TLC및 HPLC 분석을 통하여 DC의 옥심 유도체 3 ㎎을 분리하였다.

ESI-MS 및 ¹H-NMR을 통해 DC 옥심 유도체의 분자량과 화학식을 확인하였다: M.W. 547; 화학식 C₃₄H₃₁O₅N; 최대 흡광도: 200 nm, 325 nm 및 노란색의 화합물.

실시예 Ⅴ: DC의 히드라진-유도체

V-1: 일반적 방법

커큐민을 시그마사 (St. Louis, MO)로부터 구입하였다.

크로마토그래피 정제: 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (Merck, Darmstadt, Germany), 박층 크로마토그래피 (TLC, Merck), 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 일반적인 정제 과정에서 사용하였다.

스펙트럼 분석: HRFAB-MS 스펙트럼을 Jeol JMS-HX 110 질량 분광계를 사용하여 얻었다. NMR 스펙트럼을 CDCl₃ 용액에서 Varian Unity 500 분광계로 얻었다. H 및 C NMR 스펙트럼을 각각 500 및 125 MHz에서 측정하였다. 모든 화학적 이동 (chemical shift)을 내재 Me₄Si에 대하여 기록하였다. 사용된 모든 용매는 스펙트럼용 등급이었거나 사용전에 유리용기에서 증류하였다.

유도체의 합성에 대한 일반적인 과정은 모식도 1 및 2에 나타나있다:

모식도 1

V-2: 히드라지노커큐민 (2a)의 합성

정제된 1a (R₁, R₂ = OCH₃ 10 ㎎, 27 μmol)를 메탄올 (2 ㎖)에 용해하고, 히드라지니움디히드로클로라이드 (14 ㎎, 13.5 μmol) 및 트리에틸아민 (18.8 ㎕, 13.5 μmol)을 상기 용액에 첨가하였다. 아세트산의 촉매적 함량의 존재 하에서, 반응 혼합물을 천천히 교반하면서 실온에서 24시간 반응시켰다. 용매를 감압 증발시키고 분취 TLC (CHCl₃:MeOH = 6:1; R _f = 0.4) 및 HPLC (준-분취 C18 컬럼; 아세토니트릴:H₂O = 50:50; 유속= 3 ㎖/min; 체류시간: 21 분)로 정제하였으며, 그 결과 엷은 노란 검 (gum)상 (6.19 ㎎, 65%)으로 2a를 수득하였고, HRFAB-MS로 분석하였다. C₂₁H₂0N₂O₄:에 대한 정확한 질량을 계산하였다: 364.1423, 측정값은 (M+H) 365.1501이다.

V-3: 히드라지노데메톡시커큐민 (2b)의 합성

2a의 합성에서 기재된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 2b (5.9 ㎎, 61%)를 1b (10 ㎎, 29 μmol), 히드라지니움디히드로클로라이드 (14 ㎎, 13.5 μmol), 및 트리에틸아민 (18.8 ㎕, 13.5 μmol)으로부터 수득하였다. 분취 TLC (CHCl₃:MeOH = 6:1; R _f = 0.32)를 통하여 연황색 검으로 2b를 수득하였으며, HRFAB-MS로 분석하였다. C₂₀H₁₈N₂O₃에 대하여 계산된 정확한 질량: 334.1317, 측정값 (M+H) 335.1393.

V-4: 히드라지노비스데메톡시커큐민 (2c)의 합성

2a의 합성에서 기재된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여, 2c (5.5 ㎎, 57%)를 1c (10 ㎎, 32 μmol), 히드라지니움디히드로클로라이드 (14 ㎎, 13.5 μmol), 및 트리에틸아민 (18.8 ㎕, 13.5 μmol)으로부터 수득하였다. 분취 TLC (CHCl₃:MeOH = 6:1; R _f = 0.26)를 통하여 연황색 검으로 2c를 수득하였으며, HRFAB-MS로 분석하였다. C₁₉H₁₆N₂O₂에 대하여 계산된 정확한 질량: 304.1212, 측정값 (M+H) 305.1291.

