KR100513430B1

KR100513430B1 - 인삼추출 다당체 진산을 함유하는 화장품 조성물

Info

Publication number: KR100513430B1
Application number: KR10-2003-0001962A
Authority: KR
Inventors: 윤연숙; 정인성; 송지영
Original assignee: 한국원자력연구소
Priority date: 2002-03-19
Filing date: 2003-01-13
Publication date: 2005-09-07
Anticipated expiration: 2023-01-13
Also published as: KR20030011957A; KR20020040707A

Abstract

본 발명은 인삼추출 다당체 진산과 그 주성분인 프락토퓨라노스가 베타(2→6)로 결합한 프락탄다당체(이하 PG-프락탄)를 활성성분으로 하는 화장품 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 광접촉에 의한 손상피부 회복효과 및 피부 보습효과를 지닌 인삼추출 다당체 진산, 프락토퓨라노스가 베타(2→6)로 결합한 PG-프락탄 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유한 화장품 조성물에 관한 것이다.

Description

인삼추출 다당체 진산을 함유하는 화장품 조성물{Cosmetic composition containing ginsan polysaccharide extracted from Panax ginseng}

본 발명은 인삼추출 다당체 진산, 그 주성분인 프락토퓨라노스가 베타(2→6)로 결합한 PG-프락탄 또는 이들의 혼합물을 활성성분으로 함유하는 화장품 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 광접촉에 의한 손상피부 회복효과 및 피부 보습효과를 지닌 인삼추출 다당체 진산, 프락토퓨라노스가 베타(2→6)로 결합한 PG-프락탄 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유한 화장품 조성물에 관한 것이다.

인삼은 유기산으로 푸마르산, 석신산, 말레산, 시트르산, 타르타르산을 함유하며, 지방산으로는 올레인산과 리놀레인산을, 다당류로는 파낙산 A∼U를 함유하고 있다. 이 밖에도 판토텐산, 콜린, 폴리엔, 파나시놀, 헵타데카-엔-4,6-디인-3,9-디올, 올레아난, 글리코사이드, 알카로이드 등이 있다.

인삼의 성분 중 디올글리코사이드는 중추신경계에 대하여 억제적으로 작용하여 정신안정, 진통, 혈압강하, 파파베린 유사효과가 있고, 트리올글리코사이드는 중추신경계에 대하여 흥분적으로 작용하여 항피로, 정신노동의 강화작용이 있으며, 파나시놀과 리놀레인산은 항염효과가 있을 뿐만 아니라 X-선 조사에 의해 침해되는 생체조직에 있어서의 색소의 누출현상을 방지하는 효과, 혈당강하작용, 면역적 약리활성, 유도된 간장애의 수복효과가 있고, 폴리엔은 함암효과, 혈청 단백질의 생합성 촉진 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

인삼추출물을 이용한 화장품에 관한 공지된 기술로는 대한민국 공개특허공보 제99-86516호 '인삼추출물을 함유하는 피부노화 방지용 화장료 조성물'과 대한민국 공개특허공보 제2001-88981호 '인삼다당체를 함유하는 화장품 조성물' 등이 개시되어 있다. 그러나 이러한 인삼추출물을 함유하는 화장품 조성물의 경우 통상의 화장품 조성물에 비해 특수한 그 효과상의 차이를 나타내기는 어려웠던 것이다.

본 발명의 발명자들은 종래의 인삼추출물과는 상이한 인삼추출 다당체가 화장료 원료로서 우수한 효과를 지님을 발견하였고, 이러한 인삼추출 다당체를 진산이라고 명명한 후 진산 및 그 주성분인 프락토퓨라노스가 베타(2→6)로 결합한 PG-프락탄을 유효성분으로 하는 화장품 조성물을 개발한 것이다.

본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 광접촉에 의한 손상피부 회복효과 및 피부 보습효과를 지닌 인삼추출 다당체 진산을 함유하는 화장품 조성물을 개발한 것이다. 이 때 인삼추출 다당체 진산은 인삼뿌리를 세절 건조 후, 물로 추출하고 동결건조시켜 수용성 분말을 수득한 후 이를 물에 재용해한 후 메탄올, 에탄올 등의 수포화 저급지방족알코올로 포화 침전시켜 수득된 물질을 투석시켜 제조된 인삼추출 다당체를 의미하는 것이다. 또한 PG-프락탄은 진산을 이온교환 크로마토그래피하여 얻어진 활성분획을 겔여과 크로마토그래피를 시행하여 순수하게 정제한 것으로 프락토퓨라노스가 베타(2→6)로 결합한 다당체를 의미한다.

본 발명의 목적은 인삼근을 세절 건조 후, 에탄올로 추출하여 사포닌 등의 유기성 저분자들을 제거한 후 그 잔사를 물로 추출하고 동결건조시켜 수용성 분말을 수득한 후 이를 물에 재용해한 후 수포화 저급지방족알코올로 포화 침전시켜 수득된 물질을 투석시켜 제조된 인삼추출 다당체인 진산, 상기 진산을 순수히 정제한 PG-프락탄 또는 이들의 혼합물을 화장품 총 중량 중 0.00001∼60 중량%를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 광접촉에 의한 손상피부 회복효과 및 피부 보습효과를 지닌 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 화장품 조성물에 있어서, 인삼추출 다당체인 진산 및 PG-프락탄의 함량은 화장품 총 중량 중 0.01∼30.0 중량%임을 특징으로 하는 화장품 조성물이다.

