KR100474161B1

KR100474161B1 - 에어로트리신 유도체, 이의 제조 방법 및 이를 함유하는 약학조성물

Info

Publication number: KR100474161B1
Application number: KR10-2002-7009184A
Authority: KR
Inventors: 고찌마사미; 마스부찌가즈나오; 무라따다께시; 오까다다께히로; 심마노부오
Original assignee: 바실리어 파마슈티카 아게
Priority date: 2000-01-17
Filing date: 2001-01-11
Publication date: 2005-03-10
Also published as: CA2396174C; WO2001053322A3; AR027220A1; CA2396174A1; US20010031728A1; CO5261554A1; ES2240394T3; US6849709B2; ATE293637T1; CN1396929A; WO2001053322A2; DE60110209D1; MXPA02006963A; EP1254161A2; KR20020063932A; ZA200205115B; DE60110209T2; EP1254161B1; AU2514801A; BR0107609A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 나타내어지는 신규 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:

[화학식 1]

[식 중에서, R¹, R² 및 R³는 제 1 항에서 정의된 바와 같음].

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 에어로트리신 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약물의 제조를 위한, 상기 에어로트리신의 용도, 및 상기 화학식 1의 에어로트리신의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

에어로트리신 유도체, 이의 제조 방법 및 이를 함유하는 약학 조성물{AEROTHRICIN DERIVATIVES, PROCESSES FOR THE PREPARATION OF THE SAME AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THE SAME}

본 발명은 항균 활성을 갖는 신규 환식 화합물(이하, '에어로트리신 (aerothricin)'이라 함), 약학 치료에서의 에어로트리신의 용도, 에어로트리신을 함유하는 약학 조성물, 및 에어로트리신의 제조방법에 관한 것이다.

아졸(azole)계 항균제는, 현재 전신 진균증(mycosis)의 치료에 널리 사용되고 있다. 그러나, 아졸계 항균제의 장기간의 예방적 사용은, 이들의 정진균 작용 (fungistatic action)으로 인해 아졸 저항성 칸디다 종(Candida spp.)의 발생을 초래한다. 따라서, 살균제는 특히 가혹한 전신 진균증의 치료, 특히 폐국균증 (pulmonary aspergillosis)에 대한 치료에 중요하다. 또한, 현재 이용할 수 있는 항균제는, 면역타협 환자에게서 출현하는 병원균 중의 하나인 세도스포륨 종(Scedosporium spp.)에 대해 효과가 없다. 암포테리신 B는 현재 임상에서 이용되는 매우 효과적인 살균제이지만, 그의 치료 지수(유효량 대 독성량)가 매우 좁다. LY303366(EP 736 541), WF11243(EP 584 360)과 같은 일부 환식 화합물이, β-1,3-글루칸 신타아제의 억제를 통해 살균 활성을 나타내는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 이들은 항균 스펙트럼 및/또는 안정성 프로필의 측면에서, 여전히 단점을 일부 갖는다. 따라서, 더욱 개선된 안정성 프로필 및 아스페르질루스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus) 및 세도스포륨 종을 포함한 주요 전신 병원균에 대한 유효성을 갖는 신규 살균제의 개발이 집요하게 요구되고 있다.

특히, 본 발명은 하기 화학식 1에 의해 나타내어지는 신규 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:

[상기 식 중에서,

R¹은 N-(3-아미노프로필)-N-[(2S)-2,5-디아미노발레릴]아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{-5-아미노-2-[N-(3-아미노프로필)아미노]발레릴}아미노, N-(2-아미노에틸)-N-{-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노 또는 오르니틸-오르니틸아미노이고;

R²는 수소 또는 메틸이며;

R³는 수소 또는 히드록시임].

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 에어로트리신 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 약제의 제조용의 상기 에어로트리신의 용도, 및 상기 화학식 1의 에어로트리신의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 병원성 미생물에 의해 유발된 감염증의 예방적 및/또는 치료적 처치방법에 관한 것이다.

바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-[(2S)-2,5-디아미노발레릴]아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{(2R)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N-(3-아미노프로필)아미노]발레릴}아미노, N-(2-아미노에틸)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노 또는 (L)-오르니틸-(D)-오르니틸아미노이고; R²가 수소 또는 메틸, 바람직하게는 수소이며; R³가 수소 또는 히드록시, 바람직하게는 수소인 상기 화학식 1의 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-[(2S)-2,5-디아미노발레릴]아미노이고, R²및 R³가 수소원자인 상기 화학식 1의 에어로트리신, 즉 하기 화학식 3a의 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:

또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은, R¹이 (L)-오르니틸-(D)-오르니틸아미노이고, R²및 R³가 수소원자인 상기 화학식 1의 에어로트리신, 즉 하기 화학식 4a의 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:

또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노이고, R²및 R³가 수소원자인 상기 화학식 1의 에어로트리신, 즉 하기 화학식 5a의 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:

또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-{(2R)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노이고, R²및 R³가 수소원자인 상기 화학식 1의 에어로트리신, 즉 하기 화학식 6a의 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:

또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N-(3-아미노프로필)아미노]발레릴}아미노이고, R²및 R³가 수소원자인 상기 화학식 1의 에어로트리신, 즉 하기 화학식 7a의 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다.:

또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은, R¹이 N-(2-아미노에틸)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노이고, R²및 R³가 수소원자인 상기 화학식 1의 에어로트리신, 즉 하기 화학식 8a의 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다:

본 발명에 따른 에어로트리신은 하기 표 1에서 예시한 바와 같은 에어로트리신이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에 의해 나타내어진 에어로트리신은, 반응식 1 및 2에 요약한 방법에 따라, 에어로트리신 1, 2 또는 3로부터 제조될 수 있으며, 여기에서, 아미노 보호기 P₁ 및 P₂는 tert-부톡시카르보닐(Boc), 벤질옥시카르보닐(Cbz), 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 등으로부터 선택될 수 있고; R² 및 R³는 상술한 바와 같다.

단계 A

출발 화합물인 하기 화학식 2의 에어로트리신은, 수성 또는 고체 배지에서 호기성 조건하에, 에어로트리신 1, 2 및 3 [에어로트리신 3 (= WF11243)은 참고예 1에 기재되어 있음]를 생산할 수 있는 튜테로마이코티나(Deuteromycotina)에 속하는 미생물을 배양하고, 배양액으로부터 에어로트리신 1, 2 및/또는 3를 분리하는 것에 의해 생산될 수 있다:

[상기 식 중에서, R²는 수소 또는 메틸이고; R³는 수소 또는 히드록시임].

상기 화학식 2의 화합물은 하기 단계 B 또는 C에 의해서 화학식 1의 화합물로 전환될 수 있다:

단계 B

단계 C

상기 단계 A 내지 C는 하기에서 더욱 상세히 예시될 수 있다.

단계 A

본 발명에 사용되는 미생물은 에어로티르신 1, 2 및 3을 생산할 수 있는 듀테로마이코티나에 속하는 돌연변이 및 변이체를 포함한 임의의 균주일 수 있다. 일본 가고시마현에서 수집된 낙엽으로부터 분리되고, 듀테로마이코티나에 속하는 균주로서 동정된 NR 7379 균주가 특히 바람직하다.

NR 7379 균주의 배양 및 형태적 특성은 하기와 같다.

1. 배양 특성

옥수수 가루 아가 (corn meal agar; CMA): 성장이 광대하지는 않았다. 25℃에서 접종(4.5㎜ 직경의 아가 플러그)후 14일째에 콜로니는 직경 11mm에 도달하였다. 이들은 평면이고, 옅은 크림 황색이었다. 반대측면은 옅은 크림 황색이었다. 무색 및 점액질성 삼출물이 존재하였다.

미우라 배지 (LCA): 성장이 광대하지는 않았다. 25℃에서 접종후 14일째에 콜로니는 직경 11mm에 도달한다. 이들은 평면이고, 옅은 크림 황색이었다. 반대측면은 옅은 크림 황색이었다. 삼출물은 존재하지 않았다.

