KR100469800B1 - 바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산 합성유전자를이용한 표면 발현용 벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물표면 발현 방법 - Google Patents
바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산 합성유전자를이용한 표면 발현용 벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물표면 발현 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 pgsBCA를 가지는 표면 발현 벡터, 폴리감마글루탐산 합성효소를 코딩하는 유전자 및 상기 벡터를 이용하여 미생물 표면에서 목적 단백질을 발현하는 방법에 관한 것이다. 외래 유전자들이 삽입된 상기 벡터는 미생물을 형질전환시키고 외래 단백질이 미생물의 표면에서 안정하게 발현되도록 한다.
Description
최근 박테리오파아지, 세균, 효모 등의 세포 표면에 필요한 외래단백질을 발현시키려는 연구가 진행되어 새로운 백신의 생산, 각종 항원과 항체의 스크리닝, 유용한 효소를 세포표면에 고정화하는 등의 용도로 널리 이용되고 있다.
세균의 표면에 단백질을 발현시키려는 시도는 백신을 안정적으로 생산하기 위해 항원성을 지닌 펩타이드 부위를 세포 표면에 발현시키는 것으로 처음 시작되었다. 종래에는 백신의 생산을 위해 병원균을 무작위로 돌연변이시켜 안정하고 지속적으로 역가를 보인 세균을 찾아 사용하였다. 그러나 이러한 방법은 실제로 동물 또는 인간에 경구 투여할 경우 그 활성을 쉽게 잃어버리는 단점이 있으므로 이를 극복하고자 많은 시도가 이루어졌다. 먼저 그람음성 세균에서 세포 표면단백질을 이용하여 그 유전자를 항원으로 작용할 수 있는 단백질 유전자와 융합하고 이를 적당한 세균에 도입하여 융합 단백질(fusion protein)을 효과적으로 세포 표면에 발현시키는 시도가 이루어졌다. 이렇게 제조된 단백질은 안정하게 세포 표면에 돌출하므로 효과적인 항원으로 작용할 수 있다. 특히 그람음성 세균인 경우 세포외막의 지질탄수화물(lipopolysaccharide, LPS)이 표면 발현된 단백질의 항원성(antigenicity)을 증가시키는 작용을 하므로 매우 효과적인 것으로 알려져 있다.
세균의 표면에 단백질이 발현되기 위해서는, 세포 내에서 생합성된 단백질이 세포막을 통과할 수 있는 분비신호(secretion signal)가 그 단백질의 일차 서열상에 있어야 한다. 또한 그람음성 세균인 경우는 세포내막과 세포막공간을 통과하여 세포외막에 삽입 부착되어 막 외부로 돌출되게 안착되어야 한다.
세균의 경우 이러한 분비신호와 세포 표면에 안착하게 하는 표적신호(targeting signal)를 갖고 있는 단백질로는 표면단백질, 특수한 효소, 독소단백질 등을 예로 들 수 있다. 실제로 이들 단백질이 갖는 분비신호와 표적신호 등을 적당한 프로모터와 함께 사용하면 세균의 표면에 단백질을 성공적으로 발현시킬 수 있다.
외래 단백질의 표면 발현에 사용된 세균의 표면단백질은 세포외막 단백질,지질단백질(lipoprotein), 분비단백질, 세포 표면기관 단백질 등 크게 4가지로 나눌 수 있다. 현재까지 주로 그람음성 세균에 존재하는 표면단백질, 예를들면, LamB, PhoE, OmpA 등을 이용하여 필요한 외래단백질을 세균의 표면에 발현시키려는 시도가 이루어졌다. 이들 단백질을 이용한 경우 외래단백질을 세포표면에 돌출한 루프(loop)에 삽입시키므로 구조적으로 삽입할 수 있는 단백질의 크기가 제한된다. 또한 삽입될 외래단백질의 C-말단과 N-말단이 입체적으로 가깝게 위치하여야 하므로, 그 거리가 멀 경우에는 연결 펩타이드로 두 말단 사이를 가깝게 하여야 하는 문제가 있다.
실제로 LamB 나 PhoE를 이용한 경우 50-60개 이상의 아미노산으로 이루어진 외래 폴리펩타이드를 삽입하면 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하지 못하였다 [Charbit et al., J. Immunol., 139: 1658-1664 (1987) ; Agterberg et al., Vaccine, 8: 85-91 (1990)]. OmpA를 사용하여 외래단백질을 돌출된 루프에 삽입한 경우도 있지만 구조적 제한을 극복하기 위하여 세포외막에 안착하게 할 수 있는 최소한의 표적신호를 포함하는 일부 OmpA 단편만을 사용하였다. 이러한 방법으로 베타락타머제(-lactamase)를 OmpA 표적신호 C-말단에 연결하여 세포표면에 발현시킨 사례가 있다.
또한 최근에 알려진 표면발현에 사용된 그람음성 세균의 세포외막 단백질로 슈도모나스(Pseudomonas)속 유래의 빙핵활성 단백질(Ice-nucleation protein, INP)을 이용한 표면 발현이 시도되었다 [Jung et al., Nat, Biotechnol, 16: 576-560 (1998), Jung et al., Enzyme Microb. Technol, 22(5): 348-354 (1998), Lee etal., Nat. Biotechnol, 18: 645-648 (2000)]. 정(Jung) 등은 N-말단, 중앙의 반복구간 그리고 C-말단으로 구성된 빙핵활성 단백질의 C-말단에 레반슈크레이즈 (levansucrase)를, 그리고 중앙의 반복구간이 삭제된 N-말단 그리고 C-말단으로 구성된 빙핵활성 단백질의 C-말단에 카복실메틸셀룰레이즈(carboxymethylcellulase)를 융합하여 각각을 표면 발현시켜 효소 활성을 측정 확인하였다. 이(Lee) 등은 역시 N-말단, 혹은 N-말단과 C-말단으로 구성된 빙핵활성 단백질의 각각의 말단에 B형 간염 바이러스의 표면항원과 C형 간염바이러스의 코아(core) 항원을 대장균 또는 살모넬라 타이피 Ty21a (Salmonella typhi Ty21a) 균주의 표면에 발현시킨 다음 이들이 복합 생백신으로서 사용될 수 있음을 확인하였다.
지질단백질도 표면단백질로서 표면 발현에 이용되고 있다. 특히 대장균의 지질단백질은 그 N-말단에 분비신호를 갖고 세포내막을 통과할 수 있으며, 말단의 시스테인(L-cysteine)이 공유결합으로 세포외막 지질 또는 세포내막 지질과 직접 부착되어 있다. 주 지질단백질인 Lpp는 N-말단은 세포외막에, C-말단은 세포벽(peptidoglycan, PG)에 결합되어 있어 세포외막 단백질 OmpA 단편과 연결될 경우 안정적으로 외래단백질을 세포외막까지 분비하여 표면 발현할 수 있다[Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489: 2713-2717 (1992)]. 또 다른 지질단백질인 TraT는 지질단백질의 이러한 특성을 이용하여 폴리오바이러스의 C3 에피톱과 같은 펩타이드를 표면발현 하는데 사용되었다[Felici et al., J. Mol. Biol., 222: 301-310 (1991)]. 또한 아직 정확한 기능은 밝혀지지 않은 세포벽 부착형 지질단백질(Peptidoglycan-associated lipoprotein, PAL)도 재조합 항체의 표면발현에 사용되었다[Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372(1991)], 이 경우 PAL의 C-말단은 세포벽에 연결되고 N-말단은 재조합 항체에 연결되어 융합단백질이 표면 발현되었다.
세포외막을 통과하는 분비단백질도 표면단백질로서 이용될 수 있으나 그람음성 세균의 경우 분비단백질이 발달되어 있지 않으며, 몇몇 분비단백질의 경우만 그 특유의 분비기작에 관여하는 단백질들이 존재하여 세포외막 통과를 돕고 있다. 예를 들어 클랩시엘라(Klebsiella) 속의 풀룰란아제 (pullulanase)는 지질단백질로 그의 N-말단이 지방질로 치환되어 세포외막에 부착되어 있다가 완전히 세포 배양액 중으로 분비된다. 코낵커(Kornacker)등이 풀룰란아제의 N-말단 단편을 이용하여 베타락타머제를 세포 표면에 발현시켰으나 발현된 풀룰란아제-베타락타머제 융합단백질은 잠시 세포 표면에 부착되어있다가 세포 배양액 중으로 유리되는 단점이 있었다. 또한 이를 이용하여 세포막 공간(periplasmic space) 단백질인 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase)를 발현시킨 경우, 이의 분비를 위해서는 적어도 14개 이상의 단백질이 관련되므로 안정적으로 표면 발현되지 않았다[Kornacker et al., Mol. Microl., 4: 1101-1109 (1990)].
독특한 분비체계를 갖고 있는 병원 미생물 나이세리아(Neisseria) 유래의 IgA 프로테아제는 C-말단에 존재하는 단편에 N-말단에 존재하는 프로테아제를 세포외막에 안착하게 하는 신호를 갖고 있다. 일단 세포외막에 도달하여 세포 표면에 돌출한 프로테아제는 자신의 가수분해능에 의해 세포 배양액으로 분비된다. 크라우저(Klauser) 등은 이 IgA 프로테아제 -단편을 이용하여 약 12kDa의 콜레라 독소 B소단위를 안정적으로 세포 표면에 발현시켰다 [Klauser et al., EMBO J., 9:1991-1999 (1990)]. 그러나 분비과정 중 세포막 공간에서 일어난 단백질의 접힘 (protein folding)에 의해 융합단백질의 분비는 억제되었다.
이외에도 그람음성 세균의 경우 세포 표면에 존재하여 표면 발현에 응용할 수 있는 세포기관으로는 편모(Flagella), 필리(Pili) 및 핌브리아(Fimbriae) 등이 있다. 편모의 구성 소단위인 편모단백질(Flagellin)을 이용하여 콜레라 독소 B소단위와 B형 간염 바이러스로부터 유래한 펩타이드가 안정적으로 발현되었으며 이들은 그에 대한 항체와 강력하게 반응하였다[Newton et al., Science, 244: 70-72 (1989)]. 세포 표면에 실처럼 생긴 핌브리아의 구성단백질인 핌브린(fimbrilin)을 이용하여 외래 펩타이드의 발현을 시도한 결과 작은 펩타이드의 경우만 성공적으로 발현되었다[Hedegaard et al.,Gene, 85:115-124 (1989)].
