KR100507431B1 - 종양괴사인자-γ - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 TNF-γ 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA(RNA) 및 상기 폴리펩타이드를 재조합 기술에 의해 제조하는 방법을 기술한다. 또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드를, 예를 들어 종양 또는 암종에서의 세포 성장을 억제하는데 사용하고, 감염에 대한 내성을 제공하고, 염증성 활성을 유도하여 상처를 치료하고, 특정 세포 유형의 성장을 자극하여 재발협착증과 같은 질환을 치료하는 방법을 기술한다. 또한 본 발명은 TNF-γ 핵산 서열내의 돌연변이 또는 TNF-γ 폴리펩타이드의 과다발현을 검출하는 진단 방법을 기술한다. 또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드에 대한 항체 및 악액질, 패혈증 쇼크, 대뇌의 말라리아, 염증, 관절염 및 이식조직 거부반응을 치료하기 위한 치료제로서의 이의 용도를 기술한다.

Description

종양 괴사 인자-γ {Tumor Necorsis Factor-γ}

본 발명은 새롭게 동정된 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 용도, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명의 폴리펩타이드는 종양 괴사 인자 계열의 신규한 구성원으로서 동정되어 있고, 이후 "TNF-γ"로서 언급된다. 또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드의 작용 억제에 관한 것이다.

사람 종양 괴사 인자 α(TNF-α) 및 β(TNF-β 또는 림포톡신)은 인터페론(interferon), 인터류킨(interleukin) 및 성장 인자를 포함하여 총괄적으로 사이토카인(cytokine)이라 불리는 광범위한 부류의 폴리펩타이드 매개체중 관련 구성원이다[참조: Beutler, B. and Cerami, A., Annu. Rev. Immunol., 7: 625-655(1989)].

종양 괴사 인자(TNF-α 및 TNF-β)는 본래 이의 항종양 활성의 결과로서 발견되었으나, 현재 이는 면역 조절 및 염증에서 중요한 작용을 하는 다형질발현성 사이토카인으로서 인지되고 있다. 오늘날, TNF-관련 사이토카인 계열의 8개 구성원, 즉 TNF-α, TNF-β(림파톡신-α), LT-β, 및 Fas, CD30, CD27, CD40 및 4-1BB 수용체에 대한 리간드가 공지되어 있다. TNF-β를 제외한 이들 단백질은 막 앵커로서 종종 사용되는 보존된 C-말단 서열 및 가변성 N-말단 서열을 갖는다. TNF-α 및 TNF-β 둘 다는 TNF 수용체에 결합할 경우 동형삼량체로서 작용한다.

TNF는 단세포, 섬유아세포, T 세포, 자연 킬러(natural killer(NK)) 세포를 포함하여, 여러 종류의 세포 및 주로 활성화 대식세포에 의해 생성된다. TNF-α는 종양의 신속한 괴사, 면역자극, 자가면역 질환, 이식조직 거부반응, 바이러스성 반응을 형성하는 기생충에 대한 내성, 패혈증 쇼크, 성장 조절, 혈관 내피 작용 및 대사 작용에서 역할을 한다고 보고되어 왔다. TNF-α도 PAI-1, IL-1, GM-CSF 및 IL-6을 포함하여, 여러 인자들을 분비하도록 내피 세포를 자극하여 세포 증식을 촉진시킨다. 또한, TNF-α는 E-셀렉틴, ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 다양한 세포 유착 분자를 상향-조절한다. TNF-α 및 Fas 리간드도 예정된 세포 사멸을 유도한다고 밝혀졌다.

TNF 또는 LT에 의해 조절되는 다양한 세포성 반응 유도의 제1 단계는 이들이 특이적 세포 표면 수용체에 결합하는 것이다. 약 55-KDa(TNF-R1) 및 75-KDa(TNF-R2)인 두 개의 상이한 TNF 수용체는 동정되어 있고[참조: Hohman, H.P. et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934(1989)], 두 종류의 수용체에 상응하는 사람 및 마우스 cDNA가 분리되어 특성이 기술되어 있다[참조: Loetscher, H. et al., Cell, 61:351(1990)]. 두 개의 TNF 수용체는 세포외, 트랜스막 및 세포내 영역을 포함하는 세포 표면 수용체의 전형적인 구조를 공유한다.

하기 도면은 본 발명의 양태를 예시하지만, 청구의 범위에 포함되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1은 cDNA 및 본 발명의 폴리펩타이드의 상응하는 추정된 아미노산 서열을 예시한다. 처음 25개의 아미노산(밑줄)은 추정의 리더(leader) 서열이다. 아미노산에 대해 표준 일문자 약어를 사용한다.

도 2는 TNF-γ 및 TNF 계열의 나머지 구성원 간의 아미노산 서열 배열을 예시한다. TNF-γ는 그늘진 영역에 의해 나타낸 바와 같은 TNF 계열의 보존된 아미노산 잔기를 함유한다.

도 3A는 TNF-γ가 발현되는 사람 조직을 나타내는 RNA 블롯(blot) 분석이다. 지시된 조직으로부터의 RNA는 표지된 TNF-γ cDNA로 프로브된다. 도 3A에서 뚜렷한 밴드를 나타내므로 TNF-γ mRNA는 주로 신장에 존재한다. 다른 레인은 우세한 하이브리드화를 나타내는 것처럼 보이나, 이는 사실상 비특이적 얼룩이다.

도 3B는 TNF-γ가 레인 9의 HUVEC 세포(사람 제대 정맥 내피 세포; human umbilical vein endothelial cell)에서 주로 발현된다는 것을 나타내는 RNA 블롯 분석이다. 레인 6 및 레인 8은 비특이적 얼룩이다. 지시된 세포주로부터의 RNA는 표지된 TNF-γ cDNA로 프로브된다. 레인 1은 CAMA1(유방암); 레인 2는 AN3CA(자궁암); 레인 3은 SK.UT.1(자궁암); 레인 4는 MG63(골아세포종); 레인 5는 HOS(골아세포종); 레인 6은 MCF7(유방암); 레인 7은 OVCAR-3(난소암); 레인 8은 CAOV-3(난소암); 레인 9는 HUVEC; 레인 10은 AOSMIC(평활근); 레인 11은 포피 섬유아세포이다.

도 4는 세균성 발현 및 정제에 의해 제조된 TNF-γ를 전기영동시킨 후의 겔 사진이다.

도 5는 TNF-γ의 바쿨로바이러스 발현 후의 겔 사진이다.

도 6A는 무처리된 WEHI 164 세포(상단 좌측) 및 TNF-α, TNF-β 및 TNF-γ에 노출된 후의 WEHI 164 세포의 사진이다. 신장된 비원형 형태의 세포는 용해된 것이다. 첨가된 TNF는 약 0.5μg/ml이다. TNF의 첨가 후에 72시간 경과하여 사진촬영한다.

도 6B는 WEHI 164 세포 성장을 억제하는 TNF-γ의 능력을 TNF-α 및 TNF-β와 비교하여 예시한다.

도 7은 WEHI 164 세포 사멸을 유도하는 재조합 TNF-γ, TNF-α 및 TNF-β의 능력을 예시한다.

도 8은 L929 세포에서 형태 변화를 유도하는 재조합 TNF-α, TNF-β 및 TNF-γ의 능력을 예시한다. 형태 변화는 검은 원형 세포로 나타난다. 이. 콜라이(E. coli)에서 제조된, 약 0.5μg/ml의 재조합 TNF로 세포를 처리한다. TNF의 첨가후에 72시간 경과하여 사진촬영한다. 형태 변화는 세포가 사멸되었음을 나타낸다.

도 9는 정맥 내피 세포에 미치는 TNF-γ, TNF-α 및 TNF-β의 효과를 그래프상으로 예시한다. 정맥 내피 세포를 시판용 TNF-α 및 TNF-β 및 이. 콜라이에서 제조된 TNF-γ로 처리한 후의 세포 증식을 MTS 분석을 사용하여 정량한다.

도 10은 HL60 세포의 사진이고, 대조군은 HL60 세포가 분산되어 있다는 것을 나타낸다. TNF-α 및 TNF-γ는 하단 우측에서 서로 유착된 세포에 의해 예시된 바와 같이 세포 유착 및 세포-세포 접촉을 유도한다.

도 11은 TNF-γ가 두 개의 공지된 가용성 TNF 수용체, 즉 sTNF RⅠ(p55) 및 sTNF RⅡ(p75)에 현저하게 결합하지 않는다는 것을 예시한다.

본 발명의 한 측면에 따라, 도 1의 추정된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩타이드 또는 1994년 10월 26일자로 ATCC 기탁번호 제75927호로서 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산(폴리뉴클레오타이드)가 제공된다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 사람 신장 및 제대 정맥 내피 세포로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 사람 제대 정맥 내피 세포로부터 유도되는 cDNA 라이브러리 중에서 발견된다. 이는 구조적으로 TNF 계열에 관련된다. 이는, 성숙한 단백질이 149개의 아미노산을 포함하도록 처음 약 25개의 아미노산 잔기가 추정적 리더 서열이 되는, 174개의 아미노산 잔기의 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유한다. 상기 단백질은 래빗 TNF-α과 111개의 아미노산 스트렛치에 걸쳐 38%의 상동성 및 58%의 유사성을 가지며 C-말단에서 가장 높은 상동성을 나타낸다. TNF 계열의 구성원들을 통해 보존되는 서열은 TNF-γ에서도 보존된다(참조: 도 2). 굵게 표시한 문자는 보존된 아미노산 잔기를 나타낸다. TNF-γ mRNA는 도 3B의 RNA 블롯 분석에서 나타낸 바와 같은 사람 제대 정맥 내피 세포에서 특이적으로 발현된다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA 형태 또는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. 상기 DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있고, 일본쇄일 경우 암호화쇄 또는 비암호화(안티-센스)쇄일 수 있다. 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 서열은 도 1에 나타낸 암호화 서열 또는 기탁된 클론의 암호화 서열과 동일하거나, 유전자 암호의 중복성(redundancy) 또는 축퇴성(degeneracy)의 결과로서 암호화 서열이 도 1의 DNA 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 상이한 암호화 서열일 수 있다.

