KR100544347B1 - 디아릴이소옥사졸계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
디아릴이소옥사졸계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 디아릴이소옥사졸계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 디아릴이소옥사졸계 화합물은 유방암 세포주의 이동을 억제하며, 신생혈관형성을 억제함으로써, 암전이 억제제로서 사용할 수 있으며, 또한 신생혈관형성으로부터 야기되는 질병인 암, 류마티스성 관절염, 건선 또는 안구의 신생혈관생성 질환의 예방 및 치료용으로 유용하게 사용할 수 있다.
디아릴이소옥사졸, 암전이, 신생혈관형성, 억제제.
Description
도 1은 본 발명의 실시예 1의 화합물에 의한 유방암 세포주의 이동억제를 나타낸 그래프이며,
도 2는 본 발명의 실시예 1의 화합물에 의한 혈관내피세포(HUVEC)의 튜브형성 저해를 나타낸 사진이며,
도 3은 본 발명의 실시예 1∼6의 화합물에 의한 혈관내피세포의 혈관형성 억제를 나타낸 사진이며,
도 4는 본 발명의 실시예 1의 화합물에 의한 제브라피쉬(zebrafish)의 신생혈관 형성 억제를 나타낸 사진이다.
본 발명은 디아릴이소옥사졸계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암세포 이동 억제제 및 신생혈관형성 저해제에 관한 것이다.
암이란 주로 통제되지 않는 세포의 증식에서 시작되어 주위의 정상조직 또는 기관으로 침윤하여 파괴시키고 새로운 성장 장소를 만들 수 있어 개체의 생명을 빼앗아 갈 수 있는 질환 군을 총칭한다.
지난 10여년 동안 암을 정복하기 위해 세포주기나 세포사멸(apoptosis)의 조절과 발암유전자나 암억제 유전자들을 포함한 새로운 표적을 모색함에 있어서 눈에 띄는 발전을 거듭해 왔음에도 불구하고 암의 발생률은 문명이 발달됨에 따라 증가되고 있다. 현재, 암환자의 치료법은 외과적 수술, 방사선 치료, 40여종의 강한 세포독성을 보이는 항암물질 투여에 의한 화학요법에 의존하고 있는 상태인데, 이들 치료법도 대부분 조기 암환자나 특정 암에만 국한되어 암으로 인한 사망은 계속 증가하고 있는 추세이다.
한편, 암이 생명에 위협이 되는 가장 큰 원인은 암세포의 전이성에 있으며, 암으로 인한 사망의 대부분은 암 전이로 설명된다. 현재 임상적으로 입증된 보편적인 암 치료 방법이 외과 수술이지만, 원발암이 제거되더라도 다른 조직으로 전이된 암세포에 의해 환자의 치료가 어렵게 된다. 따라서 암 정복은 실질적으로는 암 전이와의 싸움이라 볼 수 있다.
암 전이에 있어서 세포의 이동은 여러 단계에 관여하는데, 암세포가 초기의 원발암 위치에서 세포간질(extracellular matrix(ECM))을 지나 혈관으로 이동할 때, 제2의 전이 조직에서 혈관 밖으로 이동할 때 및 신생혈관에서 혈관 내피세포(vascular endothelial cell)가 이동할 때에 관여하는 등 그 과정이 매우 복잡하고 다양한 기능을 갖고 있다.
이동하는 세포는 세포이동 유도물질에 의해 활성화된 신호수용체에 의해 극성(polarity)이 유도된다. 세포 앞쪽의 끝부분은 엑틴(actin)의 중합에 의해 세포막이 앞으로 확장되며 인테그린(integrin)을 통해 세포간질에 부착한다. 이때, 엑틴 폴리머에 결합된 마이오신(myosin)에 의해 엑틴 폴리머들 사이에 강한 수축력이 형성되며 세포 전체에 강한 수축력이 부여된다. 따라서 세포의 앞부분 및 뒷부분의 부착력의 차이에 의해 세포이동의 방향이 결정된다. 만약 새로 형성된 앞부분의 부착력이 뒷부분의 부착력 보다 클 경우 세포의 뒷부분이 세포간질로부터 떨어져 세포는 앞으로 이동하게 되며, 그 반대의 경우 세포는 원래의 위치에 머물게 된다. 세포이동 신호수용체에 의해 활성화된 신호전달 분자에 따라 구조 형태학적으로 다른 세포돌출부가(Lamellipoda, Filapoda) 형성된다. 이런 서로 다른 돌출부는 모두 실모양의 액틴(actin)을 포함할 뿐만 아니라 다양한 구조적, 신호적 단백질 세트를 포함하고 ECM과 역동적인 상호관계를 이끈다[Peter Friedl, et al..
Nature Cancer Review,
2003, 3: 362].