맥아 추출물 아가 (Malt extract agar; MEA): 성장이 광대하지는 않았다. 콜로니는 농포형(pustuliform)이였고, 25℃에서 접종후 14일째에 직경 18mm에 도달하였다. 콜로니의 색은 밝은 황색형 갈색이었다. 반대측면도 동일한 색이었다. 삼출물은 무색이며, 점액질성이었다.

감자-덱스트로오스 아가(potato-dextrose agar; PDA): 성장이 광대하지는 않았다. 콜로니는 농포형(pustuliform)이였고, 25℃에서 접종후 14일째에 직경 14mm에 도달하였다. 콜로니의 색 및 구조는 MEA의 것과 유사하였다. 삼출물은 무색이고, 점액질성이었다.

발아는 5℃ 내지 30℃ 사이에서 CMA, LCA, MEA 및 PDA 상에서 관찰되었다.

2. 형태학적 특성

균사체는 부분적으로 침지되었고, 부분적인 외관상으로 분지형이고, 격막을 가지며, 옅은 갈색 내지 크림 황색을 가졌다. 분생포자(conidophore)는 침지된 균사체로부터 형성되었다. 이들은 유리질(hyaline)이고, 격막을 가지며, 분지형이고, 불규칙적이었다. 분생포자성 세포는 뚜렷한 분생포자 또는 불규칙적인 균사 상에 존재하였다. 이들은 엔테로블라스트(enteroblast) 및 소경(phialide)의 말단 또는 말단 근방을 가졌다. 말단 또는 말단 근방의 소경은 길이와 모양이 다양하였다. 이들은 실린더형 내지 호상(lageniform)이었고, 이의 길이 및 폭은 각각 5.5 내지 10㎛ 및 2.5 내지 5.5㎛이었다. 격막 바로 아래의 측생 분생포자성 세포를 갖는 비규칙적인 사상(filiform) 분생포자가 빈번히 형성되었다. 분생포자는 하나의 세포로 되어있고, 유리질이며, 연질이고, 구형 내지 거의 구형(subglobe)이며, 2.0 내지 5.5㎛의 길이와 2.0 내지 5.0㎛의 폭을 가졌다.

이러한 뚜렷한 배양 및 형태학적 특성에 기초하여, 튜테로마이코티나에 속하는 본 균주를 튜테로마이코티나 NR 7379로 명명하였다.

튜테로마이코티나 NR 7379로서 표시된 균주는, 부다페스트 조약하에 1998년 6월 16일자로, 일본 105 도쿄, 미나토구, 시바 2-쵸메, 6-1 소재의 니폰 로케 K.K.의 이름으로, 일본 산업기술총합연구소 생명공학공업기술연구소(NIBH)에 다음과 같이 기탁하였다: 튜테로마이코티나 NR 7379 (FERM BP-6391).

본 발명에 의해 제공된 방법에 따른 배양은, 배양될 미생물에 의해 이용될 수 있는 관행의 영양분을 함유하는 배양배지에서 수행될 수 있다. 탄소원으로는, 예를 들어 글루코오스, 수크로오스, 전부, 글리세롤, 당밀, 덱스트린 및 이의 혼합물이 언급될 수 있다. 질소원으로는, 예를 들어 콩가루(soybean meal), 면실박 (cottonseed meal), 육류 추출물(meat extract), 펩톤, 건조 효모, 효모 추출물, 옥수수 담금 주(corn steep liquor), 암모늄 술페이트, 나트륨 니트레이트 및 그들의 혼합물이 있다. 또한, 미생물의 성장을 촉진시키고, 에어로트리신 1의 생산을 증가시키기 위한 기타 유기물질 또는 무기물질을 배양 배지에 첨가할 수 있다. 상기 물질의 예로는, 탄산칼슘, 염화나트륨, 인산염 등과 같은 무기 염이 있다.

배양은, 바람직하게는 액체 배지에서 물속 발효에 의해 또는 고체 배지에서 정적(static) 발효에 의해 호기성 조건하에서 수행된다. 20℃ 내지 30℃의 온도, 최적으로는 27℃의 온도가 배양에 적합하다. 배양은 바람직하게는 3 내지 9의 pH에서 수행된다. 배양시간은 배양이 수행되는 조건에 따라 다양하다. 일반적으로는, 20 내지 360시간 수행하면 충분하다.

배양물로부터 목적물인 에어로트리신 1, 2, 및 3을 수확하기 위해서, 배양물로부터 미생물에 의해 생성된 대사산물을 분리하기 위해 일반적으로 사용될 수 있는 분리방법이 적당하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 이롭게는 메탄올 추출성 양쪽성 물질인 에어로트리신 1은 하기 방법에 의해서 회수된다.

즉, 고체상태 발효에 의해 수득된 전체 배양고체를 적당한 용매로 추출하여 목적된 생성물을 회수한다. 전체 배양된 고체로부터 목적 화합물을 추출하기 위해 사용될 수 있는 용매는 수용성 유기 용매, 또는 메탄올, 에탄올 또는 함수(含水) 알콜과 같은 수용성 유기 용매의 함수 용액을 포함한다.

생성된 추출물로부터 염, 수용성 물질 등을 제거하기 위해서, n-부탄올, 에틸아세테이트과 같은 물-비혼합성(water-immiscible) 유기 용매와 물 사이의 용매 구분법이 이롭게 사용될 수 있다. 추출물로부터 색소 물질, 지용성 물질 등을 제거하기 위해서, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴-0.1% 트리플루오로아세트산 등의 혼합물에 의한 용매 정제법이 이롭게 사용될 수 있다.

에어로트리신의 완전한 정제를 위해서, 컬럼 크로마토그래피가 이롭게 사용될 수 있다. 상기 컬럼 크로마토그래피에서 사용될 수 있는 담체로는 YMC-GEL ODS (Yamamura Chemical Laboratory, Japan 제) 또는 분취 C18 (Waters Millipre Corporation) 등이 있다. 용출제로서, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 등과 같은 적당한 수용성 유기용매 및 트리플루오로아세트산 수용액의 혼합물로 이루어지는 용매계가 사용될 수 있다. 그리하여 정제된 각 성분을 함유하는 용출 분획은, 농축 또는 동결건조하여, 에어로트리신 1, 2 및 3를 가루화시킬 수 있다.

에어로트리신 1, 2 및 3는 트리플루오로아세트산 염으로서 분리되지만, 자유 에어로트리신 1, 2 및 3는 하기의 방법에 의해 제조될 수 있다. 즉, 에어로트리신 1, 2 및 3 트리플루오로아세트산 염은 물에 용해한 후, 동등가의 수산화 나트륨을 첨가하고, 혼합물을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피에 적용시킨 후, 메탄올-물과 같은 함수 알콜로 용출하여, 에어로트리신 1, 2 및 3 (자유 형태) 각각을 수득한다.

단계 B

화학식 3의 화합물은 화학식 2의 에어로트리신[여기에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 상기에서 정의된 바와 같음]으로부터 4 단계로 제조될 수 있다: (1) 아크릴로니트릴을 이용한 N-알킬화; (2) N-보호된 오르니틴을 이용한 아실화; (3) 아미노 보호기(P₁ 및 P₂)의 제거; 및 (4) 시아노기의 환원.

화학식 5 및 6의 화합물은 화학식 2의 에어로트리신[여기에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 상기에서 정의된 바와 같음]으로부터 6 단계로 제조될 수 있다: (1) 아크릴로니트릴을 이용한 N-알킬화; (2) N-보호된 오르니틴을 이용한 아실화; (3) 아미노 보호기(P₁)의 제거; (4) N-보호된 아미노-아세트알데히드를 이용한 환원적 N-알킬화; (5) 아미노 보호기(P₂)의 제거; 및 (6) 시아노기의 환원.