모식도 2

V-5: 히드라지노벤질커큐민 (3a)의 합성

메탄올 (2 ㎖)에 용해한 1a (10 ㎎, 27 μmol)의 용액에 4-히드라지벤조산 (20 ㎎, 13.5 μmol), 트리에틸아민 (18.8 ㎕, 13.5 μmol) 및 촉매적 함량의 아세트산을 첨가하였다. 24 시간 동안 반응시킨 후, 용매을 감압증류하였으며, TLC (CHCl₃:MeOH = 4:1; R _f ,=0.5) 및 HPLC (준-분취 C18 컬럼; 아세토니트릴:H₂O = 50:50; 유속 = 3 ㎖/min; 체류시간: 15 분)으로 정제하여, 진한 오렌지색 파우더 (7.18 ㎎, 55%)의 3a를 수득하였고, HRFAB-MS. C₂₈H₂₄N₂O₆에 대하여 계산된 정확한 질량: 484.1634, 측정값 (M+H) 485.1715.

V-6: 히드라지노벤조일데메톡시커큐민 (3b)의 합성

3a의 합성에서 기재된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여, 3b (5.52 ㎎, 42%)를 1b (10 ㎎, 29 μmol), 4-히드라지노벤조산 (20 ㎎, 13.5 μmol), 및 트리에틸아민 (18.8 ㎕, 13.5 μmol)으로부터 수득하였다. 분취 TLC (CHCl₃:MeOH = 4:1; R _f = 0.41)를 통하여 진한 오렌지색 파우더의 3b를 수득하였으며, HRFAB-MS로 분석하였다. C₂₇H₂₂N₂O₅에 대하여 계산된 정확한 질량: 454.1529, 측정값 (M+H) 455.1611.

V-7: 히드라지노벤조일비스데메톡시커큐민 (3c)의 합성

3a의 합성에서 기재된 것과 동일한 프로토콜을 사용하여, 3c (6.78 ㎎, 50%)를 1c (10 ㎎, 32 μmol), 4-히드라지노벤조산 (20 ㎎, 13.5 μmol), 및 트리에틸아민 (18.8 ㎕, 13.5 μmol)으로부터 수득하였다. 분취 TLC (CHCl₃:MeOH = 4:1; R _f = 0.34)를 통하여 진한 오렌지색 파우더의 3c를 수득하였으며, HRFAB-MS로 분석하였다. C₂₆H₂₀N₂O₄에 대하여 계산된 정확한 질량: 424.1423, 측정값 (M+H) 425.1501.

V-8: 히드라지노커큐민 (HC)의 구조 결정

커큐민의 합성 유사체인 HC (2a)를 연황색 검 (gum)상으로 수득하였으며, HRFAB-MS에 의하여 C₂₁H₂0N₂O₄에 대하여 분석되었으며, 따라서, 13 불포화도를 나타내었다. 이 화합물의 구조는 결합된 2D NMR 실험 및 커큐민에 대하여 얻어진 스펙트럼 데이터와 스펙트럼 데이터의 비교를 통하여 결정되었다 (표 4). 벤젠 고리의 프로톤 및 탄소의 모든 시그널은 ¹H COSY, gHSQC 및 gHMBC 실험의 결과에 기초하여 할당되었다. 하지만, 측면 사슬에서의 프로톤 및 탄소에 상응하는 NMR 신호에 있어서 상당한 차이가 관찰되었다. ¹³C NMR 스펙트럼은 δ131.1 (d)에서 폭이 넓은 시그널을 보여주었으며, 이것은 gHSQC 스펙트럼에서 δ7.09 및 6.94의 프로톤과 연관이 있는 것이었다. ¹H COSY 데이터는 이 프로톤들이 매우 큰 결합 상수 (coupling constant. J=16.1 Hz)로 각각 결합되어 있다는 것을 보여주었다.

따라서, 이들은 트랜스 이중 본드의 올레핀 프로톤이라고 판단되었다. 이러한 해석은 ROESY 실험에 의하여 뒷받침되는데, 교차 피크가 δ7.16 및 6.97에서 올레핀 프로톤 및 방향성 프로톤 사이에서 관찰되었다.