또한 상기 화장품 조성물중 진산과 PG-프락탄의 함량 중량비는 20∼100 : 0∼80임이 바람직하다.

또한 상기 화장품 조성물은 통상의 기재 및 첨가제를 사용하여 크림, 화장수, 로션, 에센스, 맛사지 크림 및 팩 등의 화장품 제형을 지님을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 사용되는 인삼다당체 진산의 제조방법을 살펴보면 다음과 같다. 인삼근을 세절 건조 후, 에탄올로 추출하여 사포닌 등의 유기성 저분자들을 제거한 후 그 잔사를 물로 추출하여 수가용성 분액을 수득한 후 이를 동결건조시켜 수용성 분말을 수득한다. 이 수용성 분말을 물에 재용해한 후 수포화 저급지방족 알코올로 포화시켜 침전물을 수득한 후 이를 물로 투석시켜 제조된 인삼추출 다당체를 의미한다.

상기의 과정에서 얻어진 진산을 이온교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피하여 PG-프락탄을 순수 정제하였으며 이 물질은 프락토퓨라노스가 베타(2→6)로 결합한 다당체이다.

이러한 본 발명의 인삼추출 다당체 진산 및 PG-프락탄의 제조공정은 도 1에 상세히 나타내었다.

본 발명의 인삼다당체는 물에 쉽게 혼화되고 유지와 유기성 용매는 혼화되기 어렵지만 현탁상태에서도 화장료에의 배합은 가능하고 효과에 대하여 어떠한 영향도 주지 아니한다. 본 발명의 인삼다당체를 화장료에 배합시 일반 피부 화장료에 배합되는 보통의 성분들 예컨대, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급지방족알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 향료 등을 필요한 만큼 적용 배합하는 것이 가능하다.

본 발명의 화장품 중 인삼 다당체의 함량은 0.00001∼60 중량%를 지닌다. 그러나 본 발명의 화장품의 효과를 충분히 발휘하기 위해서는 인삼 다당체 함량이 0.01∼30.0 중량%인 것이 바람직하다. 만약 0.01 중량% 이하의 인삼 다당체를 함유할 경우 피부노화방지, 피부면역증강효능, 항산화효능, 광접촉에 의한 손상피부 회복효능, 피부보습효능 등이 충분치 못하며, 30.0 중량% 이상의 경우 그 이상의 효과 증진이 나타나지 않았다.

또한 본 발명의 인삼 다당체 중 PG-프락탄의 함량이 높을수록 더 높은 효과를 나타내었는 바, 이는 진산 중 함유되어 있는 PG-프락탄이 본 발명의 피부노화방지, 피부면역증강효능, 항산화효능, 광접촉에 의한 손상피부 회복효능, 피부보습효능을 나타내는 주요 인자임이 밝혀진 것이다.

따라서 본 발명의 바람직한 실시태양은 인삼 다당체 추출물인 진산과 이 진산을 다시 분리 정제한 PG-프락탄을 20∼100 : 0∼80 중량 비율로 함유한 것이다.

본 발명에서 피부 화장료는 피부에 사용하는 것으로서 예를 들면 화장수, 유액, 크림, 팩 등의 화장료의 형태일 수 있으며, 피부노화방지, 피부면역증강효능, 항산화효능, 광접촉에 의한 손상피부 회복효능 및 피부 보습효능을 지닌 화장료로의 응용이 가능하다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 인삼다당체 진산의 제조

6년근 인삼 1kg을 세절 건조 후, 에탄올 8L로 추출하여 사포닌 등의 유기성 저분자들을 제거한 후 그 잔사를 물 8L로 추출하여 수가용성 분액을 수득한 후 이를 동결건조시켜 수용성 분말 180g을 수득한다. 이 수용성 분말을 물에 재용해한 후 80(v/v)% 에탄올로 포화시켜 침전물을 수득한 후 이를 물로 투석시켜 인삼추출 다당체 진산을 제조한다. 수득된 진산의 양은 90g이였다. 제조된 인삼추출 다당체 진산은 분자량 약 5,000∼2,000,000 달톤의 고분자 물질이고, 그 진산의 주성분은 다당체들로 구성되어 있다.

(실시예 2) 인삼 PG-프락탄의 제조

상기의 과정에서 얻어진 진산 1g을 DEAE 세파덱스 A-50 음이온교환 크로마토그래피, 세파크릴 S-500 겔여과 크로마토그래피를 순차적으로 시행하여 230mg의 PG-프락탄을 순수 정제하였으며 이 물질은 프락토퓨라노스가 베타(2→6)로 결합한 다당체이다(도 1, 도 2 및 도 3 참조).

(실시예 3) 인삼 다당체 진산 및 PG-프락탄의 구조 분석

1) 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄의 당 함량 측정

인삼으로부터 분리된 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄의 당 함량은 페놀-황산법으로 측정하였다. 0.1㎎/㎖의 농도로 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄을 증류수에 용해시킨 용액 20㎕에 5% 페놀용액 30㎕와 진한 황산 0.2㎖를 가하고 진탕한 후, 60℃에서 20분간 반응시켜 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 표준품으로는 프락토오스를 사용하여 표준용량곡선을 작성하였다. 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄의 당 함량은 각각 98.5% 및 99.5%이상이었다.

