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KR100514071B1 - 테트라하이드로퓨란 유도체 - Google Patents

테트라하이드로퓨란 유도체 Download PDF

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KR100514071B1
KR100514071B1 KR10-1999-7006716A KR19997006716A KR100514071B1 KR 100514071 B1 KR100514071 B1 KR 100514071B1 KR 19997006716 A KR19997006716 A KR 19997006716A KR 100514071 B1 KR100514071 B1 KR 100514071B1
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KR
South Korea
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dihydroxytetrahydro
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glucaric
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사가와히로아키
오쿠다신지
무라키노부코
고야마노부토
이카이가츠시게
가토이쿠노신
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다카라 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

화학식 1에 의해 표현되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염.
화학식 1

Description

테트라하이드로퓨란 유도체{TETRAHYDROFURAN DERIVATIVES}
본 발명은 항암 작용과 같은 생리학적 활성을 지닌 약제로서 유용한 신규한 테트라하이드로퓨란에 관한 것이고 또한 이러한 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
임상 요법에 사용되어 온 약학물질에는 항암제, 항생 물질, 면역강화제, 면역조정제 등 (예를 들면, 알킬화제, 항대사물질 및 식물 알칼로이드)이 포함되지만, 이러한 약물 요법이 이미 완전히 확립되었다고는 말할 수 없다.
본 발명의 목적은 항암 작용과 같은 생리학적 작용을 갖는 매우 안전한 신규 화합물을 개발하고, 이러한 화합물, 이러한 화합물을 함유하는 약제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기와 같이 요약될 것이다. 따라서, 본 발명의 제 1 특성은 화학식 1에 의해 표현되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염에 관한 것이다.
본 발명의 제 2 특성은 하기의 (a) 및 (b) 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물이 열-처리되는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 화학식 1에 의해 표현되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염의 제조방법에 관한 것이다.
(a) 글루카르산 또는 글루카르산 유도체,
(b) 글루카르산 및/또는 글루카르산 유도체를 함유하는 화합물.
본 발명의 제 3 특성은 유효 성분으로서 화학식 1에 의해 표현되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염을 함유하는 약제에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 특성의 바람직한 양태에서, 약제는 항암제이다.
도 1은 산성 조건 하에 생성된 사카르산의 열-처리 산물의 아폽토시스-유도 작용을 도시한다.
도 2는 D-사카르산의 열-처리 산물의 아폽토시스-유도 작용을 도시한다.
도 3은 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산의 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산의 자외선 흡수 스펙트럼을 도시한다.
도 5는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산의 1H-NMR 스펙트럼을 도시한다.
도 6은 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산의 13C-NMR 스펙트럼을 도시한다.
본 발명은 이하에서 상세하게 설명될 것이다.
글루카르산은 종종 C6H10O8 (분자량: 210.14)의 분자식을 갖는 사카르산으로 불리고 D-글루코스 또는 이를 함유하는 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드의 질산 등으로의 산화에 의해서 수득되거나 D-글루큐론산의 브롬수로의 산화에 의해서 수득되는 디카복실산이다. 이것은 또한 마그네슘 염으로서 고무 나무 (피쿠스 엘라스티카 (Ficus elastica))의 라텍스로부터 추출될 수 있다. 글루카르산 유도체의 예는 글루카르산 모노락톤, 글루카르산 디락톤, 글루카르산 에스테르, 글루카르산 아미드 및 염이고 열 처리에 의해 화학식 1로 표현되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산을 생성하는 모든 물질이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산은 2- 및 5- 위치에 비대칭 탄소 원자를 갖고, 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산은 4가지 이성체 모두, 즉, (2S,5S) 화합물, (2S,5R) 화합물, (2R,5S) 화합물 및 (2R,5R) 화합물을 포함한다. 글루카르산 락톤의 예는 1,4-모노락톤, 3,6-모노락톤 및 1,4-3,6-디락톤이고 이러한 락톤이 사용될 수 있다.
글루카르산 에스테르의 예는 메틸 에스테르와 에틸 에스테르이고 에스테르는 글루카르산으로부터 제조될 수 있다. 아미드화에 의해 아미드 화합물을 제조함이 가능하고 이러한 아미드 화합물이 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
글루카르산을 함유하는 화합물은 예를 들면 다당류 산화시 중간체로서 수득될 수 있다. 글루카르산 유도체를 함유하는 화합물, 예를 들면, 글루카르산 락톤, 글루카르산 에스테르 및 글루카르산 아미드를 함유하는 것이 또한 각각 제조될 수 있다.
본 발명에서, 화학식 1로 표현되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산이 열-처리 산물에 생성되는 한 글루카르산 또는 글루카르산 유도체, 글루카르산 및/또는 글루카르산 유도체를 함유하는 화합물에는 특별한 제한은 없다.
본 발명의 열 처리 방법에 관하여, 글루카르산 또는 글루카르산 유도체, 글루카르산 및/또는 글루카르산 유도체를 함유하는 화합물 중에서 선택된 화합물을 실온 내지 400 ℃에서 수 초 내지 수 일 또는 바람직하게는 50 내지 200 ℃에서 수 초 내지 24 시간 동안 중성 내지 산성 조건 하에 가열하는 방법이 있다. 이러한 방법에 의해서, 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산을 함유하는 열-처리 산물이 수득될 수 있다.
농도가 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산이 생성될 수 있는 범위 내에 있는 한 열 처리시 pH 및 물질의 농도에 특별한 제한은 없고 작업성, 수율 등을 고려하여 세팅할 수 있다.