도 1의 성숙한 폴리펩타이드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 단지 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열; 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열 및 리더 또는 분비 서열 또는 프로단백질 서열과 같은 추가의 암호화 서열; 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열(및 임의로 추가의 암호화 서열) 및 인트론과 같은 비암호화 서열 또는 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열의 비암호화 서열 5' 및/또는 3'을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

따라서, 용어 "폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드"는 단지 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 추가의 암호화 및/또는 비암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

또한 본 발명은 도 1의 추정된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체를 암호화하는 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 변이체는 폴리뉴클레오타이드의 자연 발생 대립인자 변이체 또는 폴리뉴클레오타이드의 비자연 발생 변이체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 도 1에 나타낸 바와 동일한 성숙한 폴리펩타이드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 동일한 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 도 1의 폴리펩타이드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드의 변이체를 포함한다. 상기 뉴클레오타이드 변이체는 결실 변이체, 치환 변이체 및 부가 또는 삽입 변이체를 포함한다.

상기 나타낸 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 도 1에 나타낸 암호화 서열 또는 기탁된 클론의 암호화 서열의 자연 발생 대립인자 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 대립인자 변이체는 암호화된 폴리펩타이드의 작용을 실질적으로 변화시키지 않는, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 치환, 결실 또는 부가시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열의 대체 형태이다.

또한 본 발명은 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열이 숙주 세포로부터 폴리펩타이드의 발현 및 분비를 보조하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 세포로부터 폴리펩타이드의 전달을 조절하는 분비 서열로서 작용하는 리더 서열과 동일한 리딩 프레임에서 융합될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩타이드는 프리단백질이고, 숙주 세포에 의해 절단되어 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 형성시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 성숙한 단백질 + 추가의 5' 아미노산 잔기인 프로단백질을 암호화할 수도 있다. 프로서열을 갖는 성숙한 단백질은 프로단백질이고 불활성 형태의 단백질이다. 프로서열이 절단되면 활성의 성숙한 단백질은 보존된다.

따라서, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 성숙한 단백질, 또는 프로서열을 갖는 단백질 또는 프로서열 및 프리서열(리더 서열)을 모두 갖는 단백질을 암호화할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드를 정제하도록 하는 마커 서열과 프레임내에서 융합된 암호화 서열을 가질 수도 있다. 마커 서열은 세균성 숙주의 경우에 마커와 융합된 성숙한 폴리펩타이드를 정제하기 위해 pQE-9 벡터에 의해 공급되는 헥사히스티딘 태그(tag)일 수 있거나, 예를 들어 COS-7 세포와 같은 포유류 숙주가 사용될 경우 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프(epitope)에 상응한다[참조: Wilson, I., et al., Cell, 37:767(1984)].

또한 본 발명은 서열간의 동일성이 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상일 경우, 상기 기술된 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "엄격한 조건"이란 서열간의 동일성이 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상일 경우에만 하이브리드화가 발생하는 것을 의미한다. 바람직한 양태에서 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 도 1의 cDNA 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩타이드를 암호화한다.

본 발명에서 언급된 기탁물은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 협약하에 유지된다. 이들 기탁물은 단지 당해 기술분야의 숙련가에게 편의를 제공하는 것이지 기탁이 35 U.S.C. §112하에 필요로 하는 승인은 아니다. 기탁된 물질에 함유된 폴리뉴클레오타이드의 서열, 및 이에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 본 명세서에서 참조로 인용되고 본 명세서에서 서열의 기술과 상충되는 경우에 조정한다. 실시권은 기탁된 물질을 제조, 사용 또는 판매하는데 필요할 수 있는데, 어떠한 실시권도 본원에 의해 승인되지 않는다.

또한 본 발명은 도 1의 추정된 아미노산 서열 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 TNF-γ 폴리펩타이드, 및 상기 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체에 관한 것이다.

도 1의 폴리펩타이드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 관해 언급할 경우, 용어 "단편", "유도체" 및 "동족체"는 상기 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 동족체는 프로단백질 부분의 절단에 의해 활성화되어 활성의 성숙한 폴리펩타이드를 생성할 수 있는 프로단백질을 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드, 천연 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드, 바람직하게는 재조합 폴리펩타이드일 수 있다.

도 1의 폴리펩타이드 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체는 (ⅰ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존되거나 보존되지 않는 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고 상기 치환된 아미노산 잔기가 유전자 암호에 의해 암호화된 것이거나 아닐 수 있는 것, 또는 (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환체 그룹을 포함하는 것, 또는 (ⅲ) 성숙한 폴리펩타이드가 또다른 화합물, 예를 들어 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 것, 또는 (ⅳ) 부가 아미노산이 리더 또는 분비 서열 또는 성숙한 폴리펩타이드의 정제에 사용되는 서열 또는 프로단백질 서열과 같은 성숙한 폴리펩타이드와 융합되는 것일 수 있다. 상기 단편, 유도체 및 동족체는 본 명세서의 교시로부터 당해 기술분야의 숙련가의 범주내에 있다고 간주된다.

본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되고, 바람직하게는 동종성으로 정제된다.

용어 "분리"란 당해 물질을 이의 본래 환경(예: 자연 발생의 경우에는 자연 환경)으로부터 제거함을 의미한다. 예를 들어, 살아 있는 동물내에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않으나, 자연계내에 공존하는 특정 또는 모든 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부분일 수 있고/있거나 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부분일 수 있고, 또한 상기 벡터 또는 조성물은 이의 자연 환경의 일부분이 아니므로 분리될 수 있다.

또한 본 발명은, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터로 유전공학적으로 조작된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

숙주 세포를, 예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는, 본 발명의 벡터로 유전공학적으로 조작(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)한다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 입자, 파아지 등의 형태일 수 있다. 조작된 숙주 세포를 프로모터의 활성화, 형질전환체의 선택 또는 TNF-γ 유전자의 증폭에 적합하도록 개질된 통상적인 영양 배지에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이미 사용된 것이고, 통상적으로 숙련된 기술자에게 명백할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 기술에 의해 폴리펩타이드를 제조하는데 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 다양한 발현 벡터중의 하나에 포함될 수 있다. 상기 벡터는 염색체성, 비염색체성 및 합성 DNA 서열, 예를 들어 SV40의 유도체; 세균성 플라스미드; 파아지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드 및 파아지 DNA의 조합으로부터 유도된 벡터, 백시니아, 아데노바이러스, 가금류 폭스 바이러스 및 슈도라비스와 같은 바이러스성 DNA를 포함한다. 그러나, 기타 어떠한 벡터라도 숙주내에서 복제가능하고 생존가능한 경우, 사용될 수 있다.

적합한 DNA 서열은 다양한 방법에 의해 벡터내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당해 기술분야에 익히 공지된 방법에 의해 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위 내로 삽입된다. 상기 방법 등은 당해 기술분야의 숙련가의 범주내에 있는 것으로 간주된다.

발현 벡터내의 DNA 서열은 적합한 발현 조절 서열(프로모터)에 작동적으로 연결되어 DNA 합성을 유도한다. 상기 프로모터의 대표적인 예로서, LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이 lac 또는 trp, 파아지 람다 PL 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스내에서 유전자 발현을 조절하는 것으로 공지된 다른 프로모터를 언급할 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 함유한다. 상기 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수도 있다.

또한, 발현 벡터는 바람직하게는 디하이드로폴레이트 리덕타제 또는 진핵 세포 배양에 대한 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이내에서의 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같은 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특성을 제공하는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 함유한다.

상기 기술된 바의 적절한 DNA 서열, 및 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 숙주가 단백질을 발현시키도록 하는 적절한 숙주를 형질전환시킬 수 있다.

적절한 숙주의 대표적인 예로서는, 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)과 같은 세균성 세포; 효모와 같은 진균성 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 Sf9와 같은 곤충류 세포; CHO, COS 또는 보웨스 흑색종과 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 식물 세포 등을 언급할 수 있다. 적절한 숙주의 선택은 본 명세서의 교시로부터 당해 기술분야의 숙련가의 범주내에 있다고 간주된다.

보다 특히, 본 발명은 상기 광범위하게 기술된 바와 같은 서열중 하나 이상을 포함하는 재조합 작제물도 포함한다. 상기 작제물은 본 발명의 서열을 전 또는 역 방향으로 삽입시킨, 플라스미드 또는 바이러스성 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 상기 양태의 바람직한 측면에서, 작제물은, 예를 들어 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열도 포함한다. 다수의 적합한 벡터 및 프로모터가 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있고, 시판되고 있다. 하기 벡터는 예로써 제공된다. 세균성: pQE70, pQE60, pQE-9(공급원: Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18a, pNH46A(공급원: stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(공급원: Pharmacia). 진핵성: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(공급원: Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(공급원: Pharmacia). 그러나, 임의의 다른 플라스미드 또는 벡터가 숙주내에서 복제가능하고 생존가능한 한 사용될 수 있다.

프로모터 영역은 CAT(Chloramphenicol transferase(클로람페니콜 트랜스퍼라제)) 벡터 또는 선택성 마커를 갖는 다른 벡터를 사용하여 바람직한 유전자로부터 선택될 수 있다. 두가지 적절한 벡터는 PKK232-8 및 PCM7이다. 특히 유명한 세균성 프로모터는 lacⅠ, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL 및 trp을 포함한다. 진핵성 프로모터는 CMV 이미디어트 어얼리(immediate early), HSV 티미딘 키나제, 어얼리 및 레이트(early and late) SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-Ⅰ을 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 충분히 당해 기술분야에서 통상적인 기술의 범주내이다.

추가 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유류 세포와 같은 고등 진핵 세포, 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵 세포일 수 있거나, 숙주 세포는 세균성 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 작제물의 숙주 세포로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 또는 전기천공(electroporation)에 의해 수행할 수 있다[참조: Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)].

숙주 세포내의 작제물은 통상적인 방법으로 사용되어 재조합 서열에 의해 암호화되는 유전자 생성물을 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 통상적인 펩타이드 합성기에 의해 합성적으로 생성할 수 있다.

성숙한 단백질은 적절한 프로모터의 조절하에 포유류 세포, 효모, 세균, 또는 다른 세포내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물로부터 유도된 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조하기 위해서는 무세포 번역 시스템을 사용할 수도 있다. 원핵 및 진핵 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에 기술되어 있고, 이의 기재내용은 본 발명의 명세서에 참조로 인용된다.