HC의 NMR 데이터는 추가적인 메틴기의 다른 시그널을 포함하고 있었다; δ_H 6.64, δ_C99.9. 프로톤 시그널의 세기는 다른 것들의 거의 반정도이므로, 상기 메틴은 분자의 C-10 대칭 중앙에 해당하는 것을 판단되었다. C-9 탄소의 시그널은 피라존 부위의 두 형태간의 빠른 호변 이성화 (tautomerization)으로 인하여 관찰되지 않았을 지라도, ¹³C NMR 데이터에서 C-10 메틴의 필드 위쪽으로의 이동 (upfield shift)은 인접한 위치에 전기적 음성 원자 (electronegative atom)를 포함하는 올레핀 탄소의 배치를 시사하였다. 이러한 해석을 뒷받침하는 데이터가 2D NMR 실험에 의하여 제공되었으며, 상기 실험에서 H-8 및 C-10 사이의 gHMBC-상관 관계 및 H-8 및 H-10 사이의 ROESY 교차 피크가 관찰되었다. 따라서, HC의 구조는 사슬의 중간에 피라조 부위를 갖는 포함하는 커큐민 유사체로 결정되었다.

실시예 Ⅵ: BAEC에 대한 커큐민 및 합성 유도체의 IC ₅₀ 값

합성 커큐민 유도체의 항-혈관신생 활성을 평가하기 위하여 각각의 화합물을 내피 세포 증식에 대하여 처리하였으며, MTT 색도계 분석법으로 분석하였다.

실험된 6개의 유도체 중에서, HC가 BAECs에 대하여 0.52 μM의 IC₅₀으로 가장 강력한 성장 억제 활성을 나타내었다 (표 5). BAECs에 대한 HC의 억제능은 커큐민의 억제능보다 30 배이상 높았다. 또한, 부피가 큰 벤조산을 갖는 히드라진 유도체는 상승된 항-증식 활성을 보여주었다. 하지만, 유도체들의 억제능은 HC보다 상대적으로 낮았다.

BAEC에 대한 커큐민 및 합성 유도체의 IC₅₀

	R₁	R₂	BAECs, IC₅₀ (M)^a
커큐민들,1	OCH₃	OCH₃	1.5±0.3x10^-5
	OCH₃	H	2.2±0.5x10^-5
	H	H	5.3±0.6x10^-5
히드라지노커큐민들,2	OCH₃	OCH₃	5.2±0.4x10^-7
	OCH₃	H	1.8±0.3x10^-6
	H	H	5.8±0.2x10^-6
히드라지노벤조일커큐민들,3	OCH₃	OCH₃	9.3±0.4x10^-7
	OCH₃	H	2.4±0.1x10^-6
	H	H	8.7±0.2x10^-6

^a IC₅₀ 값은 3 개의 독립된 실험의 평균 SE이다.

실시예 Ⅶ: 혈관내피세포에 대한 DC 또는 HC의 세포독성

혈관내피세포에 대한 상기 분리된 DC 또는 HC의 독성을 평가하기 위하여, 성장 억제 분석을 DC 또는 HC를 사용하여 실시하였다.

웰당 5x10³HUVECs의 96-웰 플레이트를 20% 혈청이 함유된 M199 1 ㎖와 함께 3시간 동안 37℃에서 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다. 각 웰에서 HUVECs가 80%의 밀도로 증식한 후 PBS 1 ㎖로 웰을 세척한 후 새로운 20% 혈청을 함유한 M199 배지로 배양액을 교체하고 2.5 내지 25 ㎍/㎖ 농도에서 DC를 처리하였다. 72 시간이 경과한 후 MTT 시약 및 DMSO를 첨가하고, 성장 속도를 ELISA (OD₅₄₀)로 측정한 다음, 결과를 대조군과 비교하였다.

도 2A에 나타낸 바와 같이, 본원 발명의 정제된 DC는 HUVECs에 대하여 10 ㎍/㎖의 처리 농도에서 세포 독성을 거의 나타내지 않았으며, 20 ㎍/㎖의 농도에서 10% 전후의 약한 독성을 나타내었다.

모식도 1의 2a에 나타낸 HC의 경우, BAEC에 대한 HC (300nM)의 독성을 분석하고 항-혈관신생 분석의 동일한 지속기간 동안 스타우로스포린 (10 μM)과 비교하였다. 스타우로스포린은 심각한 세포 사멸을 초래하였으나, HC는 어떠한 세포 독성을 보이지 않았다 (도 2B)

따라서, 항-신생혈관 처리는 DC의 경우 5 ㎍/㎖, 그리고 HC의 경우 100-300 nM에서 실시되었으며, 상기 농도에서 어떠한 세포 독성없이 충분한 항-혈관신생 효과를 얻을 수 있었다.