본 발명의 열 처리는 습식 가열 또는 건식 가열일 수 있지만 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산의 생산 효율의 관점에서 습식 가열이 바람직하 다. 습식 가열의 경우에, 증기로의 가열, 고압하 증기로의 가열, 고압하 가열 등과 같은 습식 가열 방법이 사용될 수 있고, 반면에 건식 가열의 경우에, 건조한 고온 공기를 사용하는 직접 가열과 구획을 통한 열원으로부터의 간접 가열과 같은 건식 가열 방법이 사용될 수 있다. 직접 가열의 예는 공기 스트림에 의한 건조 가열과 분무에 의한 건식 가열이고 반면에 간접 가열의 예는 드럼 등에 의한 건식 가열이다.
열-처리 산물에서, 아폽토시스 유도 작용, 암세포 생장의 억제 작용, 항균 작용 등을 나타내는 물질이 형성되고 목적에 따라 pH, 시간, 온도 및 물질 농도와 같은 열 처리 조건을 변경시킴으로써 원하는 물질을 함유하고 아폽토시스 유도 작용, 암세포 생장의 억제 작용, 항균 작용 등을 갖는 열-처리 산물을 제조함이 가능하다.
본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염은 암 세포 생장에 대한 강한 억제 작용을 갖는다. 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산 또는 이의 광학 활성 물질은 이러한 작용을 지표로 이용하여 열-처리 산물로부터 정제되거나 분리될 수 있다. 정제 및 분리 수단에 관하여, 화학적 방법 및 물리적 방법과 같은 공지된 정제 수단이 사용될 수 있다. 따라서, 이미 공지되어 있는 정제방법, 예를 들면, 겔 여과, 분자량 분획화 막을 사용하는 분획화, 용매로의 추출, 분별 증류, 이온 교환 수지 등을 사용하는 다양한 크로마토그래피법이 병행하여 사용될 수 있고, 이로 인해 반응 산물 중의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산 또는 이의 광학 활성 물질이 정제되고 분리될 수 있다.
예를 들면, 글루카르산을 121 ℃에서 4 시간 동안 반응시켜 제조할 경우, 화학식 1에 의해 표현되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산 또는 광학 활성 물질이 반응 용액에서 생성되고, 이러한 유도체를 함유하는 반응 산물의 역상 컬럼 크로마토그래피의 결과로서, 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산 또는 이의 광학 활성 성분이 정제되고 분리될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 α-케토글루타레이트 세미알데히드의 수화 반응에 의해서 수득될 수 있다. α-케토글루타레이트 세미알데히드는 공지된 방법에 의해서 수득될 수 있다 [참조문헌: Journal of Bacteriology, 116, 1346-1354 (1973)].
분리된 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산을 광학 분할할 경우, (-)-2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산과 (+)-2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산이 수득될 수 있다.
광학 활성 물질의 분리는 라세미 혼합물을 기계적 분할, 우선 결정, 부분입체 이성질체 염으로서 또는 포접 화합물로서 결정에 의한 분할, 효소 또는 미생물을 사용하는 동력학적 분할, 크로마토그래피에 의한 분할 등에 투입함으로써 수행될 수 있다.
기체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 등이 크로마토그래피에 의한 분리의 경우에 사용될 수 있고 이들 각각에 적합한 키랄 고정상이 사용될 수 있다.
키랄 고정상을 사용하는 방법, 키랄 용출물을 사용하는 방법, 부분입체 이성질체로서 분리 등이 액체 크로마토그래피에 의한 광학 분할에 사용될 수 있다.
아미드 유형의 고정상, 우레아 유형의 고정상, 리간드 교환형의 고정상, 다당류-다당류 유도체 고정상, 단백질 고정상, 폴리메타크릴산 에스테르 고정상, 폴리메타크릴아미드 고정상 등이 키랄 고정상으로서 사용될 수 있다.
용출액에 관하여, 헥산형, 알콜형, 수성(완충제)형 용출액이 상술된 고정상과 배합하여 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산의 염 또는 이의 광학 활성 물질의 염에 관하여, 약제로서 허용되는 염에는 예를 들면, 알칼리 금속의 염, 알칼리 토금속의 염, 유기 염기를 갖는 염이 예시되고 이들은 공지된 방법에 의해서 전환시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염은 암세포의 생장에 대한 억제 작용, 아폽토시스-유도 작용, 항균 작용 등과 같은 약리 작용을 지닌다. 예를 들면, 암, 감염성 질환 등의 치료 또는 예방을 위한 약제는 유효 성분으로서 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염 중에서 선택되는 화합물을 사용함으로써 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 활성 물질 또는 이들의 염은 암세포, 예를 들면, 인간 전골수성 백혈병 세포 HL-60, 인간 급성 임파아구성 백혈병 세포 MOLT-3, 폐암 세포 A-549, SV40-형질전환 폐암 세포 WI-38VA13, 간암 세포 Hep G2, 결장암 세포 HCT 116, 인간 결장암 세포 SW 480, 인간 결장 암 세포 WiDr, 위암 세포 AGS 및 골수종 세포의 생장에 대한 억제 작용을 지닌다. 예를 들면, 항암제는 유효 성분으로서 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염 중에서 선택된 화합물을 사용함으로써 제조될 수 있다.