암세포 이동을 표적으로 하는 항암제는 암전이 억제를 목표로 하고 있다. 세포이동 억제제가 최상의 표적은 아니나, 우리가 추구하는 암 환자의 생명을 연장할 수 있는 현실적인 접근 방법이라고 할 수 있다. 실제로 암은 어떤 부위에 발생하든지 생성 부위만 찾으면 외과적 수술에 의해 간단하게 제거될 수 있는데, 이러한 외과적 수술의 한계는 암세포가 원발암 부위 이외의 여러 다른 곳으로 퍼져 나가기 때문에 초기 시기에만 수술을 통한 완치를 기대할 수 있다. 그러나 초기에 암을 진단하지 못하였을 경우에는 이미 암세포가 혈관을 경유하여 온 몸에 퍼져있고 제2 또는 제3의 위치에서 매우 작은 콜로니(colony)를 형성한 경우에는 외과적 수술에 의해서는 암 치료를 성공적으로 치료할 수 없다. 실제로 많은 경우 암세포가 전이되어 외과적 치료를 포기하는 경우가 많은데, 이러한 경우에는 더 이상의 전이가 확산되지 않도록 암세포 이동을 억제한 상태에서 항암제를 투여하여 암세포의 사멸을 유도함으로써, 환자의 생명을 연장시키는데 도움을 줄 수 있을 것이다. 따라서, 암세포의 이동 억제제의 개발은 새로운 개념의 신약 항암제로 개발될 수 있으며, 확인된 저해제는 세포의 이동에 관한 학문적 연구에 중요한 재료로 사용될 수 있다.
혈관신생(angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정을 말하는데, 악성종양으로 전개되는 과정 중 암의 전이 시에 이러한 혈관신생과정이 필수적으로 동반된다[Jack L. Arbiser, et al., Proc. Natl. Aced. Sci. USA, 1997, 94: 861]. 최근, 새로운 항암제 개발 방법으로서 이러한 혈관신생 저해제가 주목을 받고 있는데, 그 이유는 첫째, 혈관신생작용은 원발성 혹은 전이성 종양에서 필수적이며, 암 조직은 신생혈관에 의한 영양분과 산소 공급이 없으면 1∼2 ㎣ 이상 성장할 수 없다[J. Folkman. Semin Cancer Biol., 1992, 3: 65]. 혈관신생작용이 일어나는 동안 원발성 암세포가 혈관 내로 유입되어 다른 장소로 이동하여 전이 암을 형성하게 된다. 따라서 혈관신생 억제제는 모든 고형성 종양(solid tumor)에서 공통적으로 사용할 수 있다는 가능성이다. 둘째, 기존의 항암화학요법은 암세포가 빠르게 성장하는 특징을 이용하여 치료하기 때문에 비교적 세포주기(turn over)가 빠른 골수세포, 위장관계세포에 독작용(cytotoxicity)을 나타내는 반면 혈관신생 억제제는 장기 투여에도 비교적 적은 부작용은 나타낼 수 있다는 점이다. 뿐만 아니라, 항암 화학요법은 형질이 변형된 암세포를 치료 목표로 하기 때문에 새로운 내성을 나타낼 수 있지만, 혈관신생 억제제는 정상혈관 세포가 치료의 대상이라는 점에서 내성을 나타낼 가능성이 적다. 셋째, 하나의 혈관세포는 수백 개의 암세포에 영양분과 산소를 공급하기 때문에 하나의 혈관세포의 억제를 통해서 많은 암세포를 억제하는 효과적인 치료방법이 될 수 있다. 마지막으로 항암제 전달방법에 있어서 기존의 항암 요법의 경우 항암제가 혈관 밖으로 유출되어 암세포에 영향을 나타내는 반면 혈관신생 억제제는 직접 혈관 내피세포에 접촉하여 작용함으로 약물전달이 용이하다는 점 등이다.
1970년대 초, 하버드 의대의 포크만(Folkman) 박사에 의해 암세포가 혈관신생을 유도하기 위해서 특정 인자를 분비한다는 가설이 제안되었고, 이후 포크만 박사 연구그룹을 포함한 여러 연구팀의 노력으로 이러한 혈관신생이 암세포의 전이과정에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌으며, 아울러 혈관신생을 저해하는 인자의 존재도 밝혀졌다[J. Folkman, et al., Science, 1987, 235: 442]. 1985년에는 하버드 의대의 발리(Vallee) 박사팀에 의해 신생혈관 유도인자인 앤지오제닌(angiogenin)이 인간의 결정선 암세포의 분비액으로부터 최초로 발견되었다. 또한, 고형암(solid tumor)은 자기 주위로 유도된 새로운 혈관을 이용하여 영양분을 공급받고 노폐물을 배설함으로써 계속 성장할 수 있으며, 이 암세포가 순환기에 연결되어 폐, 간 등의 다른 부위로 전이된다는 사실도 밝혀지게 되었다[L. A. Liotta, et al., Cell, 1991, 64: 327]. 아울러, 혈관신생 억제인자 중의 하나인 앤지오스타틴(angiostatin)은 폐암세포의 전이와 성장을 막는다는 것이 발표되었다[M. S. O'Relly, et al., Cell, 1994, 79: 715]. 이와 같은 사실들은 암 연구의 초기에 암세포가 혐기성 호흡을 하는 조직으로서 이해되기도 한 것과는 달리, 암세포의 성장에는 산소와 영양소 공급이 절대적이라는 것을 보여주는 것이다.