고등 진핵 세포에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 전사는 인핸서(enhancer) 서열을 벡터내로 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 통상적으로 약 10 내지 300bp의 DNA의 cis-작용 성분이며, 프로모터에 작용하여 이의 전사를 증가시킨다. 복제 기점 100 내지 270bp의 말단측 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 어얼리 프로모터 인핸서, 복제 기점의 말단측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 예로서 포함한다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기점 및 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선택성 마커, 예를 들어 이. 콜라이 및 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) TRP1 유전자의 암피실린 내성 유전자, 및 하부 구조 서열의 전사를 유도하는 고도 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 그 중에서도 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제, 또는 열 쇼크 단백질 등과 같은 해당 효소를 암호화하는 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이종성 구조 서열은 번역 개시 및 종결 서열, 바람직하게는 번역된 단백질을 외질 공간 또는 세포외 매질내로 분비할 수 있는 리더 서열과 함께 적절한 상으로 조립된다. 임의로, 이종성 서열은 바람직한 특성, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 간소화된 정제를 제공하는 N-말단 동정 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화시킨다.

세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 작용성 프로모터를 가진 작동성 리딩 상내로 적합한 번역 개시 및 종결 시그널과 함께 목적하는 단백질을 암호화하는 구조 DNA 서열을 삽입함으로써 작제된다. 상기 벡터는 하나 이상의 표현형 선택성 마커 및 복제 기점을 포함하여 벡터를 유지하고, 필요한 경우 숙주내에서 증폭을 제공한다. 형질전환을 위한 적합한 원핵 숙주는, 다른 것들이 선택적으로 사용될 수도 있지만, 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피뮤리움 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스, 및 스태필로코커스(Staphylococcus) 속을 포함한다.

대표적이나 제한하지 않는 예로서, 세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 익히 공지된 클로닝 벡터 pBR322의 유전자 성분(ATCC 37017)을 포함하는 시판용 플라스미드로부터 유도된 선택성 마커 및 세균성 복제 기점을 포함할 수 있다. 상기 상업용 벡터는, 예를 들어 pKK223-3(제조원: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 GEM1(제조원: Promega Biotec, Madison, WI, USA)을 포함한다. 상기 pBR322 "중축(backbone)" 영역은 적합한 프로모터 및 발현될 구조 서열과 조합된다.

적합한 숙주 균주를 형질전환시키고 적합한 세포 밀도로 숙주 균주를 성장시킨 다음, 선택된 프로모터를 적합한 방법(예: 온도 변화 또는 화학적 유도)에 의해 유도하고 세포들을 추가의 기간 동안 배양시킨다.

세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수확하고, 물리적 또는 화학적 방법에 의해 분쇄하고, 생성된 조 추출물을 추가 정제를 위해 유지한다.

단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는, 당해 기술분야의 숙련가에게 익히 공지된 임의의 통상적인 방법, 예를 들어 동결-해동 순환, 초음파 분해처리, 기계적 분쇄, 또는 세포 용해제의 사용에 의해 분쇄시킬 수 있다.

또한, 각종 포유류 세포 배양 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유류 발현 시스템의 예는, 문헌[참조: Gluzman, Cell, 23:175(1981)]에 기술된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 주, 및 적합성 벡터를 발현시킬 수 있는 기타 세포주, 예를 들어 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유류 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스(splice) 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열, 및 5' 플랜킹 비전사 서열을 포함한다. SV40 스플라이스, 및 폴리아데닐화 부위로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여 필요로 하는 비전사 유전자 성분을 제공한다.

TNF-γ 폴리펩타이드를 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수하고 정제할 수 있다. 단백질 리폴딩(refolding) 단계를, 필요한 경우 성숙한 단백질의 배열을 완성하는데 사용할 수 있다. 최종적으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 최종 정제 단계에 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 자연의 정제된 생성물, 또는 화학적 합성 과정의 생성물이거나, 원핵 또는 진핵 세포 숙주(예를 들어, 배양물중의 세균성, 효모, 고등 식물, 곤충류 및 포유류 세포에 의해)로부터 재조합 기술에 의해 제조할 수 있다. 재조합 제조 과정에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 글리코실화 또는 비글리코실화될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 개시 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.

본 발명의 TNF-γ 폴리펩타이드를 사용하여 종양 세포 성장 또는 신형성을 억제할 수 있다. TNF-γ 폴리펩타이드는 막 기포(발포작용), 사이토플라스마의 응축 및 내재성 엔도뉴클레아제(도 7)의 활성화를 특징으로 하는 세포 괴사를 통한 종양 사멸을 유도한다. 표 1에 나타낸 바와 같이, TNF-γ는 세포 증식 및 조절이 비정상적인 시험된 세포주, 예를 들어 섬유성육종 및 암종 세포주에 대해 강한 세포독성 활성을 가진다. 또한 이는 TNF-γ가 세포독성 활성을 통해 L929 및 WEHI 164 세포 성장을 억제하는 능력을 가진다는 것을 나타내는 도 6A, 6B, 및 8에 예시된다. WEHI 164 세포는 마우스 섬유성육종 세포이다. TNF-γ를 투여하는 바람직한 방법은 종양내로 직접 주사에 의한 것이다.

TNF-γ의 세포 유착 활성은 상처 치료에 사용할 수 있다. 표 1 및 도 9에 나타낸 바와 같이, TNF-γ는 TNF-γ가 상처 치료에서 작용한다는 징후인 강력한 내피 세포 증식 효과를 가진다. TNF-γ의 세포 유착 효과도 상처 치료에서 작용한다.

TNF-γ를 사용하여 성장 촉진 활성을 필요로 하는 질환, 예를 들어 재발협착증을 치료할 수도 있다. 상기 언급된 바와 같이, TNF-γ는 내피 세포 성장에 강한 증식 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다. 따라서, TNF-γ를 사용하여 조혈 및 내피 세포 발생을 조절할 수도 있다.

TNF-γ 폴리펩타이드는, T-세포의 활성화를 자극하는 이의 능력에 의해, 면역 반응의 중요한 매개체이다. 따라서, 이 폴리펩타이드를 사용하여 다양한 기생충, 세균 및 바이러스 감염에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. TNF-γ는 바이러스-감염 세포를 용해하므로, HIV 감염 세포의 성장을 정지시키기 위해 사용할 수 있다.

또한, TNF-γ 폴리펩타이드를 사용하여 T-세포 증식성 반응을 증진시킴으로써 Ⅰ형 당뇨병과 같은 자가면역 질환을 치료할 수 있다.

TNF-γ 활성의 요약

세포주	공급원 및 유형	활성
		세포독성	증식성	분화성	유착성
L929	마우스 섬유아세포	+	-	-	-
WEHI 164	마우스 섬유성육종	+++	-	-	-
NRK-54E	래트 신장 상피-유사체	+	-	-	-
THP-1	사람 단핵세포성 백혈병	+	-	++	++
HL-60	사람 전골수세포성 백혈병	-	-	-	++
Raji	사람 버키트 림프종	-	-	-	-
Jurkat	사람 T 세포 백혈병	++	-	-	-
Primary	사람 정맥 내피 세포	-	++	-	?
Primary	사람 동맥 내피 세포	+*	++	-	?
A-431	사람 표피유사 암종	++	-	-	-
293	사람 태아 신장	-	++	-	-
＊ 고도의 복용량에서만. +의 갯수는 활성의 상대적 수준을 나타낸다. -는 시험된 농도 범위에서 활성이 검출되지 않는다는 것을 나타낸다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 사람 질환에 대한 치료제 및 진단약을 발견하기 위한 조사 시약 및 물질로서 사용할 수 있다.

본 발명은 TNF-γ에 대한 수용체의 동정 방법을 제공한다. 수용체를 암호화하는 유전자는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 다수의 방법, 예를 들어 리간드 패닝(panning) 및 FACS 분류에 의해 동정할 수 있다[참조: Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Chapter 5, (1991)]. 바람직하게는, 발현 클로닝을 폴리아데닐화 RNA가 TNF-γ에 대한 반응성 세포로부터 제조되는 경우에 사용하고, 이 RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 풀(pool)로 분할하고 TNF-γ에 반응성이 없는 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염시키는데 사용한다. 유리 슬라이드 상에서 성장시킨 형질감염 세포를 표지된 TNF-γ에 노출시킨다. TNF-γ를 부위 특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 요오드화 또는 혼입을 포함하는 다양한 방법에 의해 표지할 수 있다. 고정 및 배양시킨 다음, 슬라이드를 방사능사진 분석에 적용시킨다. 양성 풀을 동정하여 서브-풀을 제조하고 반복 서브-풀링 및 재선별 방법을 사용하여 재형질감염시켜, 최종적으로 추정의 수용체를 암호화하는 단일 클론을 수득한다.

수용체 동정에 대한 또 다른 연구로서, 표지된 TNF-γ는 세포막과 연결된 광친화성 또는 수용체 분자를 발현시키는 추출물 제제일 수 있다. 가교-결합 물질을 PAGE에 의해 분리하고 X-레이 필름에 노출시킨다. TNF-γ-수용체를 함유하는 표지된 복합체를 분해하고, 펩타이드 단편으로 분리하고, 단백질 마이크로서열화(microsequencing)에 적용시킨다. 마이크로서열화로부터 수득된 아미노산 서열을 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 프로브 세트를 디자인하는데 사용하여 추정의 수용체를 암호화하는 유전자를 동정할 수 있다.

TNF-γ는 두 개의 가용성 TNF 수용체, sTNF-RⅠ(p55) 및 sTNF-RⅡ(p75)에 현저하게 결합하지는 않는다. 따라서, TNF-γ는 공지된 TNF 단백질의 활성을 포함하고 이에 부가적인 활성을 가질 수 있다(참조: 도 11).