화학식 8의 화합물은 화학식 2의 에어로트리신[여기에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 상기에서 정의된 바와 같음]으로부터 6 단계로 제조될 수 있다: (1) N-보호된 아미노-아세트알데히드를 이용한 환원적 N-알킬화; (2) N-보호된 오르니틴을 이용한 아실화; (3) 아미노 보호기(P₁)의 제거; (4) N-보호된 아미노-아세트알데히드를 이용한 환원적 N-알킬화; (5) 아미노 보호기(P₂)의 제거; 및 (6) 시아노기의 환원.

화학식 7의 화합물은 화학식 2의 에어로트리신[여기에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 상기에서 정의된 바와 같음]으로부터 6 단계로 제조될 수 있다: (1) 아크릴로니트릴을 이용한 N-알킬화; (2) N-보호된 오르니틴을 이용한 아실화; (3) 아미노 보호기(P₁)의 제거; (4) 아크릴로니트릴을 이용한 N-알킬화; (5) 아미노 보호기(P₂)의 제거; 및 (6) 시아노기의 환원.

단계 C

화학식 6의 화합물은 상기 화학식 2의 에어로트리신[여기에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 상기에서 정의된 바와 같음]으로부터 4 단계로 제조될 수 있다: (1) (1) N-보호된 오르니틴을 이용한 아실화; (2) 아미노 보호기(P₁)의 제거; (3) N-보호된 오르니틴을 이용한 아실화; (4) 아미노 보호기(P₂)의 제거.

상기 단계 B 및 C에 있어서,

(a) 아미노기의 N-모노알킬화는 문헌 [Organic Synthesis col. Vol. Ⅲ, page 93]에 기재된 방법에 따라, 아크릴로니트릴을 사용하여 수행될 수 있다.

(b) 일차 또는 2차 아미노기의 N-알킬화는, 아세트산과 같은 약산의 존재 또는 부재하에, 나트륨 시아노보로히드라이드와 같은 환원제를 사용하여, N-보호된 아미노-아세트알데히드를 이용한 종래의 환원적 알킬화에 의해 수행될 수 있다. 반응은 메탄올, 에탄올, 아세트산 등의 용매 중에서, 상온에서 수행될 수 있다.

(c) 니트릴기의 환원은, 나트륨 보로히드라이드/염화 코발트, 보란-메틸술라이드 복합체 등을 이용한 촉매 수소화 또는 환원에 의해서 수행될 수 있다[J. Med. Chem., 37, 222 (1994) 참조].

(d) 아미노기의 N-아실화는, 디사이클로헥실카르보디이미드, BOP, HBTU, TNTU, PyBroP^TM, PyBOP^TM, TBTU, TSTU, HOBt 등, 또는 이들 중 둘의 조합물과 같은 축합제를 사용하여, N-보호된 오르니틴으로 수행될 수 있다. 상기 반응은, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, 피리딘 등과 같은 염기의 존재 또는 부재하에, 메탄올, 에탄올, 피리딘, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등과 같은 용매 중에서, -20℃ 내지 +50℃, 바람직하게는 0℃ 내지 +25℃의 온도에서 수행될 수 있다.

(e) 아미노 보호기의 제거는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 Boc 기에 대한 트리플루오로아세트산의 처리 또는 Fmoc 기에 대한 피페리딘의 처리에 의해 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 에어로트리신의 산 첨가 염에 관한 것이다. 산 첨가염은, 일반적인 과정의 분리 후에, 트리플루오로아세트산 염으로서 얻어질 수 있다. 이렇게 수득된 염을 물에 용해시킬 수 있고, 목적된 음이온을 얻기 위해서 음이온 교환 컬럼에 통과시킬 수도 있다. 목적된 염을 함유하는 용출액은 농축시켜, 고체 생성물로서 회수할 수 있다.

화학식 1의 에어로트리신은, 3차 질소원자의 존재하에, 대응 염으로 전환될 수 있다.

화학식 1의 에어로트리신의 산 첨가 염은, 광물산(예컨대, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등) 및 유기산(예컨대, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등)와 같은 적당한 산 중 하나 이상의 화학정량으로 에어로트리신의 자유 염기를 처리하는 것에 의해 수득될 수 있다. 전형적으로, 상기 자유염기는 에탄올, 메탄올 등과 같은 불활성 유기용매에 용해시키고, 산이 유사한 용매 중에서 첨가된다. 온도는 약 40℃로 유지시킨다. 생성된 염은 저절로 침전되거나, 약간 극성인 용매를 이용하여 용액으로부터 수득될 수 있다.

화합물 1의 에어로트리신의 산 첨가염은 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 탄산 칼륨, 나트륨 중탄산염, 암모니아 등과 같은 적당한 염기의 하나 이상의 화학정량으로 처리하는 것에 의해, 대응 자유 염기로 전환될 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 에어로트리신은 다양한 균에 대해서 폭넓은 살균활성을 나타내고, 균 감염증의 치료 및 예방용 제제로서 사용될 수 있다. 화학식 1의 대표 에어로트리신의 시험관내 및 생체내 항균 활성(표 2, 3-1 및 3-2 참조) 및 간세포 독성(표 4 참조)이 다음과 같이 보여졌다:

1. 시험관내 항균 활성

본 연구의 대표 에어로트리신의 시험관내 항균활성은, 분광 광도측정적으로 (spectrophotometrically) 약물-비처리 대조군의 성장에 대하여, 20% 탁도가 되도록 균의 성장을 억제하기 위한 항균제의 최소 농도로서 계산된 80% 억제 농도(IC₈₀)를 측정하여 평가하였다.

IC₈₀ 값은, NCCL 승인 표준에 기초한 브로스 미세희석 실험법(broth micro-dilution procedure)을 하기와 같이 약간 변형시켜 측정하였다[임상 실험 표준화를 위한 국제 위원회(National Committee for Clinical Laoratory Standards). (1997) Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeast. Approved standard. Document M27-A). 1% 글루코오스 및 0.25% K₂HPO₄를 보충한 효모 질소 염기(Yeast Nitrogen Base; YNB; Difro Lab.)를 효모용 검사 배지로서 사용하였고, 0.2% 저융점 아가로오스(BRL)를 이용하여 고체화시킨 동일배지를 사상균용으로 사용하였다. 접종물 크기는 1-3 ×10³세포/㎖로 하였고, 배양은 35℃에서 1-2일간 수행하였다.

시험관내 항균 활성, IC₈₀ (㎍/㎖)

	칸디다 알비칸스 CY1002	아스페르질루스 푸미카투스 CF1003	세도스포륨 아피오스페르뭄 CF1077
에어로트리신 132	0.28	2.9	0.38
에어로트리신 134	0.37	0.58	0.37
에어로트리신 135	0.41	0.37	0.35
에어로트리신 136	0.33	0.38	0.34

2. 생체내 항균 유효성

2-1: 뮤린의 전신 칸디다증

본 발명의 에어로트리신의 전신 칸디다증에 대한 생체내 항균 유효성을 하기표 3-1에 나타내었다. 종래 면역성 마우스 균주인 Crj:CD-1(ICR) 마우스가 전신 칸디다증의 실험 감염 모델로 사용되었다. 4주령 Crj:CD-1(ICR) 마우스를 사용하여, 꼬리 정맥을 통해 칸디다 알비칸스 5 ×10⁶ 분생포자/마우스를 주입하여 전신 칸디다증을 유발하였다. 전신 칸디다증을 위한 주입 후, 검사 화합물을 단지 한번 정맥내(i.v.) 투여하였다. 50%의 유효량 값(ED₅₀)이 7일째에 각각의 투여에서의 생존수로부터 계산되었다.

마우스에서 전신 칸디다증에 대한 생체내 항균활성, 7일째 ED₅₀(㎎/㎏)

에어로트리신 132	0.43
에어로트리신 133	0.35
에어로트리신 135	0.35

2-2: 뮤린 폐국균증

폐국균증에 대한 본 발명의 에어로트리신의 생체내 항균 유효성을 하기 표 3-2에 나타내었다. 뮤린 폐국균증은 코르티손-처리된(250㎎/㎏, 감염 3일 전 및 감염일의 2번의 피하 처리) ICR 수컷 마우스에서 유발시켰다. A. 푸미가투스의 분생포자(2.5 ×10⁵ 분생포자/마우스)가 상기 마우스에 기관지내로 감염되었고, 4일동안 매일 한번씩 처리하였다. 각 약물의 유효성이 생존수로부터 측정되었고, 50%의 유효량 (ED₅₀)이 14일째에 각각 투여에서의 생존수로부터 계산되었다.