2) 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄의 단백질 함량 측정

인삼으로부터 분리된 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄의 단백질 함량은 브래드포드법을 기본으로 제품화된 단백질 함량 측정 키트(Protein Assay Kit, Bio-Rad사)를 사용하여 측정하였다. 소의 혈청 알부민을 표준품으로 하여 표준용량곡선을 작성하였으며 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄의 단백질 함량은 각각 0.5% 및 0.1%미만이었다.

3) 인삼 다당체의 분자량 확인

인삼 다당체의 분자량확인은 겔 여과 컬럼을 장치한 액체크로마토그래피 (Hewrette-packard HP-600S)를 사용하였으며 이동상으로 0.1몰-탄산나트륨 수용액을 사용하였고, 유속은 1.5㎖/분, 검출기는 굴절율 검출기를 사용하였다. 80%에탄올 추출물을 셀룰로오스 투석막으로 투석하여 제조한 인삼 다당체 추출물의 겔 여과 액체크로마토그래피한 결과는 표 1과 같으며 각 분자량 크기별 조성비는 12.4 : 3.9 : 4.8 : 0.8 : 44.1 : 34.0 이었다.

겔 여과 컬럼을 장치한 액체크로마토그래피에 의한 인삼 다당체의 분자량 확인

시료	머무름 시간(분)	분자량(달톤)	면적비(%)
GⅠ	10.012	2,000,000	12.4
GⅡ	10.658	1,500,000	3.9
GⅢ	12.230	700,000	4.8
GⅣ	14.459	115,000	0.8
GⅤ	18.693	25,000	44.1
GⅥ	21.997	5,500	34.0

4) 인삼 다당체의 적외선흡수 스펙트럼 분석

인삼 다당체를 브롬화칼륨(KBr)을 사용하여 적외선 흡수 스펙트럼 분석용 박편을 만든 다음 푸리에-변환 적외선 분광기(Fourier Transform-Infra Red spectroscopy, Bomem DA8.12, Hartman and Braun사, Canada)를 사용하여 분석하였다. 3400 cm^-1부근의 히드록시기(-OH), 1000∼1100 cm^-1 부근의 에스테르기(C-O), 2800∼2900 cm^-1의 탄화수소의 흡수스펙트럼이 확인되어 전형적인 다당체의 흡수 스펙트럼임을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

6) PG-프락탄의 적외선흡수 스펙트럼 분석

PG-프락탄을 브롬화칼륨(KBr)을 사용하여 적외선 흡수 스펙트럼 분석용 박편을 만든 다음 푸리에-변환 적외선 분광기(Fourier Transform-Infra Red spectroscopy, Bomem DA8.12, Hartman and Braun사, Canada)를 사용하여 분석하였다. 3400 cm^-1부근의 히드록시기(-OH), 1000∼1100 cm^-1 부근의 에스테르기(C-O), 2800∼2900 cm^-1의 탄화수소의 흡수스펙트럼이 확인되어 전형적인 다당체의 흡수 스펙트럼임을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

7) 인삼 PG-프락탄의 핵자기 공명 스펙트럼에 의한 분석

인삼 다당체를 D₂O에 녹여 ¹H, ¹³C-핵자기 공명장치(500MHz Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, Bruker AMX 500, Germany)를 이용하여 측정하였다. ¹H-NMR에서δ3.3∼4.1 ppm 부근의 하나의 히드록시기가 결합된 CH기의 수소 피크들을 확인하였다(도 6 참조). ¹³C-NMR에서는 δ60.6, 64.0, 75.8, 76.9 80.9, 104.9ppm의 피크가 전형적인 PG-프락탄의 피크임을 나타내어 이를 기지의 프락탄다당체인 레반(levan)과 비교한 결과 그 스펙트럼이 일치하여 프락토퓨라노스가 베타(2→6)로 결합한 다당체인 PG-프락탄임을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).

(제조예 1)

인삼다당체 진산을 함유한 화장료 중 유연 화장수의 처방예는 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
진산	5.0
1,3-부틸렌 글리콜	6.0
소디움 히알루로네이트	2.0
글리세린	4.0
피이지 4000	1.0
폴리 솔베이트 20	0.5
에탄올	10.0
방부제	적량
벤조페논-9	0.05
향	적량
정제수	적량
합계	100

(제조예 2)

제조예 1에서 인삼다당체 진산의 함유량만 PG-프락탄으로 바꾸어 제조한 것이다.

(제조예 3)

인삼다당체 진산을 함유한 화장료중 밀크 로션의 처방예는 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
진산	2.0
스테아린산	0.4
1,3-부틸렌 글리콜	6.0
세토스테아릴 알콜	1.2
글리세린	4.0
글리세릴 스테아레이트	1.0
트리에탄올 아민	0.25
토코페릴 아세테이트	3.0
유동 파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아 너트 오일	2.0
폴리 솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.6
카르복시비닐 폴리머	0.15
방부제	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 4)

제조예 3에서 인삼다당체 진산 대신에 진산 1.0 중량%, PG-프락탄 1.0 중량%로 함량을 바꾸어 제조한 것이다.