또한 본 발명은 TNF-γ를 의태하거나(효능제) TNF-γ의 작용을 방지하는 것들을 동정하기 위한 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 예들은 코미토겐(comitogen) Con A의 존재하에 사람 내피 세포의 증식을 현저히 자극하는 TNF-γ의 능력을 이용한다. 내피 세포를 수득하여 Con-A(제조원: Calbiochem, La Jolla, CA) 2μg/ml의 존재하에 10% 열-비활성화 태아 소 혈청(제조원: Hyclone Labs, Logan, UT), 1% L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 10μg/ml 스텝토마이신, 0.1% 겐타마이신(제조원: Gibco Life Technologies, Grand Island, NY)가 보충된 PRM1 1640중의 96-웰 평저 배양 플레이트(제조원: Costar, Cambridge, MA)에서 배양한다. Con-A 및 스크리닝될 화합물을 최종 용적 0.2ml로 가한다. 37℃에서 60시간 동안 배양시킨 후에, 배양물을 [3H]티미딘 1μCi(5Ci/mmol; 1Ci = 37 BGq; NEN)로 12 내지 18시간 동안 펄스시키고 유리 섬유 여과기(제조원: PhD; Cambridge Technology, Watertown, MA) 상에서 수확한다. 3회 배양물의 평균 [3H]티미딘 혼입(cpm)을 액체 신틸레이션 카운터(제조원: Beckman Instruments, Irvine, CA)를 사용하여 측정한다. 현저한 [3H]티미딘 혼입은 내피 세포 증식의 자극을 나타낸다.

또한, TNF-γ와 수용체의 상호작용에 따른 공지된 제2 메신저 시스템의 반응을 측정하고 상기 화합물의 존재 또는 부재하에 비교한다. 상기 제2 메신저 시스템은 cAMP 구아닐레이트 사이클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시타이드 가수분해를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

길항제를 분석하기 위해서는 상기 기술된 분석에서 TNF-γ를 스크리닝될 화합물과 함께 가하여 수행하는데, TNF-γ의 존재하에 [3H]티미딘 혼입을 억제하는 상기 화합물의 능력은 상기 화합물이 TNF-γ의 길항제라는 것을 나타낸다. 또한, TNF-γ 길항제를 TNF-γ 및 잠재적인 길항제를 경쟁적 억제 분석에 적합한 조건하에 막-결합 TNF-γ 수용체 또는 재조합 수용체와 조합함으로써 검출할 수 있다. TNF-γ를 상기와 같이 방사활성에 의해 표지하여, 수용체에 결합된 TNF-γ의 수에 의해 잠재적인 길항제의 유효성을 측정할 수 있다.

또한, TNF-γ 수용체를 발현시키는 포유류 세포 또는 막 제제를 상기 화합물의 존재하에 표지된 TNF-γ와 함께 배양시킨다. 다음, 이 상호작용을 증진시키거나 억제하는 상기 화합물의 능력을 측정한다.

TNF-γ에 특이적인 항체는 TNF-γ에 결합하여 이것이 수용체에 결합하는 것을 방지함으로써 길항제로서 사용할 수 있다. 모노클로날 항체는 이 점에서 특히 효과적이다. 그러나, TNF-γ 수용체에 특이적인 항체는 TNF-γ의 수용체와의 상호작용에 미치는 TNF-γ의 효과를 효능화시키는 경향이 있는 별개의 세포 반응을 매개할 수 있다.

또한 잠재적인 TNF-γ의 길항제는 TNF-γ 수용체에 결합하고, 제2의 메신저 반응을 유도하지 않아 수용체를 이의 천연 리간드로부터 효율적으로 차단하는 TNF-γ 돌연변이체를 포함한다. 특이적으로 디자인된 올리고뉴클레오타이드 및 소형 분자도 TNF-γ 수용체에 결합하여 이를 TNF-γ로부터 차단할 수 있다. 소형 분자의 예는 소형 펩타이드 또는 펩타이드-유사 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

또 다른 잠재적인 TNF-γ 길항제는 TNF-γ에 결합하여 막-결합 TNF-γ 수용체와의 상호작용을 억제하는 TNF-γ 수용체의 가용성 형태이다. 상기 방법으로, 수용체는 TNF-γ에 의해 자극되지 않는다.

또 다른 잠재적인 TNF-γ 길항제는 안티센스(antisense) 기술을 사용하여 제조된 안티센스 작제물이다. 안티센스 기술을 사용하여, 폴리뉴클레오타이드를 DNA 또는 RNA에 결합시키는 것을 기초로 하는 두가지 방법, 즉 삼중-나선형 구조 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통한 유전자 발현을 조절한다. 예를 들어, 본 발명의 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 암호화 부분을 사용하여 약 10 내지 40 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 디자인한다. DNA 올리고뉴클레오타이드는 전사에 관여하는 유전자 영역에 상보적이 되도록 디자인하여[삼중 나선 - 참조: Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); Cooney et al, Science, 241:456(1988); 및 Dervan et al., Science, 251: 1360(1991)], 전사 및 TNF-γ의 생성을 억제한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 mRNA와 하이브리드화하고 mRNA 분자가 TNF-γ 폴리펩타이드로 번역되는 것을 차단한다[안티센스-참조: Okano, J. Neurochem., 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL(1988)]. 또한 상기 기술된 올리고뉴클레오타이드를 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현될 수 있는 세포로 전달하여 TNF-γ의 생성을 억제할 수 있다.

TNF-길항제를 사용하여 TNF-γ에 의해 억제되는 지단백질 리파제의 시스템상의 결함으로 인한 지질 제거 결함인 악액질을 치료할 수도 있다. TNF-γ 길항제를 사용하여 TNF-γ가 병인의 역할을 하는 것처럼 보이는 대뇌 말라리아를 치료할 수도 있다. 상기 길항제를 사용하여 활액 세포내에서 IL-1과 같은 염증성 사이토카인의 TNF-γ 유도된 생성을 억제함으로써 류마티스성 관절염을 치료할 수도 있다. 관절염을 치료할 경우, TNF-γ는 관절내로 주사하는 것이 바람직하다.

TNF-γ 길항제를 사용하여 이식조직의 존재하에 TNF-γ에 의한 면역계의 자극을 억제함으로써 이식조직 거부반응을 방지할 수도 있다.

TNF-γ가 골흡수를 유도할 수 있으므로, TNF-γ 길항제를 사용하여 골다공증을 치료할 수도 있다.

TNF-γ가 증진된 염증성 반응을 매개하므로, TNF-γ에 대한 길항제는 소염제로서 사용할 수도 있다.

상기 길항제를 사용하여, 패혈증성 쇼크라고도 불리우는 내독소성 쇼크를 치료할 수도 있다. 이와 같은 위험한 질환은 세균성 또는 다른 유형의 감염에 대한 과다한 반응으로부터 유래한다. 상기 반응은 쇼크 및 조직 손상을 일으키는 TNF-γ의 수준 상승을 유도한다.

상기 길항제는 상기 기술된 바와 같이 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 조성물로 사용할 수 있다.

전체 길이의 TNF-γ 유전자의 단편을 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리드화 프로브로서 사용하여 전체 길이의 유전자를 분리시키고 상기 유전자와 고도의 서열 유사성 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 다른 유전자를 분리시킬 수 있다. 상기 유형의 프로브는, 예를 들어 20 내지 2000 염기일 수 있다. 그러나, 프로브는 바람직하게는 30 내지 50개 염기쌍을 가진다. 프로브를 사용하여 전체 길이의 전사체 및 게놈 클론 또는 조절 및 프로모터 영역, 엑손, 및 인트론을 포함하는 완전한 TNF-γ 유전자를 함유하는 클론에 상응하는 cDNA 클론을 동정할 수도 있다. 스크리닝의 예로서는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 합성하기 위한 공지된 DNA 서열을 사용함으로써 TNF-γ 유전자의 암호화 영역을 분리시키는 것을 포함한다. 상기 프로브가 라이브러리의 어떤 구성원과 하이브리드화하는지를 측정하기 위해, 본 발명의 유전자 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 사람 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝한다.

본 발명의 TNF-γ 폴리펩타이드 및 효능제 및 길항제를 적합한 약제학적 담체와 함께 사용할 수 있다. 상기 조성물은 치료학적 유효량의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 상기 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 조합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 제형은 투여 형태에 적합하다.

또한 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 상기 용기와 관련된 사항은 약제 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지일 수 있고, 이 통지는 사람 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물을 다른 치료학적 화합물과 함께 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물을 통상적인 방법, 예를 들어 국부, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하, 비강내 또는 경피내 경로에 의해 투여할 수 있다. 약제학적 조성물은 특이적인 증상의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 투여한다. 일반적으로, 이를 약 10μg/체중kg 이상의 양으로 투여하고, 대부분의 경우에 1일 약 8mg/체중kg을 초과하지 않는 양으로 투여해야 한다. 대부분의 경우에, 복용량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여, 1일 약 10μg/체중kg 내지 약 1mg/체중kg이다.

TNF-γ 폴리펩타이드, 및 폴리펩타이드인 효능제 및 길항제는 생체내에서 상기 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 본 발명에 따라 사용할 수도 있는데, 이를 종종 "유전자 치료(gene therapy)"라고 부른다.

따라서, 예를 들어 환자의 세포를 생체외에서 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)로 조작한 다음, 조작된 세포를 폴리펩타이드로 치료할 수 있는 환자에게 제공할 수 있다. 상기 방법은 당해 기술분야에 익히 공지되어 있고 본 발명의 교시로부터 명백하다. 예를 들어, 세포를 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스성 입자를 사용하여 조작할 수 있다.

유사하게, 예를 들어 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의해 폴리펩타이드를 생체내에서 발현시키기 위해 생체내에서 조작할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA를 함유하는 레트로바이러스 입자를 제조하기 위한 생산자 세포를 환자에게 투여하여, 생체내에서 세포를 조작하고 생체내에서 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 상기 방법에 의해 투여하기 위한 모든 방법은 본 발명의 교시로부터 당해 기술분야의 숙련가에게 명백하여야 한다. 예를 들어, 세포를 조작하기 위한 발현 비히클(vehicle)은 레트로바이러스와는 다를 수 있는데, 예를 들어 아데노바이러스를 사용하여 적합한 전달 비히클과 결합시킨 후에 생체내에서 세포를 조작할 수 있다.

또한 본 발명은 돌연변이된 TNF-γ의 존재와 관련된 질환 또는 질환에 대한 감수성을 검출하기 위한 진단 분석의 부분으로서 TNF-γ 유전자의 용도에 관한 것이다. 상기 질환은 TNF-γ의 과소 발현, 예를 들어 종양 및 암종과 같은 비정상적 세포 증식과 관련된다.

