KR100457071B1 - 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해미생물의 배양 방법 및 이를 이용한 염색 폐수 처리 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해 미생물의 배양 방법 및 이를 이용한 염색 폐수 처리 방법에 관한 것으로 염색 폐수 배출 지역의 토양에 자생하는 미생물을 분리 배양하고, 이를 통해 오염의 주요 원인인 폐수의 색도 제거와 중간 분해산물의 완전 무기물화를 유도하여 염색 폐수의 무독화 및 무기물화를 목적으로 창출된 것으로,
상기 염색 폐수 색도 분해 미생물은 폐수 방출지역의 토양을 채취한 후 증류수와 1:10의 비율로 현탁한 후 30분 동안 정치후 현탁액중 2%를 취출하고,
상기 취출된 현탁액은,
취출된 현탁액 대비 99배의 부피를 가지는 멸균 복합 배양 배지에 접종하며,
상기 접종된 배지에는,
배지 부피 대비 1/99부피를 가지는 광유를 중층하여 30℃에서 정치 배양하며, 상기 배양액을 98well microtiter plate(BECTON DIKINSON)에 순차적으로 희석하여 1.5％agar가 첨가된 영향 한천 평판배지에 도말하여 투명환을 생성하는 간균를 분리하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해 미생물의 배양 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 염색 폐수 배출 지역의 토양에서 색도 분해 미생물을 배양하고, 이를 통해 염색 폐수를 탈색하여 친환경적인 폐수 정화를 이루기 위함이다.
일반적으로 염색 폐수는 폐수 발생량과 폐수 특성면에서 살펴볼 때, 전체 폐수 방출량에 약 4.5％에 지나지 않으나,
폐수로 인한 오염 부하량(처리전 BOD농도)은 전체 폐수의 약 24％를 차지하고 있어 공공 수역에 미치는 영향은 매우 크다 할 수 있다.
이러한 염색 폐수는 취급하는 포지가 천연 섬유인가, 합성 섬유인가에 따라 염색법도 다르고,
또한 동일한 섬유질이라도 염색법 및 염색의 색조에 따라서 사용되는 염료나 매염제등의 종류가 전혀 다르기 때문에 그 성분 조사도 일반적으로 복잡하며, 작업 공정의 가동상황에 따라 수질의 일간변동이 매우 큰 특징을 갖는다.
이와 같이 염색 폐수에는 성분조성이 복잡하고 수질 변동이 크기 때문에 여라 가지 처리법과 그에 대한 조합이 검토되어 왔으나, 아직도 정확한 폐수처리 시스템의 정착이 되지 않고 있는 실정이다.
상기와 같이 염색 폐수 처리 시설은 적절한 처리 시설 운영 및 관리의 부제, 부적절한 처리시설의 설계, 그리고 폐수의 양과 질의 변동등으로 개선이 절실히 필요한 문제점을 안고 있어따.
특히 염색 폐수의 배출 기준이 강화되면서 수질 기준을 만족하는 것 이외에 염색 폐수의 가장 큰 문제점인 색도 제거가 최근에 큰 관심사로 대두되고 있다.
이러한 염색 폐수의 색도는 폐수 정화후에도 다양한 색상의 색도가 잔류하여정화수의 재활용이 불가능하며,
또한 정화수의 방출시 하천, 해역, 리조트 지구 및 도시 조경등에 잔류 색도에 따른 착색 현상을 유발하여 환경 오염의 주요 원인으로 작용하였다.
그리하여 염색 폐수에 포함된 색도를 제거하기 위한 다양한 방법과 설비가 안출되어 사용되고 있으며,
그 가운데 염소계산화법, 염소계 산화-자외선법, 펜톤(fenton)시약법, 오존(O3)법으로 탈색하는 화학적 방법과, 여과법, 자연 침강법, 가압부상법등의 물리적 방법으로 크게 구분되었다.
하지만, 상기한 화학적, 물리적 방법은 다음과 같은 문제점을 안고 있는데,
① 특정 착색 물질에만 적용되어 다양한 색도의 탈색이 불가능한 점.
② 착색 물질에 따라 과다한 초기 비용 또는 운전 비용 소요로 비경제적 점.
③ 탈색 효율에 대한 명확한 보증이 전무한 상황.
등으로 그 실효성이 극히 미진한 상태이다.
이에 본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위해 창출된 것으로 염색 폐수 배출 지역의 토양에 자생하는 미생물을 분리 배양하고, 이를 통해 오염의 주요 원인인 폐수의 색도 제거와 중간 분해산물의 완전 무기물화를 유도하여 염색 폐수의 무독화 및 무기물화를 그 목적으로 한다.