(제조예 5)

인삼다당체 진산을 함유한 화장료중 영양 크림의 처방예는 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
진산	2.0
바셀린	7.0
세토스테아릴 알콜	2.5
글리세릴 스테아레이트	2.0
스테아린산	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리 솔베이트 60	1.5
솔비탄 세스퀴올레이트	0.8
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌 글리콜	6.0
글리세린	4.0
트리에탄올 아민	0.5
토코페릴 아세테이트	0.1
방부제	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 6)

제조예 5에서 인삼다당체 진산 대신에 진산 1.0 중량%, PG-프락탄 1.0 중량%로 함량을 바꾸어 제조한 것이다.

(제조예 7)

인삼다당체 진산을 함유한 화장료 중 에센스의 처방예는 다음과 같다.

성분	함량(중량)
진산	5.0
글리세린	10.0
피이지 1500	2.0
알란토인	0.1
판테놀	0.3
이.디.티이.에이(EDTA)	0.02
벤조페논-9	0.04
히드록시 에틸 셀룰로오스	0.1
소디움 히알루로네이트	8.0
카르복시비닐 폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-25	0.6
에탄올	6.0
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 8)

제조예 7에서 인삼다당체 진산 대신에 진산 2.0 중량%, PG-프락탄 3.0 중량%로 함량을 바꾸어 제조한 것이다.

(제조예 9)

인삼다당체 진산을 함유한 화장료 중 맛사지 크림의 처방예는 다음과 같다.

성분	함량(중량%)
진산	3.0
글리세릴 스테아레이트	2.0
세토스테아릴 알콜	2.5
스테아린산	1.0
폴리 솔베이트 60	1.5
솔비탄 스테아레이트	0.6
이소스테아릴 이소스테아레이트	5.0
스쿠알렌	5.0
광물유	35.0
디메치콘	1.0
산탄검	0.1
히드록시에틸 셀룰로오스	0.12
글리세린	6.0
트리에탄올 아민	0.5
방부제, 향, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 10)

제조예 9에서 인삼다당체 진산 대신에 진산 1.0 중량%, PG-프락탄 2.0 중량%로 함량을 바꾸어 제조한 것이다.

(제조예 11)

인삼다당체 진산을 함유한 화장료 중 팩 처방예는 다음과 같다.

성분	함량(중량)
진산	3.0
폴리비닐 알콜	15.0
셀룰로오스 검	0.15
글리세린	3.0
피이지 1500	2.0
판테놀	0.4
알란토인	0.1
에탄올	6.0
피이지 40 경화 피마자유	0.3
방부제, 향, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

(제조예 12)

제조예 11에서 인삼다당체 진산 대신에 진산 1.5 중량%, PG-프락탄 1.5 중량%로 함량을 바꾸어 제조한 것이다.

(비교예 1)

제조예 3 혹은 제조예 4에서 인삼다당체 진산 혹은 PG-프락탄의 함유량만 전분으로 바꾸어 제조한 것이다.

(비교예 2)

제조예 5 혹은 제조예 6에서 인삼다당체 진산 혹은 PG-프락탄의 함유량만 전분으로 바꾸어 제조한 것이다.

(시험예 1) 피부노화방지효과 측정 시험

1) 섬유아세포(Fibroblast)의 증식효능 측정

3.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Doubecco's Modified Eagle's Media)배지에서 배양한 인체 섬유아세포를 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 5,000세포/well가 되도록 분주하고, 시료로서 실시예 1과 2의 인삼다당체 진산과 PG-프락탄을 각각 1%의 양으로 사용하여, 배양배지로 1/10씩 순차적으로 희석하여 첨가한 후, 37℃ 온도에서 4일간 배양하였다. 배양 후, 0.2% MTT(3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 각 well당 50㎕씩 첨가하고, 다시 37℃ 온도에서 4시간 동안 배양한 후, 생성된 포르마잔(formazane)을 DMSO(Dimethylsulfoxide)로 용해시켰다. 용해된 포르마잔의 흡광도를 평판배양측정기(microplate reader)를 이용하여 570nm에서 측정하였다. 이를 인삼추출물 진산과 PG-프락탄을 처리하지 않은 대조군에 대하여 상기와 동일한 방법으로 실시하여 흡광도를 측정하였다. 인삼추출물 진산과 PG-프락탄을 함유한 실험군과, 이를 함유하지 않은 대조군의 흡광도를 각각 비교한 후, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

시료농도(%)	섬유아세포증식능(%)
시료농도(%)	인삼다당체 진산	PG-프락탄
1×10^-7	5	11
1×10^-6	11	23
1×10^-5	17	49
1×10^-4	25	58
1×10^-3	39	71
1×10^-2	46	84
1×10^-1	51	98

표 2로부터, 인삼다당체 진산을 처리한 섬유아세포에 비하여, PG-프락탄을 처리한 섬유아세포의 증식 효능이 훨씬 높음을 알 수 있다.

2) 각질형성세포(Keratinocyte)의 증식효능 측정

각질형성세포를 사용하여 시험예 1에서와 동일한 방법으로 각질형성세포의 증식효능을 측정하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

시료농도(%)	각질형성세포 증식능(%)
시료농도(%)	인삼다당체 진산	PG-프락탄
1×10^-7	3	14
1×10^-6	8	19
1×10^-5	12	27
1×10^-4	17	35
1×10^-3	21	43
1×10^-2	26	49
1×10^-1	29	56

상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 인삼다당체 진산을 처리한 각질형성세포에 비하여, PG-프락탄을 처리한 각질형성세포는 약 2배 정도 향상된 증식 효능을 나타내었다.