1993년 독일 과학자들은 혈관신생의 유도를 저해하는 화학물질을 콩에서 분리하였다고 발표하였다[T. Fotsis, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 2690]. 이 물질은 제니스테인(genistein)이라고 명명되었는데, 작은 악성종양이 크게 자라는 것을 억제할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 일본인의 경우 콩을 많이 섭취하므로 전립선암을 갖는 빈도가 서구인에 비해 매우 낮다. 그러나 일본인이 서구로 이민간 후 단 몇 년 동안이라도 콩을 많이 먹지 않으면 전립선암을 갖는 빈도가 급격히 증가한다고 보고 되고 있다[F. M. Uckun, et al., Science, 1995 267: 886]. 그리고, 1995년 미국 미네소타 대학의 Faith M. Uckun 박사 팀은 단일클론 항체에 제니스테인을 가교 결합시킨 약을 인간 BCP 백혈병 세포(leukemia cell)를 이식한 쥐에 투여한 결과 놀랍게도 인간 BCP 백혈병 세포가 99.999% 소멸되었음을 보고하였다[F. M. Uckun, et al., Science, 1995, 267: 886].
따라서, 새로운 혈관신생을 억제하는 물질(angiogenesis inhibitor)의 발견은 암의 성장 기전을 밝히는 단서가 되고, 암의 조기진단 및 예방, 치료에 응용될 수 있을 뿐만 아니라 혈관신생과정과 관련된 질병인 당뇨병성 망막증, 류마티스성 관절염, 만성염증, 혈관종 등의 질병 치료에도 광범위하게 사용될 수 있다. 이런 이유로 인해 그동안 학계 및 산업계는 이것에 대해 계속적으로 관심을 두고 연구 및 개발에 노력을 하고 있는 실정이다[W. Auerbach, et al., Pharmac. Ther., 1994, 61: 265].
본 발명의 목적은 암전이 억제 및 신생혈관 생성 억제 활성을 갖는 새로운 화합물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 디아릴이소옥사졸계 화합물을 유효성분으로 함유하는 암세포 이동 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 디아릴이소옥사졸계 화합물을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 억제제를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암세포 이동 억제제를 제공한다.
(상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로, 히드록시기, C1∼C10 알킬기, C1∼C10 알콕시기, 1 내지 3개의 치환기를 갖는 페닐기로 치환된 C1∼C5 알킬기, 1 내지 3개의 치환기를 갖는 페닐기로 치환된 C1∼C5 알콕시기 또는 할로겐 원소이며,
R3는 히드록시기, C1∼C10 알킬기, C1∼C10 알콕시기, 1 내지 3개의 치환기를 갖는 페닐기로 치환된 C1∼C5 알킬기, 1 내지 3개의 치환기를 갖는 페닐기로 치환된 C1∼C5 알콕시기이다.)
상기 화학식 1의 화합물은
(1) 5-(5-에틸-2-히드록시-4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸,
(2) 5-(2,4-디메톡시-5-에틸페닐)-4-(4-브로모페닐)이소옥사졸,
(3) 5-(2,4-디메톡시-5-에틸페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸,
(4) 5-(2-벤질옥시-5-에틸-4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸,
(5) 5-(5-에틸-2-히드록시-4-메톡시페닐)-4-(4-히드록시페닐)이소옥사졸 또 는
(6) 5-(2,4-디히드록시-5-에틸페닐)-4-(4-히드록시페닐)이소옥사졸이 바람직하다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 암세포 억제활성을 갖는다. 첨부된 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물 중 하나인 5-(5-에틸-2-히드록시-4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸(1)은 50 nM 농도에서 유방암세포(MDA-MB-231)의 이동을 50 % 억제하여 우수한 세포이동 저해활성을 가짐을 알 수 있다. 이러한 암세포 억제활성으로 인해 본 발명의 화합물은 암세포 이동 억제하는 항암제로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 억제제를 제공한다.