마우스에서 폐국균증에 대한 생체내 항균활성, 14일째 ED₅₀(㎎/㎏)

에어로트리신 132	5.2
에어로트리신 134	5.8
에어로트리신 137	5.2
에어로트리신 3	> 15

3. 실험관내 간세포독성 검사

마우스의 간세포가 콜라게나아제 소화에 의해 분리되었고, 마이크로테스트 플레이트(microtest plate)에서 배양되었다. 간세포 단일층은 배양계에서 1일동안 검사 에어로트리신에 노출되었다. 배양기간 후에, 간세포를 현미경으로 관찰하였고, 형태학적으로 평가하였다. 검사 에어로트리신에 의한 간세포의 형태학적 변화(퇴화)의 정도는 WF11243 및 LY303366과 비교하였다.

간세포에 대한 세포독성(㎍/㎖)

에어로트리신 132	> 100
에어로트리신 134	> 100
에어로트리신 135	> 100
WF11243 (에어로트리신 3)	100
LY303366	10

2주동안 마우스에 5㎎/㎏ 및 30㎎/㎏의 에어로트리신 132의 투여(매일 1번: i.v.)는 어떠한 급성 독성도 나타내지 않았다.

따라서, 화학식 1의 신규 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염은, 마우스에서 국균증을 포함한 다양한 균 감염에 대해, 폭넓은 범위의 투여량에 걸쳐 잠재 항균활성을 나타내고, 따라서 항균제로서 유용하다. 게다가, 본 발명에 의해 제공되는 에어로트리신은, 공지의 환식 펩티드 유도체(WF11243 및 LY303366) 보다, 간세포에 대해 훨씬 더 독성이 낮다.

또한, 본 발명의 에어로트리신은 면역타협 환자에게서 뉴모시스티스 카리니이(pneumocystis carinii) 감염을 억제하거나 경감하는데에 유용하다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 신규 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

화학식 1의 신규 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염은 매우 효과적인 살균제이다. 이들은 칸디다 종, 아스페르질루스 종, 세도스포륨 종, 무코르 종 및 아비시디아 종을 포함한 다양한 균종에 대해 유효하다.

따라서, 본 발명의 에어로트리신은, 인간 및 동물에게서 진균증의 국소적 치료 및 전신적 치료를 위해 유용하다. 예를 들어, 이들은 칸디다 종, 트리코피톤 종 및 마이크로스포륨 종에 의해 유발되는 국소적 및 점액질성 균 감염의 치료에 유용하다. 또한, 이들은, 예를 들어 칸디다 종, 아스페르질루스 종 또는 세도스포륨 종에 의해 유발되는 전신 균 감염의 치료에 유용하다.

임상의 용도를 위해서, 화학식 1의 신규 에어로트리신 및 그의 약학적으로 수용가능한 염은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로는 부형제, 접합제, 윤활제, 분해제, 코팅 물질, 에멀젼화제, 현탁제, 용매, 안정화제, 흡수 강화제 및/또는 연고 기재의 혼합에 의해, 특정 용도에 적합하도록 제형화된 약학 혼합물로 투여된다. 상기 혼합물은 경구, 주사형, 코, 직장 또는 국소적 투여용으로 사용될 수 있다.

경구 투여용 에어로트리신의 약학 제형은, 과립, 정제, 당 코팅된 타블렛, 캡슐, 환약, 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하로의 투여와 같은 비경구 투여를 위해서, 화학식 1의 에어로트리신은, 예를 들어 등장 용액으로 만들기 위한 염 또는 글루코오스와 같은 기타 물질을 함유할 수 있는 무균수 용액의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 앰플 내에 단위 투여 형태로 존재하거나, 또한 바람직하게는 첨가된 보존제와 함께 다수투여 용기내에 존재할 수 있다. 또한, 활성 함유물은, 투여 전에 적당한 운반제로 재구성되는 파우더 형태일 수 있다. 또한, 에어로트리신은 좌약 또는 페서리(pessary)의 형태일 수 있으며, 이들은 로션, 용액, 크림, 연고 또는 미세 파우더(dusting powder)의 형태로 국소적으로 적용할 수도 있다.

화학식 1의 에어로트리신의 1당 투여분은, 경구 또는 비경구 경로로 투여할 때, 0.1 내지 50㎎/㎏(배분된 투여량으로)이다. 에어로트리신의 타블렛 또는 캡슐은 단독 또는 2회 이상의 투여를 위해 적합하게는 한번에 5㎎ 내지 0.5g의 활성화합물을 함유할 것으로 예상할 수 있다. 어떠한 경우에서도, 실제적인 투여량은 의사에 의해 결정될 수 있으며, 특정 환자의 나이, 몸무게 및 반응에 따라 다양할 수 있다.

에어로트리신이 항균제 용도일때, 임의의 투여방법이 사용될 수 있다. 진균성 감염증(mycotic infection)을 치료하기 위해서는, 일반적으로는 경구 또는 정맥내 투여가 이용된다.

에어로트리신이 뉴모시스티스 감염의 조절을 위해 사용된다면, 폐 및 기관지에 직접 처리하는 것이 바람직하다. 이러한 이유로, 흡입 방법이 바람직하다. 흡입에 의한 투여 또는 코로의 투여를 위해서, 본 발명의 에어로트리신은 관행에 따라 압축된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 흡입 또는 코로의 투여를 위한 바람직한 전달계는, 불화탄소 또는 탄화수소와 같은 적당한 추진제 중의 화학식 1의 파우더, 현탁액 또는 용액으로서 제형화될 수 있는 측량된 흡입 에어로졸이다.

본 발명의 에어로트리신은 타블렛, 캡슐, 국소적 조성물, 취입 파우더, 좌약 등으로서 사용될 수 있고, 물 및 수성 매체 중의 본 발명의 에어로트리신의 용해도는 주사형 제형으로, 또한 에어로졸 스프레이용으로 적합한 액체 조성물로 사용하기에 적합하다.

하기 실시예는 본 발명의 에어로트리신의 제조를 위한 바람직한 방법을 예시하지만, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에서, 생성물은 하기 나열된 것으로부터 선택된 역상(reverse phase) 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 분석되고 정제되었다. 혼합용매는, 각각의 제조 실시예에 기재된 적합한 비율을 갖는 0.05% 트리플루오로아세트산-물 : 0.05% 트리플루오로에세트산-아세토니트릴로 이루어진다.

HPLC 컬럼:

컬럼 A: CAPCELL PAK C18, UG-120, 4.6 × 250 ㎜

컬럼 B: CAPCELL PAK C18, UG-120, 10 × 250 ㎜

컬럼 C: CAPCELL PAK C18, UG-80, 20 × 250 ㎜

컬럼 D: CAPCELL PAK C18, SG-120, 4.6 × 250 ㎜

컬럼 E: CAPCELL PAK C18, SG-120, 10 × 250 ㎜

컬럼 F: TSK GEL ODS-80Ts, 20 ×250 ㎜

하기 제조 실시예에서, 특별한 언급이 없다면, 에어로트리신은 트리플루오로아세트산 염으로 수득되었다.