항암제, 아폽토시스-유도제, 항균제 등과 같은 약제는 유효 성분으로서 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염 중에서 선택된 화합물을 사용할 경우 제조될 수 있고 공지된 약학적 담체와 배합함으로써 약제로 제조된다. 일반적으로, 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염이 약학적으로 허용되는 액체 또는 고체 담체와 배합되고, 필요한 경우, 용매, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 충진제, 결합제, 붕해제, 윤활제 등이 여기에 첨가되어 고체, 예를 들면, 정제, 과립, 희석 분말, 분말, 캡슐 등 또는 액체, 예를 들면, 용액, 현탁액, 에멀션 등일 수 있는 항암제와 같은 제제를 생성한다. 또한, 이것은 사용전 적합한 담체를 첨가함으로써 액체로 제조될 수 있는 건조물일 수 있다.
약학적 담체는 상기의 투여 양식 및 제제의 형태에 따라 선택될 수 있다. 경구제의 경우에, 전분, 락토스, 당, 만니톨, 카복시메틸 셀룰로스, 옥수수 전분, 무기염 등이 사용될 수 있다. 경구제의 제조시, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 유동성 촉진제, 미각-교정제, 착색제, 풍미제 등이 추가로 이들과 배합될 수 있다.
한편, 비경구제의 경우, 이들은 본 발명의 유효 성분인 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염이 희석제, 예를 들면, 주사용 증류수, 생리 식염수 용액, 글루코스 수용액, 주사용 식물성 오일, 호마유, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등에 용해되거나 현탁된 다음, 필요한 경우, 살균제, 안정제, 등장제, 진통제 등이 이에 첨가된다.
본 발명의 항암제는 제제의 형태에 따라 적절한 경로로 투여된다. 투여 방법에는 특별한 제한이 없고 경구용, 외용 및 주사에 의해서 투여될 수 있다. 주사제는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경피, 피내 등으로 투여될 수 있고, 반면에 외용제에는 좌제 등이 포함된다.
항암제로서의 용량은 제제의 형태, 투여 방법, 사용 목적, 치료될 환자의 나이, 체중 및 증상에 의해 적당히 결정되고, 일정하지는 않지만 보통 제제에 함유되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염의 양은 1일당 0.1 ㎍ 내지 200 mg/kg (성인에 대해)이다. 물론, 용량은 다양한 조건에 따라 변할 수 있고, 따라서, 상기량 이하의 용량이 일부 경우에는 충분할 수 있고, 반면에 다른 경우에는 상기량 이상의 용량이 필요할 수 있다. 본 발명의 약제는 직접 경구 투여될 수 있고, 또한 약제가 일상적으로 섭취될 수 있도록 식품 및 음료에 첨가될 수 있다.
본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염은 글루카르산으로부터 효율적으로 제조될 수 있다. 항암 작용 외에도, 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염은 생리학적 활성, 예를 들면, 암세포 분화의 유도 활성, 아폽토시스-유도 활성 및 항균 활성을 지니고 약학 화합물로서 유용하다.
본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산은 또한 α-케토글루타레이트 세미알데히드의 수화 반응에 의해서 수득될 수 있고 α-케토글루타레이트 세미알데히드가 투여시 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산으로 전환되는 경우 유효 성분으로서 α-케토글루타레이트 세미알데히드를 함유하는 약제가 본 발명의 약제에 포함된다.
본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 활성 물질 또는 이들의 염은 항암 작용 및 아폽토시스-유도 작용과 같은 생리학적 작용을 지니고 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염이 함유되고 첨가되고/되거나 희석된 식품 또는 음료는 항암 작용 및 아폽토시스-유도 작용과 같은 생리학적 작용을 갖는 식품 또는 음료로서 유용하다.
글루카르산, 글루카르산 유도체 및 글루카르산 및/또는 글루카르산 유도체를 함유하는 화합물 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 가열함으로써 수득된 열-처리 산물은 아폽토시스-유도 작용, 암 세포 생장의 억제 작용, 항균 작용 등을 나타내고 열-처리 산물이 유효 성분이고 공지된 약학적 담체와 배합되는 항암제와 같은 약제를 제조함이 가능하다.
항암제로서의 용량은 제제의 형태, 투여 방법, 사용 목적, 치료될 환자의 나이, 체중 및 증상에 의해 적당히 결정되고, 일정하지는 않지만 보통 제제에 함유되는 유효 성분의 양은 1 일당 1 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 10 내지 200 mg (성인에 대해)이다. 물론, 용량은 다양한 조건에 따라 변할 수 있고, 따라서, 상기량 이하의 용량이 일부 경우에는 충분할 수 있고, 반면에 다른 경우에는 상기량 이상의 용량이 필요할 수 있다. 본 발명의 제제는 직접 경구 투여될 수 있고, 또한 제제가 일상적으로 섭취될 수 있도록 식품 및 음료에 첨가될 수 있다.
상기 열-처리 산물은 항균 활성을 갖고 식품 또는 음료의 보존성을 개선하기 위한 방부제로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 열-처리 산물은 식품 또는 음료에 첨가되어 식품 또는 음료를 방부하는 방법에 사용될 수 있다.
식품 또는 음료에 첨가되는 경우 상기 열-처리 산물을 함유하는 항균제의 형태는 액체, 페이스트, 분말, 플레이크, 과립 등일 수 있다. 용이한 작업 또는 기타 첨가제와의 혼합에 의한 사용이 고려되는 경우, 제제를 건조에 의해 분말, 플레이크 또는 과립으로 제조함이 바람직하다. 건조 방법에 관하여, 통상 사용되는 방법, 예를 들면, 분무 건조, 드럼 건조, 선반 건조, 진공 건조, 동결 건조 등이 사용될 수 있다.