위와 같은 그람음성 세균의 표면단백질에 의한 표면 발현 시도 외에 그람양성 세균의 표면단백질을 이용한 표면 발현이 최근에 시도되었다[Samuelson et al., J. Bacteriol., 177:1470-1476 (1995)]. 이 경우도 세포 내막을 통과할 수 있는 분비신호와 세포막에 부착되는 표면발현 모체를 필요로 한다. 실제로 스타필로코쿠스 (Staphylococcus hyicus) 유래의 리파제를 분비신호로 사용하고, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 프로테인A를 막 부착 모체로 사용하여 80개 아미노산으로 이루어진 말라리아 항원(malaria blood stage antigen)과 스트렙토코쿠스 단백질G 유래의 알부민 부착 단백질을 효과적으로 그람양성 세균의 표면에 발현시킨 사례가 있다.
상기한 그람음성 및 양성 세균의 표면 발현에 대한 연구를 통해 많은 유용한 단백질 발현 시스템이 개발되어 미국, 유럽과 일본 등에서 출원된 바 있다. 이중에서 특히 그람음성 세균의 세포외막 단백질을 이용한 경우가 5건(WO9504069, WO9324636, WO9310214, EP603672, US5356797) 보고 되었고, 세포 표면 기관인 필리(pili)를 이용한 경우가 한 건(WO9410330)이 있으며, 또한 세포 표면 지질단백질(lipoprotein)을 이용한 경우도 한 건(WO9504079)이 보고되었다.
이상과 같이 세균의 세포외막 단백질을 이용하여 외래단백질을 세포 표면에 발현시키기 위해서는 적당한 세포외막 단백질과 외래단백질을 유전자수준에서 서로 연결하여 융합단백질이 생합성되도록 유도하고, 이들이 안정하게 세포내막을 통과하여 세포외막에 부착되어 유지되도록 해야 한다. 이를 위해서는 다음과 같은 요구조건을 갖는 세포외막 단백질을 선정하여 표면 발현의 모체로 사용해야 할 것이다: 먼저 세포내막을 통과할 수 있는 분비신호가 있을 것, 둘째 세포외막에 안정되게 부착될 표적신호가 있을 것, 셋째 세포 표면에 다량으로 발현될 것, 넷째 단백질의 크기에 관계없이 안정적으로 발현될 것.
하지만 위의 조건을 모두 만족시키는 표면발현 모체는 아직까지 개발되지 않은 상태이고 현재까지는 상기한 경우의 단점을 보완하는 수준이다.
이와 같은 배경에서, 본 발명자들은 바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산의 합성 유전자(pgsBCA)를 새로운 표면발현 모체로 활용하는 것에 대하여 예의 검토하고 연구한 바, pgsBCA 유전자를 이용하여, 외래단백질을 미생물의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터, 및 미생물의 표면에 외래단백질을 다량 발현시키는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질(pgsBCA)을 이용하여 외래 단백질을 미생물의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터에 관한 것이다. 또한 본 발명은 바실러스속 균주 유래의 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질을 이용하여 외래단백질을 미생물의 표면에 발현시키는 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 의한 그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터, pGNBCA 및 전환벡터 pGNBCA-HB168의 유전자 지도.
도 2는 본 발명의 표면발현 전환벡터 pGNBCA-HE168로 형질 전환시킨 그람음성 미생물에서 B형 간염 바이러스의 표면항원기 단백질의 표면발현을 보여주는 웨스턴 블러팅 사진 및 형광-활성 세포 선별 측정 결과 그래프
도 3은 본 발명에 의한표면 발현용 벡터, pGNCA 및 전환벡터 pGNCA-HB168의 유전자 지도.
도 4는 본 발명의 표면발현 전환벡터 (pGNCA-HB168:A2, pGNA-HB168:A3 그리고 pGNHB-A:A4)로 형질전환시킨 그람음성 미생물에서 B형 간염 바이러스의 표면항원기 단백질의 표면발현을 보여주는 웨스턴 블러팅 사진 및 형광-활성 세포 선별 측정 결과 그래프.
도 5는 본 발명에 의한 표면 발현용 벡터, pGNA 및 전환벡터 pGNA-HB168의 유전자 지도.
도 6은 본 발명에 의한 표면 발현용 벡터, pGNCA2 및 전환벡터 pGNHB-A의 유전자 지도.
도 7은 본 발명에 의한 표면 발현용 벡터, pGNC 및 전환벡터 pGNC-PreS1의유전자 지도.
도 8은 본 발명의 표면발현 전환벡터 (pGNC-PreS1)로 형질 전환시킨 그람음성 미생물의 표면에 발현된 B형 간염 바이러스의 PreS1 단백질의 발현 양상을 보여주는 웨스턴 블러팅 사진.
도 9는 본 발명에 의한 표면 발현용 벡터, pHCE1LB:BCA 및 전환벡터 pHCE1LB:BCA-HB168의 유전자 지도.
도 10은 본 발명의 표면발현 전환벡터 (pHCE1LB:BCA-HB168)로 형질 전환시킨 그람음성 미생물에서 B형 간염 바이러스의 표면항원기 단백질의 표면발현을 보여주는 웨스턴 블러팅 사진 및 형광-활성 세포 선별 측정 결과 그래프.
도 11은 본 발명의 표면발현벡터 (pHCE1LB:BCA-HB168)로 형질전환시킨 그람음성 미생물의 생백신 효과를 보여주는 그래프.
도 12는 본 발명의 표면발현벡터 (pHCE1LB:BCA-HB168)로 형질전환시킨 그람양성 미생물에서 B형 간염 바이러스의 표면항원기 단백질의 표면발현을 보여주는 웨스턴 블러팅 사진 및 형광-활성 세포 선별 측정 결과 그래프.
도 13은 본 발명의 표면발현벡터 (pHCE1LB:BCA-HB168)로 형질전환시킨 그람양성 미생물의 생백신 효과를 보여주는 그래프.
도 14는 본 발명에 의한 표면 발현용 벡터, pHCE1LB:A과 전환벡터 pHCE1LB:A-TGEN1 및 pHCE1LB:A-PEDN의 유전자 지도.
도 15는 본 발명의 표면발현벡터 (pHCE1LB:A-TGEN1)로 형질전환시킨 그람음성 미생물(대장균) 및 그람양성 미생물에서 발현된 TGE 바이러스의 N 단백질의 발현 양상을 보여주는 웨스턴 블러팅 사진.
도 16은 본 발명의 표면발현벡터 (pHCE1LB:A-PEDN)로 형질전환시킨 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물에서 발현된 PED 바이러스의 N 단백질의 발현 양상을 보여주는 웨스턴 블러팅 사진.
도 17은 본 발명의 표면발현벡터 (pHCE1LB:A-TGEN1 및 pHCE1LB:A-PEDN)로 형질전환시킨 그람양성 미생물의 생백신 효과를 보여주는 그래프.
도 18은 본 발명에 의한 표면 발현용 벡터, pHCE1LB:A와 전환벡터 pHCE1LB:A-PreS1 및 pHCE1LB:A-PreS2의 유전자 지도.
도 19는 본 발명에 의한 표면 발현용 벡터, pHCE1LB:A와 전환벡터 pHCE1LB:A-PreS1:PreS2 및 pHCE1LB:A-L의 유전자 지도.
도 20은 본 발명의 표면발현 전환벡터 (pHCE1LB:A-PreS1, pHCE1LB:A-PreS1:PreS2)로 형질전환시킨 그람음성 미생물에서 발현된 B형 간염 바이러스의 PreS1 혹은 PreS1:PreS2 단백질의 발현 양상 및 표면발현 전환벡터 (pHCE1LB:A-L)로 형질전환시킨 그람음성 미생물에서 발현된 B형 간염 바이러스의 L 단백질의 발현 양상을 보여주는 웨스턴 블러팅 사진.
도 21는 본 발명에 의한 표면 발현용 전환벡터 pHCE1LB:A-TNF-a 의 유전자 지도.
도 22는 본 발명에 의한 표면 발현용 전환벡터 pGNA-lipase의 유전자지도 및 pGNA-lipase로 형질전환시킨 그람음성 미생물의 표면에 발현된 lipase의 활성을 보여주는 사진.
도 23은 본 발명에 의한 표면 발현용 전환벡터 pGNA-amidase의 유전자 지도 및 pGNA-amidase로 형질전환시킨 그람음성 미생물의 표면에 발현된 amidase의 활성을 보여주는 그래프.
본 발명은 그람양성 미생물과 그람음성 미생물의 표면에 외래단백질을 대량 발현 시킬 수 있는 새로운 표면 발현모체로서 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질을 선택하고, 이를 이용하여 외래단백질이나 펩타이드를 미생물 표면에 발현 시킬 수 있는 표면 발현용 벡터를 제조하고, 이것으로 형질전환된 다양한 형질전환체에서 외래단백질이 효율적으로 형질전환체의 표면에 발현시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
전기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 이루는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 중 어느 하나 또는 둘 이상을 포함하는 미생물 표면발현용 벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 균주를 제공한다.
또한 본 발명은, 전기한 목적을 달성하기 위하여, 상기 미생물 표면발현용 벡터를 이용하여 외래 단백질을 형질전환균주의 표면에 발현시키는 방법을 제공한다.
유전자 pgsBCA가 코딩하는 단백질은 바실러스 속에 존재하는 세포외막 단백질로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis IFO3336; 낫또균; Biochem. Biophy. Research Comm., 263, 6-12, 1999), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis ATCC9945; Biotech. Bioeng. 57(4), 430-437, 1998), 바실러스 안쓰라시스(Bacillus anthracis; J. Bacteriology, 171, 722-730, 1989) 등으로부터 생산되는 식용, 수용성, 음이온성, 생분해성 고분자물질인 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 단백질이다.
낫또균(Bacillus subtilis IFO3336)의 경우, 세균으로부터 분리된 세포외막 단백질(pgsBCA)은 총 922개의 아미노산으로 이루어진 단백질로 pgsB는 393 아미노산으로, pgsC는 149 아미노산으로 그리고 pgsA는 380 아미노산으로 구성이 되어 있다. 아시우찌(Ashiuchi) 등은 바실러스 낫또균 유래의 폴리감마글루탐산의 합성 유전자획 클로닝하고 대장균에 형질전환하여 대장균에서의 폴리감마글루탐산의 합성을 관찰한 바 있다[Ashiuchi et al., Biochem. Biophy. Res. Communications, 263: 6-12 (1999)].
그러나 전기한 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 이루는 단백질 pgsBCA의 구체적인 역할 및 기능은 아직 밝혀지지 않았다. 다만, 복합체 구성 단백질 중 pgsB는 아마이드 리게이즈계로서 pgsB의 N-말단의 특이 아미노산이 세포막 혹은 세포벽과 상호작용을 하고, pgsA의 경우 N-말단과 C-말단에 친수성의 특이 아미노산 서열을 갖고 있어서, pgsB의 도움과 더불어 이들 아미노산 서열이 세포내막을 통과할 수 있는 분비신호 와 표적 및 부착신호를 갖고 있는 것으로 추측된다.