참고예 1

에어로트리신 1, 2 및 3의 제조

a) 고체 발효

10%(v/v) 글리세롤 용액 중의 듀테로마이코티나 NR7379(FERM BP-6391)의 동결된 배양물 0.1㎖ 분량을 녹이고, 2% 글루코오스, 1% 감자 전분, 1.5% 글리세롤, 1% 토스트 소야(Toast soya)(Nissin Seiyu), 0.35% 효모 추출물(Nippon Seiyaku), 0.25% 폴리펩톤(Nippon Seiyaku), 0.3% NaCl, 0.5% CaCO₃, 0.005% ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.0005% CuSO₄ㆍ5H₂O 및 0.0005% MnSO₄ㆍ4H₂O로 이루어진 배양액 100㎖을 함유하고 있는 500㎖ 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 접종하였다. 배지의 pH는 조정하지 않았다. 접종 배양물을 회전 교반기에서 27℃, 220rpm으로 7일동안 배양하였다. 2㎖의 접종 배양물을 200g의 압축 보리, 0.12g의 효모 추출물(Difco), 0.06g의 나트륨 타르타르산염, 0.06g의 KH₂PO₄ 및 120㎖의 물로 이루어진 고체 배지를 함유하는 3 리터의 에를렌마이어 플라스크로 옮겼다. 정적인 조건하에서, 27℃에서 발효를 수행하였다. 생성물은 발효 240시간 경에 최대값에 도달하였으며, 배양물은 에어로트리신 1, 2 및 3의 분리 공정을 수행하였다.

수득된 배양 고체(10㎏)을 메탄올(40ℓ)에 첨가하고, 혼합물을 교반한 다음, 여과 분리하여, 메탄올 추출물(39ℓ)를 수득하였다. 수득된 메탄올 추출물을 감압하에서 농축하여 건조시키고, 잔류물(64.8g)에 에틸아세테이트(1ℓ) 및 물(1ℓ)를 첨가하였다. 그리고, 혼합물을 교반한 다음, 에틸 아세테이트 층을 제거하였다.

이어서, 수용액층을 에틸 아세테이트(1ℓ)로 두번 세척하였다. 잔류 수성층을 n-부탄올(1ℓ)로 세번 추출하였다. 그리하여 수득된 추출물을 결합하고, 감압하에서 농축하여 건조시키고, 잔류물(28.5g)을 아세토니트릴-0.1% 트리플루오로아세트산 수용액(1:1)에 용해하였다. 원심분리에 의해 불용성 물질을 제거한 후, 수득된 용액을 감압하에서 증발건조하고, 잔류물에 메탄올(300㎖)을 첨가한 후, 혼합물을 교반한 다음, 여과분리하여, 메탄올 용액(280㎖)을 수득하였다. 그리하여 수득된 메탄올 수용성 물질(9.3g)에 대해, 역상 실리카 겔 C18(1ℓ) 상에서 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 메탄올-0.1% 트리플루오로아세트산 수용액(2:8, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3 및 8:2)의 혼합물을 사용하여 단계별로 용출하였다. 메탄올-0.1% 트리플루오로아세트산 (7:3)의 순서에서 용출된 에어로트리신 1, 2 및 3을 진공하에서 농축 건조시켜, 흰색 파우더성 에어로트리신 3 트리플루오로아세트산 염(731㎎), 에어로트리신 1 트리플루오로아세트산 염(747㎎)을 각각 수득하였다. 에어로트리신 2를 함유하고 있는 분획은 감압하에서 농축하고, 하기 조건하에서 HPLC로 더 정제하였다: 컬럼: Capcell Pak C18 (i.d. 30 ×250㎜, Shiseido Co., LTD.); 이동상: 아세토니트릴-0.1% 트리플루오로산 수용액(45:55); 흐름 속도: 40㎖/분; 검출: UV 220㎚. 상기 조건하에서 수득된 적당한 용출액을, 진공하에서 농축건조하여, 흰색 파우더성 에어로트리신 2 트리플루오로아세트산(42㎎)을 수득하였다.

b) 플라스크 발효

10%(v/v) 글리세롤 용액 중의 듀테로마이코티나 NR7379(FERM BP-6391)의 동결된 배양물 2㎖ 분량을 녹이고, 1% 글루코오스, 1% 귀리 가루(oat flour), 4% 감자 전분, 0.5% 옥수수 담금 주(Ando kasei), 0.001% FeSO₄ㆍ7H₂O, 0.001% MnSO₄ㆍ4H₂O, 0.0001% CaCl₂, 0.0002% ZnSO₄ㆍ7H₂O, 0.00002% (NH₄)6MoO₂ㆍ4H₂O 및 0.00006% H₃BO₃로 이루어진 배양액 100㎖을 함유하고 있는 500㎖ 에를렌마이어 플라스크에 접종하였다. 살균 전에 배지의 pH를 6.8로 조정하였다. 접종 배양물을 회전 교반기에서, 27℃, 220rpm으로 3일동안 배양하였다. 1차 접종 배양물 2㎖을, 동일배지 100㎖을 함유하고 있는 500㎖ 에를렌마이어 플라스크로 옮긴 다음, 회전 교반기에서 동일한 조건하에 3일동안 배양하였다. 2차 접종 배양물 2㎖은 8.5% 글리세롤, 감귤 유래의 펙틴 1%, 0.4% 땅콩 파우더, 비타민 비함유 우유 유래의 카제인 0.4%, 0.4% 토마토 페이스트(paste), 0.4% 옥수수 담금 주(Ando kasei), 0.2% 글리신 및 0.2% KH₂PO₄로 이루어지는 배양액 100㎖을 포함하는 500㎖ 에를렌마이어 플라스크에 접종하였다. 살균 전에, 배지의 pH를 7.0으로 조정하였다. 발효는 220rpm로 교반하면서, 270℃에서 수행하였다. 배양 10일 후, 생성물은 최대값에 도달하였으며, 전체 배양물은 에어로트리신 1, 2 및 3의 분리 공정을 수행하였다.

c) 단지 발효(jar fermentation)

10%(v/v) 글리세롤 용액 중의 듀테로마이코티나 NR7379(FERM BP-6391)의 동결된 배양물 2㎖ 분량을 녹이고, 상술한 바와 동일한 접종 배지 100㎖을 함유한 500㎖ 에를렌마이어 플라스크에 접종하였다. 플라스크를 220rpm으로, 27℃에서 3일 동안 교반하였다. 1차 접종 배양물 2㎖을 상기와 동일한 접종배지 100㎖을 함유한 500㎖ 에를렌마이어 플라스크로 옮긴 다음, 회전교반기에서 상기와 동일한 조건하에 3일 동안 배양하였다. 2차 접종 배양물의 600㎖을, 상술한 바와 동일한 생성 배지 30ℓ및 0.4% 디스포암(disfoam; Nissan Disfoam CA-123)을 함유한 50ℓ 단지 발효기에서 배양하였다. 발효는 30ℓ/분의 폭기(曝氣) 및 400rpm의 교반과 함께 27℃에서 수행하였다. 발효 168시간 경에서 생성물이 최대값에 도달하였고, 전체 배양물에 대해 에어로트리신 1, 2 및 3의 분리 공정을 수행하였다.

에어로트리신 1

1) 모양: 흰색 고체

2) 분자량 (FAB-MS 방법): m/z 1547 (M+H)⁺

3) 분자식: C₇₂H₁₁₈N₁₄O₂₃

4) 고해상도 질량 분광분석 ((M+H)⁺에 대해):

측정값: 1547.8568

C₇₂H₁₁₉N₁₄O₂₃에 대해 계산된 값: 1547.8572

5) UV 스펙트럼 (도 1): 메탄올에서:

λ(ξ)max (MeOH): 225 ±5 (10600sh), 270 ±5 (2000), 278 ±5 (2100)

λ(ξ)max (N/10 NaOH-MeOH): 240 ±5(7700), 268 ±5(1800), 298 ±5(1800)

6) IR 스펙트럼(KRr) (도 2):

주요 흡수 파장 수(㎝^-1)는 다음과 같다:

3379, 2927, 2855, 1740, 1660, 1535, 1453, 1203, 1139, 837

7) ¹H-NMR 스펙트럼 (도 3):

400 MHz, CD₃OD에서

8) ¹³C-NMR 스펙트럼 (도 4):

100 MHz, CD₃OD에서

9) 용해도:

용해성: 물, 메탄올, 디메틸술폭시드

10) 착색 반응:

양성: 닌히드린, 아니살데하이드-황산, 요오드 증기, 바닐린-황산, 리돈-스미스 시약(Rydon-Smith reagent), 몰리브도인산(molybdophosphoric acid)

음성: 사카구치 시약(Sakaguchi reagent), 브로모크레솔 그린, 2,4-디니트로페닐히드라진-황산

11) 박층 크로마토그래피 (TLC):

담체	용매	Rf
실리카겔 F254^*1	n-BuOH: 아세톤:AcOH:H₂O (4:5:1:1)	0.74
실리카겔 F254^*1	MeOH: H₂O (95:5)	0.12
^*1 E. Merck AG., Germany 제조

12) 고성능 액체 크로마토그래피:

담체: Capcell Pak C18 gel S120A, 4.6 ×250㎜ (Shiseido, Co. LTD. 제조)

이동상: 아세토니트릴 : 0.05% 트리풀루오로아세트산 수용액 = 1:1

흐름 속도: 1㎖/분.