유효 성분으로서 상기 열-처리 산물을 함유하는 항균제 또는 방부제는 당해분야 기술자들에 의해 제조될 수 있다. 이러한 제제의 제조시, 공지된 첨가제, 예를 들면, 충진제, 안정제, 붕해제, 결합제, 보조 가용화제 등이 적합하게 첨가될 수 있다. 또한, 에탄올, 글리신, 나트륨 아세테이트, 아스코르브산, 글리세롤 지방산 에스테르, 염, EDTA 및 기타 항균 물질과 함께 사용될 수 있다.
식품 또는 음료에 첨가될 상기 열-처리 산물의 양은 식품 또는 음료의 유형에 따라 변할 수 있고 목적을 충족하는 양이 첨가될 수 있다.
유효 성분으로서 상기 열-처리 산물을 함유하는 항균제를 사용하는 하나의 방법은 제제를 적당한 방법에 의해 식품 또는 음료에 첨가하는 방법이다. 첨가 방법에는 특별한 제한은 없지만 궁극적으로 상기 열-처리 산물이 임의 수단에 의해서 식품 또는 음료에 함유되면 된다. 따라서, 항균제의 사용시, "첨가"라는 용어는 모든 방법을 포함하고, 이로 인해 상기 열-처리 산물이 식품 또는 음료에 함유되어 제조된다. 통상의 방법은 식품 또는 음료의 제조 단계 도중 첨가하는 것이지만, 식품을 상기 열-처리 산물을 함유하는 용액에 침지시키는 방법이 또한 사용될 수 있다. 식품을 용액에 침지시키는 방법과 함께 이것을 식품에 첨가하는 방법을 수행함이 또한 가능하다. 침지 방법에 적합한 식품의 예는 물에서도 형태를 잃지 않는 식품, 예를 들면, 어류 또는 육류 페이스트 (예를 들면, 카마보코 [끓인 어류 페이스트] 및 비엔나 소시지), 국수 (예를 들면, 끓인 국수) 및 냉동전 어류, 패류 및 새우의 냉동 제품이다.
유효 성분으로서 상기-열처리 산물을 함유하는 항균제가 방부제로서 사용되는 경우, 식품 또는 음료의 보존성이 또한 향상될 수 있다. 냉동 식품 및 냉동 후식의 경우에, 냉동전 가공 단계의 오염된 미생물의 생장이 억제될 수 있고, 이로 인해 위생의 견지에서 매우 유리한 결과가 수득될 수 있다. 유효 성분으로서 상기 열-처리 산물을 함유하는 항균제는 그람 양성 및 그람 음성 세균 모두에 유효하고, 예를 들면, 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 감염 방지 및 장출혈성 에세리히아 콜라이 O-157과 같은 식중독 유발균 감염의 방지에 매우 유용하다.
상기의 항균제는 충치 및 치주 질환균에 대한 항균 활성을 나타내고 본 발명의 항균제를 함유하는 구내용제가 제공될 수 있다. 구내용제의 형태는 공지된 형태, 예를 들면, 액체 또는 페이스트일 수 있다. 구내용제의 예는 치약이다. 치약은 공지된 형태, 예를 들면, 액체, 페이스트 또는 분말일 수 있다. 치약내 상기 열-처리 산물의 양에 특별한 제한은 없지만, 충치 및 치주 질환균에 대한 유효 농도가 함유되면 그것으로 충분하다. 공지된 첨가제, 예를 들면, 가습제, 계면활성제, 결합제, 향료, 감미제 등이 치약에 첨가될 수 있다.
아폽토시스-유도용 식품 또는 음료는 상기 열-처리 산물이 식품 또는 음료에 함유되도록 함으로써 제조될 수 있다. 열-처리 산물의 다양한 생리학적 활성, 예를 들면, 아폽토시스-유도 활성, 항암 활성 및 항균 활성으로 인하여, 상기 열-처리 산물을 함유하는 식품 또는 음료는 발암-예방 및 암-억제 효과를 갖는 세포의 비정상적 생장에 의해 수반되는 질환에 대한 건강 식품 또는 음료이다. 이것은 또한 생체의 항상성을 유지하기에 또는 특히 위장의 건강을 유지하기에 유용한 식품 또는 음료이다. 또한, 항균 활성으로 인하여, 매우 양호하게 보존되는 식품 또는 음료이다. 또한, 상기 열-처리 산물은 식품 또는 음료 첨가제, 특히 방부제로서 매우 유용하다.
본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염 또는 상기 열-처리 산물은 경구 투여에 의해 마우스에 대한 어떠한 독성도 나타내지 않는다.
본 발명은 하기 실시예에 의해서 구체적으로 설명되며 이들 실시예에 제한되지는 않는다. 덧붙여 말하자면, 실시예에 사용된 "%"는 "중량%"를 의미한다.
실시예 1
(1) 칼륨 D-사카레이트 (304-02; Nacalai Tesque 제조)를 농도 10 mg/ml로 되도록 하기 위해서 1N HCl에 용해시키고 염산의 산성 조건 하에서 생성된 열-처리 산물을 제조하기 위해서 121 ℃에서 30 분 동안 가열한다. 이어서 염산의 산성 조건 하에서 생성된 열-처리 산물을 NaOH로 pH 7.0으로 조절하고, 농도 5 mg/ml로 되도록 하기 위해서 희석시킨 다음, 인간 전골수성 백혈병 세포 (HL-60)에 대한 아폽토시스-유도 활성을 하기와 같이 측정한다.
따라서, 56 ℃에서 30 분 동안 처리된 10 % 태송아지 혈청 (Gibco 제조)을 함유하는 RPMI 1640 배지 (Nissuisha 제조) 중 37 ℃에서 배양된 HL-60 (ATCC CCL-240)을 농도 2.5 x 105 세포/4.5 ml로 되도록 하기 위해서 태송아지 혈청 10 %를 함유하는 RPMI 1640 배지에 현탁시킨다.