사람 TNF-γ 유전자내에 돌연변이를 포함하는 개체를 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출할 수 있다. 진단용 핵산을 환자의 세포, 예를 들어 혈액, 소변, 타액, 조직 생체검사 및 검시 물질로부터 수득한다. 게놈 DNA를 검출용으로 직접 사용할 수 있거나, 분석에 선행하여 PCR[참조: Saiki et al., Nature, 324:163-166(1986)]을 사용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. RNA 또는 cDNA도 동일한 목적을 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, TNF-γ를 암호화하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 TNF-γ 돌연변이를 동정하고 분석할 수 있다. 예를 들어, 결실 및 삽입은 정상 유전자형과 비교하여 증폭된 생성물의 크기 변화에 의해 검출할 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 방사성표지된 TNF-γ RNA 또는 방사성표지된 TNF-γ 안티센스 DNA 서열과 하이브리드화시킴으로써 동정할 수 있다. 바람직하게는 매치된 서열을 RNase A 분해 또는 융점 온도의 차이에 의해 미스매치된 듀플렉스(duplex)로부터 판별한다.

DNA 서열 차이를 기준으로 한 유전적 시험은 변성제의 존재 또는 부재하에 겔에서 DNA 단편의 전기영동에 의한 이동 변화를 검출함으로써 수행될 수 있다. 소형 서열 결실 및 삽입은 고 분해능 겔 전기영동에 의해 가시화할 수 있다. 상이한 DNA 단편의 이동이 이들의 특정한 융점 또는 부분 융점 온도에 따라 상이한 위치에서 겔에 지체되는 변성 포름아미딘 구배 겔 상에서 상이한 서열의 DNA 단편을 판별할 수 있다[참조: Myers et al., Science, 230:1242(1985)].

또한 특정 위치에서의 서열 변화는 RNase 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 분석 또는 화학적 절단 방법[참조: Cotton et al., PNAS, USA, 85:4397-4401(1985)]에 의해 나타낼 수 있다.

따라서, 특이적 DNA 서열의 검출은 하이브리드화, RNase 보호, 화학적 절단, 직접적인 DNA 서열화 또는 제한 효소(예: 제한 단편 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphisms(RFLP)) 및 게놈 DNA의 서던 블롯팅의 사용과 같은 방법에 의해 수행할 수 있다.

보다 통상적인 겔-전기영동 및 DNA 서열화뿐만 아니라, 동일계 내에서의 분석에 의해 돌연변이를 검출할 수 있다.

또한 본 발명은 다양한 조직내에서 TNF-γ 단백질의 수준 변화를 검출하기 위한 진단 분석에 관한 것인데, 정상적인 대조군 조직 샘플과 비교하여 과다 발현된 단백질은 질환 또는 질환에 대한 감수성, 예를 들어 종양 및 대뇌 말라리아의 존재를 검출할 수 있기 때문이다. 숙주로부터 유도된 샘플내에서 TNF-γ 단백질의 수준을 검출하는데 사용된 분석은 당해 기술분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있고, 방사능면역분석, 경쟁적 결합 분석, 웨스턴 블롯 분석, ELISA 분석 및 "샌드위치(sandwich)" 분석을 포함한다. ELISA 분석[참조: Coligan, et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), Chapter 6, (1991)]은 우선 TNF-γ 항원에 특이적인 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체를 제조하는 것을 포함한다. 또한 리포터 항체를 모노클로날 항체에 대하여 제조한다. 리포터 항체에 방사성, 형광성과 같은 검출가능한 시약 또는 본 실시예에서 양고추냉이 퍼옥시다제 효소를 결합시킨다. 샘플을 숙주로부터 제거시키고, 샘플중의 단백질과 결합하는 폴리스티렌 디쉬와 같은 고체 지지체 상에서 배양시킨다. 이어서, 디쉬 상의 유리 단백질 결합 부위를 BSA와 같은 비특이적 단백질과 함께 배양함으로써 보호한다. 다음, 모노클로날 항체를 디쉬에서 모노클로날 항체가 폴리스티렌 디쉬에 결합된 TNF-γ 단백질에 결합하는 시간 동안 배양시킨다. 결합되지 않은 모노클로날 항체를 완충액으로 세척한다. 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 리포터 항체를 디쉬에 넣어 TNF-γ에 결합된 모노클로날 항체에 리포터 항체를 결합시킨다. 이어서, 결합되지 않은 리포터 항체를 세척하여 제거한다. 다음, 퍼옥시다제 기질을 디쉬에 가하여 제공된 시간내의 발색량은 표준 곡선과 비교하여 제공된 용적의 환자 샘플에 존재하는 TNF-γ 단백질의 측정량이다.

TNF-γ에 특이적인 항체를 고체 지지체 및 표지된 TNF-γ에 부착시키고, 숙주로부터 유도된 샘플을 고체 지지체 위로 통과시키며, 예를 들어 액체 신틸레이션 크로마토그래피에 의해 검출된 표지량을 샘플내의 TNF-γ의 양과 상호관련시키는 경쟁 분석을 사용할 수도 있다.

"샌드위치" 분석은 ELISA 분석과 유사하다. "샌드위치" 분석에서, TNF-γ를 고체 지지체 위로 통과시켜 고체 지지체에 부착된 항체에 결합시킨다. 이어서, 제2 항체를 TNF-γ에 결합시킨다. 이어서, 표지되고 제2 항체에 특이적인 제3 항체를 고체 지지체 위로 통과시켜 제2 항체에 결합시킨 다음 그 양을 정량할 수 있다.

본 발명의 서열은 염색체 동정에도 유용하다. 상기 서열은 특이적으로 표적화되고 개체의 사람 염색체 상의 특정 위치와 하이브리드화할 수 있다. 또한, 염색체 상의 특정 부위를 동정해야 할 통상적인 필요가 있다. 염색체 위치를 마킹하기 위한 실제 서열 데이터(반복 다형성)를 기준으로 하는 염색체 마킹 시약은 현재 거의 이용할 수 없다. 본 발명에 따라 DNA의 염색체로의 맵화(mapping)는 이들 서열을 질환과 관련된 유전자와 상호관련시키는데 있어서 중요한 제1 단계이다.

요약하면, 서열은 PCR 프라이머(바람직하게는 15 내지 25bp)를 cDNA로부터 제조함으로써 염색체로 맵화할 수 있다. 서열의 3' 미번역 영역의 컴퓨터 분석을 사용하여 게놈 DNA내에 하나 이상의 엑손을 신장시키지 않는 프라이머를 신속하게 선택함으로써 증폭 방법을 복잡하게 한다. 다음, 상기 프라이머를 개체의 사람 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 상기 프라이머에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 생산할 수 있다.

체세포 하이브리드의 PCR 맵화는 특정 DNA를 특정 염색체로 지정하기 위한 신속한 방법이다. 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 본 발명을 이용하면, 유사한 방법으로 특이적 염색체 또는 대형 게놈 클론의 풀로부터의 단편의 패널을 사용하여 국소화할 수 있다. 이의 염색체로 맵화하는데 유사하게 사용될 수 있는 다른 맵화 방법은 염색체 특이적-cDNA 라이브러리를 작제하기 위한 동일계내의 하이브리드화, 표지된 플로우(flow)-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝 및 하이브리드화에 의한 예비선택을 포함한다.

중기 염색체 스프레드에 의한 cDNA 클론의 동일계내 형광성 하이브리드화는 1단계로 정확한 염색체의 위치를 제공한다. 상기 기술은 500 내지 600개 염기와 같이 짧은 cDNA를 사용할 수 있다; 그러나, 2,000bp 이상의 클론은 단순 검출을 위한 충분한 시그날 강도를 가진 특이적 염색체 위치에 결합할 가능성이 높다. FISH는 발현 서열 태그(EST)가 유도되는 클론 및 보다 길고 보다 우수한 클론의 사용을 필요로 한다. 예를 들어, 2,000bp가 적당하고, 4,000bp가 보다 적당하고, 4,000bp 이상은 아마도 상당한 시간으로 우수한 결과를 수득하기에 필요하지 않다. 상기 기술의 재고를 위해 문헌[참조: Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조하라.

서열이 정확한 염색체 위치로 맵화되면, 염색체 상의 서열의 물리적 위치를 유전자 맵 데이터와 상호관련시킨다. 상기 데이터는, 예를 들어 문헌[참조: V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Library를 통해 온 라인으로 입수가능)]에서 구한다. 이어서, 유전자 및 동일한 염색체 영역에 맵화된 질환의 관계를 결합 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동유전형질)을 통해 동정한다.

이어서, 감염자 및 비감염자간의 cDNA 또는 게놈 서열 차이를 측정하는 것이 필요하다. 돌연 변이가 몇 사람 또는 모든 감염자에서 관찰되나 정상상태의 개체에서는 관찰되지 않을 경우, 돌연변이는 아마도 당해 질환의 유인제일 것이다.

물리적 맵화 기술 및 유전학적 맵화 기술의 현행 분석에 따라, 질환과 관련된 염색체 영역으로 정확하게 국지화된 cDNA는 50 내지 500개의 잠재적인 유인 유전자중의 하나일 수 있다(이는 1 메가베이스 맵화 분해능 및 20kb당 하나의 유전자를 가정한다).

당해 폴리펩타이드, 이의 단편 또는 기타 유도체, 또는 이의 동족체, 또는 이를 발현시키는 세포를 면역원으로서 사용하여 이에 대한 항체를 제조할 수 있다. 이 항체는, 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한 본 발명은 키메라성, 일본쇄, 및 인간화된 항체, 및 Fab 단편, 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 상기 항체 및 단편을 제조할 수 있다.

본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체는 상기 폴리펩타이드를 동물내로 직접 주사하거나 상기 폴리펩타이드를 동물, 바람직하게는 사람 이외의 동물에 투여함으로써 수득할 수 있다. 이어서, 상기와 같이 수득된 항체는 상기 폴리펩타이드 그 자체에 결합한다. 상기 방법으로, 상기 폴리펩타이드의 단편만을 암호화하는 서열이더라도 모든 천연 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 생성시키는데 사용할 수 있다. 이어서, 상기 항체를 사용하여 상기 폴리펩타이드를 발현시키는 조직으로부터 폴리펩타이드를 분리시킬 수 있다.