본 발명의 화합물은 상기 기술된 바와 같이, 암세포 이동 억제활성을 갖는 동시에 신생혈관형성 억제활성을 갖는다. 첨부된 도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 100 nM 농도에서 혈관내피세포(HUVECs)의 튜브형성을 저해함을 알 수 있다. 또한, 도 4에서 보는 바와 같이, 5-(5-에틸-2-히드록시-4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸(1)은 500 nM 농도에서 제브라피쉬(zebrafish)의 신생혈관 형성을 50 % 저해함을 알 수 있다. 이러한 활성으로 인해 본 발명의 화합물은 신생혈관 형성 억제제로 사용할 수 있으며, 구체적으로 신생혈관형성으로부터 야기되는 질병인 암, 류마티스성 관절염, 건선 또는 안구의 신생혈관생성 질 환의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸 무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 100∼1000 ㎎/일이며, 바람직하게는 100∼500 ㎎/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 5-(5-에틸-2-히드록시-4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸{5-(5-ethyl-2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4-(4-methoxyphenyl) isoxazole}의 제조
하기 반응식 1과 같은 방법으로 상기 화합물을 제조하였다.
구체적으로, 14.5ml (0.18mol)의 건조 디메틸포름알데히드를 10oC의 수욕에 장치하고 4.43ml (0.078mol)의 POCl3를 천천히 떨어뜨린 후 30분간 교반시켰다. 여기에 3.0g (0.022mol)의 4-에틸레조시놀을 14.5ml (0.18mol)의 디메틸포름알데히드에 희석하여 천천히 부가하고 수욕을 제거한 다음 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 0oC의 수욕을 장치하고 2M 수산화나트륨 수용액을 가하여 반응을 종결시켰다. 반응용액을 에틸아세테이트로 희석시킨 다음 2M 수산화나트륨수용액으로 2회 추출한 후, 수용액을 3N 염산를 사용하여 중화 시키고 에틸아세테이트로 4회 추출한 다음 소금물로 세척하였다. 유기용액을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨후 여과하여 농축하였다. 이 농축액을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(헥산/에틸아세테이트 7:1)로 정제하여 62%(2.5g)의 수율로 2을 얻었다.
2.55g (0.015mol)의 2과 4.24g (0.03mol)의 탄산칼륨을 디메틸포름알데히드 (25ml)에 녹인후 여기에 2.28g (0.016mol)의 메틸요오드을 가하고 상온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응액의 무기염을 필터하여 제거하고 200ml의 물를 넣고 에틸아세테이트로 3회 추출한 다음 소금물로 세척하였다. 유기용액을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여 농축하였다. 이 농축액을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(헥산/에틸아세테이트 20:1)로 정제하여 54%(1.6g)의 수율로 3을 얻었다.
2.1g (0.012mol)의 3과 4.8g (0.035mol)의 탄산칼륨을 디메틸포름알데히드 (20ml)에 녹인후 여기에 2.88g (0.016mol)의 벤질브로마이드를 가하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응액의 무기염을 필터하여 제거하고 200ml의 물을 넣고 에틸아세테이트로 3회 추출한 다음 소금물로 세척하였다. 유기용액을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨후 여과하여 농축하였다. 이 농축액을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(헥산/에틸아세테이트 5:1)로 정제하여 94%(3.0g)의 수율로 4을 얻었다.
0.75g (0.031mol)의 마그네슘에 5ml의 테트라하이드로퓨란을 넣고 0.6g (3.8mmol)의 4-메톡시벤질클로라이드를 천천히 가한 후 여기에 다시 1.0g (6.4mmol)의 4-메톡시벤질클로라이드을 10ml의 테트라하이드로퓨란에 묽힌 후 천천히 부가하였다. 이 반응액을 한시간 동안 가열환류 시키고 0oC의 수욕을 장치하여 식힌 다음 주사기를 사용하여 잿빛용액만 뽑아서 그린야드시약으로 사용하였다. 0.92g (3.4mmol)의 4을 15ml의 테트라하이드로퓨란에 녹여서 0oC의 수욕에 장치하고 위에서 만든 그린야드시약을 천천히 부가 한다음 수욕을 제거하고 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응액에 포화염화암모늄 용액을 넣고 에틸아세테이트로 3회 추출한 다음 소금물로 세척하였다. 유기용액을 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 후 여과하여 농축하였다. 이 농축액을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(헥산/에틸아세테이트 7:1)로 정제하여 97.4%(1.3g)의 수율로 5을 얻었다.
1.3g (3.3mmol)의 5, 0.57g (4.9mmol)의 4-methylmorpholine N-oxide, 1.64g의 무수 파우더로 된 4Å molecular sieves을 6.54ml의 디클로로메탄(CH2Cl2)에 녹인후 57mg의 테트라프로필암모늄 퍼루테네이트(tetrapropylammonium perruthenate)을 가한 다음 30분간 교반시켰다. 짧은 실리카 겔 패드(pad)를 만들어 반응물을 에틸아세테이트로 씻어주면서 여과시켜 농축하여 93.1%(1.2g)의 수율로 6 을 얻었 다.