본 발명자들의 연구결과, 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질은 그의 아미노산 일차 서열 구조와 특성상 외래단백질을 세포 표면에 발현시키는 표면발현 모체로서 많은 장점이 있음이 밝혀졌다: 첫째, 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질은 폴리감마글루탐산의 합성 및 세포외로의 분비를 위해서 세포 표면에 다량 발현될 수 있고, 둘째, 발현된 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질은 세포 주기상 휴지기에서도 안정하게 유지되며,셋째, 구조적으로 특히 pgsA의 경우 세포 표면에 돌출되어 있으며, 넷째로는 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질(pgsBCA)은 그 기원이 그람양성 세균의 표면으로 다양한 그람양성 세균 뿐만이 아니라 그람음성 세균의 표면에서 안정되게 발현될 수 있다는 점등의 장점이 있다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 특성을 이용하여 외래단백질을 세균의 표면에 발현할 수 있는 유용한 벡터를 제공하는데 그 목적이 있다. 특히, 본 발명의 미생물 표면 발현용 벡터는 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질(pgsBCA)의 일차 서열상에 갖고 있는 분비신호와 표적신호를 포함한다.
또한, 본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 특성을 이용한 표면 발현용 벡터를 사용하여 외래단백질을 그람양성 미생물과 그람음성 미생물의 표면에 발현시키는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다. 특히, 본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질을 이용하여 외래단백질을 미생물의 표면에 발현시킴으로 세포의 파쇄 또는 단백질의 분리정제 과정을 거치지 않고 효율적으로 외래단백질을 이용할 수 있는 외래단백질의 제조방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 표면 발현 방법으로 생산된 외래단백질을 다양한 용도에 제공할 수 있다. 본 용도에는 항체 및 효소의 효과적인 생산이 있으며, 이외에도 항원, 부착 또는 흡착 단백질 및 새로운 생리 활성 물질을 스크리닝하기 위한 펩티드라이브러리의 생산 등이 포함된다.
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막단백질을 포함한 모든 종류의 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 유전자를 이용한 표면 발현용 벡터는 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
또한 본 발명의 폴리감마글루탐산의 합성 유전자를 이용한 표면 발현용 벡터는 외래단백질을 미생물의 표면에 발현하기 위해 모든 균주에 적용할 수 있고, 바람직하게는 그람음성 세균, 더욱 바람직하게는 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리모 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 그리고 그람양성 세균, 바람직하게는 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스, 스트랩토코커스 균주 등에 적용할 수 있다. 상기 균주를 이용한 모든 외래단백질의 제조방법은 본 발명의 범위에 포함된다.
필요에 따라 폴리감마글루탐산의 합성 유전자의 N- 말단 혹은 C-말단에 모든 또는 일부 제한 효소의 다양한 인식 부위를 삽입할 수 있고, 이들 제한효소 부위가 삽입된 표면 발현용 벡터는 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
구체적으로 본 발명은 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성 유전자 모두를 포함하고, 그 유전자중 pgsA의 C-말단에 제한효소 인식부위를 삽입하여 다양한 외래단백질 유전자를 손쉽게 클로닝할 수 있는 표면 발현용 벡터 pGNBCA를 제공한다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복합체중 pgsB, pgsC 그리고 pgsA로 구성되어 pgsA의 C-말단에 B형 간염바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 N-말단을 연결하여, S 항원의 중화항체 형성 항원기를 융합단백질 형태로 그람음성균의 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pGNBCA-HB168을 제공한다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복합체중 pgsC와 pgsA로 구성되어 pgsA의 C-말단에, 혹은 세포외막 단백질의 복합체중 pgsA로 구성이 되어 pgsA의 N-말단 또는 C-말단에 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 N-말단을 연결하여, S 항원의 중화항체 형성 항원기를 융합단백질 형태로 그람음성균의 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pGNCA-HB168, pGNA-HE168 그리고 pGNHB-A를 제공한다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복합체중 pgsC로 구성되어 pgsC의 C-말단에 B형 간염 바이러스 표면항원 중 PreS1 항원의 N-말단을 연결하여, 융합단백질 형태로 그람음성균의 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pGNC-PreS1을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 그람음성균의 표면발현용 벡터 pGNBCA를 개량 하여 폴리감마글루탐산 합성 유전자 pgsBCA 모두 혹은 pgsA만을 포함하고, pgsA의 C-말단에 외래단백질 유전자를 클로닝할 수 있는 그람음성균과 그람양성균 모두에 적용되는 표면발현용 벡터 pHCE1LB:BCA 와 pHCE1LB:A를 제공한다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복 합체중 pgsB, pgsC 그리고 pgsA로 구성되어 pgsA의 C-말단에 B형 간염바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 N-말단을 연결하여, S 항원의 중화항체 형성 항원기를 융합단백질 형태로 그람음성균과 그람양성균의 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pHCE1LB:BCA-HB168을 제공한다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복합체중 pgsA로 구성되어 pgsA의 C-말단에 돼지 전염성 위장염(TGE) 바이러스의 nucleoprotein (N) 일부의 N-말단을 연결하여, N 단백질을 융합단백질 형태로 그람음성균과 그람양성균의 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pHCE1LB:A-TGEN1을 제공한다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복합체중 pgsA로 구성되어 pgsA의 C-말단에 돼지 설사병(PED) 바이러스의 nucleoprotein (N)의 N-말단을 연결하여, N 단백질을 융합단백질 형태로 그람음성균과 그람양성균의 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pHCE1LB:A-PEDN을 제공한다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복합체중 pgsA로 구성되어 pgsA의 C-말단에 B형 간염 바이러스의 표면 L(PreS1-PreS2-S) 단백질 중 각각의 PreS1, PreS2 N-말단을 그리고 PreS1-PreS2 혹은 전체 L 단백질 각각의 N-말단을 연결하여, 각각의 단백질들을 pgsA와의 융합단백질 형태로 그람음성균과 그람양성균의 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pHCE1LB:A-Pres1, pHCE1LB:A-PreS2, pHCE1LB:A-PreS1:PreS2 그리고 pHCE1LB:A-L을 제공한다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복합체중 pgsA의 C-말단에 cytokine 중의 하나인 Tumor necrosis facter alpha (TNF-a)의 N-말단을 연결하여, TNF-alpha를 융합단백질 형태로 그람음성균과 그람양성균의 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pHCE1LB:A-TNF-a을 제공한다.
본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복합체중pgsA로 구성되어 pgsA의 C-말단에 산업용 효소중의 하나인 lipase 및 amydase의 N-말단을 연결하여 각각의 효소 단백질을 융합단백질 형태로 그람음성균 표면에 발현할 수 있는 표면 발현 전환벡터 pGNA-lipase 및 pGNA-amydase을 제공한다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명할 것이다.
특히 하기 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar. chungkookjang, KCTC 0697BP)로부터 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsBCA를 획득하였으나, 유전자는 폴리감마글루탐산을 생산하는 모든 바실러스 속 균주로부터 pgsBCA를 획득하여 벡터를 제조하거나 외래 단백질을 표면발현시키는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다. 예컨대, 바실러스 서브틸리스 청국장에 존재하는 pgsBCA 유전자 의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 타 균주 유래의 pgsBCA 유전자를 사용하여 벡터를 제조하거나 외래 단백질을 표면발현시키는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기, 돼지 전염성 위장염 (TGE) 바이러스의 nucleoprotein (N) 단백질 일부, 돼지 설사병 (PED) 바이러스의 nucleoprotein (N) 단백질, B형 간염 바이러스의 표면 L (PreS1-PreS2-S) 단백질들, Tumor necrosis facter alpha (TNF-a) 단백질 그리고효소인 lipase와 amydase 등을 외래 단백질로 사용하였으나, 기타 다른 효소, 항원, 항체, 부착단백질 또는 흡착단백질 등 어떠한 단백질도 외래 단백질이 될 수 있을 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 그람음성균에 적용되는 표면 발현용 벡터를 제조하고, 숙주세포로 대장균을 사용하였으나, 대장균 이외의 여하한 그람음성균을 숙주세포로 활용할 수 있을 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 그람음성균과 그람양성균 모두에 적용되는 표면 발현용 벡터를 제조하고, 숙주세포로 대장균, 살모넬라 타이피 Ty21a 그리고 락토바실러스를 사용하였으나, 이들 세균 이외에 여하한 그람음성균 및 그람양성균들로 형질전환시키는 것도 당업자에게는 자명할 것이다.
실시예 1 : 표면 발현용 벡터 pGNBCA의 제조
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA)를 이용한 그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터를 제조하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar. chungkookjang, KCTC 0697BP)의 총염색체를 이용하였다.
상기 유전자 pgsBCA는 서열 1에 기재된 염기서열로 표시되는 DNA인 pgsB, 서열 2에 기재된 염기서열로 표시되는 DNA인 pgsC 및 서열 3에 기재된 염기서열로 표시되는 DNA인 pgsA가 연속되어 있는 염기서열을 갖는다.
폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자를 얻기 위하여, 상기 총염색체를 주형으로 사용하고 N-말단에는서열 4 (5-gaa cca tgg gct ggt tac tcc tta tag cct g-3), C-말단에는 서열 5 (5-ctc gga tcc ttt aga ttt tag ttt gtc act-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합 효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.
N-말단에 대한 서열 4에는 발현벡터 pHCE 19T(Ⅱ)에 존재하는 제한효소 Nco I 인식부위가 존재하도록 구성하고, 서열 5의 시발체에도 발현벡터 pHCE 19T(Ⅱ)에 존재하는 제한효소 BamH I 인식부위가 존재하도록 구성하였다. 이때 증폭한 유전자 부위는 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 유전자인 pgsB의 N-말단부위부터 pgsA의 C-말단부위까지 약 2.8 kb의 크기였다. 중합 효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자를 제한효소 Nco I과 BamH I으로 절단하고 이미 Nco I과 BamH I으로 절단된 항시적 고발현 벡터인 pHCE 19T(Ⅱ)에 삽입하여 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자에 번역 끝 코돈이 없고 새로운 제한효소 인식부위가 첨가된 새로운 약 6.5 kb 크기이고 서열 6에 기재된 염기서열로 표시되는 벡터를 제조하고 이를 pGNBCA로 명명하였다(도 1). 본 표면 발현용 벡터로 대장균을 형질전환하고, pGNBCA를 함유하는 대장균을 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, 대전광역시 유성구 어은동 52 소재)에 KCTC 10025BP의 수탁번호로 기탁하였다.