모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속적인 세포주 배양에 의해 제조된 항체를 제공하는 기술을 사용할 수 있다. 예로는 하이브리도마(hybridoma) 기술[참조: Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497], 트리오마(trioma) 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술[참조: Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72], 사람 모노클로날 항체를 제조하기 위한 EBV-하이브리도마 기술[참조: Cole, et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]을 포함한다.

일본쇄 항체의 제조를 위해 기술된 기술[참조: U.S. 특허 4,946,778]을 적용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 산물에 대한 일본쇄 항체를 제조할 수 있다. 또한, 유전자전환된 마우스를 사용하여 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 생성물에 대한 인간화된 항체를 발현시킬 수 있다.

또한 본 발명은 하기 실시예와 관련하여 기술할 것이나; 이는 본 발명이 이들 실시예에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 다른 방법으로 명시하지 않는 한, 모든 부 또는 양은 중량 기준이다.

하기 실시예의 이해를 용이하게 하기 위해 빈번히 나타나는 방법 및/또는 용어를 기술한다.

"플라스미드(plasmid)"는 우선 소문자 p 및/또는 이어서 대문자 및/또는 숫자로 표기된다. 본 발명의 출발 플라스미드는 상업적으로 구입, 제한되지 않은 조건으로 공개적으로 구입할 수 있거나, 구입할 수 있는 플라스미드로부터 공개된 방법에 따라 작제할 수 있다. 또한, 기술된 것과 동등한 플라스미드는 당해 기술분야에 공지되어 있고 통상적으로 숙련된 기술자에게 명백할 것이다.

DNA의 "분해(digestion)"란 DNA의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소로 DNA를 촉매적으로 절단하는 것을 의미한다. 본 발명에 사용된 각종 제한 효소는 시판용이고, 이의 반응조건, 보조인자 및 기타 필요조건은 통상적으로 숙련된 기술자에게 공지된 바와 같이 사용된다. 분석 목적을 위해, 전형적으로 플라스미드 또는 DNA 단편 1μg을 약 20μl의 완충액중의 효소 2단위와 함께 사용한다. 플라스미드 작제를 위해 DNA 단편을 분리하고자 하는 경우에는 전형적으로 DNA 5 내지 50μg을 보다 큰 용적으로 효소 20 내지 250 단위를 사용하여 분해한다. 특정 제한 효소에 적합한 완충액 및 기질량은 제조자에 의해 명시된다. 37℃에서 약 1시간의 배양 시간이 통상적으로 사용되나, 공급자의 지시에 따라 달라질 수 있다. 분해 후에 반응물을 폴리아크릴아미드 겔상에서 직접 전기영동시켜 목적하는 단편을 분리시킨다.

절단된 단편의 크기 분리는 문헌[참조: Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057(1980)]에 기술된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.

"올리고뉴클레오타이드"란 일본쇄의 폴리데옥시뉴클레오타이드 또는 화학적으로 합성할 수 있는 두 개의 상보적 폴리데옥시뉴클레오타이드 쇄를 의미한다. 상기 합성 올리고뉴클레오타이드는 5' 포스페이트를 가지지 않으므로, 키나제의 존재하에 ATP와 함께 포스페이트를 첨가하지 않을 경우에는 다른 올리고뉴클레오타이드에 연결되지 않는다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 탈인산화되지 않은 단편에 연결될 것이다.

"연결(ligation)"이란 두 개의 이본쇄 핵산 단편간의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 방법을 의미한다[참조: Maniatis, T., et al., Id., p. 146]. 다른 방법을 제공하지 않는 한, 공지된 완충액 및 조건을 사용하여 대략 등몰량의 연결될 DNA 단편 0.5μg당 T4 DNA 리가제("리가제") 10 단위와 연결을 수행한다.

다른 방법을 나타내지 않는 한, 형질전환은 문헌[참조: Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52:456-457(1973)]에 기술된 방법과 같이 수행한다.

실시예 1

TNF-γ의 세균 발현 및 정제

TNF-γ를 암호화하는 DNA 서열, ATCC # 75927를 TNF-γ 단백질의 5' 서열 및 TNF-γ 유전자에 대한 벡터 서열 3'에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 먼저 증폭시킨다. TNF-γ에 상응하는 부가적인 뉴클레오타이드를 5' 및 3' 서열에 각각 가한다. 5' 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 BamHⅠ 제한 효소 부위에 이어서 프로세싱된 단백질 코돈의 추정된 종결 아미노산으로부터 출발하는 TNF-γ 암호화 서열의 처음 24개 뉴클레오타이드를 함유하는 서열 5' GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC 3'을 갖는다. 3' 서열 5' CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG 3'은 XbaⅠ 부위에 이어서 TNF-γ의 22개 뉴클레오타이드 및 TNF-γ DNA 삽입물에 대해 3' 방향에 위치한 pQE-9 벡터 서열에 상보적인 서열을 함유한다. 제한 효소 부위는 세균성 발현 벡터 pQE-9(공급원: Qiagen) 상의 제한 효소 부위에 상응한다. 이어서, pQE-9를 BamHⅠ 및 XbaⅠ을 사용하여 분해한다. 증폭된 서열을 pQE-9내로 연결시키고 히스티딘 태그 및 RBS를 암호화하는 서열을 가진 프레임내에 삽입시킨다. 이어서, 연결 혼합물을 사용하여 문헌[참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]에 기술된 방법에 의해 이. 콜라이 균주(공급원: Qiagen, 상표명: M15/rep4)를 형질전환시킨다. M15/rep4는 lacⅠ 억제제를 발현시키고 또한 카나마이신 내성(Kanr)을 부여하는 플라스미드 pREP4의 다수 카피를 함유한다. 형질전환체를 LB 플레이트 상에서 성장하는 이의 능력에 의해 동정하고 암피실린/카나마이신 내성 콜로니를 선택한다. 플라스미드 DNA를 분리시키고 제한 분석에 의해 확인한다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론을 Amp(100ug/ml) 및 Kan(25ug/ml)가 보충된 LB 배지중의 액체 배양물에서 밤새(O/N) 성장시킨다. O/N 배양물을 사용하여 1:100 내지 1:250의 비로 대형 배양물에 접종시킨다. 세포를 0.4 내지 0.6의 광학 밀도 600(O.D600)으로 성장시킨다. 이어서, IPTG("이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드"(Isopropyl-B-D-thiogalacto pyranoside))를 최종 농도 1mM로 가한다. lacⅠ 억제제를 비활성화시키고, 유전자 발현을 증가시키는 P/O를 제거함으로써 IPTG를 유도한다. 세포를 추가로 3 내지 4시간 성장시킨다. 이어서, 세포를 원심분리에 의해 수확한다. 세포 펠릿을 카오트로픽제(chaotropic agent) 6M 구아니딘 HCl 중에서 가용화시킨다. 정화시킨 후에, 가용화된 TNF-γ를 6-His 태그를 함유하는 단백질에 의해 단단히 결합되도록 하는 조건하에 니켈-킬레이트 칼럼 상에서 크로마토그래피에 의해 상기 용액으로부터 정제시킨다[참조: Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184(1984)]. TNF-γ를 니켈-킬레이트 칼럼 상에서의 두 번째 작동에 의해 추가로 정제시킨다. TNF-γ(90% 순도)를 pH 5.0의 6M 구아니딘 HCl 내에서 칼럼으로부터 용출시키고, PBS 완충액 중에 투석하여 복원시킨다. 발현 생성물을 SDS-PAGE에 의해 전기영동시키고, 그 결과를 도 4에 나타내는데, 여기서 M은 분자량 마커이고; 레인 1은 유도된 세포 용해물이고; 레인 2는 유도되지 않은 세포 용해물이고; 레인 3은 두 번의 니켈-킬레이트 칼럼 정제 후의 TNF-γ 단백질이고; 레인 4는 첫 번째 칼럼 정제 후의 TNF-γ 단백질이다.

실시예 2

바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용한 TNF-γ의 클로닝 및 발현

전체 길이의 TNF-γ 단백질을 암호화하는 DNA 서열, ATCC # 75927을 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다:

5' 프라이머는 서열 5' GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC 3'을 가지고 Bam HⅠ 제한 효소 부위(진하게 표시)에 이어서 TNF-γ 유전자의 24개 뉴클레오타이드(번역을 위한 개시 코돈 "ATG"는 밑줄로 표시되어 있다)를 함유한다.

3' 프라이머는 서열 5' CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG 3'을 가지고 제한 엔도뉴클레아제 XbaⅠ 및 TNF-γ 유전자의 3' 번역되지 않은 서열에 상보적인 22개의 뉴클레오타이드에 대한 절단 부위를 함유한다. 증폭된 서열을 시판용 키트(상표명: "Geneclean", 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 단편을 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 XbaⅠ를 사용하여 분해시킨 다음 다시 1% 아가로스 겔 상에서 정제시킨다. 상기 단편을 F2로 명명한다.

벡터 pA2(하기에 언급된 pVL941 벡터의 변형)를 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하는 TNF-γ 단백질의 발현에 사용한다[참조: Summers, M.D. and Smith, G.E. 1987, A mannual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555]. 상기 발현 벡터는 오토그라파 칼리포니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)의 강한 폴리헤드린 프로모터에 이어서 제한 엔도뉴클레아제 BamHⅠ 및 XbaⅠ에 대한 인식 부위를 함유한다. 원숭이 바이러스(simian virus(SV)) 40의 폴리아데닐화 부위는 효율적인 폴리아데닐화를 위해 사용한다. 재조합 바이러스의 용이한 선택을 위해, 이. 콜라이로부터의 베타-갈락토시다제 유전자를 폴리헤드린 프로모터에 이어서 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그날과 동일한 방향으로 삽입한다. 폴리헤드린 서열은 공동형질감염된 야생형 바이러스 DNA의 세포-매개 상동성 재조합을 위한 바이러스 서열이 양측에 위치할 수 있다. pA2 대신에 pRG1, pAc373, pVL941 및 pAcIM1과 같은 다수의 다른 바쿨로바이러스 벡터를 사용할 수 있다[참조: Luckow, V.A. and Summers, M.D., Virology, 170:31-39].

플라스미드를 제한 효소 BamHⅠ 및 XbaⅠ를 사용하여 분해한 다음, 송아지 장의 포스파타제를 사용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 탈인산화시킨다. 이어서, DNA를 시판용 키트(상표명: "Geneclean", 공급원: BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.)을 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시킨다. 상기 단편을 V2로 명명한다.