1.2g (3.0mmol)의 6을 톨루엔에 녹인 후 5.3ml (40mmol)의 디메틸포름알데히드 디메틸아세탈을 천천히 가하고 16시간동안 135 oC에서 가열환류 시켰다. 반응액을 식히고 농축하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피로 정제하여 70%(0.94g)의 수율로 7을 얻었다.
0.94g(2.1mmol)의 7을 메탄올 (35ml)과 물 (11ml)에 녹인후 70.5mg (1.2mmol)의 탄산나트륨과 1.6g (2.3mmol)의 NH2OH.HCl 을 가한후 교반시켰다. 여기에 아세트산으로 pH 4-5으로 만든다음 2시간동안 가열환류 시켰다. 반응액을 식힌후 포화 수산화암모늄수용액으로 pH 8으로 조절하고 디클로로메탄으로 4회 추출하여 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 여과하여 농축하였다. 이 농축액을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피로 정제하여 90.5%(0.8g)의 수율로 8 을 얻었다.
0.8g (1.9mmol)의 8을 에틸아세테이트 (10ml)에 녹인후 여기에 40mg의 10% Palladium/C를 넣고 50 psi 압력의 수소 존재하에 14시간동안 반응시켰다. 짧은 실리카 겔 pad를 만들어 에틸아세테이트로 씻어주면서 반응물을 여과하고 농축하여 92%(0.57g)의 수율로 최종화합물 9를 얻었다.
녹는점 149-150 oC
1H NMR (CDCl3) δ8.35 (s, 1H), 7.28 (dd, J = 6.9, 2.4 Hz, 2H), 7.06 (s, 1H), 6.88 (dd, J = 6.9, 2.4 Hz, 2H), 6.48 (s, 1H), 3.80 (s, 6H), 2.42 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3H) ppm.
13C NMR (CDCl3) δ162.3, 160.3, 159.4, 153.6, 151.5, 129.3, 128.5, 125.2, 121.6, 115.2, 114.4, 105.3, 99.6, 55.3, 55.2, 22.0, 13.7 ppm.
<실시예 2> 5-(2,4-디메톡시-5-에틸페닐)-4-(4-브로모페닐)이소옥사졸{5-(2,4-dimethoxy-5-ethylphenyl)-4-(4-Bromophenyl) isoxazole}의 제조
상기 실시예 1에서와 동일한 방법에 4-메톡시벤질클로라이드 대신 4-브로모벤질클로라이드를 가하여 표제화합물을 얻었다.
녹는점 102-103 oC,
질량분석으로 분자량이 373이고 M+2가 375임을 확인하였다.
<실시예 3> 5-(2,4-디메톡시-5-에틸페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸{5-(2,4-dimethoxy-5-ethylphenyl)-4-(4-methoxyphenyl)isoxazole}의 제조
상기 실시예 1에서와 동일한 방법에 4-에틸레조시놀 대신 3,4-디메톡시에틸벤젠을 가하여 표제화합물을 얻었다.
녹는점 72-73 oC
1H NMR (CDCl3) δ8.42 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.20 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.43 (s, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.51 (s, 3H), 2.56 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.15 (t, J = 7.2 Hz, 3H) ppm.
13C NMR (CDCl3) δ162.3, 159.9, 158.6, 156.3, 150.5, 130.6, 128.2, 124.9, 123.4, 116.3, 113.7, 109.6, 95.2, 55.4, 55.3, 55.1, 22.2, 14.0 ppm.
<실시예 4> 5-(2-벤질옥시-5-에틸-4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸{5-(2-benzyloxy-5-ethyl-4-methoxyphenyl)-4-(4-methoxyphenyl)isoxazole}의 제조
상기 실시예 1에서와 동일한 방법에 4-에틸레조시놀 대신 3-메톡시-4-벤질옥시에틸벤젠을 가하여 표제화합물을 얻었다.
녹는점 99-100 oC
1H NMR (CDCl3) δ8.42 (s, 1H), 7.25-7.00 (m, 8H), 6.78 (dd, J = 6.9, 2.4 Hz, 2H), 6.48 (s, 1H), 4.84 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 2.56 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.14 (t, J = 7.2 Hz, 3H) ppm.
13C NMR (CDCl3) δ162.3, 159.7, 158.7, 155.5, 150.5, 136.5, 130.8, 128.2, 127.6, 127.0, 125.3, 123.3, 116.6, 113.8, 109.3, 97.0, 70.7, 55.3, 55.2, 22.3, 14.0 ppm.
<실시예 5> 5-(5-에틸-2-히드록시-4-메톡시페닐)-4-(히드록시페닐)이소옥사졸{5-(5-ethyl-2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4-(4-hydroxyphenyl) isoxazole}의 제조
상기 실시예 1에서와 동일한 방법에 4-메톡시벤질클로라이드 대신 4-벤질옥시벤질클로라이드를 가하여 표제화합물을 얻었다.