실시예 2 : 표면 발현용 전환 벡터 pGNBCA-HB168의 제조
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA)를 이용하여 그람음성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기를 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pGNBCA-HB168을 제조하였다.
그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터 pGNBCA에 B형 간염바이러스 S 항원 유전자를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8에 클론되어 있는 약 1.4 kb의 형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 7(5-ctg gga tcc caa ggt atg ttg ccc gtt tg-3) 및 서열 S(5-tga agc tta tta gga cga tgg gat ggg aat-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 S항원 유전자를 증폭하였다.
이때 증폭된 유전자 부위는 168 bp크기였다.
상기 서열 7 및 서열 8의 시발체는 표면 발현용 벡터 pGNBCA에 존재하는 제한효소 BamH I과 Hind Ⅲ 인식부위가 존재하도록 구성되었다. 상기 증폭된 B형 간염 바이러스 S 항원 유전자를 제한효소 BamH I, Hind Ⅲ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pGNBCA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pGNBCA-HB168를 도 1에 나타내었다.
실시예 3 : pGNBCA-HB168를 이용한 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기 표면 발현
상기 표면 발현용 벡터 pGNBCA-HB168를 이용하여 대장균에서 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 표면발현을 조사하였다.
실시예 2에서 제작된 발현 벡터를 대장균에 형질전환시킨 다음 항생제(암피실린) 100 mg/L이 첨가된 50 ㎖ 엘비배지 (효모엑기스 5 g/L, 트립톤 10 g/L, 소금 5 g/L, pH 7.0)를 포함한 500 ㎖ 플라스크에서 증식시킴으로 표면 발현을 유도하였다.
폴리감마글루탐산을 합성하는 유전자의 C-말단과 융합된 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 세균 발현은 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 (western immunoblotting)을 수행하여 확인하였다. 구체적으로 동일한 세포 농도에서 얻은 단백질을 디네이쳐(denature)시켜 시료를 준비하여 이를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한 다음 분획된 단백질들을 PVDF 멤브레인에 옮겼다. 단백질들이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액 (50 mM 트리스 염산, 5 % 스킴 밀크(skim milk), pH 8.0)에서 1시간 동안 흔들어 블로킹시킨 다음 S 항원에 대한 양 유래의 폴리클론 1차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 바이오틴이 접합된, 양에 대한 2차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 아비딘-바이오틴 (avidin-biotin) 시약을 1시간 동안 반응시켜 다시 세척하였다. 세척된 멤브레인에 기질과 발색시약으로 H202 와 DAB 용액을 첨가하여 발색시키고 S 항원에 대한 특이 항체와 상기 융합단백질간의 특이적인 결합을 확인하였다(도 2에서 A). 도에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109, 레인 2는 형질전환된 pGNBCA-HB168/JM109이다. 도면에서 보는 바와 같이, pGNBCA-HB168 플라즈미드에 의해서 약 48 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인 할 수 있었다.
또한 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 대장균의 표면에 위치 발현됨을 직접 확인하기 위하여 outeremembrane fractionation방법으로 발현을 유도한 대장균의 soluble, innermembrane, outermembrane 등 각각을 분리한 후 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 (western immunoblotting)을 수행하여 확인하였다. 구체적으로 상기의 방법으로 융합단백질의 표면 발현이 유도된 대장균을 형질전환되지 않은 대장균과 동일한 세포 농도가 되도록 수확하고 세포를 완충용액(10mM HEPES buffer, pH 7.4)으로 여러 번 세척한 다음, 10 ㎍/㎖ lysozyme, 1 mM PMSF 그리고 1 mM EDTA가 포함이 된 완충용액으로 부유시키고 4℃에서 10분 동안 반응시킨 후, DNase (0.5 mg/㎖) 와 RNase (0.5 mg/㎖)을 첨가 후 sonication으로 세포를 파괴 후 Intact 대장균과 cellular debris이 4℃, 20분 동안의 10,000 X g 원심분리에 의해서 분리가 되고 분리된 대장균의 cellular debris이 4℃, 2시간 동안의 15,000 X g 원심분리에 의해서 대장균의 periplasm 과 cytoplasm의 단백질을 포함하는 분획을 얻을 수 있었다. 그리고 얻은 pellet은 1% Sarcosyl (N-lauryl sarcosinate, sodium salt)을 포함하는 완충용액 (PBS, pH 7.4)으로 부유시킨 후 4℃, 2시간 동안의 15,000 X g 원심분리에 의해서 상층액은 대장균의 inner membrane으로, pellet은 대장균의 outer membrane의 단백질로 그 분획을 얻은 후 각각의 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 각각의 대장균 분획 중 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 outer membrane에 위치함을 확인하였다(도 2에서 A; 대장균 membrane 분획 웨스턴 블럿 결과). 도에서 레인 1은 형질전환되지 않은JM109, 레인 2는 형질전환된 pGNBCA-HB168/JH109의 whole cell, 레인 3은 형질전환된 pGNBCA-HB168/JM109의 soluble 분획, 레인 4는 형질전환된 pGNBCA-HB168/JM109의 innermembrane 분획, 레인 5는 형질전환된 pGNBCA-HB168/JM109의 outermembrane 분획을 나타낸다.
S 항원의 중화항체 형성 항원기의 발현이 폴리감마글루탐산 합성 단백질의 C-말단에 의해 대장균의 표면에 발현됨을 형광-활성 세포 선별 측정방법 (Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow cytometry)으로 확인하였다. 면역 형광(immunofluorescence) 염색을 위하여 발현을 유도시킨 대장균을 동일한 세포 농도가 되도록 수확하고 세포를 완충용액 (PBS buffer. pH 7.4)으로 여러 번 세척한 다음, 1 % 소혈청 알부민을 함유하는 완충용액 1 ㎖에 부유시키고 S 항원에 대한 양 유래의 폴리클론 1차 항체를 1000배 희석하여 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포들은 완충용액으로 여러 번 세척하고 1 % 소혈청 알부민을 함유하는 완충용액 1 ㎖ 에 부유시킨 다음 바이오틴이 결합되어 있는 2차 항체를 1000배 희석하여 4℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 다시 반응이 끝난 세포는 완충용액으로 여러 번 세척하고 1 % 소혈청 알부민이 들어있는 완충용액 0.1 ㎖ 에 부유시킨 다음 바이오틴에 특이적인 스트렙토아비딘-R-피코에리트린 (streptavidin-R-phycoerythrin) 염색시약을 1000배 희석하여 결합시켰다.
반응이 끝난 대장균을 여러 번 세척하고 형광-활성 세포 선별 측정방법으로 측정한 결과, 형질전환되지 않은 대장균과 비교되는 S 항원의 중화항체 형성 항원기 단백질이 표면에 발현됨을 확인하였다(도 2에서 B). 도에서 흰색은 형질전환되지 않은 JM109, 검은색은 형질전환된 pGNBCA-HB168/JM109에서 유래된 것을 나타낸다. 도면에서 보는 바와 같이, 형질 전환되지 않은 대장균에서는 S 항원 중화항체 형성기가 발현되지 않았으나, 표면 발현용 벡터에 의해 형질전환이 된 대장균의 S 항원 중화항체 형성기의 표면 발현이 명확히 확인되었다.
실시예 4 : 표면 발현용 전환 벡터 pGNCA-HB168의 제조 및 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기 표면 발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsC와 pgsA를 이용한 그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터를 제조하였다.
상기 유전자 pgsCA는 서열 2에 기재된 염기서열로 표시되는 DNA인 pgsC 및 서열 3에 기재된 염기서열로 표시되는 DNA인 pgsA가 연속되어 있는 염기서열을 갖는다.
폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질중 pgsC와 pgsA의 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자를 얻기 위하여, 상기 총염색체를 주형으로 사용하고 N-말단에는 서열 9 (5-gca cat atg ttc gga tca gat tta tac atc-3), C-말단에는 서열 5의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합 효소 연쇄반응을 수행하였다.
N-말단에 대한 시발체인 서열 9에는 발현벡터 pHCE 19T(Ⅱ)에 존재하는 제한효소 Nde I 인식부위가 존재하도록 구성하였다. 이때 증폭한 유전자 부위는 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 유전자인 pgsC의 N-말단부위부터pgsA의 C-말단부위까지 약 1.6 kb의 크기였다.
중합 효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자를 제한효소 Nde I과 BamH I으로 절단하고 이미 Nde I과 BamH I으로 절단된 항시적 고발현 벡터인 pHCE 19T(Ⅱ)에 삽입하여 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자에 번역 끝 코돈이 없고 새로운 제한효소 인식부위가 첨가된 새로운 약 5.3 kb 크기의 벡터를 제조하고 이를 pGNCA로 명명하였다(도 3).
(2) 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsC와 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기를 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pGNCA-HB168을, 전기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 제조하였다.
이렇게 제조한 전환 벡터 pGNCA-HB168를 도 3에 나타내었다.
(3) 상기 표면 발현용 벡터 pGNCA-HB168를 이용하여 대장균에서 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 발현을 조사하였다.
이를 위해 상기 발현 벡터를 대장균에 형질전환시키고 전기 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 세포외막 단백질 pgsCA와 융합된 S 항원의 중화항체 항원기가 대장균에서 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다 (도 4).
도 4에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109, 레인 2는 형질전환된 pGNCA-HB168/JM109이다. 도면에서 보는 바와 같이, pGNCA-HB168 플라즈미드에 의해서 약 48 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인 할 수 있었다.
실시예 5 : 표면 발현용 전환 벡터 pGNA-HB168의 제조 및 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기 표면 발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용한 그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터를 제조하였다.
상기 유전자 pgsA는 서열 3에 기재된 염기서열로 표시되는 DNA인 pgsA의 염기서열을 갖는다.
폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질중 pgsA의 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자를 얻기 위하여, 상기 총염색체를 주형으로 사용하고 N-말단에는 서열 10 (5-caa cat atg aaa aaa gaa ctg agc ttt cat-3), C-말단에는 서열 5의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합 효소 연쇄반응을 수행하였다.
N-말단에 대한 서열 10에는 발현벡터 pHCE 19T(Ⅱ)에 존재하는 제한효소 Nde I 인식부위가 존재하도록 구성하였다. 이때 증폭한 유전자 부위는 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 유전자인 pgsA의 N-말단부위부터 C-말단부위까지 약 1.1 kb의 크기였다.