Rt = 12.1 ±0.5

13) 아미노산 분석:

에어로트리신 1을 6N HCl 중에서 120℃로 24시간동안 가열한 다음, 아미노산 분석을 수행하여, 트레오닌, 알로-트레오닌 3 유닛, 글리신, 알라닌, 발린, 티로신, 오르니틴, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 3-히드록시글루타민을 검출하였다.

에어로트리신 2

1) 모양: 흰색고체

2) 분자량 (FAB-MS 방법): m/z 1549 (M+H)⁺

3) 분자식: C₇₁H_l17N₁₄O₂₄

4) 고해상도 질량 분광분석 ((M+H)⁺에 대해):

측정값: 1549.8384

C₇₁H_l16N₁₄O₂₄에 대한 계산된 값: 1549.8365

5) UV 스펙트럼 (도 5): 메탄올에서:

λ(ξ)max (MeOH에서): 225 ±5 (10200sh), 275 ±5 (1900), 278 ±5 (2000)

λ(ξ)max (N/10 NaOH-MeOH에서): 240 ±5 (7700), 293 ±5 (2000)

6) IR 스펙트럼 (KBr) (도 6):

주요 흡수 파장 수(㎝^-l)는 다음과 같다:

3323, 2928, 2856, 1740, 1670, 1531, 1450, 1203, 1137, 837

7) ¹H-NMR 스펙트럼 (도 7):

400 MHz, CD₃OD에서

8) ¹³C-NMR 스펙트럼 (도 8):

100 MHz, CD₃OD에서

9) 용해도:

용해성: 물, 메탄올, 디메틸술폭시드

10) 착색반응:

양성: 닌히드린, 아니살데히드-황산, 요오드 증기, 바닐린-황산, 리돈-스미스 시약, 몰리브도인산

음성: 사카구치 시약, 브로모크레솔 그린, 2,4-디니트로페닐히드라진-황산

11) 박층 크로마토그래피 (TLC):

담체	용매	Rf
실리카겔 F254^*1	n-BuOH:아세톤:AcOH:H₂O (4:5:1:1)	0.29
실리카겔 F254^*1	MeOH: H₂O (95:5)	0.15
^*1 E. Merck AG., Germany 제조

12) 고성능 액체 크로마토그래피:

담체: Capcell Pak C18 gel S120A, 4.6 ×250㎜ (Shiseido, Co., LTD. 제조)

이동상: 아세토니트릴 : 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액 = 1:1

유속: 1㎖/분.

Rt = 9.9 ±0.5

13) 아미노산 분석:

에어로트리신 2를 6N HCl 중에서 120℃로 24시간동안 가열한 다음, 아미노산 분석을 수행하여, 트레오닌, 알로-트레오닌 3 유닛, 글리신, 알라닌, 발린, 3-히드록시티로신(DOPA), 오르니틴, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 3-히드록시글루타민을 검출하였다.

에어로트리신 3

1) 모양: 흰색 고체

2) 분자량 (FAB-MS 방법): m/z 1533 (M+H)⁺

3) 분자식: C₇₁H₁₁₆N₁₄0₂₃

4) UV 스펙트럼: 메탄올에서:

λ(ξ)max (MeOH에서): 225 ±5 (11000sh), 275 ±5 (2000), 280 ±5 (1900)

λ(ξ)max (N/10 NaOH-MeOH에서): 243 ±5 (7800), 295 ±5 (1800)

5) IR 스펙트럼 (KBr):

주요 흡수 파장 수(㎝^-l)는 다음과 같다:

3334, 2928, 2852, 1742, 1662, 1520, 1449, 1202, 1136, 836

6) 용해도:

용해성: 물, 메탄올, 디메틸술폭시드

7) 착색반응:

8) 박층 크로마토그래피 (TLC):

담체	용매	Rf
실리카겔 F254^*1	n-BuOH:아세톤:AcOH:H₂O (4:5:1:1)	0.26
실리카겔 F254^*1	MeOH: H₂O (95:5)	0.09
^*1 E. Merck AG., Germany 제조

9) 고성능 액체 크로마토그래피:

담체: Capcell Pak C18 gel S120A, 4.6 ×250㎜ (Shiseido, Co., LTD. 제조)

이동상: 아세토니트릴: 0.05% 트리플루오로아세트산 수용액 = 1:1

유속: 1㎖/분.

Rt = 9.1 ±0.5

10) 아미노산 분석:

에어로트리신 3을 6N HCl 중에서 120℃로 24시간동안 가열한 다음, 아미노산 분석을 수행하여, 트레오닌, 알로-트레오닌 3 유닛, 글리신, 알라닌, 발린, 티로신, 오르니틴, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 3-히드록시글루타민을 검출하였다.

실시예 1: 에어로트리신 132의 제조

(a) MeOH (10㎖) 중의 에어로트리신 3 (500㎎, 0.326m㏖) 및 트리에틸아민 (682㎕, 4.89m㏖)의 혼합물에, 아크릴로니트릴(214㎕, 3.27m㏖)을 상온에서 첨가하였다. 상기 혼합물을 상온에서 20시간 동안 교반하였다. 진공에서 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 n-부탄올에 용해하고, 희석된 염산으로 세척한 다음, 이어서 물로 세척하였다. 유기층을 진공에서 증발시켰다. 미정제 잔류물을 분취(分取; preparaive) 역상 HPLC로 정제하였으며, 이의 세부 조건은 하기와 같다. 적당한 분획을 결합하고, 동결한 다음, 동결건조하여, 무색 비결정질 고체로서 207㎎의 에어로트리신 120 (R² 및 R³가 수소이고, R¹이 (2-시아노에틸)-아미노인 화학식 1의 화합물)을 수득하였다.

HPLC(Rt) 27.5분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 53:47); FAB-MS (m/z): 1586 [M+H]⁺.

(b) DMF(2㎖) 중의 Boc-L-Orn(Boc)-OH(46㎎, 0.138m㏖)의 교반된 용액에, BOP 시약(62㎎, 0.14m㏖), HOBT 수화물(22㎎, 0.144m㏖) 및 N-에틸디이소프로필아민(24㎕, 0.138 m㏖)을 첨가하였다. 상온에서 2시간동안 교반한 후, DMF(2㎖) 중의 에어로트리신 120(100㎎, 0.063m㏖) 및 N-에틸디이소프로필아민(24㎕, 0.138m㏖)의 용액을, 반응 혼합물에 첨가하였다. 상온에서 20시간 동안 교반한 후, 용매를 진공에서 증발시켰다.

상기 수득된 TFA(3㎖) 중의 미정제 잔류물의 용액을 0℃에서 30분동안 교반하였다. 반응 용기를 열고, TFA를 건조 질소의 스트림(stream)하에서 증발시켰다. 잔류물을 분취 역상 HPLC에 의해 정제하였으며, 이의 세부조건은 하기에서 보는 바와 같다. 정제 분획을 결합하고, 동결하였으며, 동결건조하여, 흰색 비결정질 고체로서 60.5㎎의 화합물-1을 수득하였다.

HPLC(Rt) 20.7분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 57:43); FAB-MS (m/z): 1700 [M+H]⁺.