3) 섬유아세포의 콜라겐 합성능 측정

인체 섬유아세포를 24공 평판배양기에 배양한 후, 실시예 1과 2와 동일한 시료를 사용하여, 배양배지로 1/10씩 순차적으로 희석하여 첨가하였다. 배양 3일째에 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM배지를 각 well당 0.5㎖씩 첨가한 후, L[2, 3, 4, 5-³H]-프롤린 10Ci를 첨가하였다. 24시간 경과 후, 각 well에 들어있는 배지와 세포들을 모아 5% 삼염화식초산(TCA; Trichloroacetic acid) 용액에 넣어 수세한 후, 2개의 시험관에 분주하고, 1개의 시험관에는 타입 I 콜라게나제(type I collagenase) 1unit/㎕를 넣고 37℃ 온도에서 90분간 배양하였으며, 다른 시험관은 4℃에서 보관하였다. 그 후, 모든 시험관에 50% TCA를 0.05㎖씩 첨가하고 4℃에서 20분간 방치한 다음, 각각 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여, 각각의 상등액과 침전물을 액체 신틸레이션 계수기(LSC; Liquid Scintillation Counter)로 디피엠(DPM; decay per minute)값을 얻어, 하기 수학식 1에 의거하여, 상기 시험예에서와 동일한 대조군과 실험군에 대해 콜라겐 생합성 값(RCB ; Relative Collagen Biosynthesis)을 구하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

시료농도(%)	콜라겐 증식능(%)
시료농도(%)	인삼다당체 진산	PG-프락탄
1×10^-7	2	13
1×10^-6	5	23
1×10^-5	9	34
1×10^-4	13	53
1×10^-3	19	61
1×10^-2	24	69
1×10^-1	27	73

상기 표 4의 결과로부터, 인삼다당체 진산을 처리한 섬유아세포에 비하여, PG-프락탄을 처리한 섬유아세포는 약 3배정도 향상된 콜라겐 생합성 촉진효능을 나타냄을 알 수 있다.

4) 인체 피부를 대상으로 한 피부 주름개선 효과

35~45세의 안면주름이 있는 시험대상자 30명에 대하여, 상기 제조예 5와 6의 영양크림을 주고, 피부주름 개선효과를 비교 평가하게 하였다. 피검자의 안면 좌부에는 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄을 2% 함유한 영양크림을, 우부에는 비교예 2의 전분을 1% 함유한 영양크림을 3개월간 사용하게 하였으며, 영양크림 사용 이전에 안면 양쪽부의 피부 상태를 측정해 놓고, 3개월 후 동일부위를 재측정하는 방법으로 피부주름의 변화를 측정하였다. 피부측정은 온도 24℃, 상대습도 40%의 항온실습실에서 하였으며, 눈꼬리 부위의 주름을 레플리카(replica)로 떠서, 비시오메타 시스템 (Visiometer system; C+K사)으로 피부주름을 측정하였다. 피부주름의 변화량은 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

(상기 식에서, Tdi; D90에서의 측정부위 값이며, Tdo; D0에서의 측정부위 값이다. )

상기 식에 따라, 계산한 결과, 비교예 2를 사용한 부위의 피부주름은 24 ±10%(평균 ±표준편차)의 감소치를 나타낸 반면, 제조예 5를 사용한 부위의 피부주름은 36 ±12%, 제조예 6을 사용한 부위의 피부주름은 63 ±15% 의 감소치를 보여, 본 발명의 화장료가 우수한 피부주름 개선효과가 있음을 알 수 있었다.

상기한 시험 결과들로부터, 본 발명의 PG-프락탄은 기존의 인삼추출물에 비해 피부의 각질형성세포(Keratinocyte) 및 섬유아세포(Fibroblast)의 증식효능이 우수하며, 이로 인한 콜라겐의 생합성 촉진작용을 통해 피부노화를 방지하는 효과가 우수함을 알 수 있다.

(시험예 2) 피부면역증강효능 시험

8∼10주령의 C57BL/6 생쥐를 대상으로 복부를 면도한 다음 FS-20 sun lamp를 이용하여 자외선 B파장을 (UVB) 2.4KJ/m²로 조사하면 접촉성 과민반응(contact hypersensitivity) 이 정상군에 비해 44.3% 억제되는 면역억제현상을 초래하게 된다. 따라서 본 발명의 제조예 5와 6을 UV 조사후 도포하고 3일이 경과한 다음 UV조사 영역에 3% 삼질소염화벤젠(trinitrochlorobenzene)으로 감작시킨다. 6일 후 1%의 삼질소염화벤젠을 생쥐의 귀에 도포하고 부종 상태를 측정하였다. 피부면역증강효과는 다음과 같은 수식에 의해 계산하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

제조예 도포 및 UVB 조사군의 귀 부종 두께 - UVB 조사군의 귀 부종 두께-------------------------------------------------------------------- ×100정상군의 귀 부종 두께 - UVB 조사군의 귀 부종 두께