실시예 Ⅷ: DC 또는 HC에 의한 모세관 형성의 억제

매트리겔 (Matrigel) (250 ㎕, 10 ㎎/㎖)을 24-웰 배양 플레이트에 놓고 30분 동안 37℃에서 중합시켰다. BAECs (1x10⁵ 세포)를 매트리겔의 표면에 접종하고 bFGF (30 ng/㎖)으로 처리하였다. 그 다음, 모식도 1의 2a에서 나타낸 HC를 첨가하고 6-18 시간 배양하였다. 세포 및 형성되는 관의 형태적 변화를 현미경 하에서 관찰하고 JVC 디지털 카메라 (Victor, Yokohama, 일본국)를 사용하여 100 배 크기로 사진촬영하였다.

모세관 형성에 대한 DC의 억제 활성을 확인하기 위하여, 웰당 1x10⁴ HUVECs의 24-웰 플레이트를 5 ㎍/㎖ DC를 포함하는 1 ㎖ 배지에서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 중, 모세관의 형성을 ImagePro Plus 소프트웨어 (Media Cybernetics, Inc.)를 사용하여 40 배 크기로 시간에 따라 사진촬영하여 관찰하였다 (도 3A).

DC에 대한 상기 분석법과 동일한 과정으로 BACEs를 사용하여 모세관 형성에 대한 HC의 억제효과를 평가하였다 (도 3B).

도 3에 보는 바와 같이, DC 및 HC는 효과적으로 bFGF에 의하여 유도된 모세관 형성을 억제하였다. 하지만, HC의 억제 효과는 DC 보다 더 강력한 것으로 확인되었다.

실시예 Ⅸ: 내피 세포에 대한 HC의 성장 억제 효과

우 대동맥 내피세포 (BAECs)의 초기 계대 (5-7 계대)를 한국 NIH의 조 박사에게서 제공받았다. BAECs를 10% 우태아 혈청 함유 MEM에서 성장시켰다. HT29 (결장암종), NIH3T3 (마우스 정상 섬유아세포) 및 Chang (정상 간) 세포를 10% 우태아 혈청을 포함하는 RPMI1640에서 유지하였다. 모든 세포를 5% CO₂의 습윤한 대기에서 37℃에서 성장시켰다. MTT 색도계 분석법으로 세포성장 분석을 실시하였다. 지수적으로 성장하는 세포를 96-웰 플레이트에 5x10³ 세포/웰의 밀도로 접종하였다. 24시간 동안 성장 배지에서 세포를 배양하였다. 다양한 농도의 커큐민 유도체를 각각의 웰에 첨가하고 72 시간까지 배양하였다. 72시간 후에 50 ㎕의 MTT (2 ㎎/㎖ 원액, 시그마)을 첨가하고 플레이트를 4시간 더 배양하였다. 배양 상등액을 제거한 후, 150 ㎕의 DMSO를 첨가하였다. 마이크로플레이트 판독기 (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, Vermont)를 사용하여 540 ㎚에서 플레이트를 판독하였다.

세포주 특이성을 측정하기 위하여 모식도 1의 2a에 나타낸 HC의 항-증식 활성을 조사하였다.

수개의 내피세포 및 섬유아세포, 즉, HT29, 결장암종, NIH3T3, 정상 섬유아세포, Chang 정상 간세포 및 BAECs를 조사하였으며, 그 결과 HC는 다른 활성 스펙트럼으로 각 세포주의 증식을 억제하였다 (도 4). 흥미롭게도, HC은 항-증식 활성에 있어서 내피세포에 높은 특이성을 나타내었다. HT29 및 결장암종 (colorectal carcinoma cells)에 대하여 20 이상의 특이성 요소 (specificity factors)를 얻었다. 또한, 다른 정상 세포주는 HC에 대하여 어느 정도의 다른 민감도를 보여주었다. HC와 대조적으로, 모화합물인 커큐민은 이들 세포의 증식을 상대적으로 비선택적인 양상으로 억제하였다 (결과 미첨부). 이 결과는 HC가 내피세포에 특이적으로 세포 증식을 억제하는 것을 시사한다.

실시예 Ⅹ: 내피 세포 침투에 대한 HC의 영향

폴리카르보네이트 필터를 갖는 트랜스웰 (Transwell) 챔버 시스템을 사용하여 인비트로에서 내페세포의 침투 실험을 실시하였다.