이러한 현탁액의 4.5 ml에 염산의 산성 조건 하에서 생성된 상기 열-처리 산물 0.5 ml를 첨가하고 5 % 이산화탄소의 존재 하에 37 ℃에서 16 시간 동안 배양을 수행한다. 또한, 확실히 하기 위해서, 동일한 배양을 염산의 산성 조건 하에서 생성된 상기 열-처리 산물 대신에 아폽토시스 유도를 위한 시약으로서 알려져 있는 악티노마이신 D (Sigma 제조)의 수용액 (0.1 mg/ml) 0.05 ml와 생리 식염수 용액 0.45 ml를 사용하여 수행한다.
배양된 세포를 광학 현미경 하에서 관찰하고 핵의 응축, 세포 수축, 아폽틱 바디의 형성 및 세포 생장에 대한 억제 작용이 염산의 산성 조건 하에 생성된 열-처리 산물 및 악티노마이신 D가 첨가된 각각의 배양 세포에서 확인된다. 덧붙여 말하자면, 이러한 현상은 생리 식염수 용액 0.5 ml, NaCl의 0.5 M 수용액 (pH 조정 후 희석된 염산의 산성 조건 하에 생성된 열-처리 산물과 동일한 염 농도) 또는 비-가열 칼륨 글루카레이트를 세포에 첨가한 다음 배양시킨 대조군에서는 주지되지 않는다.
(2) 칼륨 사카레이트를 농도 10 mg/ml로 되도록 하기 위해서 물에 용해시킬 경우, 생성된 pH는 3.95이다. 이것을 121 ℃에서 30 분 동안 가열한다. 열-처리 산물의 pH는 4.1이다. 산성-조건 하에 생성된 이러한 열-처리 산물을 NaOH로 pH 7.0으로 조절하고, HL-60 세포에 대한 이의 아폽토시스-유도 활성 및 세포 생장 억제 활성을 실시예 1-(1)의 방법에 의해 측정하였으며, 그 결과 이러한 샘플은 두 활성 모두를 지녔다.
결과가 도 1에 도시되어 있다. 따라서, 도 1은 산성 조건 하에 생성된 사카르산의 열-처리 산물을 농도 1 mg/ml로 되도록 하기 위해서 HL-60 세포의 배양액에 첨가하였을 때, 배양 시간과 배양액내 생세포 수간 관계를 도시하고, 여기서 횡좌표는 배양 시간 (시간)을 나타내고 종좌표는 배양액내 생세포 수 (x 105 세포/5 ml)를 나타낸다. 도 1에서, 백색 사각형은 샘플이 첨가되지 않은 분획 (대조군)이고 백색 사방형은 산성 조건 하에 생성된 사카르산의 열-처리 산물이 첨가된 분획이다.
(3) D-사카르산 1,4-락톤 모노하이드레이트 (304-35; Nacalai Tesque 제조)를 농도 10 mg/ml로 되도록 하기 위해서 1N HCl에 용해시키고 염산의 산성 조건 하에 생성된 열-처리 산물을 제조하기 위해서 121 ℃에서 30 분 동안 가열한다. 이어서 염산의 산성-조건 하에 생성된 이러한 열-처리 산물을 NaOH로 pH 7.0으로 조절하고, 농도 5 mg/ml로 되도록 하기 위해서 희석한 다음, HL-60 세포에 대한 아폽토시스-유도 활성 및 세포 생장 억제 활성을 실시예 1-(1)의 방법에 의해 측정하였으며, 그 결과 이러한 샘플은 두 활성 모두를 지녔다. 덧붙여 말하자면, 비-가열 D-사카르산 1,4-락톤은 어떠한 활성도 갖지 않는다.
(4) D-사카르산 1,4-락톤 모노하이드레이트를 농도 10 mg/ml로 되도록 하기 위해서 물에 용해시키고, NaOH로 pH 7.0으로 조정한 다음, 121 ℃에서 30 분 동안 가열한다. 열-처리 산물의 pH는 4.3이다. 이러한 열-처리 산물을 NaOH로 pH 7.0으로 조절하고, HL-60 세포에 대한 이의 아폽토시스-유도 활성 및 세포 생장 억제 활성을 실시예 1-(1)의 방법에 의해 측정하였으며, 그 결과 이러한 샘플은 두 활성 모두를 지녔다. 덧붙여 말하자면, 비-가열 D-사카르산 1,4-락톤은 어떠한 활성도 갖지 않는다.
결과가 도 2에 도시되어 있다. 따라서, 도 2는 D-사카르산 1,4-락톤의 열-처리 산물을 농도 1 mg/ml로 되도록 하기 위해서 HL-60 세포의 배양액에 첨가하였을 때, 배양 시간과 배양액내 생세포 수간 관계를 도시하고, 여기서 횡좌표는 배양 시간 (시간)을 나타내고 종좌표는 배양액내 생세포 수 (x 105 세포/5 ml)를 나타낸다. 도 2에서, 백색 사각형은 샘플이 첨가되지 않은 분획 (대조군)이고 백색 사방형은 D-사카르산 1,4-락톤의 열-처리 산물이 첨가된 분획이다.