자외선 B 조사	처치군	TNCB감작	귀 부종 두께(x 0.01mm)	피부면역증강효과(%)
-	-	-	4.8	-
-	-	+	31.4	-
2.4	-	+	14.0	-
2.4	비교예 2	+	14.4	2.3
2.4	제조예 5 (0.1mg/ml)	+	23.1	52.3
2.4	제조예 5(0.5mg/ml)	+	27.4	77.0
2.4	제조예 5(2.5mg/ml)	+	28.5	83.3
2.4	제조예 6(0.1mg/ml)	+	23.6	55.2
2.4	제조예 6(0.5mg/ml)	+	27.9	79.9
2.4	제조예 6(2.5mg/ml)	+	29.2	87.4

(시험예 3) 항산화효과 측정 시험

1) 크산틴옥시다아제 법

제조예 1에서 제조된 인삼추출물 진산과 PG-프락탄 1%용액을 이용하여 항산화효과를 측정하였다.

본 발명에서는 항산화효과를 측정하기 위하여 크산틴과 크산티옥시다제에 의하여 생성하는 활성산소가 본 발명에 의한 추출물에 의하여 제거되는 효과, 즉 활성산소효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitrobluetetrazolium: NBT)과 반응하여 이것에 의하여 생성하는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소량을 측정한다.

시험시약 :

가) 0.05M Na₂CO₃ 완충액(분자량 105.99) 2.4ml

탄산나트륨 5.25g(50mM)을 정제수에 용해한 용액과 50mM NaHCO₃(분자량 84.01) 용액을 혼합하여 pH 10.2로 한다.

나) 3mM 크산틴 용액 0.1ml

크산틴(분자량 152.11) 45.6mg을 물에 용해하여 10ml로 한다.

다) 3mM EDTA 용액 0.1ml

에틸렌디아민4초산나트륨(분자량 60.1)을 증류수에 용해하여 3mM로 한다.

라) 0.15% BSA 용액 0.1ml

BSA(Fration V, Powder, Sigma) 15mg을 증류수에 용해하여 10ml로 한다.

마) 0.75mM NBT 용액 0.1ml

니트로블루테트라졸리움(분자량 817.65) 61.32mg을 증류수에 용해하여 10ml로 한다.

바) 크산틴옥시다제 용액 0.1ml

크산틴옥시다제를 증류수로 약 100배 희석하고 측정조작에서 공시험의 흡광도가 0.2∼0.23의 범위에 들도록 한다. 흡광도의 변화가 A560=0.3/20분이 되게 한다.

사) 6mM 염화구리 용액 0.1ml

염화구리(분자량 134.55) 102.29mg을 증류수에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법 :

1) 바이엘병에 가, 나, 다, 라, 마를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml를 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

2) 바를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간 배양을 개시한다.

3) 그 후 사를 가하여 반응을 중지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

4) 공 시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.

5) 공 시험용액은 바 대신 증류수를 사용하여 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

항산화효과는 다음과 같이 산출한다.

억제율 (%) = (1-(St-So_/Bt-Bo) ×100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공 시험액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공 시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

본 실험에서 사용한 시료는 실시예 1과 2의 인삼추출물 진산과 PG-프락탄을 사용하여 시험하여 평균화한 결과 값이며 본 발명의 액상 추출물에서 항산화효과가 가장 크게 나타났다.

시료농도(%)	항산화능(%)
시료농도(%)	인삼다당체 진산	PG-프락탄	가용성 전분
1×10^-7	11	19	3
1×10^-6	26	37	5
1×10^-5	32	48	11
1×10^-4	45	69	15
1×10^-3	79	88	21
1×10^-2	83	93	28
1×10^-1	82	96	32

(시험예 4) 자유라디칼 소거능

상기 실시예 1과 2에서 얻은 인삼추출물 진산과 PG-프락탄에 대하여 자유라디칼 소거능을 다음과 같이 측정하였다. 블로이스에 의한 내춰 잡지(Blois, M. S. Nature) 181호 1190쪽, 1958년에 기재된 1,1-디페닐-2-피크릴-히드라진(DPPH)의 방법을 사용하여 수행하였다. 상기 DPPH는 비교적 안정한 자유라디칼로서, 라디칼 상태로 존재시에는 517㎚에서 최대 흡광을 보이며 소거되면 흡광성을 잃는다.

DPPH는 시그마사의 제품을 사용하였으며, 0.15mM의 농도로 메틸알코올에 녹여 사용하였다. 먼저 상기 실시예 1과 2의 인삼다당체 진산과 PG-프락탄을 각 농도별(1㎍/㎖ - 100㎍/㎖)로 제조하여 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 100㎕씩 넣었다. 여기에 DPPH용액을 100㎕씩 첨가한 다음 상온에서 30분간 방치한 후 마이크로 플레이트 리이더(Micro plate reader, 바이오텍 EL-340)를 이용하여 517㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군으로는 인삼다당체 진산과 PG-프락탄 대신 같은 농도의 전분용액 100㎕를 넣은 것을 사용하였다.

상기 표 6의 결과에서 알 수 있듯이 인삼다당체 진산과 PG-프락탄은 매우 강력한 자유라디칼 소거제임을 알 수 있다.