중합 효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자를 제한효소 Nde I과 BamH I으로 절단하고 이미 Nde I과 BamH I으로 절단된 항시적 고발현 벡터인 pHCE 19T(Ⅱ)에 삽입하여 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자에 번역 끝 코돈이 없고 새로운 제한효소 인식부위가 첨가된 새로운 약 4.8 kb 크기의 벡터를제조하고 이를 pGNA로 명명하였다(도 5).
(2) 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기를 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pGNA-HB168을, 전기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 제조하였다.
이렇게 제조한 전환 벡터 pGNA-HB168를 도 5에 나타내었다.
(3) 상기 표면 발현용 벡터 pGNA-HB168를 이용한 대장균에서 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 발현을 조사하였다.
이를 위해 상기 발현 벡터를 대장균에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 S 항원의 중화항체 항원기가 대장균에서 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다 (도 4). 도에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109, 레인 3은 형질전환된 pGNA-HB168/JM109이다. 도면에서 보는 바와 같이, pGNA-HB168 플라즈미드에 의해서 약 48 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인할 수 있었다.
또한 S 항원의 중화항체 항원기가 세포외막 단백질 pgsA에 의해 대장균의 표면에 발현됨을 형광-활성 세포 선별 측정방법 (Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow cytometry)으로 확인하였다. 이를 위해 실시예 3에서와 동일한 과정으로 측정한 결과 형질전환되지 않은 대장균과 비교되는 S 항원의 중화항체 형성 항원기 단백질이 표면에 발현됨을 확인하였다(도 4). 도에서 흰색은 형질전환되지 않은 JM109, 검은색은 형질전환된 pGNA-HB168/JM109에서 유래된 것을 나타낸다. 도면에서 보는 바와 같이, 형질전환되지 않은 대장균에서는 S 항원 중화항체 형성기가 발현되지 않았으나, pgsA만을 가진 표면 발현용 벡터에 의해 형질전환이 된 대장균의 S 항원 중화항체 형성기의 표면 발현이 명확히 확인되었다.
실시예 6 : 표면 발현용 전환 벡터 pGNHB-A의 제조 및 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기 표면 발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA의 N-말단을 이용한 그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터를 제조하였다.
상기 유전자 pgsA는 서열 3에 기재된 염기서열로 표시되는 DNA인 pgsA의 염기서열을 갖는다.
폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 중 pgsA의 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자를 얻기 위하여, 상기 총염색체를 주형으로 사용하고 N-말단에는 서열 11 (5-tgt gga tcc aaa aaa gaa ctg agc ttt cat- 3), C-말단에는 서열 12 (5-tta aag ctt tta tta ttt aga ttt tag ttt gtc act-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합 효소 연쇄반응을 수행하였다.
N-말단에 대한 서열 11에는 발현벡터 pHCE 19T(Ⅱ)에 존재하는 제한 효소 Bam I 인식부위가 존재하도록 구성하고, 서열 12의 시발체에도 발현벡터 pHCE 19T(Ⅱ)에 존재하는 제한효소 Hind Ⅲ 인식부위가 존재하도록 구성하였다. 이때 증폭한 유전자 부위는 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 유전자인 pgsA의 N-말단부위부터 C-말단부위까지 약 1.1 kb의 크기였다. 중합 효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자를 제한효소 BamH I과 HindⅢ으로 절단하고 이미 BamH Ⅰ과 HindⅢ로 절단된 항시적 고발현 벡터인 pHCE 19T(Ⅱ)에 삽입하여 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자에 번역 앞 코돈이 없고 pgsA의 유전자 앞에 새로운 제한효소 인식부위가 첨가된 새로운 약 4.8 kb 크기의 벡터를 제조하고 이를 pGNA2로 명명하였다(도 6).
(2) 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA의 N-말단을 이용한 그람음성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기를 표면 발현할 수 있는 전환벡터 pGNHB-A를 제조하였다.
그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터 pGNA2에 B형 간염 바이러스 S 항원 유전자를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8에 클론되어 있는 약 1.4 kb의 형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 13 (5-ctg cat atg caa ggt atg ttg ccc gtt tg-3), 서열 14 (5-gaa gga tcc gga cga tgg gat ggg aat aca-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 S항원 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 168bp크기였다.
상기 서열 13 및 서열 14의 시발체는 표면 발현용 벡터 pGNA2에 존재하는 제한효소 NdeⅠ과 BamH Ⅰ 인식부위가 존재하도록 구성되었다. 상기 증폭된 B형 간염 바이러스 S 항원 유전자를 제한효소 NdeⅠ, BamH Ⅰ으로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pGNA2의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자중 pgsA의 N-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pGNHB-A를 도 6에 나타내었다.
(3) 상기 표면 발현용 벡터 pGNHB-A를 이용하여 대장균에서 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 발현을 조사하였다.
이를 위해 상기 발현 벡터를 대장균에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 S 항원의 중화항체 항원기가 대장균에서 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다(도 4). 도에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109, 레인4는 형질전환된 pGNHB-A/JM109이다. 도면에서 보는 바와 같이, pGNHB-A 플라즈미드에 의해서 약 48 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인 할 수 있었다.
실시예 7 : 표면 발현용 전환 벡터 pGNC-PreS1의 제조 및 B형 간염 바이러스의 Pres1 항원의 표면 발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsC의 C-말단을 이용한 그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터를 제조하였다.
상기 유전자 pgsC는 서열 2에 기재된 염기서열로 표시되는 DNA인 pgsC의 염기서열을 갖는다.
폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질중 pgsC의 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자를 얻기 위하여, 상기 총염색체를 주형으로 사용하고 N-말단에는 서열 15 (5-cgc cat atg ttc gga tca gat tt-3), C-말단에는 서열 16 (5-cgg gat cca att aag tag taa aca aac at-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합 효소 연쇄반응을 수행하였다.
N-말단에 대한 서열 15에는 발현벡터 pHCE 19T(Ⅱ)에 존재하는 제한효소 Ned I 인식부위가 존재하도록 구성하고, 서열 16의 시발체에도 발현벡터 pHCE 19T(Ⅱ)에 존재하는 제한효소 BamH I 인식부위가 존재하도록 구성하였다. 이때 증폭한 유전자 부위는 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 유전자인 pgsC의 N-말단부위부터 C-말단부위까지 약 0.45 kb의 크기였다. 중합 효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자를 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단하고 이미 NdaI과 BamH I로 절단된 항시적 고발현 벡터인 pHCE 19T(Ⅱ)에 삽입하여 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자중 pgsC에 번역 끝코돈이 없고 새로운 제한효소 인식부위가 첨가된 새로운 약 4.1 kb 크기의 벡터를 제조하고 이를 pGNC로 명명하였다(도 7).
(2) 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsC의 N-말단을 이용한 그람음성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염 바이러스의 PreS1 표면 항원을 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pGNC-PreS1을 제조하였다.
그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터 pGNC에 B형 간염 바이러스의 PreS1 항원 유전자를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8에 클론되어 있는 약 1.5 kb의 B형 간염 바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 17 (5-cgggat ccg gag gtt ggt ctt cca a-3), 서열 18 (5-ccc aag ctt tta ggc ctg agg atg act gt -3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 S항원 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 356 bp크기였다.
상기 서열 17 및 서열 18의 시발체는 표면 발현용 벡터 pGNC에 존재하는 제한효소 BamH I과 HindⅢ 인식부위가 존재하도록 구성되었다. 상기 증폭된 PreS1 항원 유전자를 제한효소 BamH I과 HindⅢ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pGNC의 유전자중 pgsC의 N-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pGNC-PreS1을 도 7에 나타내었다.
(3) 상기 표면 발현용 벡터 pGNC-PreS1을 이용한 대장균에서 B형 간염 바이러스의 PreS1 항원의 발현을 조사하였다. 이를 위해 상기 발현 벡터를 대장균에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 세포외막 단백질 pgsC와 융합된 PreS1 항원이 대장균에서 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 PreS1 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다(도 8). 도 8에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109, 레인 2, 3은 형질전환된 pGNC-PreS1/JM109이다. 도면에서 보는 바와 같이, pGNC-PreS1 플라즈미드에 의해서 약 27 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인 할 수 있었다.
실시예 8 : 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:BCA, pHCE1LB:BCA-HB168의 제조 및 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기 표면 발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA)를 이용한 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:BCA를 제조하였다.
그람음성균 및 그람양성균 모두에서 복제 및 선별이 가능하도록 기본벡터로는 pHCE1LB 플라즈미드를 이용하였다. 상기의 발현 벡터 pHCE1LB는 항시적 고발현의 HCE promoter를 갖고 있고, 그 뒤로 다양한 제한 효소 부위를 갖는 cloning 부위가 있으며 그람음성균에서 복제가 가능하도록 해주는 origin 및 암피실린 항생제 마커를 갖고 있다. 또한 pHCE1LB는 그람양성균에서 복제가 가능하도록 해주는 lactobacillus 유래의 origin 및 클로람페니콜 항생제 마커를 갖고 있다.
폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자 (pgsBCA)를 얻기 위하여, 상기 총염색체를 주형으로 사용하고 N-말단에는 서열 4, C-말단에는 서열 5의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합 효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때 증폭한 유전자 부위는 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 유전자인 pgsB의 N-말단부위부터 pgsA의 C-말단부위까지 약 2.8 kb의 크기였다.
중합 효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자를 제한효소 Nco Ⅰ과 BamH Ⅰ으로 절단하고 이미 Nco I과 BamH I으로 절단된 발현 벡터인 pHCE1LB에 삽입하여 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자에 번역 끝 코돈이 없고 새로운 제한효소 인식부위가 첨가된 새로운 약 8 kb 크기를 갖는 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현 벡터를 제조하고 이를 pHCE1LB:BCA로 명명하였다(도 9).
(2) 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA)를 이용하여 그람음성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기를 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pHCE1LB:BCA-HB168을, 전기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 제조하였다.
이렇게 제조한 전환 벡터 pHCE1LB:BCA-HB168을 도 9에 나타내었다.
(3) 상기 표면 발현용 전환벡터 pHCE1LB:BCA-HB168를 이용하여 그람음성균인 살모넬라 타이피 Ty21a에서 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 표면 발현을 조사하였다.
상기 표면 발현용 전환벡터를 살모넬라 타이피 Ty21a에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 방법으로 표면발현을 유도한 후 동일 방법으로 항원기가 살모넬라 타이피 Ty21a의 표면에 위치 발현됨을 outeremembrane fractionation 방법으로 soluble, innermembrane, outermembrane 등 각각을 분리하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 (western immunoblotting)을 수행하였다. 그 결과 각각의 살모넬라 타이피 Ty21a 분획 중 pgsA와 융합된 S 항원의 중화항체 형성 항원기 48 kDa의 밴드가 outermembrane에 위치됨을 확인하였다(도 10).