녹는점 146-147 oC
1H NMR (CD3OD) δ8.57 (s, 1H), 7.17 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 2H), 6.97 (s, 1H), 6.70 (dd, J = 6.6, 2.4 Hz, 2H), 6.48 (s, 1H), 4.86 (brs, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.48 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.06 (t, J = 7.2 Hz, 3H) ppm.
13C NMR (CD3OD) δ161.3, 157.9, 156.2, 151.5, 131.3, 129.5, 125.2, 122.8, 118.1, 116.3, 108.0, 100.0, 55.7, 23.3, 14.7 ppm.
<실시예 6> 5-(2,4-디히드록시-5-에틸페닐)-4-(4-히드록시페닐)이소옥사졸{5-(2,4-dihydroxy-5-ethylphenyl)-4-(4-hydroxyphenyl)isoxazole}의 제조
상기 실시예 1에서와 동일한 방법에 4-에틸레조시놀 대신 3,4-디벤질옥시에틸벤젠, 그리고 4-메톡시벤질클로라이드 대신 4-벤질옥시벤질클로라이드를 가하여 표제화합물을 얻었다.
녹는점 85-86 oC
1H NMR (CD3OD) δ8.56 (s, 1H), 7.18 (dd, J = 8.4 Hz, 2H), 6.92 (s, 1H), 6.71 (dd, J = 8.4 Hz, 2H), 6.39 (s, 1H), 2.48 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.08 (t, J = 7.2 Hz, 3H) ppm.
13C NMR (CD3OD) δ164.4, 159.2, 157.8, 155.8, 151.4, 131.7, 129.5, 123.9, 122.9, 117.8, 116.3, 107.6, 103.8, 23.3, 14.7 ppm.
<제제예 1> 캡슐제의 제조방법
실시예 1의 화합물 5 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.
상기 분말 및 캡슐제의 구성성분은 다음과 같다.
실시예 1의 화합물 ················· 5.0 ㎎
락토오스 ······················14.8 ㎎
폴리비닐 피롤리돈··················10.0 ㎎
마그네슘 스테아레이트 ··············· 0.2 ㎎
<제제예 2> 주사액제의 제조방법
실시예 1의 화합물 10 ㎎, 만니톨 180 ㎎, Na2HPO4·12H2O 26 ㎎ 및 증류수 2974 ㎎을 함유시켜 주사제를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.
실시예 1의 화합물 ················· 100 ㎎
만니톨 ······················· 180 ㎎
Na2HPO4·12H2O ····················26 ㎎
증류수 ······················ 0.2 ㎎
<실험예 1> 세포이동 분석법
세포이동 분석을 위하여, Modified Boyden chamber와 8 ㎛ pore 크기의 membrane은 Neuro probe사에서 구입했으며, 세포 염색에 필요한 염색 용액인 Giemsa solution은 Sigma사에서 구입하였다. 필요한 실험기자재는 세포배양에 필요한 CO2 항온기(incubator), 세포를 씻어 주기위해 원심분리기 및 결과의 관찰을 위해 도립현미경(TE 300,Nikon, Japan)을 사용하였다.
구체적으로, 세포는 배양접시에 90% 정도 성장한 세포를 트립신/EDTA로 떼어 냈으며, soybean 트립신 억제제를 처리하고, serum free 배지로 3번 정도 씻은 후 4 ×105 cells/㎖ 이 되게 세포를 준비하였다. Modified Boyden chamber의 아랫부분에는 상기 실시예 1∼6의 화합물과 10% FBS가 든 배지를 각각 30 ㎕씩 chamber well에 넣고 8 ㎛ pore 크기의 membrane을 올려놓았다. 그 위에 실리콘 개스킷(silicon gasket)을 올리고 개스킷위로 top plate를 놓고 너트로 꽉 조였다. 그 다음 준비된 세포를 top plate의 well에 50 ㎕씩 넣었다. chamber를 랩으로 싸서 37℃, 5% CO2 배양기에서 18시간 동안 배양하였다.
18시간 후에 너트를 제거하고 membrane을 분리하여 메탄올에 10분 동안 고정시킨 후 공기 중에 말렸다. membrane을 말린 뒤 염색시약인 Giemsa 용액에 90분 동안 염색시켰다. 이때 염색시약은 증류수와 1:10 비율로 희석 시킨 것을 사용하였다. 염색 후 세포를 씻어 주기위해 증류수에 10초 정도 담가 두었다. membrane을 세포가 이동하지 않은 쪽을 위쪽으로 향하게 해서 커버슬립(cover slip)위에 올려놓고 면봉으로 잘 닦아내었다. 커버슬립 가장자리에 매니큐어를 조금 바르고 슬라이드 글라스위에 덮어 잘 고정시켰다. 이렇게 준비된 샘플을 도립현미경을 이용하여 이동한 세포 수를 관찰하였다.