단편 F2 및 탈인산화된 플라스미드 V2를 T4 DNA 리가제와 연결시킨다. 이어서, 이. 콜라이 XL1 블루 세포를 형질전환시킨다. 클론된 단편의 서열을 DNA 서열화에 의해 확인한다.

플라스미드 pBac TNF-γ 5μg을 리포펙션(lipofection) 방법[참조: Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417(1987)]을 사용하여 시판되고 있는 선형화된 바쿨로바이러스(상표명: "BaculoGoldTM 바쿨로바이러스 DNA", 공급원: Pharmingen, San Diego, CA.) 1.0μg으로 공동형질감염시킨다.

바쿨로골드(BaculoGold) 바이러스 DNA 1μg 및 플라스미드 pBac TNF-γ 5μg을 무혈청 그레이스 배지 50㎕를 함유하는 미세적정 플레이트의 멸균 웰에서 혼합한다[참조: Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD]. 리포펙틴 10μl와 그레이스 배지 90μl를 가한 후에, 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양시킨다. 이어서, 형질감염 혼합물을 무혈청 그레이스 배지 1㎖와 함께 35mm 조직 배양 플레이트에 접종된 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가한다. 플레이트를 전후로 진탕하여 새롭게 추가된 용액을 혼합한다. 이어서, 플레이트를 27℃에서 5시간 동안 배양시킨다. 5시간 후에 형질감염 용액을 플레이트로부터 제거하고, 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1ml을 가한다. 플레이트를 배양기 내에 넣고 4일 동안 27℃에서 계속 배양시킨다.

4일 후에 상등액을 수집하고 플라크 분석을 상기 섬머와 스미스에 의해 기술된 방법과 동일하게 수행한다. 변형으로서 블루 염색된 플라크를 용이하게 분리시키는 "블루 Gal"[참조: Life Technologies Inc., Gaithersburg]과 함께 아가로스 겔을 사용한다. "플라크 분석"의 상세한 기술은 문헌[참조: Life Technologies Inc., Gaithersburg, page 9-10]에 의해 배포된 곤충 세포 배양 및 바쿨로바이러스학에 대한 사용자 가이드에서 볼 수 있다.

4일 후에 일련의 희석 후, 바이러스를 세포에 가하고, 블루 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫의 팁으로 수확한다. 이어서, 재조합 바이러스를 함유하는 아가를 그레이스 배지 200μl를 함유하는 에펜도르프 튜브 내에서 재현탁시킨다. 아가를 단시간의 원심분리에 의해 제거하고 재조합 바쿨로바이러스를 함유하는 상등액을 사용하여 35mm 디쉬에 접종된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후에 상기 배양 디쉬의 상등액을 수확한 다음 4℃에서 저장한다.

Sf9 세포를 10% 열-비활성화된 FBS가 보충된 그레이스 배지내에서 성장시킨다. 상기 세포를 감염 다중도(multiplicity of infection(MOI)) 2에서 재조합 바쿨로바이러스 V-TNF-γ로 감염시킨다. 6시간 후에 배지를 제거하고, 메티오닌 및 시스테인 비함유 SF900 Ⅱ 배지로 대체한다[참조: Life Technologies Inc., Gaithersburg]. 42시간 후에 35S-메티오닌 5μCi 및 35S 시스테인 5μCi(공급원: Amersham)를 가한다. 세포를 원심분리에 의해 수확하기 전에 16시간 동안 추가 배양시키고, 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자동방사성사진에 의해 가시화시킨다. 도 5는 레인 1 및 3이 TNF-γ 및 대조군의 배지이고; 레인 2 및 4가 TNF-γ 및 대조군의 세포 용해물인 겔을 예시한다.

실시예 3

COS 세포내에서 재조합 TNF-γ의 발현

플라스미드, TNF-γ HA의 발현을 1) SV40 복제 기점, (2) 암피실린 내성 유전자, (3) 이. 콜라이 복제 기점, (4) CMV 프로모터에 이어서 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 함유하는 벡터 pcDNAⅠ/Amp(인비트로겐(Invitrogen))로부터 유도한다. 전체 TNF-γ 전구체를 암호화하는 DNA 단편 및 이의 3' 말단과 프레임내에서 융합된 HA 태그를 벡터의 폴리링커 영역내로 클론화하여, 재조합 단백질 발현을 CMV 프로모터하에 유도한다. HA 태그는 상기 기술된 바와 같이 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다[참조: I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell 37. 767]. 표적 단백질로의 HA 태그의 주입은 HA 에피토프를 인식하는 항체로 재조합 단백질을 용이하게 검출하도록 한다.

플라스미드 작제 방법은 하기에 기술한다:

TNF-γ를 암호화하는 DNA 서열, ATCC # 75927을 두 개의 프라이머: BamHⅠ 부위에 이어서 개시 코돈으로부터 출발하는 TNF-γ 암호화 서열의 24개 뉴클레오타이드를 함유하는 5' 프라이머(바쿨라 예와 동일함); XbaⅠ부위, 번역 정지 코돈, HA 태그 및 TNF-γ 암호화 서열의 마지막 18개 뉴클레오타이드(정지 코돈을 함유하지 않음)에 상보적인 서열을 함유하는 3' 서열 5' CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGATAGTAAGAAGGCTCCAAAG 3'를 사용하여 클론된 본래의 EST에 대한 PCR에 의해 작제한다. 따라서, PCR 생성물은 BamHⅠ 부위, TNF-γ 암호화 서열에 이어서 프레임 내에서 융합된 HA 태그, HA 태그에 이어서 번역 종결 정지 코돈 및 XbaⅠ부위를 함유한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNAⅠ/Amp를 BamHⅠ 및 XbaⅠ 제한 효소로 분해하고 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 SURE(공급원: Stratagene Cloning System, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) 내로 형질전환시키고, 형질전환된 배양물을 암피실린 배지 플레이트 상에 플레이팅하고 내성 콜로니를 선택한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리시키고 정확한 단편의 존재를 제한 분석에 의해 조사한다. 재조합 TNF-γ의 발현을 위해서는 COS 세포를 DEAE-DEXTRAN 방법에 의해 발현 벡터로 형질감염시킨다[참조: J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)]. TNF-γ HA 단백질의 발현을 방사성표지 및 면역침강 방법에 의해 검출한다[참조: E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)]. 세포를 35S-시스테인으로 8시간 동안 표지화하고 2일 후에 형질감염시킨다. 이어서, 배양 배지를 수집하고 세포를 세정제(RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM 트리스, pH 7.5))로 용해시킨다[참조: Wilson, I. et al., Id. 37:767(1984)]. 세포 용해물 및 배양 배지 모두를 HA 특이성 모노클로날 항체로 침강시킨다. 침강된 단백질을 15% SDS-PAGE 겔 상에서 분석한다.

실시예 4

사람 조직내에서 TNF-γ의 발현 패턴

RNA 블롯 분석을 수행하여 사람 조직내에서 TNF-γ의 발현 정도를 조사한다. 총 세포 RNA 샘플을 RNAzolTM B 시스템(공급원: BIotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033)으로 분리시킨다. 상기 각 사람 조직으로부터 분리된 총 RNA 약 2μg(도 3A의 RNA 블롯을 위해)을 1% 아가로스-포름알데히드 겔 상에서 분리하고, 나일론 필터 상에서 블롯시킨다[참조: Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)]. 표지화 반응을 50ng TNF-γ cDNA를 사용하여 Stratagene Prime-It 키트에 따라 수행하여 32P-표지된 TNF-γ cDNA를 제조한다. 표지된 DNA를 Select-G-50 칼럼(공급원: 5 Prime-3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303)을 사용하여 정제한다. 이어서, 필터를 0.5M NaPO4, pH 7.4 및 7% SDS중의 방사성 표지된 전체 길이의 TNF-γ 유전자 1,000,000cpm/ml와 65℃에서 밤새 하이브리드화시킨다. 0.5 x SSC, 0.1% SDS로 실온에서 2회 및 60℃에서 2회 세척한 후에, 필터를 강화된 스크린으로 밤새 -70℃에서 노출시킨다. TNF-γ에 대한 메시지 RNA는 신장내에 풍부하다(도 3A).

지정된 조직으로부터의 폴리 A RNA 10μg이 사용된다는 것만을 변화시키고, 도 3B에 나타낸 결과를 위해 동일한 반응을 수행한다. TNF-γ에 대한 메시지 RNA는 HUVEC 세포내에서 우세하게 발현된다(도 3B).

실시예 5

WEHI 164 및 L929 세포 증식을 억제하고, HL-60 세포내에서의 세포 유착을 유도하며 내피 세포 성장을 촉진하는 재조합 TNF-γ의 능력

유착성 표적 세포를 PBS 내에서의 트립신화에 의해 컨플루언트 배양물로부터 제조하고, 비유착 표적 세포를 정지 배양물로부터 수확하여 배지로 1회 세척한다. 표적 세포를 10% FCS를 함유하는 배지에 3 x 105세포/ml로 현탁시킨다. 0.1mℓ 분취량을 연속하여 희석된 세포의 시험 샘플(WEHI 164 및 L929) 0.1ml를 함유하는 96-웰 평저 미세적정 플레이트로 분배한다. 70시간 동안 계속 배양한다. TNF-α, TNF-β 및 TNF-γ를 0.5μg/ml 농도로 가한다. 각각의 웰에 MTS 20μl 및 페나진 메토설페이트(penazine methosulfate(PMS)) 용액을 가하여 수행하는 MTS 분석을 사용하여 세포독성 및 증식 활성을 정량화한다. 3시간 배양 후에, 492nm에서의 OD를 ELISA 플레이트 리더(reader)에 의해 측정한다. OD492는 웰내에서 생존가능한 세포의 수에 비례한다. 세포독성의 백분율은 하기와 같이 계산한다: % 세포독성 = (100 - OC실험군/OD대조군) x 100. 72시간 후에 사진을 촬영한다. 도 6A 및 8에 나타낸 바와 같이, TNF-γ는 사멸된 어두운 원형의 세포로 나타나는 형태 변화를 유도한다.

도 6B의 그래프에서는, 상기와 같이 분석을 수행하나, TNF의 증가량을 가한다. 결과는 TNF-γ가 WEHI 164 세포의 억제제라는 것을 나타낸다.