도 10에서 레인 1은 형질전환되지 않은 균주, 레인 2는 형질전환된 균주의 whole cell, 레인 3, 4 및 5는 각각 형질전환된 군주의 soluble 분획, innermembrane 분획 및 outermembrane 분획을 나타낸다.
또한 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 표면 발현됨을 형광-활성 세포선별측정방법 (Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow cytometry)으로 확인하였다. 이를 위해 실시예 3에서와 동일한 과정으로 측정한 결과 형질전환되지 않은 살모넬라 타이피 Ty21a와 비교되는 항원기 단백질이 표면에 발현됨을 확인하였다(도 10). 도 10에서 화살표가 없는 검은색은 형질전환되지 않은 살모넬라 타이피 Ty21a, 화살표 표시된 검은색은 형질전환된 균주에서 유래된 것을 나타낸다. 도면에서 보는 바와 같이, 표면발현용 전환벡터에 의해 형질전환이된 살모넬라 타이피 Ty21a의 S 항원 중화항체 형성기의 표면 발현이 명확히 확인되었다.
실시예 9: B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 표면발현된 미생물의 백신효과 분석 1
전기 실시예 8에서 제작된 표면 발현용 전환벡터 pHCE1LB:BCA-HB168를 그람음성균인 살모넬라 타이피 Ty21a에 형질전환시키고 실시예 3에서와 같은 방법으로 항원의 살모넬라 타이피 Ty21a로의 표면발현을 유도한 후, 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막단백질과 융합된 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 항원성을 조사하였다.
구체적으로, 상기 표면발현 전환벡터 pHCE1LB:BCA-HB168를 살모넬라 타이피 Ty21a에 형질전환시켜 상기 항원의 발현이 확인된 일정 양의 살모넬라균을 BALB/c 마우스의 비강으로 투여를 하고 일정기일이 지난 다음 ① 마우스의 혈청을 취하여 혈청내 S 항원에 대한 IgG 항체 생성여부 및 ② 마우스의 내장부위를 취하여 장의 내부를 씻은 부유액내에서의 S 항원에 대한 IgA 항체 생성여부를 엘리자 방법 (ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent assay)으로 확인하였다.
이때 각각의 동일한 세균농도가 되도록 수확한 세포를 완충용액 (PBS buffer, pH7.4))으로 여러 번 세척을 하고, 항원이 표면발현된 살모넬라 타이피 Ty21a 2 X 109의 균을 4-6주령의 BALB/c 마우스의 비강으로 3일 간격으로 두 번 그리고 4주 뒤에 역시 3일 간격으로 두 번 투여 후 각각의 투여후 2주 뒤에 마우스의 혈청 및 내장세척액을 취하여 S항원을 이용한 엘리자방법으로 항원에 대한 항체가를 측정하였다 (도 11).
도 11에서 A는 혈청내 S 항원기에 대한 IgG 항체가를 나타내는 그래프이며, ▼은 pHCE1LB:BCA:HB168로 형질전환된 살모넬라, ○은 pHCE1LB:HB168로 형질전환된 살모넬라 그리고 ●은 형질전환되지 않은 살모넬라로 처리된 군의 항체가이다. 도 11에서 B는 장관내 S 항원기에 대한 IgA 항체가를 나타내는 그래프이며, □은 형질전환되지 않은 살모넬라, ▨은 pHCE1LB:HB168로 형질전환된 살모넬라 그리고은 pHCE1LB:BCA:HB168로 형질전환된 살모넬라로 처리된 군의 항체가이다.
도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, pHCE1LB:BCA-HB168로 형질전환시킨 살모넬라 타이피 Ty21a를 투여한 BALB/c 마우스군의 혈청 및 내장세척액에서 B형 간염 바이러스 S 항원에 대한 IgG 항체가 및 IgA 항체가가 대조군에 비해 상당히 높게 나타남을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 의한 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 표면발현된 미생물은 생백신으로서 효과적으로 작용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 10: 그람양성균에서 pHCE1LB:BCA-HB168를 이용한 B형 간염 바이러스S항원의 중화항체 형성 항원기 표면 발현
전기 실시예 8에서 제작된 표면 발현용 전환벡터 pHCE1LB:BCA-HB168를 이용하여 그람양성균인 락토바실러스 카제이에서 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 표면 발현을 조사하였다.
상기 표면 발현용 전환벡터를 락토바실러스 카제이에 형질전환시키고 항생제인 클로람페니콜 50 mg/L가 첨가된 200 ㎖의 MRS배지를 포함하는 500 ㎖ 플라스크에서 정체 배양 증식시킴으로 표면발현을 유도하였다.
상기 항원기가 락토바실러스 카제이의 표면에 위치 발현됨을 확인하기 위하여, cell wall fractionation 방법으로 cell cytoplasm과 cell wall 등으로 각각 분리하여 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 구체적으로 상기의 방법으로 융합단백질의 표면 발현이 유도된 락토바실러스를 형질전환되지 않은 락토바실러스와 동일한 세포 농도가 되도록 수확하고 세포를 TES buffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 25% sucrose)으로 여러 번 세척한 다음, 5mg/㎖ lysozyme, 1 mM PMSF 그리고 1 mM EDTA가 포함이 된 증류수로 부유시키고 -60℃와 상온을 여러 번 이동하여 얼림과 녹힘을 수회 반복한 후, DNase (0.5 mg/㎖)와 RNase (0.5 mg/㎖)를 첨가하고 sonication하여 세포를 파괴하였다. 이어서 파쇄액을 4℃, 20분 동안의 10,000 X g 원심분리하여 파괴되지 않은 whole 락토바실러스(pellet; whole cell 분획)와 cellular debris(상등액)를 분리하고, 분리된 cellular debris를 4℃, 1시간 동안의 21,000 X g 원심분리하여 락토바실러스의 cytoplasm 단백질을 포함하는상등액(soluble 분획)과 pellet을 얻었다. pellet을 1% SDS를 포함하는 TE용액 (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, pH 7.4)에 부유시켜 락토바실러스의 cell wall 단백질(cell wall 분획)을 얻었다.
각각의 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 S 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 (western immunoblotting)을 수행하여 각각의 락토바실러스 분획 중 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 cell wall에 위치함을 확인하였다(도 12A). 도 12에서 레인 1, 3, 5는 형질전환되지 않은 락토바실러스 카제이, 레인 2는 형질전환된 pHCE1B:BCA-HB168/락토바실러스 카제이의 whole cell, 레인 4 및 6은 각각 형질전환된 균주의 soluble 분획 및 cell wall 분획을 나타낸다.
또한, S 항원의 중화항체 형성 항원기의 발현이 폴리감마글루탐산 합성단백질의 C-말단에 의해 락토바실러스의 표면에 발현됨을 형광-활성 세포선별 측정방법 (Fluorescence-activating cell sorting (FACS) flow cytometry)으로 확인하였다. 이를 위해 실시예 3에서와 동일한 과정으로 표면발현 양상을 측정한 결과 형질전환되지 않은 락토바실러스와 비교되는 항원기 단백질이 표면에 발현됨을 확인하였다(도 12B). 도 12B에서 흰색은 형질전환되지 않은 락토바실러스에서, 검은색은 형질전환된 pHCE1LB:BCA:HB168/락토바실러스에서 유래된 것을 나타낸다.
도면에서 보는 바와 같이, 표면 발현용 전환벡터에 의해 형질전환된 락토바실러스의 표면에 S 항원 중화항체 형성기가 발현됨을 명확히 확인할 수 있다.
실시예 11: B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 표면 발현된 미생물의 백신효과 분석 2
전기 실시예8에서 제작된 표면 발현용 전환벡터 pHCE1LB:BCA-HB168로 그람양성균인 락토바실러스 카제이를 형질전환시키고 실시예 3에서와 같은 방법으로 상기 항원을 락토바실러스 카제이에서 표면발현을 유도한 후, 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막단백질과 융합된 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기의 항원성을 조사하였다.
구체적으로, 본 발명의 표면발현 전환벡터 pHCE1LB:BCA-HB168을 락토바실러스 카제이에 형질전환시켜 각각의 동일한 세균농도가 되도록 수확한 세포를 완충용액 (PBS buffer, pH7.4))으로 여러 번 세척을 하고, 항원이 표면발현된 락토바실러스 5 X 109균을 4-6주령의 BALB/c 마우스의 구강으로 1일 간격으로 세 번 그리고 4주 뒤에 역시 1일 간격으로 세 번 투여하고 또한 항원이 표면발현된 락토바실러스 1 X 109균을 마우스의 비강으로 3일 간격으로 두 번 그리고 4주 뒤에 역시 3일 간격으로 두 번 투여 후 각각의 경구와 비강투여 후 2주 뒤에 각각의 ① 마우스군 혈청을 취하여 혈청내 S 항원에 대한 IgG 항체가 및 ② 마우스의 내장부위를 취하여 장의 내부를 씻은 부유액내에서의 S 항원에 대한 IgA 항체가를 엘리자 방법으로 항원에 대한 항체가를 측정하였다(도 13).
도 13에서 A는 혈청내 S 항원기에 대한 IgG 항체가를 나타내는 그래프로서, ▽은 pHCE1LB:BCA:HB168로 형질전환된 락토바실러스가 비강투여된 군, ■은 pHCE1LB:BCA:HB168로 형질전환된 락토바실러스가 경구투여된 군, ▼은 pHCE1LB:HB168로 형질전환된 락토바실러스가 비강투여된 군, ○은pHCE1LB:HB168(pgsBCA가 삭제된 plasmid로 세포내에서 HB168을 발현하는 plasmid)로 형질전환된 락토바실러스가 경구투여된 군, 그리고 ●은 형질전환되지 않은 락토바실러스가 경구투여된 군의 항체가를 나타낸다. 도 13에서 B는 장관내 S 항원기에 대한 IgA 항체가를 나타내는 그래프로서, □은 형질전환되지 않은 락토바실러스, ▨은 pHCE1LB:HB168로 형질전환된 락토바실러스 그리고은 pHCE1LB:BCA:HB168로 형질전환된 락토바실러스가 처리된 군의 항체가이다. 실험은 비강투여와 구강투여로 구분하여 실시되었다.
도 13에 나타난 바와 같이, pHCE1LB:BCA-HB168로 형질전환시킨 락토바실러스를 투여한 BALB/c 마우스군의 혈청 및 내장세척액에서 B형 간염 바이러스 S 항원에 대한 IgG 항체가 및 IgA 항체가가 대조군에 비해 상당히 높게 나타남을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 의한 B형 간염 바이러스 S 항원의 중화항체 형성 항원기가 표면발현된 미생물은 생백신으로서 효과적으로 작용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 12 : 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A의 제조
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA만을 이용한 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A를 제조하였다.
폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질중 pgsA의 N-말단과 C-말단을 암호화하는 유전자 (pgsA)를 얻기 위하여, 상기 총염색체를 주형으로 사용하고 N-말단에는 서열 10, C-말단에는 서열 5의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합 효소 연쇄반응을 수행하였다.
이때 증폭한 유전자 부위는 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질 유전자인 pgsA의 N-말단부위부터 C-말단부위까지 약 1.1 kb의 크기였다. 중합 효소 연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자를 제한효소 Nde I과 BamH I으로 절단하고 이미 Nde I과 BamH I으로 절단된 발현 벡터인 pHCE1LB에 삽입하여 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자에 번역 끝 코돈이 없고 새로운 제한효소 인식부위가 첨가된 새로운 약 6.3 kb 크기를 갖는 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현 벡터를 제조하고 이를 pHCE1LB:A로 명명하였다(도 14).
실시예 13 : 표면 발현용 전환 벡터 pHCE1LB:A-TGEN1의 제조 및 TGE N 항원의 표면발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 돼지의 전연성 소화기 질병을 유발하는 돼지의 전염성 위장염 바이러스 (Transmissible Gastroenteritis virus, TGE)의 nucleoprotein (N) 항원을 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pHCE1LB:A-TGEN1을 제조하였다.
그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는, 전기 실시예 12에서 제작된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 TGE 바이러스의 N 항원 유전자중 주요 항원성을 나타내는 부위를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8에 클론되어 있는 약 1.1 kb의 TGE 바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 19 (5-cg gga tccgcc aac cag gga caa cg -3) 및 서열 20 (5-ccc aag ctt tta tgg att cat tat tag c-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 S항원 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 415 bp크기였다. 상기 서열 19 및 서열 20의 시발체는 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 존재하는 제한효소 BamH I과 Hind Ⅲ 인식부위가 존재하도록 구성되었다.
상기 증폭된 TGE 바이러스 N 항원 유전자를 제한효소 BamH I, Hind Ⅲ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A의 세포외막 단백질 유전자 (pgsA)의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pHCE1LB:A-TGEN1을 도 14에 나타내었다.
(2) 상기 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A-TGEN1을 이용한 대장균 및 락토바실러스에서 TGE 바이러스의 N 항원의 발현을 조사하였다. 이를 위해 상기 발현 벡터를 대장균 및 락토바실러스에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 TGE N 항원이 대장균 및 락토바실러스에서 발현되었음을 SDS-폴리아크릴 아미드 젤 전기영동 및 TGE N항원에 대한 항체와 pgsA에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다(도 15).
도 15의 A에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109, 레인2, 3은 형질전환된 pHCE1LB:A-TGEN1/JM109이고, 도 15의 B에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 락토바실러스 카제이, 레인 2, 3은 형질전환된 pHCE1LB:A-TGEN1/락토바실러스 카제이 이다.
도면에서 보는 바와 같이, pHCE1LB:A-TGEN1 플라즈미드에 의해서 약 57 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인 할 수 있었다.
실시예 14 : 표면 발현용 전환 벡터 pHCE1LB:A-PEDN의 제조 및 PED N 항원의 표면발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 돼지의 전연성 소화기 질병을 유발하는 돼지의 전염성 설사병 바이러스 (Porcine Epidemic Diarrhea virus, FED)의 nucleoprotein (N) 항원을 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pHCE1LB:A-PEDN을 제조하였다.
그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는, 전기 실시예 12에서 제작된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 PED 바이러스의 N 항원 유전자를 나타내는 부위를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8에 클론되어 있는 약 1.3 kb의 PED 바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 21 (5-cg gga tcc gct tct gtc agc ttt cag g-3) 및 서열 22 (5-ccc aag ctt tta att tcc tgt atc gaa ga-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 S항원 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 1326 bp크기였다. 상기 서열 21 및 서열 22의 시발체는 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 존재하는 제한효소 BamH Ⅰ과 Hind Ⅲ 인식부위가 존재하도록 구성되었다.
상기 증폭된 PED 바이러스 N 항원 유전자를 제한효소 BamH Ⅰ, Hind Ⅲ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A의 세포외막 단백질 유전자 (pgsA)의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터pHCE1LB:A-PEDN을 도 14에 나타내었다.
(2) 상기 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A-PEDN을 이용한 대장균 및 락토바실러스에서 PED 바이러스의 N 항원의 발현을 조사하였다. 이를 위해 상기 발현 벡터를 대장균 및 락토바실러스에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 PED N 항원이 대장균 및 락토바실러스에서 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 PED N항원에 대한 항체와 pgsA에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅(western immunoblotting)을 수행하여 확인하였다(도 16).
도 16의 A에서 레인 1, 3은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109. 레인 2 (PEDN에 대한 항체), 4 (pgsA에 대한 항체)는 형질전환된 pHCE1LB:A-PEDN/JM109이고, 도 15의 B에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 락토바실러스 카제이, 레인 2는 형질전환된 pHCE1LB:A/락토바실러스 카제이 그리고 레인 3은 형질전환된 pHCE1LB:A-PEDN/락토바실러스 카제이 이다.
도면에서 보는 바와 같이, pHCE1LB:A-PEDN 플라즈미드에 의해서 약 90 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인 할 수 있었다.
실시예 15 : TGE 바이러스 및 PED 바이러스의 N 항원을 표면에 발현하는 락토바실러스의 생백신 효과
전기 실시예 13 및 14에서 제작된 표면 발현용 전환벡터 pHCE1LB:A-TGEN1, pHCE1LB:A-PEDN을 그람양성균인 락토바실러스 카제이에 형질전환시키고 실시예 3에서와 같은 방법으로 상기 항원을 락토바실러스에서 표면발현을 유도한 후 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막단백질 pgsA 와 융합된 TGE 바이러스의 N 항원 및 PED 바이러스의 N 항원 각각의 항원성을 조사하였다.
구체적으로, 본 발명의 표면발현 전환벡터 pHCE1LB:A-TGEN1. pHCE1LB:A-PEDN을 락토바실러스 카제이에 형질전환시켜 각각의 동일한 세균농도가 되도록 수확한 세포를 완충용액 (PBS buffer, pH7.4))으로 여러번 세척을 하고, 각각의 N 항원이 표면발현된 락토바실러스 5 X 109균을 4-6주령의 BALB/c 마우스의 구강으로 1일 간격으로 세 번 그리고 1주 뒤에 역시 1일 간격으로 세 번 투여 후 처음 투여부터 4주 뒤에 각각의 마우스군 혈청을 취하여 혈청내 각각의 N 항원에 대한 IgG 항체 생성을 각각의 N 항원을 가지고 수행한 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다(도 17).
그 결과 17도에서 보는 바와 같이, pHCE1LB:A:TGEN1 (A) 및 pHCE1LB:A-PEDN (B)로 형질전환시킨 락토바실러스를 투여한 각각의 BALB/c 마우스군 혈청에서 각각의 N 항원에 대한 항체가 생성되었음을 확인하였다.
실시예 16 : 표면 발현용 전환 벡터 pHCE1LB:A-PreS1의 제조 및 PreS1 항원의 표면발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염바이러스의 표면 항원 중 PreS1 항원을 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pHCE1LB:A-PreS1을 제조하였다.
그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는, 전기 실시예 12에서 제작된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 B형 간염바이러스의 표면 항원중 PreS1 항원을 나타내는 부위를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8에 클론되어 있는 약 1.5 kb의 B형 간염바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 17 및 서열 18의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 S항원 유전자를 증폭하였다.
이때 증폭된 유전자 부위는 356 bp크기였다.
상기 증폭된 HBV의 S항원 유전자를 제한효소 BamH Ⅰ, Hind Ⅲ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A의 세포외막 단백질 유전자(pgsA)의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pHCE1LB:A-PreS1을 도 18에 나타내었다.
(2) 상기 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A-PreS1을 이용한 대장균에서 HBV의 PreS1 항원의 발현을 조사하였다. 이를 위해 상기 발현 벡터를 대장균에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 PreS1 항원이 대장균에서 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 PreS1 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다(도 20에서 A). 도 20의 A에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109 그리고 레인 2는 형질전환된 pHCE1LB:A-PreS1/JM109이다.
도면에서 보는 바와 같이, pHCE1LB:A-TGEN1 플라즈미드에 의해서 약 55KDa의 융합 단백질 밴드를 확인 할 수 있었다.
실시예 17 : 표면 발현용 전환 벡터 pHCE1LB:A-PreS2의 제조
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염바이러스의 표면 항원 중 PreS2 항원을 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pHCE1LB:A-PreS2을 제조하였다.
그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는, 전기 실시예 12에서 제작된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 B형 간염바이러스의 표면 항원중 PreS2 항원을 나타내는 부위를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8에 클론되어 있는 약 1.5 kb의 B형 간염바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 23 (5-cg gga tcc cag tgg aat tcc aca aca-3), 서열 24 (5-ccc aag ctt tta gtt cgg tgc agg gtc c-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레로타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 PreS2항원 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 165 bp크기였다. 상기 서열 23 및 서열 24의 시발체는 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 존재하는 제한효소 BamH I과 Hind Ⅲ 인식부위가 존재하도록 구성되었다.
상기 증폭된 HBV의 PreS2 항원 유전자를 제한효소 BamH I, Hind Ⅲ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A의 세포외막 단백질 유전자 (pgsA)의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pHCE1LB:A-PreS2을 도 18에 나타내었다.
실시예 18 : 표면 발현용 전환 벡터 pHCE1LB:A-PreS1:PreS2의 제조 및 PreS1:PreS2 항원의 표면발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염바이러스의 표면 항원 중 PreS1과 PreS2 항원을 융합된 형태로 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pHCE1LB:A-PreS1:PreS2를 제조하였다.
그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 B형 간염바이러스의 표면 항원 중 PreS1과 PreS2 항원을 나타내는 부위를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8에 클론되어 있는 약 1.5 kb의 B형 간염바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 17 및 서열 24의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 S항원 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 522 bp크기였다.
상기 증폭된 HBV의 PreS1:PreS2항원 유전자를 제한효소 BamH I. Hind III로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A의 세포외막 단백질 유전자 (pgsA)의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pHCE1LB:A-PreS1:PreS2을 도 19에 나타내었다.