상기의 방법으로 상기 실시예 1∼6의 화합물에 의한 암세포 및 평활근 세포이동 억제를 관찰측정하였으며, 하기 수학식 1에 의하여 세포이동 저해도를 계산하였다.
상기 식에서 대조시료에는 화합물을 첨가하지 않고 1% 디메틸 설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO)만 첨가하여 관찰하였다.
결과는 도 1 및 표 1에 나타내었다.
| 화합물 | 1 uM | 10 uM |
| 실시예 1 | 92.30% | 94.50% |
| 실시예 2 | 90.80% | 94.80% |
| 실시예 3 | 68.40% | 82.50% |
| 실시예 4 | 54.60% | 70.10% |
| 실시예 5 | 43.50% | 43.30% |
| 실시예 6 | 79.50% | 79.40% |
도 1은 실시예 1의 화합물의 농도에 따른 유방암 세포주(MDA-MB-231)의 이동억제를 나타낸 그래프이로서, 도 1에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 화합물의 농도가 증가함에 따라 유방암 세포주의 이동억제 효과가 우수함을 알 수 있으며, 특히, 50 nM 농도에서 유방암세포의 이동을 50% 억제함을 관찰하여 우수한 세포이동 저해활성을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 상기 표 1은 실시예 1∼6의 화합물을 1 μM 및 10 μM로 각각 사용하였을 경우 유방암 세포주의 이동억제 효과를 나타낸 것으로서, 표 1에서 보는 바와 같이, 실시예 1 뿐만 아니라 그 외 화합물에 대한 유방암 세포주의 이동억제 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
<실험예 2> In vitro endothelial morphogenesis 분석법을 이용한 신생혈관형성 저해 활성 측정
본 발명의 화합물의 신생혈관 형성 저해를 인간유래 세포주인 HUVECs으로 in vitro endothelial morphogenesis 분석법을 사용해서 in vivo와 유사하게 관찰하였다.
실험을 위해 24-well 세포배양 플레이트(cell culture plate)와 매트리젤 매 트릭스(matrigel matrix)는 BD biosciences사에서 구입하였다. 필요한 기자재로는 세포를 배양하기위한 CO2 배양기와 결과의 관찰 및 확인을 위해서 디지털 카메라가 장착된 도립현미경(TE 300,Nikon, Japan)을 사용하였다.
구체적으로, HUVECs를 serum free 배지를 사용하여 하룻밤동안 starvation시킨 것을 준비하였다. 24-well 세포배양 플레이트 각 well당 0.2 ㎖의 매트리젤 매트릭스로 코팅을 시키고 1시간 동안 37℃ 배양기에서 배양했다. well당 준비된 20000개의 세포 0.2 ㎖을 넣어주고 30분 동안 CO2 배양기에서 배양시켰다. 그 후 실시예 1∼6의 화합물을 농도별로 희석한 신선한 배지를 각 well에 넣어주고, 1% serum을 첨가하여 24시간 동안 배양했다. 이때 HUVECs는 튜브모양(Tube formation)을 형성하는데 튜브형성의 저해정도를 도립현미경을 이용하여 관찰하였다. 결과는 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 2는 실시예 1의 화합물의 농도에 따른 혈관내피세포에 의한 혈관형성 억제를 나타낸 그림이며, 도 3은 실시예 1∼6의 화합물 1 μM의 농도에서 혈관내피세포의 혈관형성 억제를 나타낸 그림이다.
도 2에서 보는 바와 같이, 실시예 1의 화합물에 의해 혈관내피세포의 튜브모양 형성이 저해됨을 알 수 있다. 구체적으로, 0.01 μM 농도에서 이미 혈관내피세포의 튜브모양 형성이 저해됨을 알 수 있으며, 농도를 증가시킬수록 튜브모양의 형성은 깨어져 물방울 모양으로 그 형태가 보여짐을 알 수 있다.
또한, 도 3에서 보는 바와 같이, 상기 실시예 1의 화합물에서 뿐만 아니라 실시예 2∼6의 화합물도 관내피세포의 튜브모양 형성이 저해함을 확인할 수 있다.
<실험예 3> Zebrafish를 이용한 신생혈관형성 저해 활성 측정
상기 실시예 1의 화합물의 신생혈관 형성 저해를 제브라피쉬(zebrafish)를 이용하여 관찰하였다.
필요한 실험 기자재로는 배아를 부화시키기 위해 온도를 일정하게 유지시킬 수 있는 항온기(incubator)와 결과의 관찰 및 확인을 위해서 필요한 디지털카메라가 장착된 도립현미경(TE 300,Nikon, Japan)을 사용하였다.