TNF-γ의 유착 능력을 시험하기 위해, HL-60 세포를 사용하여 세포 유착 및 세포-세포 접촉을 현미경 관찰로 측정하고, 두명의 독립적인 조사자에 의해 주관적으로 기록한다. 도 10은 세포 유착을 유도하는 TNF-γ의 능력을 예시한다.

내피 세포 성장을 촉진하는 TNF-γ의 능력을 시험하기 위한 분석에서, 증식 지수(proliferation index(PI))는 하기와 같이 계산한다: PI = OD실험군/OD대조군. 도 8은 TNF-γ가 내피 세포 성장의 촉진제라는 것을 설명한다.

실시예 6

TNF-γ의 세포소멸(apoptosis) 능력의 측정

제1 배양 단계에서, 항히스톤 항체를 미세적정 플레이트 모듈의 벽면에 흡착에 의해 고정시킨다. 후속적으로, 벽면상의 비특이적 결합 부위를 배양 완충액(예: 차단 용액)으로 처리하여 포화시킨다. 제2 배양 단계 동안, WEHI 164 세포 샘플내에 함유된 뉴클레오솜을 이들의 히스톤 성분을 통해 고정화 항히스톤 항체에 결합된 TNF-α, TNF-β 또는 TNF-γ로 처리한다. 제3 배양 단계에서, 항-DNA-퍼옥시다제(POD)를 뉴클레오솜의 DNA 부분과 반응시킨다. 결합되지 않은 모든 퍼옥시다제 접합체를 세척 단계에 의해 제거한 후에, 면역복합체내에 보유된 퍼옥시다제의 양을 기질로서 ABTS(2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트])를 사용하여 광도계로 측정한다. 항히스톤 항체를 샘플의 히스톤 H1, H2A, H2B, H3 및 H4와 반응시킨다. 항-DNA POD 항체를 일본쇄 및 이본쇄 DNA에 결합시킨다. 따라서, ELISA로 단일 및 올리고뉴클레오솜을 검출하고 세포소멸성 세포 사멸을 측정할 수 있다. 세포 사멸의 수준을 흡광도 A405nm/A490[참조: Boehringer mannheim Catalogue, 0990 C 93 2 1541170]으로서 나타내는 세포질 히스톤 결합된 DNA 단편의 양에 의해 측정한다[참조: 도 7].

실시예 7

TNF-γ를 사용하는 수용체 결합 분석

TNF-α 및 TNF-γ를 6-His 태그를 사용하는 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하여 1μg/웰을 니켈 킬레이트 코팅된 96-웰 플레이트(제조원: Xenopore Corp.)에 가하고, 2시간 동안 배양시킨다. 3회 세척한 후에, 사람 가용성 TNF 수용체 100ng, sTNF RⅠ 또는 sTNF RⅡ를 각각의 웰에 가하여 2시간 동안 배양시킨다. 플레이트를 3회 세척하고, 알칼리성 포스파타제-표지된 폴리클로날 항체를 sTNF RⅠ 또는 sTNF RⅡ(200μl)에 가한다. 기질 용액 200μl을 각각의 웰에 가하고 2시간 동안 플레이트를 배양시킨다. ELISA 리더(시험 파장 450nm, 보정 파장 590nm)를 사용하여 OD를 측정한다. 도 11에 나타낸 결과는 TNF-γ가 sTNF-수용체에 현저하게 결합하지는 않는다는 것을 나타낸다.

본 발명의 다수의 변형 및 변화는 상기 교시의 관점 및, 첨부된 청구범위내에서 가능하고, 본 발명은 상세히 기술된 바와 다른 방법으로 실행될 수도 있다.

서열 목록

(1) 일반적 정보:

(ⅰ) 출원인: YU, ET AL.

(ⅱ) 발명의 명칭: 사람 종양 괴사 인자-γ

(ⅲ) 서열수: 2

(ⅳ) 서신 주소:

(A) 수신인: 카렐라, 비른, 바인, 길필란, 체치, 슈테바르트 & 올슈타인

(B) 거리: 베커 팜 로드 6

(C) 시: 로즈랜드

(D) 주: 뉴 져지

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 07068

(ⅴ) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체 유형: 3.5in 디스켓

(B) 컴퓨터: IBM PS/2

(C) 운영 시스템: MS-DOS

(D) 소프트웨어: 워드 퍼펙트 5.1

(ⅵ) 현재 출원 데이터:

(A) 출원 번호:

(B) 출원일: 본원과 함께 제출

(C) 분류:

(ⅶ) 선행 출원 데이터:

(A) 출원 번호:

(B) 출원일:

(ⅷ) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 페라로, 그레고리 디

(B) 등록 번호: 36,134

(C) 참조/소송 번호: 325800-256

(ⅸ) 원거리통신 정보:

(A) 전화: 201-994-1700

(B) 팩스: 201-994-1744

(2) 서열 1에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 2442개의 염기 쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: cDNA

서열 1A

서열 1B

(2) 서열 2에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징

(A) 길이: 174개의 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄:

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자 유형: 단백질

서열 2

본 발명의 폴리펩타이드는 구조적 아미노산 서열 상동성, 및 기능적 유사성에 기초하는 TNF 계열의 구성원으로서 동정되어 있고, 예를 들어 TNF-γ는 프로-염증성 단백질이다.

본 발명의 한 측면에 따라, TNF-γ인 신규의 성숙한 폴리펩타이드, 및 생물학적으로 활성이고 진단학적 또는 치료학적으로 유용한 이의 단편, 동족체 및 유도체가 제공된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 사람 기원이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, mRNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA 및, 이의 동족체 및 생물학적으로 활성이고 진단학적 또는 치료학적으로 유용한 단편 및 유도체를 포함하는, 사람 TNF-γ를 암호화하는 분리된 핵산 분자가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 단백질의 발현 및 상기 단백질의 후속적인 회수를 촉진시키는 조건하에, 사람 TNF-γ 핵산 서열을 함유하는 재조합 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 배양함을 포함하여, 재조합 기술에 의해 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 방법, 효능제 및 길항제를 선별하는 방법 및 치료 목적, 예를 들어 상처를 치료하는 방법, 종양 증식을 억제하고, 기생충, 세균 및 바이러스에 대한 내성을 제공하고, 염증 활성을 유도하고, 내피 세포 및 특정 조혈 세포의 증식을 유도하고, 재발협착증을 치료하고 특정 자가면역 질환을 방지하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 사람 TNF-γ 서열과 특이적으로 하이브리드화하기에 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브(probe)도 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, TNF-γ를 의태하고 TNF-γ수용체에 결합하여 TNF-γ형 반응을 유도하는, TNF-γ 효능제가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 상기 폴리펩타이드의 작용을 억제하기 위해, 예를 들어 패혈증 쇼크, 염증, 대뇌의 말라리아, HIV 바이러스의 활성화, 이식조직 거부반응, 골흡수 및 악액질을 방지하기 위해 사용할 수 있는 상기 폴리펩타이드에 대한 길항제가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, TNF-γ 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 과소 발현 및 과다 발현에 관련된 질환을 검출하기 위한 진단 분석물이 제공된다.

본 발명의 모든 측면은 본원의 교시로부터 당해 기술분야의 숙련가에게 명백하여야 한다.

Claims (65)

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26. (a) 서열 2의 아미노산 잔기 -25 내지 149를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 및

    (c) 서열 2의 아미노산 잔기 1 내지 149를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, TNF-γ 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
27. 제26항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열 2의 아미노산 잔기 -25 내지 149를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
28. 제26항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열 2의 아미노산 잔기 1 내지 149를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
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36. 제26항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 따른 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
37. 제26항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
38. 제26항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현을 조절하는 이종성 조절 서열과 작동적으로 결합되는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
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40. 제37항에 따른 숙주 세포를 당해 세포내에 도입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드가 발현되기에 충분한 시간 및 조건하에서 배양 또는 성장시키는 것을 포함하여, TNF-γ 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
41. 제36항에 따른 벡터로 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 것을 포함하여, TNF-γ 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 세포를 생산하는 방법.
42. 제40항의 방법에 의해 생산된 재조합 TNF-γ 폴리펩타이드.
43. (a) 서열 2의 잔기 -25 내지 149로서 제시된 아미노산 서열; 및

    (b) 서열 2의 아미노산 잔기 1 내지 149로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 분리되거나 재조합된 TNF-γ 폴리펩타이드.
44. 제43항에 있어서, 서열 2의 아미노산 잔기 -25 내지 149를 포함하는 분리되거나 재조합된 폴리펩타이드.
45. 제43항에 있어서, 서열 2의 아미노산 잔기 1 내지 149를 포함하는 분리되거나 재조합된 폴리펩타이드.
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54. (a) 내피 세포, Con A, [3H]티미딘 및 조절 활성에 대한 피검용 화합물을, 사람 TNF-γ 활성이 상기 내피 세포내로 [3H]티미딘 혼입을 자극하기에 충분한 시간 및 조건하에서 제43항 내지 제45항중의 어느 한 항에 따른 분리되거나 재조합된 폴리펩타이드와 배합하는 단계; 및

    (b) 상기 화합물의 부재하에 수득된 [3H]티미딘 혼입과 비교하여(여기서, [3H]티미딘 혼입의 변화는 당해 화합물이 TNF-γ 활성의 조절제임을 나타낸다) 단계 (a)에서의 [3H]티미딘 혼입의 수준을 측정하는 단계를 포함하여, 사람 TNF-γ 활성의 조절제를 동정하는 방법.
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57. 제26항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 따른 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 이와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 화학적으로-합성된 올리고뉴클레오타이드 또는 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는, 피검체의 종양 또는 종양에 대한 감수성을 진단하기 위한 조성물.
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62. 제43항 내지 제45항중의 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 종양 세포 성장 억제, 상처 치료 촉진 또는 재발협착증의 치료를 위한 약제학적 조성물.
63. 제26항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 따른 분리된 폴리뉴클레오타이드를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 종양 세포 성장 억제, 상처 치료 촉진 또는 재발협착증의 치료를 위한 약제학적 조성물.
64. 제36항에 따른 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
65. 제36항에 따른 벡터를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 종양 세포 성장 억제, 상처 치료 촉진 또는 재발협착증의 치료를 위한 약제학적 조성물.

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