(c) 디옥산(2㎖) 및 물(2㎖) 중의 화합물-1(60.5㎎, 0.0356m㏖)의 혼합물에, 목탄(charcoal) 상의 10% 팔라듐(10㎎)을 첨가하고, 반응용기를 수소로 충전시켰다. 상온에서 14시간 동안 교반한 후, 혼합물을 막 필터(구멍 크기: 0.2㎜)를 통해 여과하고, 용매를 진공에서 증발시켰다. 미정제 잔류물을 분취 역상 HPLC에 의해 정제하였으며, 이의 세부 조건은 하기에서 보는 바와 같다. 적당한 분획을 결합하고, 동결하며, 동결건조하여, 무색 비결정질 고체로서 27.8㎎의 에어로트리신 132를 수득하였다.

HPLC(Rt) 18.9분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 60:40); FAB-MS (m/z): 1704 [M+H]⁺.

실시예 2: 에어로트리신 134의 제조

(a) DMF(6㎖) 중의 Fmoc-L-Orn(Boc)-OH(379㎎, 0.834m㏖)의 교반 용액에, BOP 시약(368㎎, 0.832m㏖), HOBT 수화물(128㎎, 0.836m㏖) 및 N-에틸디이소프로필아민(145㎕, 0.832m㏖)를 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반한 후, DMF(3㎖) 중의 에어로트리신 120(600㎎, 0.378m㏖) 및 N-에틸디이소프로필아민(145㎕, 0.832m㏖)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. 상온에서 18시간 동안 교반한 후, 피페리딘(3㎖)을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 10분 동안 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 및 디에틸에테르로 세척하여, 시약을 제거하였다. 미정제 생성물을 추가적인 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

(b) 상기에서 수득된 미정제 생성물(320㎎)의 MeOH(10㎖) 중의 용액에, MeOH(4㎖) 중의 (2-옥소-에틸)카르밤산 tert-부틸에스테르(미정제물, 530㎎), AcOH(2㎖) 및 NaBH₃CN(210㎎, 3.342m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 20시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 n-부탄올에 용해하고, 희석된 염산으로 세척한 다음, 이어서 물로 세척하였다. 유기층을 진공에서 증발시켰다.

상기에서 수득된 미정제 잔류물의 TFA(6㎖) 중의 용액을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응 용기를 열고, TF를 건조 질소의 스트림하에서 증발시켰다. 잔류물을 분취 역상 HPLC에 의해 정제하였으며, 이의 세부 조건은 하기와 같다. 적당한 분획을 결합하고, 동결하며, 동결건조하여, 흰색 비결정질 고체로서 88.2㎎의 화합물-2를 수득하였다.

HPLC(Rt) 22.4분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 60:40).

(c) 디옥산(1.5㎖) 및 물(1.5㎖) 중의 화합물-2(88.2㎎, 0.494m㏖)의 혼합물에, 목탄 상의 10% 팔라듐(20㎎)을 첨가하고, 반응용기를 수소로 충전하였다. 상온에서 16시간 동안 교반한 후, 혼합물을 막 필터(구멍 크기: 0.2㎜)를 통해 여과하고, 용매를 진공하에서 증발시켰다. 미정제 잔류물을 분취 역상 HPLC에 의해 정제하였으며, 이의 세부 조건은 하기와 같다. 적당한 분획을 결합하고, 동결하며, 동결건조하여, 무색 비결정질 고체로서 22.0㎎의 에어로트리신 134를 수득하였다.

HPLC(Rt) 25.7분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 63:37); FAB-MS (m/z): 1790 [M+H]⁺.

실시예 3: 에어로트리신 135의 제조

에어로트리신 135는 실시예 2에 기재된 것과 유사한 방법에 따라 제조되었다.

HPLC(Rt) 25.5분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 63:37); FAB-MS (m/z): 1790 [M+H]⁺.

실시예 4: 에어로트리신 136의 제조

(a) DMF(6㎖) 중의 Fmoc-L-Orn(Boc)-OH(379㎎, 0.834m㏖)의 교반된 용액에, BOP 시약(368㎎, 0.832m㏖), HOBT 수화물(128㎎, 0.836m㏖) 및 N-에틸디이소프로필아민(145㎕, 0.832m㏖)을 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 교반한 후, DMF(3㎖) 중의 에어로트리신 120(600㎎, 0.378m㏖) 및 N-에틸디이소프로필아민(145㎕, 0.832m㏖)의 용액을 반응 혼합물에 첨가하였다. 상온에서 18시간 동안 교반한 후, 피페리딘(3㎖)을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 10분 동안 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 및 디에틸에테르로 세척하여, 시약을 제거하였다. 미정제 생성물을 추가적인 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

(b) 상기에서 수득된 미정제 생성물(300㎎)의 EtOH(10㎖) 중의 용액에, 아크릴로니트릴(110㎕, 1.68m㏖) 및 N-에틸디이소프로필아민(44㎕, 0.253m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 14시간 동안 교반한 후, 아크릴로니트릴(440㎕, 6.72m㏖) 및 N-에틸디이소프로필아민(44㎕, 0.253m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 22시간 동안 교반한 후, 아크릴로니트릴(220㎕, 3.36m㏖) 및 N-에틸디이소프로필아민(44㎕, 0.253m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 6시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공하에서 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 및 디에틸에테르로 세척하여, 시약을 제거하였다.

상기에서 수득된 미정제 잔류물의 TFA(3㎖) 중의 용액을 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응용기를 열고, TFA를 건조 질소의 스트림하에서 증발시켰다. 잔류물을 분취 역상 HPLC에 의해 정제하였으며, 이의 세부 조건은 하기와 같다. 적당한 분획을 결합하고, 동결하며, 동결건조하여, 흰색 비결정질 고체로서 104.6㎎의 화합물-3을 수득하였다.

HPLC(Rt) 27.8분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 57:43).

(c) 디옥산(3㎖) 및 물(3㎖) 중의 화합물-3(104.6㎎, 0.0596m㏖)의 혼합물에, 목탄 상의 10% 팔라듐(25㎎)을 첨가하고, 반응용기를 수소로 충전하였다. 상온에서 16시간 동안 교반한 후, 혼합물을 막 필터(구멍 크기: 0.2㎜)를 통해 여과하고, 용매를 진공하에서 증발시켰다. 미정제 잔류물을 분취 역상 HPLC에 의해 정제하였으며, 이의 세부 조건은 하기와 같다. 적당한 분획을 결합하고, 동결하며, 동결건조하여, 무색 비결정질 고체로서 40.3㎎의 에어로트리신 136을 수득하였다.

HPLC(Rt) 25.8분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 63:37); FAB-MS (m/z): 1761 [M+H]⁺.

실시예 5: 에어로트리신 133의 제조

DMF(10㎖) 중의 에어로트리신 3 모노TFA 염(2.5g)의 용액에, Fmoc-D-Orn(BOC)OH(850㎎), BOP(180㎎), HOBT(279㎎) 및 N-에틸디이소프로필아민(0.795㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 3시간동안 교반한 후, 피페리딘(4.0㎖)을 첨가하였다. 교반을 상온에서 30분 동안 지속한 다음, 용매를 진공하에서 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고, 에테르를 적가하여, 흰색 비결정질 파우더로서 미정제 생성물을 수득하였다. 에테르로 세척하고, 추가적인 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

(b) 상기에서 수득된 미정제 생성물을 DMF(20㎖)에 용해하였다. 이 용액에, Boc-L-Orn(Boc)OH(656㎎), BOP(872㎎), HOBT(302㎎) 및 N-에틸디이소프로필아민 (0.793㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 3시간 동안 교반한 후, 용매를 진공하에서 제거하였다.

(c) 상기에서 수득된 잔류물에, TFA(15㎖)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 에테르를 적가하여 흰색 침전물을 수득하였다. 이를 에테르로 세척하고, 분취 역상 HPLC로 정제하였다. 정제 분획을 결합하고, 동결하며, 동결건조하여, 무색 비결정질 고체로서 515㎎의 에어로트리신 133을 수득하였다.