Zebrafish 배아(embryo)를 96-well plate의 각 well 당 3개체씩 준비하고 발생과정이 하루째 인지를 확인하였다(Synchronized embryo). 0.1% DMSO에 녹아 있는 각 화합물을 농도별로 구분하여 처리하며, 4 well당 한 화합물을 처리함으로써 12 배아를 대상으로 Subintestinal vessels(SIVs)의 억제 여부를 관찰하였다. 8 well은 0.1% DMSO(in embryo water: 0.2 g/ℓinstant ocean salt)로 처리/분석하여 대조군으로 확인 하였다(Randall T. Peterson, et al.. Proc. Natl. Aced. Sci. USA, 2000, 97: 12965).
Angiogenic vessels 즉, SIVs의 관찰을 위한 면역학적 방법은 Catherine E. Willet 등(Catherine E. Willet, et al..
Angiogenesis,
1999, 3: 353)의 방법을 사용하였는데 발생 3일후 배아는 4% paraformaldehyde에 2시간 동안 실온에서 고정을 시켰다. Phosphate buffered saline(PBS)으로 2번 세척을 하고 PBS, 25, 50, 75및 100% 메탄올 단계로 탈수를 시킨 후 다시 100, 75, 50, 25% 메탄올 및 PBS 단계로 다시 수화(rehydrate)시켰다. 염색을 위해서 배아는 NTMT 완충용액(0.1 M Tris-HCl pH 9.5; 50 mM MgCl; 0.1 M NaCl; 0.1% Tween 20)으로 실온에서 45분간 안정화시켰다. NTMT 완충용액에 안정화된 배아에 75 mg/㎖ NBT 4.5 ㎕ 및 50 mg/㎖ X-phosphate 3.5 ㎕를 첨가하였다. 10∼20분간 염색 후 PBST(PBS; 0.5% Tween 20)를 첨가하여 염색반응을 중지 시켰다. 멜라닌(melanin)색소를 제거하여 혈관 관찰을 용이하게 하기위하여 PBS에 5% formamide와 10% 과산화수소(H2O2)를 첨가한 용액을 처리 하였다. 배아 신생혈관 형성(SIVs)은 도립현미경을 이용하여 관찰하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4의 화살표로 표시된 부분을 대조군과 비교함과 같이, 본 발명의 실시예 1의 화합물은 0.5 μM 농도에서 제브라피쉬의 신생혈관 형성을 저해하여 우수한 신생혈관 저해 활성을 가지는 것을 확인하였다.
<실험예 4> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험
6주령의 특정병원체부재 (specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2마리씩이 동물에 본 발명의 화합물 1을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 시행하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐 사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 본 발명의 실시예 1은 렛트에서는 1000 mg/kg 까지도 독성변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소치사량 (LD50)은 렛트에서는 1500 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 디아릴이소옥사졸계 화합물은 유방암 세포주의 이동을 억제하며, 신생혈관형성을 억제함으로써, 암전이 억제제로서 사용할 수 있으며, 또한 신생혈관형성으로부터 야기되는 질병인 암, 류마티스성 관절염, 건선 또는 안구의 신생혈관생성 질환의 예방 및 치료용으로 유용하게 사용할 수 있다.
Claims (6)
- 하기 화학식 1로 표시되는 디아릴이소옥사졸계 화합물.<화학식 1>
(상기 식에서,R1 및 R2는 각각 독립적으로, 히드록시기, C1∼C10 알콕시기, 1 내지 3개의 치환기를 갖는 페닐기로 치환된 C1∼C5 알콕시기 또는 할로겐 원소이며,R3는 히드록시기, C1∼C10 알콕시기, 1 내지 3개의 치환기를 갖는 페닐기로 치환된 C1∼C5 알콕시기이다.) - 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은(1) 5-(5-에틸-2-히드록시-4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸,(2) 5-(2,4-디메톡시-5-에틸페닐)-4-(4-브로모페닐)이소옥사졸,(3) 5-(2,4-디메톡시-5-에틸페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸,(4) 5-(2-벤질옥시-5-에틸-4-메톡시페닐)-4-(4-메톡시페닐)이소옥사졸,(5) 5-(5-에틸-2-히드록시-4-메톡시페닐)-4-(4-히드록시페닐)이소옥사졸, 및(6) 5-(2,4-디히드록시-5-에틸페닐)-4-(4-히드록시페닐)이소옥사졸로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 디아릴이소옥사졸계 화합물.
- 제 1항의 디아릴이소옥사졸계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제.
- 삭제
- 제 1항의 디아릴이소옥사졸계 화합물을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 억제제.
- 제 5항에 있어서, 상기 신생혈관형성 억제제가 신생혈관 형성으로부터 야기되는 질병인 암, 류마티스성 관절염, 건선 또는 안구의 신생혈관생성 질환의 예방 및 치료용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 신생혈관형성 억제제.
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