(5) 칼륨 D-사카레이트를 농도 10 mg/ml로 되도록 하기 위해서 물에 용해시키며, 그 결과 pH는 3.95였다. 이것을 121 ℃에서 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 16 시간 동안 가열한다. 각각의 가열 및 비-가열 산물을 약 pH 7로 조절하고 아폽토시스-유도 활성과 세포 생장 억제 활성을 측정하기 위한 샘플을 제조하기 위해서 0.22 μm의 필터를 사용하여 멸균시킨다. 샘플을 2-, 5-, 10-, 20-, 50- 및 100-배로 희석하고, 이의 세포 생장 억제 활성을 HL-60 세포 (인간 전골수성 백혈병 세포)를 사용하여 측정한 다음, 활성의 강도를 비교한다.
따라서, 각각의 희석 용액 10 μl 또는 물 10 μl을 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 넣는다. 10 % 태송아지 혈청과 5000 HL-60 세포를 함유하는 RPMI 1640 배지 (100 μl)를 이에 첨가하고 5 % 이산화탄소 기체의 존재 하에 37 ℃에서 48 시간 동안 배양을 수행한다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT; Sigma 제조) 5 mg/ml를 함유하는 포스페이트 완충 식염수 용액 (10 μl)을 이에 첨가하고, 혼합물을 4 시간 이상 배양하며 세포 생장의 상태를 현미경 하에서 관찰한다. 또한, 0.04 N HCl을 함유하는 2-프로판올 100 μl를 첨가하고 혼합물을 잘 교반하며 590 nm에서의 흡광도를 측정한 다음 세포 생장의 정도로 정의한다 (MTT 방법).
결과는 비-가열 칼륨 D-사카레이트 용액은 어떠한 세포 생장 억제 활성도 갖지 않고, 반면에 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 16 시간 동안 가열된 칼륨 D-사카레이트 용액은 각각 2-, 5-, 10- 및 20-배 희석까지 세포 생장 억제 활성을 나타내는 것으로 확인된다는 것이다. 또한, 핵의 응축, 세포의 수축 및 아폽틱 바디의 형성이 세포 생장 억제 활성이 주지되고 이로 인해 아폽토시스-유도 활성이 확인되는 샘플 농도에서 배양된 세포에서 확인된다.
동시에, 각각의 열-처리 산물 일부를 샘플링하고 농축 건조시킨 다음 생성된 샘플의 1/20 용적을 50 % 메탄올에 용해시킨다. 농축물 용액을 박층 실리카 겔 (Silica Gel 60 F254; Merck 제조) 두 장에 스폿팅하고 전개제 (n-부틸 아세테이트: 아세트산: 증류수 = 3:1:1)로 전개시킨다. 전개 후 박층 중 하나를 스폿을 검출하기 위해서 짧은 파장의 자외선으로 조사한다. 이것을 추가로 AgNO3-NH3 용액 (동 용적의 AgNO3 0.1 N 수용액과 5N NH3의 혼합물)으로 분무한 다음 스폿을 검출하기 위해서 가열한다. 다른 박층을 에탄올과 황산의 혼합물 (에탄올:황산 = 1:1)로 분무한 다음 스폿을 검출하기 위해서 가열한다.
박층 실리카 겔 크로마토그래피의 결과로서, 시간의 경과와 함께 증가하는 스폿이 약 0.13, 약 0.16 및 약 0.03의 Rf 값으로 존재하는 것으로 확인되고, 이러한 증가 경향은 MTT 방법에 의해서 분석되는 세포 생장 억제 활성의 증가와 평행 관계이다.
(6) D-사카르산 1,4-락톤 모노하이드레이트 (Nacalai Tesque 제조)를 농도 10 mg/ml로 되도록 하기 위해서 물에 용해시키며, 그 결과 pH는 2.5였다. 이것을 121 ℃에서 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 16 시간 동안 가열한다. 각각의 가열 및 비-가열 산물을 약 pH 7로 조절하고 세포 생장 억제 활성을 측정하기 위한 샘플을 제조하기 위해서 0.22 μm의 필터를 사용하여 멸균시킨다. 세포 생장 억제 활성을 측정하기 위한 이들 샘플을 2-, 5-, 10-, 20-, 50- 및 100-배로 희석하고, HL-60 세포에 대한 이의 세포 생장 억제 활성을 실시예 1-(5)에 언급된 MTT 방법에 의해서 측정한 다음, 활성의 강도를 비교한다. 또한, 배양 세포의 핵 응축, 세포의 수축 및 아폽틱 바디의 형성을 관찰하고 아폽토시스-유도 작용의 강도를 이에 의해 비교한다.
결과는 비-가열 칼륨 D-사카르산 1,4-락톤 용액은 세포 생장 억제 활성 또는 아폽토시스-유도 활성을 갖지 않고, 반면에 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 및 16 시간 동안 가열된 칼륨 D-사카르산 1,4-락톤 용액의 열-처리 산물은 각각 1-, 2-, 5-, 10- 및 50-배 희석까지 세포 생장 억제 활성과 아폽토시스-유도 활성을 지니는 것으로 확인된다는 것이다.
동시에, 각각의 열-처리 산물의 일부를 샘플링하고 농축 건조시킨 다음 생성된 샘플의 1/20 용적을 50 % 메탄올에 용해시킨다. 농축물 용액을 실시예 1-(5)에서 언급된 방법에 의해서 박층 실리카 겔에 투입한다.
박층 실리카 겔 크로마토그래피의 결과로서, 시간의 경과와 함께 증가하는 스폿이 약 0.13, 약 0.06 및 약 0.03의 Rf 값으로 존재하는 것으로 확인되고, 이러한 증가 경향은 MTT 방법에 의해서 분석되는 세포 생장 억제 활성의 증가와 평행 관계이다.