실시예 1과 2에서 얻은 인삼다당체 진산과 PG-프락탄을, 다음과 같이 배양된 세포를 이용하여 자외선에 의하여 발생된 자유라디칼에 의한 세포내 지질 과산화 억제작용을 시험하였다. 상기 시험은 V79-4라고 하는 헴스터 유래 섬유아세포종 세포를 사용하여 수행하였다. 배지는 DMEM에 10%의 소혈청을 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기 세포를 60㎜의 세포배양 페트리디쉬에 2 × 10⁵개 세포/디쉬의 농도로 접종하여 3일간 배양하였다. 배양시 상기 인삼다당체 진산과 PG-프락탄을 배양액에 첨가하여 배양하였다. 3일 후 배지를 따라 버리고, PBS 용액으로 2번 씻은 다음 1㎖의 PBS 용액을 배양용기에 첨가해준 후 일정한 광량(15J/㎠)의 자외선 A를 조사해 주었다. 조사 직후 PBS 용액을 탄닌계 물질을 포함하는 정상적인 배지로 바꾸고 24시간동안 더 배양하였다.

또한, 세포에 생성된 지질 과산화물의 정량은, 티오바르비투르산(TBA)의 반응성을 이용하여 수행하였으며, 시험 방법은 다음과 같다(카리 피이 등, 저널 오브 인베스트먼트 오브 더마톨로지 (J. Invest. Dermatol.), 96호, 255-259쪽, 1991년). 먼저 세포를 셀스크랩퍼를 이용하여 페트리디쉬에서 떼어내었다. 떼어난 세포를 1㎖의 균질화된 완충액에 현탁시킨 후 유리 호모게니저를 이용하여 분쇄하였다. 이 세포 분쇄액 0.5㎖에 30% 삼염화식초산(TCA) 용액 0.5㎖와 50㎕의 2% 부틸화 히드록시톨루엔(BHT) 에탄올 용액을 가하였다. 여기에 0.5㎖의 TBA 수용액(375㎎/㎖)을 가한 후 끓는 물에서 중탕으로 15분간 끓였다. 이것을 냉각한 후 535㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 자외선을 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 기준으로 하여 표 7에 나타내었다.

인삼다당체 진산과 PG-프락탄의 세포 지질 과산화 억제 작용

시 료	A535(대조군의 %)	저 해 율 (%)
대조군(정상군)	100	-
물질 미첨가(자외선 조사군)	172±3.9	0
인삼다당체 진산 (100㎍/㎖) +자외선 조사군	137±4.4	51
인삼다당체 진산 (200㎍/㎖) +자외선 조사군	122±3.3	70
PG-프락탄 (100㎍/㎖) +자외선 조사군	124±3.1	67
PG-프락탄 (200㎍/㎖) +자외선 조사군	112±5.8	83

상기 표 7의 결과에서 알 수 있듯이, 인삼다당체 진산과 PG-프락탄은 자외선에 의한 세포막 지질의 과산화를 매우 효과적으로 막아줄 수 있다. 즉, 인삼다당체 진산과 PG-프락탄은 자외선에 의한 자유라디칼 생성 및 지질 과산화를 억제함으로써 노화방지 및 주름방지 등에 사용될 수 있음을 의미한다.

상기 제조예 1∼6에서 얻은 화장품에 대하여 자외선에 의한 피부 광노화 억제 효과를 다음과 같이 실험하였다. 약 10주된 무모 생쥐(hairless mouse) 90마리를 10 마리씩 9개군으로 나눈 다음, 자외선 등(웨스팅하우스 FS-40 선램프)을 이용하여 30 mJ/㎠의 광량으로 일주일에 3번씩 12주간 자외선 B를 조사하였다. 한편 조사 2시간 전 3개의 실험군에 제조예 1, 3, 5를, 다른 3개의 실험군에 제조예 2, 4, 6을, 다른 3개의 군에는 각각의 기제를 도포하였다. 주름 발생의 정도는 마지막 자외선 조사가 끝나고 1주일 후 판정하였다. 판정기준은 각각의 기제 도포 대조군과 비교하여 개선없음, 약간의 개선, 중등도의 개선, 상당한 개선의 4 단계로 판정하였으며, 그 결과는 표 8에 나타내었다.

자외선에 의한 주름 발생 억제 효과 (마리수)

시 료		개선없음	약간의 개선	중등도의 개선	상당한 개선
진산	제조예 1	1	4	3	2
	제조예 3	1	2	4	3
	제조예 5	0	2	5	3
진산 + PG-프락탄	제조예 2	0	2	5	3
	제조예 4	0	2	4	4
	제조예 6	0	1	5	4

상기 표 8에서 알 수 있듯이 본 발명에 따른 실시예들은 무모 생쥐에서 자외선에 의한 주름 생성을 효과적으로 막아주었다. 이 결과는 본 발명에 따른 물질을 피부에 도포 외용제로 사용하였을 때 자외선에 의한 광노화를 효과적으로 방지 또는 경감해 줄 수 있다는 것을 의미한다.

(시험예 5) 광접촉에 의한 손상피부 회복효과 측정 시험

자외선 조사후 손상피부 회복효과는 솔라 시뮬레이터(solar simulator)를 이용하여 10명의 시험자들의 양쪽팔에서 최소 홍반량을 측정하였다. 우선, 홍반을 유발하기 위해 시험자들의 양쪽팔에 자외선(UV)을 FDA 방법에 의거하여 조사하였다.