필터 하단을 10 ㎕의 젤라틴 (1 ㎎/㎖)으로 피복하고 필터의 상단은 10 ㎕의 마트리겔 (3 ㎎/㎖)로 피복하였다. 지수적으로 성장하는 세포 (1x10⁵ 세포)를 필터의 상단에 놓고, HC를 접종 전에 실온에서 30 분 동안 하단부에 처리하였다. 그 다음 챔버를 18 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 메탄올로 세포를 고정하고 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다. 100 배 비율의 광학 현미경을 사용하여 필터의 하단상의 전체 세포를 계수하여 세포 침투를 측정하였다.

내피세포 침투 및 관 구조의 형성 그리고 세포 증식은 혈관신생의 필수적인 단계들이다. 따라서, BAECs 침투에 대한 HC의 영향을 평가하였다. 화학유인물질로서 bFGF를 사용하였다. 모식도 1의 2a 나타낸 HC는 강력하게 bFGF-유도된 BAECs 침투를 나노몰 농도에서 억제하였다 (도 5).

실시예 ⅩⅠ: 난황 혈관신생에 대한 DC, HC 및 이들의 유도체의 억제 효과

DC, HC 및 이들의 유도체의 항-혈관신생 효과를 나타내는 상기 인비트로 결과를 보다 확실히 하기 위하여 인 비보에서 난황막 (chorioallantoic membrane, CAM) 분석을 하기와 같이 실시하였다.

수정된 닭의 계란을 37℃ 습윤 배양기에서 3일 동안 보관하였다. 그 다음, 약 2 ㎖의 계란 알부민을 피하침으로 제거하여 CAM 및 난황낭을 난막 (shell membrane)으로부터 떨어지도록 하였다. 3.5 일 후, 껍질에 구멍을 내고 난막을 벗기어 낸다. 4.5 일된 닭의 배아 단계에서 DC, HC (모식도 1의 2a) 또는 이들의 유도체 (20 ㎕/계란)를 로드한 터마녹스 커버슬립 (thermanox coverslip)을 건조시키고 CAM 표면에 처리하였다. 이틀 후에, 2 ㎖의 10% 지방 에멀젼을 장뇨막 (chorioallantois)에 주입하고 CAM을 현미경으로 관찰하였다. 레티노산 (RA)은 항-혈관신생 화합물로 알려져 있으므로, 20 ㎍/계란 RA를 항-혈관신생 반응의 양성 대조군으로 사용하였다. 시료를 처리한 CAM이 빈 커버슬립에 비하여 거의 관 (vessel)을 갖지 않는 RA-처리된 CAM과 유사한 정도의 무혈관부위 (avascular zone)를 나타내는 경우, 반응을 양성으로 기록하고 실험된 계란의 총 수에 대한 양성 계란의 백분율에 기초하여 계산하였다.

독립적으로 실험을 3 회 반복하였으며, 최소 20 이상의 계란을 사용하였다 (표 6).

인 비보에서 CAM의 혈관신생 억제

	양/디스크	억제 (%)
대조군	메탄올 (2 ㎕)	15
레티노산	20 ㎍	89
DC	20 ㎍	86
디메칠 DC	20 ㎍	85
옥심 유도체	20 ㎍	80
HC (2a)	20 ㎍	94

도 6에서 보는 바와 같이 잘 알려진 항-혈관신생제인 레티노산과 비교하여 동등한 DC의 억제 효과 및 HC의 보다 강력한 억제 효과는 본 발명의 DC, HC 및 이의 유도체들 또한 항-혈관신생제임을 시사한다.

본 발명의 바람직한 구현예를 기재함에 있어서, 본 발명의 사상 내의 이들의 이형 및 변형은 당업자에게 명확하며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위 및 이들의 등가물이다.

Claims

(a) 다음의 화학식 Ⅵ으로 표시되는 커큐민 유도체의 약제학적 유효량; 및

(b) 약제학적 수용 가능한 담체를 포함하는, 류마티스 관절염, 당뇨성 망막염, 암, 혈관종 및 건선으로 구성된 군으로부터 선택되는 비조절성 혈관신생과 연관된 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물:

상기 화학식에서 R₂는 H 또는 1-4 탄소원자의 저급 알콕시기이며, R₃은 H 또는 1-4 탄소원자의 저급 알콕시기이다.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 비조절성 혈관신생과 연관된 질병은 암인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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제 1 항에 있어서, 화학식에서 R₂ 및 R₃은 독립적으로 수소 또는 메톡시기인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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