이어서, D-사카르산 1,4-락톤의 열-처리 산물 1.5 ml을 농축 건조시키고 생성된 산물을 50 % 메탄올 60 μl에 재용해시키고 이의 50 μl를 실시예 1-(5)에서와 동일한 방식으로 박층 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 전개시킨다. 이어서 Rf 값이 약 0.13, 0.13 내지 0.16, 약 0.06 및 약 0.03인 점과 또한 이러한 박층 실리카 겔의 출발점에서 실리카 겔을 긁어내고 각각을 50 % 메탄올 500 μl로 추출한다. 추출물을 농축 건조시키고, 생성된 산물을 멸균 증류수 100 μl에 용해시킨 다음, 세포 생장 억제 활성 및 아폽토시스-유도 활성을 실시예 1-(5)에서와 동일한 방법으로 측정하여 활성은 출발점 내지 Rf 값이 0.13인 영역에서 발견된다.
(7) D-사카르산 1,4-락톤 모노하이드레이트 (Nacalai Tesque 제조)를 pH가 2.5인 경우 농도 10 mg/ml로 되도록 하기 위해서 물에 용해시킨다. 이것을 121 ℃에서 4 시간 및 16 시간 동안 가열한다.
이러한 D-사카르산 1,4-락톤의 가열 산물과 비-가열 산물을 API-III (Sciex 제조)를 사용하여 음이온 양식으로 질량 분석에 투입한다. 결과적으로, 가열 산물에서, 130, 148 등의 분자량을 갖는 물질은 가열 시간 및 아폽토시스-유도 활성의 증가에 상응하여 증가한다.
실시예 2
(1) 121 ℃에서 4 시간 동안 1 % D-사카르산 1,4-락톤 모노하이드레이트를 가열함으로써 수득된 샘플 (100 ml)을 동결-건조시키고 물 2 ml에 재용해시킨다. 이러한 재용해된 용액의 일부를 0.5 μm의 Cosmonice 필터 (440 내지 84; Nacalai Tesque 제조)를 통하여 여과시키고, 이동 상으로서 트리플루오로아세트산 (349-01; Nacalai Tesque 제조)의 0.1 % 수용액을 사용하여 0.5 ml/분의 유동율로 TSK 겔 ODS-80Ts (6 mm X 250 mm; Tosoh 제조)를 사용하는 HPLC로 투입한 다음, 검출을 10 개의 주요 피크가 확인되는 210 nm의 흡광도에서 수행한다. 이어서, 각각의 피크를 동일한 방법에 의해 수집하고 암 세포 생장 억제 활성을 검사하기 위한 샘플을 제조하기 위해서 0.22 μm의 필터를 사용하여 멸균시킨다. 샘플을 1-, 2-, 4-, 8-, 16- 및 32-배로 희석한 다음, 아폽토시스-유도 활성과 인간 전골수성 백혈병 세포 (HL-60 세포)에 대한 세포 생장 억제 활성을 실시예 1-(5)에 언급된 방법에 의해 측정하고 활성의 강도를 비교한다.
결과적으로, 활성은 보유 시간이 5.6 분인 피크에서 확인되고 암 세포 생장 억제 활성과 아폽토시스-유도 활성은 보유 시간 5.6 분 피크의 32-배 희석 산물까지 확인된다.
(2) 실시예 2-(1)에 언급된 5.6 분의 보유 시간의 피크를 수집하고 진공에서 농축 건조시킨다. 이러한 샘플의 질량 분석을 DX302 질량 분광광도계 (Nippon Denshi 제조)를 사용하여 수행한다. 또한, 이것을 중수에 용해시키고 이의 구조를 핵 자기 공명 (NMR)에 의해서 분석한다. 핵 자기 공명 분광광도계로는, JNM-A500 (Nippon Denshi 제조)을 사용한다. 이어서, 이것을 농도 88 μg/ml로 되도록 하기 위해서 물에 용해시키고 이의 자외선 흡수 스펙트럼을 UV-2500 분광광도계 (Shimadzu 제조)를 사용하여 제조한다. 결과가 하기에 언급되어 있다.
샘플의 특성은 첨부된 도 3 내지 도 6에 제공되어 있다. 따라서, 모든 도 3 내지 6은 본 발명의 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산의 특성을 나타내는 도면이다.
도 3은 질량 스펙트럼 [종좌표는 상대 강도 (%)를 나타내고 횡좌표는 m/z를 나타냄]을 도시하고, 도 4는 자외선 흡수 스펙트럼 [종좌표는 흡광도를 나타내고 횡좌표는 파장 (nm)을 나타냄]을 도시하며, 도 5는 1H-NMR 스펙트럼 [종좌표는 시그널 강도를 나타내고 횡좌표는 화학 이동 값 (ppm)을 나타냄]을 도시하며, 도 6은 13C-NMR 스펙트럼 [종좌표는 시그널 강도를 나타내고 횡좌표는 화학 이동 값 (ppm)을 나타냄]을 도시한다.
FAB-MS: m/z 131 [M-H2O+H]+
UV: λmax 말단 흡수
부분입체 이성질체 1
1H-NMR: δ 1.83 (1H, m, 4-H), 1.94 (1H, m, 3-H), 2.18 (1H, m, 4-H), 2.36 (1H, m, 3-H), 5.55 (1H, d-d, J=2.0. 5.0 Hz, 5-H)
13C-NMR: δ 32.1,34.3,100.5,103.3,174.4
부분입체 이성질체 2
1H-NMR: δ 1.88 (1H, m, 4-H), 2.07 (1H, m, 3-H), 2.15 (1H, m, 4-H), 2.23 (1H, m, 3-H), 5.51 (1H, d-d, J=3.5. 5.0 Hz, 5-H)
13C-NMR: δ 32.7,35.5,101.1,103.5,174.7
부수적으로, HOD의 화학 이동 값은 1H-NMR에서 4.65 ppm으로 되고 디옥산의 화학 이동 값은 13C-NMR에서 67.4로 된다.