HPLC(Rt) 19.7분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 60:40); FAB-MS (m/z): 1761 [MH]⁺.

실시예 6: 에어로트리신 137의 제조

(a) 디클로로메탄(16㎖) 및 MeOH(4㎖) 중의 에어로트리신 3 모노TFA 염(622㎎)의 용액에, N-Boc-아미노에타날(120㎎) 및 N-에틸디이소프로필아민(0.072㎖)을 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물에, 나트륨 시아노보로히드라이드(48㎎) 및 황산(0.04㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 72시간 동안 교반한 후, 용매를 진공하에서 증발시킨 다음, 0.1N HCl을 첨가하였다. nBuOH로 추출한 다음, 농축시켰다.

(b) 잔류물을 DMF(6㎖)에 용해한 다음, 여기에 2-(S)-[비스-(2-Boc-아미노에틸)아미노]-5-Boc-아미노펜타노산(294㎎), HOAt(77㎎), HBTU(215㎎) 및 N-에틸디이소프로필아민(0.148㎖)을 첨가하였다. 상온에서 48시간 동안 교반한 후, 용매를 진공하에서 증발시키고, 잔류물을 디클로로메탄에 용해하였다. 이 용액에 에테르를 첨가하여, 흰색 침전물을 수득하였다. 이를 에테르로 세척한 다음, 추가적인 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

(c) 이어서, 상기에서 수득된 화합물에, TFA(3㎖)을 0℃에서 첨가하였다. 0℃에서 30분 동안 교반 한 후, 에테르를 반응 혼합물에 첨가하여, 흰색 침전물을 수득하였다. 이를 에테르로 세척하고, 분취 역상 HPLC로 정제하였다. 정제 분획을 결합하고, 동결하며, 동결건조하여, 무색 비결정질 용액으로서 95㎎의 에어로트리신 137을 수득하였다.

HPLC(Rt) 14.6분 (컬럼 F, 흐름 속도: 10㎖/분, 용출제: 0.05% 트리플루오로아세트산:0.05% 트리플루오로아세트산-아세토니트릴 = 61:39); FAB-MS (m/z): 1776 [M+H]⁺.

실시예 A

하기 성분을 함유하는 각각의 주사형 용액이 종래의 본질적인 방법으로 제조되었다:

에어로트리신 132	20 ㎎
2나트륨 수소인산염, 무수물	7.6 ㎎
나트륨 2인산염 2수화물	2.0 ㎎
에틸 알콜	150 ㎎
탈염 및 멸균된 증류수	850 ㎎
총	1029.6 ㎎

Claims

하기 화학식 1로 나타내어지는 에어로트리신(Aerothricin) 및 그의 약학적으로 수용가능한 염:

[화학식 1]

[상기 식 중에서,

R¹은 N-(3-아미노프로필)-N-[(2S)-2,5-디아미노발레릴]아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{-5-아미노-2-[N-(3-아미노프로필)아미노]발레릴}아미노, N-(2-아미노에틸)-N-{-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노 또는 오르니틸-오르니틸아미노이고;

R²는 수소 또는 메틸이며;

R³는 수소 또는 히드록시임(단, 여기에서, R2 및 R3가 수소이고, R1이 (R)-오르니틸-(R)-오르니틸아미노인 것은 제외함)].
제 1 항에 있어서, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-[(2S)-2,5-디아미노발레릴]아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{(2R)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노, N-(3-아미노프로필)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N-(3-아미노프로필)아미노]발레릴}아미노, N-(2-아미노에틸)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노 또는 (L)-오르니틸-(D)-오르니틸아미노임을 특징으로 하는 에어로트리신.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R² 및 R³는 수소임을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 있어서, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-[(2S)-2,5-디아미노발레릴]아미노임을 특징으로 하는 에어로트리신.
제 1 항에 있어서, R¹이 (L)-오르니틸-(D)-오르니틸아미노임을 특징으로 하는 에어로트리신.
제 1 항에 있어서, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N,N-비스 (2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노임을 특징으로 하는 에어로트리신.
제 1 항에 있어서, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-{(2R)-5-아미노-2-[N,N-비스 (2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노임을 특징으로 하는 에어로트리신.
제 1 항에 있어서, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N-(3-아미노프로필)아미노]발레릴}아미노임을 특징으로 하는 에어로트리신.
제 1 항에 있어서, R¹이 N-(2-아미노에틸)-N-{(2S)-5-아미노-2-[N,N-비스(2-아미노에틸)아미노]발레릴}아미노임을 특징으로 하는 에어로트리신.
제 1 항에 있어서, R¹이 N-(3-아미노프로필)-N-[(2S)-2,5-디아미노발레릴]아미노이고, R² 및 R³가 수소임을 특징으로 하는 에어로트리신.
(a) 아크릴로니트릴을 이용한 화학식 2의 화합물[여기에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 제 1항에서 정의된 바와 같음]의 N-알킬화 단계; (b) N-보호된 오르니틴을 이용한 상기 생성된 화합물의 아실화 단계; (c) 아미노 보호기(P₁ 및 P₂)의 제거 단계; 및 (d) 시아노기의 환원 단계를 포함함을 특징으로 하는 제 4 항에 따른 화합물의 제조 방법.
(a) 아크릴로니트릴을 이용한 화학식 2의 화합물[상기 식 중에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 제 1 항에서 정의된 바와 같음]의 N-알킬화 단계; (b) N-보호된 오르니틴을 이용한 상기 생성된 화합물의 아실화 단계; (c) 케토기에 인접한 아미노 보호기(P₁)의 제거 단계; (d) N-보호된 아미노-아세트알데히드를 이용한 환원적 N-알킬화단계; (e) 잔류 아미노 보호기(P₂)의 제거 단계; 및 (f) 시아노기의 환원 단계를 포함함을 특징으로 하는 제 6 항에 따른 화합물의 제조 방법.
(a) N-보호된 아미노-아세트알데히드를 이용한 화학식 2의 화합물[상기 식 중에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 제 1 항에서 정의된 바와 같음]의 환원적 N-알킬화 단계; (b) N-보호된 오르니틴을 이용한 상기 생성된 화합물의 아실화 단계; (c) 케토기에 이접한 아미노 보호기(P₁)의 제거 단계; (d) N-보호된 아미노-아세트알데히드를 이용한 환원적 N-알킬화 단계; (e) 잔류 아미노 보호기(P₂)의 제거 단계; 및 (f) 시아노기의 환원 단계를 포함함을 특징으로 하는 제 9 항에 따른 화합물의 제조 방법.
(a) 아크릴로니트릴을 이용한 화학식 2의 화합물[상기 식 중에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 제 1 항에서 정의된 바와 같음]의 N-알킬화 단계; (b) N-보호된 오르니틴을 이용한 상기 생성된 화합물의 아실화 단계; (c) 케토기에 인접한 아미노 보호기(P₁)의 제거 단계; (d) 아크릴로니트릴을 이용한 N-알킬화 단계; (e) 잔류 아미노 보호기(P₂)의 제거 단계; 및 (f) 시아노기의 환원 단계를 포함함을 특징응로 하는 제 8 항에 따른 화합물의 제조 방법.
(a) N-보호된 오르니틴을 이용한 화학식 2의 화합물[상기 식 중에서, R¹은 아미노기이고; R² 및 R³는 제 1 항에서 정의된 바와 같음]의 아실화 단계; (b) 케토기에 인접한 아미노 보호기(P₁)의 제거 단계; (c) N-보호된 오르니틴을 이용한 아실화 단계; 및 (d) 잔류 아미노 보호기(P₂)의 제거 단계를 포함함을 특징으로 하는 제 5 항에 따른 화합물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 의약 치료에 사용함을 특징으로 하는 에어로트리신.
제 1 항에 따른 화합물 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 진균증의 치료용 또는 예방용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 진균증(mycosis)의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용됨을 특징으로 하는 에어로트리신.
제 1 항에 따른 화합물을 포함함을 특징으로 하는, 병원성 미생물에 의해 유발되는감염 질환의 치료용 및/또는 예방용 조성물.
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