(2) 상기 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A-PreS1:PreS2을 이용한 대장균에서 HBV의 PreS1과 PreS2의 융합항원의 발현을 조사하였다. 이를 위해 상기 발현 벡터를 대장균에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 PreS1:PreS2 항원이 대장균에서 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 PreS1 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅 (western immunoblotting)을 수행하여 확인하였다(도 20에서 A). 도 20의 A에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109, 레인 3은 형질전환된 pHCE1LB:A-PreS1:PreS2/JM109이다.
도면에서 보는 바와 같이, pHCE1LB:A-TGEN1 플라즈미드에 의해서 약 60 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인 할 수 있었다.
실시예 19 : 표면 발현용 전환 벡터 pHCE1LB:A-L의 제조 및 L 항원의 표면발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA)중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 B형 간염바이러스의 표면 항원 중 PreS1과 PreS2 그리고 S 항원을 융합된 형태로 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pHCE1LB:A-L을 제조하였다.
그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 B형 간염바이러스의 표면 항원 중 PreS1과 PreS2 그리고 S 항원을 나타내는 부위를 도입하기 위하여, 범용 클로닝 벡터인 pUC8에 클론되어 있는 약 1.5 kb의 B형 간염바이러스 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 17 및 서열 25 (5-ccc aag ctt tta aat gta tac cca aag ac-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 L항원 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 1206 bp크기였다. 상기 서열 25의 시발체는 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 존재하는 제한효소 BamH I과 Hind Ⅲ 인식부위가 존재하도록 구성되었다.
상기 증폭된 HBV의 L 항원 유전자를 제한효소 BamH I, Hind Ⅲ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A의 세포외막 단백질 유전자 (pgsA)의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pHCE1LB:A-L을 도 19에 나타내었다.
(2) 상기 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A-L을 이용한 대장균에서 HBV의 PreS1과 PreS2 그리고 S의 융합항원인 L항원의 발현을 조사하였다. 이를 위해 상기 발현 벡터를 대장균에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 다음 세포외막 단백질 pgsA와 융합된 L항원이 대장균에서 발현되었음을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 PreS1 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다(도 20에서 B). 도 20의 B에서 레인 1은 형질전환되지 않은 숙주세포인 JM109, 레인 2. 3은 형질전환된 pHCE1LB:A-L/JM109이다.
도면에서 보는 바와 같이, pHCE1LB:A-L 플라즈미드에 의해서 약 86 KDa의 융합 단백질 밴드를 확인 할 수 있었다.
실시예 20 : 표면 발현용 전환 벡터 pHCE1LB:A-TNF의 제조
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 의약용 단백질중 하나인 tumor necrosis factor alpha (TNF) 단백질을 융합된 형태로 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pHCE1LB:A-TNF를 제조하였다.
그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는, 전기 실시예 12에서 제작된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 TNF 유전자를 도입하기 위하여, 대장균 발현벡터인 pHCE IIB에 클론되어 있는 약 0.5 kb의 TNF 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 26 (5-tat gga tcc gtc aga tca tct tct cga acc-3) 및 서열 27 (5-aga aag ctta tta cag ggc aat gat ccc aaa g-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 TNF 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 482 bp크기였다. 상기 서열 26 및 서열 27의 시발체는 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A에 존재하는 제한효소 BamH I과 Hind Ⅲ 인식부위가 존재하도록 구성되었다.
상기 증폭된 TNF 유전자를 제한효소 BamH I, Hind Ⅲ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pHCE1LB:A의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pHCE1LB:A- TNF를 도 21에 나타내었다.
실시예 21 : 표면 발현용 전환벡터 pGNA-lipase의 제조 및 lipase의 표면발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물을 숙주로 하여 효소인 리파제를 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pGNA-lipase을 제조하였다.
그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터 pGNA에 리파제 유전자를 도입하기 위하여, 대장균-바실러스 셔틀 벡터인 pMA5에 클론되어 있는 약 0.5 kb의 리파제 유전자를 주형으로 사용하고, 서역 28 (5-gcg gga tcc gct gag cat aat ccg gtt g-3) 및 서열 29 (5-caa gct tat tcg tat tct gtc ctc c-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 리파제 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 546 bp크기였다. 상기 서열 28및 서열 29의 시발체는 표면 발현용 벡터 pGNA에 존재하는 제한효소 BamH I과 Hind Ⅲ 인식부위가 존재하도록 구성되었다.
상기 증폭된 리파제 유전자를 제한효소 BamH I, Hind Ⅲ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pGNA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다.
이렇게 제조한 전환 벡터 pGNA-lipase를 도 22에 나타내었다.
(2) 상기의 표면 발현용 전환벡터 pGNA-lipase를 이용한 대장균에서의 리파제 표면발현을 조사하였다. 이를 위해 상기의 pGNA-lipase를 대장균에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 후 표면발현된 리파제의 효소 활성을 1% 오일 기질(Tricaprylin)이 첨가된 한천배지(1% Tryptone, 0.5% yeast extract, 0.619% NaCl, 0.5% gum Arabic. 1 mM CaCl2, 1% Tricaprylin )에서 오일의 분해능으로 확인하였다. 대장균을 1% 오일 기질이 첨가 되어 있는 한천 배지에 뿌려 준 뒤 37℃로 유지하며 9시간을 배양하였다.
배양 결과, 오일 기질이 분해되어 맑게 변한 부분이 확인되었다(도 22).
따라서 본 발명의 방법에 의하면 리파아제를 표면발현시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시예 22 : 표면 발현용 전환벡터 pGNA-amidase의 제조 및 amidase의 표면발현
(1) 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물을 숙주로 하여 효소인 아미다제를 표면 발현할 수 있는 전환 벡터 pGNA-amidase 을 제조하였다.
그람음성 미생물을 숙주로 하는 표면 발현용 벡터 pGNA에 아미다제 유전자를 도입하기 위하여, 대장균 발현벡터인 pHCE ⅡB에 클론되어 있는 약 0.8 kb의 아미다제 유전자를 주형으로 사용하고, 서열 30 (5-tat gga tcc aaa gtt tat att agt gca g-3) 및 서열 31 (5-cct taa gct tat taa gtt aaa aac tgc aat a-3)의 염기서열을 갖는 올리고 누클레오타이드를 시발체로 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 아미다제 유전자를 증폭하였다. 이때 증폭된 유전자 부위는 792 bp크기였다. 상기 서열 28 및 서열 29의 시발체는 표면발현용 벡터 pGNA에 존재하는 제한효소 BamH I과 Hind Ⅲ 인식부위가 존재하도록 구성되었다.
상기 증폭된 아미다제 유전자를 제한효소 BamH Ⅰ, Hind Ⅲ로 절단하여 미리 준비된 표면 발현용 벡터 pGNA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 연결하였다. 이렇게 제조한 전환 벡터 pGNA-amidase를 도 23에 나타내었다.
(2) 상기 표면 발현용 전환벡터 pGNA-amidase를 이용한 대장균에서의 아미다제 표면발현을 조사하였다. 이를 위해 상기의 pGNA-amidase를 대장균에 형질전환시키고 실시예 3에서와 동일한 과정으로 발현을 유도한 후 기질 D-alaNH2 10mM과 보조인자 CoCl2 0.5mM을 포함한 100mM Tris-HCl (pH8.0) 버퍼에 아미다제가 표면발현된 대장균을 첨가하여 활성을 측정하였다. 이때 사용된 아미다제가 표면 발현된 대장균은 세포성장 OD600nm값이 1일 때, 단위 부피를 사용하여 일정시간 반응시킨 후, HPLC [Hypersil ODS (250x4.6mm) 칼럼]을 이용하여 분석하였다. 대조구로서 야생형 대장균과 표면발현 벡터 pGNA를 포함한 형질전환체를 사용하여 표면 발현 아미다제의 활성을 비교하였다.
도 23에서 보는 바와 같이 형질전환된 대장균의 표면에서 대조군에 비해 100배에 가까운 아미다제 활성이 나타남을 확인하였다. 따라서 본 발명의 방법에 의하면 아미다제를 표면발현시킬 수 있음을 알 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명에 의하여, 미생물 표면에 외래 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있도록 표면 발현 모체로서 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA)를 이용하여, 외래단백질을 그람양성 세균과 그람음성 세균의 표면에 안정적으로 발현시키는 새로운 벡터와 목적으로 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있도록 구성된 전기 표면 발현용 벡터에 의하여 형질전환된 형질전환체 및 전기 표면 발현용 벡터에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입한 발현벡터로 형질전환체를 제조하여 배양하고, 미생물 표면에 발현시키는 것이 가능하게 된다.
본 발명의 표면 발현용 벡터를 이용하여 미생물 표면에 외래 단백질을 발현시키면 세포주기에 상관없이 외래단백질이 안정적으로 발현되고 유지되며 다양한 미생물에 적용이 가능하며 미생물의 표면에 다량 발현하므로 확인이 용이하다. 상기와 같은 미생물 표면발현계를 이용하여 다양한 항원 재조합 항체, 재조합 효소, 부착 또는 흡착 단백질을 효율적으로 생산 할 수 있으며, 각종 항원 및 항체의 스크리닝과 생물학적 전환에 이용되는 효소를 미생물 표면에 발현시켜 지속적으로 촉매의 활성감소 없이 사용이 가능한 전세포 생물전환 등의 목적에 유용하게 사용될수 있다.
Claims (12)
- 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA 중 어느 하나 또는 둘 이상과 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 목적단백질의 미생물 세포 표면발현용 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 pgsB, pgsC 및 pgsA 유전자는 폴리감마글루탐산을 생산하는 바실러스 속 균주에서 유래한 것을 특징으로 하는 미생물 세포 표면발현용 벡터.
- 제 1항에 있어서,pgsB, pgsC 및 pgsA 유전자는 각각 서열 1, 서열 2 및 서열 3의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자는 효소, 항원, 항체, 부착단백질 또는 흡착단백질을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 미생물 세포 표면발현용 벡터.
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현벡터는 그람음성균에 적용되는 것을 특징으로 하는 미생물 세포 표면발현용 벡터.
- 목적 단백질 생산을 위한 제6항의 미생물 세포 표면발현용 벡터에 의해 형질전환된 그람음성균.
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 그람양성균에 적용되는 것을 특징으로 하는 미생물 세포 표면발현용 벡터.
- 목적단백질 생산을 위한 제8항의 미생물 세포 표면발현용 벡터에 의해 형질전환된 그람양성균.
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 그람음성균 및 그람양성균에 동시에 적용되는 것을 특징으로 하는 미생물 세포 표면발현용 벡터.
- 제7항의 형질전환된 그람음성균을 배양하여 목적단백질을 세포 표면에 발현하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 발현방법.
- 제9항의 형질전환된 그람양성균을 배양하여 목적단백질을 세포 표면에 발현하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 발현방법.
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