이들 값으로부터, 본 발명이 화학식 2에 의해 표현되는(2S,5S)-2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산 및 이의 광학 대장체와 화학식 3에 의해 표현되는 (2S,5R)-2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산 및 이의 광학 대장체의 혼합물임이 명백해졌다. 부수적으로, 부분입체 이성질체 1과 부분입체 이성질체 2 중 하나는 화학식 2에 의해 표현되는 물질, 이의 광학 대장체 또는 이들의 혼합물이고 다른 하나는 화학식 3에 의해 표현되는 물질, 이의 광학 대장체 또는 이들의 혼합물이다.
실시예 3
α-케토글루타레이트 세미알데히드를 문헌 [참조: Journal of Bacteriology, 116, 1346-1354 (1973)]에 기재된 방법에 의해서 제조한 다음 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산을 생성하기 위해서 수화 반응에 투입한다.
실시예 4
(1) 칼륨 D-사카레이트를 농도 1 %로 되도록 하기 위해서 증류수에 용해시키고 120 ℃에서 4 시간 동안 가열한다. 항균 활성을 생성된 열-처리 칼륨 사카레이트를 사용하여 시험한다.
에세리히아 콜라이 HB 101을 밤새 L-브로스 중의 시이드 배양액 (1 % 트립톤, 0.5 % 효모 추출물 및 0.5 % NaCl; pH 7.0)에 투입한다. 시이드 배양액 (5 μl)을 열-처리 칼륨 사카레이트 50 μl 또는 500 μl를 L-브로스 5 ml에 첨가함으로써 제조된 배지 및 또한 L-브로스에 어떤 것도 첨가하지 않은 배지에 접종하고 생장을 측정하기 위해서 진탕 배양한다. 접종 개시시 및 조절된 스케일이 82.3인 조건 하에서 Fuji 디지털 탁도 측정계 (Fuji Kogyo KK에 의해 시판; Akimoto Denki Seisakusho)를 사용하여 6.5 시간 후 측정을 수행하고 6.5 시간 후의 값에서 개시시의 값을 뺌으로서 수득된 값을 생장으로서 정의한다. 결과적으로, 항균 활성이 표 1에 예시된 바와 같이 열-처리 칼륨 사카레이트에서 주지된다.
첨가된 양 (μl/5 ml) 생장 (탁도)
0 167
50 159
500 120
(2) D-사카릭산 1,4-락톤 모노하이드레이트를 농도 1 %로 되도록 하기 위해서 증류수에 용해시키고 120 ℃에서 4 시간 동안 가열한다. 항균 활성을 이러한 열-처리 D-사카릭산 1,4-락톤을 사용하여 실시예 4-(1)에 언급된 방법에 의해서 시험한다. 결과적으로, 항균 활성은 표 2에 예시된 바와 같이 열-처리 D-사카릭산 1,4-락톤에서 주지된다.
첨가된 양 (μl/5 ml) 생장 (탁도)
0 167
50 154
500 15
실시예 5. 주사제
(1) 증류수에 용해된 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산의 0.1 % 수용액을 제조하고 주사제를 생성하기 위해서 무균 여과한다.
(2) 실시예 1-(2)에 언급된 열-처리 D-사카릭산 농축 건조 산물을 1 % 용액을 제조하기 위해 주사용 증류수에 용해시킨다. 이러한 용액을 현탁물 분획의 건조 물질로서 계산된 10 mg의 양으로 동결-건조하기 위해서 바이얼에 채우고 동결-건조에 투입한다. 생리 식염수 용액 (2 ml)을 용해를 위한 액체로서 이에 부착시킨다.
유사하게 1-(4)에 언급된 D-사카릭산의 열-처리 산물을 사용하여 주사제가 제조된다.
실시예 6. 정제
정제를 하기 제형에 따라 제조한다.
열-처리 칼륨 D-사카레이트 10 mg
옥수수 전분 65 mg
카복시메틸 셀룰로스 20 mg
폴리비닐피롤 3 mg
마그네슘 스테아레이트 2 mg
실시예 1-(2)에 언급된 열-처리 D-사카릭산의 중화 산물의 동결-건조 산물이 사용된다.
본 발명에 따라서, 항암 작용, 암 세포 생장 억제 작용, 아폽토시스-유도 작용 및 항균 작용과 같은 생리학적 작용 및 높은 안전성을 갖는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산 또는 이의 광학 이성질체 또는 이들의 염이 제공되고, 또한 생리학적 활성 작용을 갖는 화합물을 함유하는 약제 (특히, 항암제)가 제공된다.

Claims (4)

  1. 화학식 1에 의해 표현되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염.
    화학식 1
  2. (a) 글루카르산 또는 글루카르산 락톤, 글루카르산 에스테르, 글루카르산 아미드 또는 염과
    (b) 글루카르산 및/또는 글루카르산 락톤, 글루카르산 에스테르, 글루카르산 아미드 또는 염을 함유하는 화합물 중에서 선택된 적어도 하나의 화합물을 열-처리하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 화학식 1에 의해 표현된 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염의 제조방법.
  3. 화학식 1에 의해 표현되는 2,5-디하이드록시테트라하이드로-2-퓨란카복실산, 이의 광학 활성 물질 또는 이들의 염을 유효 성분으로 함유하는 항암제.
  4. 삭제
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