자외선 조사후 8, 16, 24, 48시간 이후 제조예 1∼8 및 비교예 1∼2를 시험자의 한쪽팔에 도포하였고, 다른쪽 팔에는 증류수를 도포하였다. 자외선 전후에 피부색을 측정하였다. 자외선 조사후 전 피부색을 100으로 조정하고 상대적으로 홍반지수를 측정하였다. 아노바 테스트(Anova test) 통계유의는 p<0.05이다.

진산 및 PG프락탄 함유 화장료와 비교예의 화장료와의 자외선 조사후 피부 손상 회복 효과 (n = 10)

시료명	홍반지수(Erythema index)
	8시간	16시간	24시간	48시간
제 조 예 1	127.18 ±20.0	155.67 ±15.9	148.63 ±18.7	139.71 ±22.4
제 조 예 3	125.08 ±15.2	148.72 ±19.2	142.28 ±17.9	126.25 ±30.9
제 조 예 5	123.47 ±30.2	144.68 ±31.5	138.67 ±24.3	125.88 ±26.1
제 조 예 7	124.08 ±18.5	145.04 ±16.8	138.02 ±19.1	126.06 ±31.5
제 조 예 2	127.18 ±21.3	151.67 ±14.8	139.63 ±22.4	126.71 ±28.7
제 조 예 4	126.41 ±19.7	144.14 ±15.3	135.10 ±24.2	125.44 ±19.2
제 조 예 6	125.82 ±25.7	141.30 ±24.1	130.67 ±15.6	121.46 ±31.3
제 조 예 8	125.29 ±27.3	140.15 ±23.8	132.18 ±15.5	120.59 ±22.8
비 교 예 1	150.78 ±20.0	197.87 ±20.9	195.35 ±21.1	175.88 ±26.3
비 교 예 2	148.98 ±21.8	195.78 ±21.9	192.78 ±17.2	174.14 ±18.9

(시험예 6) 피부 보습효과 측정 시험

피부 보습효과는 대표적으로 보습제인 히아론산과 비교하였다. 제조예 1∼8 및 비교예 1∼2 을 10명의 시험자들이 팔 안쪽에 도포하고 테이프를 붙였다. 피부수화는 처치전, 처치직후 및 처치 2시간 후 컨덕턴스를 측정하여 얻었다.

하이론산의 경우 피부보습율이 처치 직후 43%에서 처치 2시간 후에는 12%로 감소한 반면에 제조예 1∼8에서 제조된 진산 함유 화장수의 경우는 피부보습율이 처치직후 43%에서 처치 2시간 후에는 11%로 감소하였다. 한편 비교예 1에서 제조된 화장수의 경우는 피부보습율이 처치직후 43%에서 처치 2시간 후에는 28%로 감소하였다.

본 발명의 효과는 상기 시험예의 결과를 근거로 하여, 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄을 함유함으로서, 피부 세포의 증식 및 생합성 촉진효과, 피부면역증강효과, 항산화효과, 광접촉에 의한 손상피부 회복효과 및 피부 보습효과를 지닌 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 또한 상기 화장품 조성물은 통상의 기재 및 첨가제를 사용하여 크림, 화장수, 로션, 에센스, 맛사지 크림 및 팩 등의 화장품 제형으로 개발할 수 있다. 그러나, 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄을 함유한 화장료가 이들 제형으로만 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 화장품 조성물에 사용되는 인삼다당체 진산 및 PG-프락탄의 추출 정제과정을 나타낸 공정도이다.

도 2는 DEAE-음이온교환 크로마토그래피한 결과이다.

도 3은 겔여과 크로마토그래피한 결과이다.

도 4는 인삼다당체 진산의 적외선흡수 스펙트럼이다.

도 5는 PG-프락탄의 적외선흡수 스펙트럼이다.

도 6은 PG-프락탄의 수소 핵자기공명 스펙트럼이다.

도 7은 PG-프락탄의 탄소 핵자기공명 스펙트럼이다.

도 8은 PG-프락탄의 구조이다.

Claims

인삼근을 세절 건조 후, 에탄올로 추출하여 사포닌 등의 유기성 저분자들을 제거한 후 그 잔사를 물로 추출하고 동결건조시켜 수용성 분말을 수득한 후 이를 물에 재용해한 후 수포화 저급지방족알코올로 포화 침전시켜 수득된 물질을 투석시켜 제조된 인삼추출 다당체인 진산, 상기 진산을 순수히 정제한 PG-프락탄 또는 이들의 혼합물을 화장품 총 중량 중 0.00001∼60 중량%를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 손상피부 회복효과를 지닌 화장품 조성물
제 1항에 있어서, 인삼추출 다당체인 진산 및 PG-프락탄의 함량은 화장품 총 중량 중 0.01∼30.0 중량%임을 특징으로 하는 화장품 조성물
제 1항에 있어서, 상기 화장품 조성물중 진산과 PG-프락탄의 함량 중량비는 20∼100 : 0∼80임을 특징으로 하는 화장품 조성물
제 1항의 화장품 조성물에 통상의 기재 및 첨가제를 사용하여 제조된 크림, 화장수, 로션, 에센스, 맛사지 크림 및 팩 등