도 1은 본 발명인 색도 분해 미생물을 통한 염색 폐수 처리시 산성도에 따른 적색에 대한 색도 분해 상태를 도시한 그래프,
도 2는 본 발명인 색도 분해 미생물을 통한 염색 폐수 처리시 산성도에 따른 황색에 대한 색도 분해 상태를 도시한 그래프,
도 3은 본 발명인 색도 분해 미생물을 통한 염색 폐수 처리시 산성도에 따른 청색에 대한 색도 분해 상태를 도시한 그래프,
도 4는 본 발명인 색도 분해 미생물의 간균분리에 사용된 염료의 종류를 도시한 도표.
이하 첨부되는 도면과 관련하여 본 발명의 미생물 배양 과정과 이를 통한 색도 분해 과정을 설명한다.
도 1은 본 발명인 색도 분해 미생물을 통한 염색 폐수 처리시 산성도에 따른 적색에 대한 색도 분해 상태를 도시한 그래프, 도 2는 본 발명인 색도 분해 미생물을 통한 염색 폐수 처리시 산성도에 따른 황색에 대한 색도 분해 상태를 도시한 그래프, 도 3은 본 발명인 색도 분해 미생물을 통한 염색 폐수 처리시 산성도에 따른 청색에 대한 색도 분해 상태를 도시한 그래프, 도 4는 본 발명인 색도 분해 미생물의 간균분리에 사용된 염료의 종류를 도시한 도표로서 함께 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명인 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해 미생물의 배양 방법은 염색 폐수를 처리하는 미생물이 기존의 사상균류가 아닌 세균의 생장과 제재화를 통해 수행하는 것으로,
이를 위해서 폐수 방출지역의 토양을 채취한 후 증류수와 1:10의 비율(토양-1g, 증류수-10㎖)로 현탁한 후 30분 동안 정치시키고, 상기 정치된 현탁액중 2㎖를 염료가 첨가된 멸균 복합배양 배지 198㎖에 접종하며,
상기 복합배양 배지에 첨가되는 염료는,
도 4에서와 같이 일반적으로 염색 공장에서 사용되는 염료로서 청색, 황색, 적색, 흑색, 주황색, 녹색, 갈색, 보라색의 8색상의 63종류를 토대로 적용하였다.
상기 복합배양 배지는 2％의 LB배지(DIFCO, Lennox)로 염료는 동일 비율로 혼합하여 멸균 증류수 1ℓ에 염료 100㎎의 농도로 사용하며, 배양 조건을 미세호기 조건으로 설정하기 위해 상등액 접종 후 광유 2㎖로 중층하였고, 30℃에서 정치 배양하였다.
상기와 같은 배양액을 98well microtiter plate(BECTON DIKINSON)에 순차적으로 희석하여 1.5％agar가 첨가된 영향 한천 평판배지에 도말하여 투명환을 생성하는 간균를 분리하였다.
상기와 같은 조건하에서 배양 분리된 간균는 그 산업적 적용에 앞서 분리 간균의 생화학적 특성과 생리특성을 파악하기 위해
간균의 세포벽 양상 및 세포의 형태를 알아보기 위하여 그람 염색 키트(kit)를 통한 염색 작업과,
분리된 간균의 포자 형성 능력을 알아보기 위하여 LB평판 배지에 24시간 배양 후 포자 염색 시약(Malachite green, sapranin)을 이용하여 7-10여분 가열 염색하는 포자 염색 및
분리 간균의 동정을 위해 API(Analytical Profile Index)20A를 이용하여 기질 이용능 및 생리 생화학적 검사를 수행하였다.
상기와 같은 각종 실험을 거친 간균는 다음과 같은 실험 결과를 도출하는데,
URE(urease), GEL(gelatin), SPOR(spore), GRAM(gram staining)의 양성 반응을 나타내여 동정 번호(ID value, 20020003)를 입력한 결과 CLOSTRIDIUM spp.와 99.6％의 상동성을 나타내었다.
이에 상술한 내용으로 배양 분리된 간균는 탈색 및 분해능이 우수한 절대혐기성 간균인 CLOSTRIDIUM spp.로 확인되었다.
이상과 같이 염색 폐수의 탈색과 분해능이 우수한 절대혐기성 간균인CLOSTRIDIUM spp.를 이용한 탈색 및 분해능 상황을 실시예를 통하여 상세히 설명한다.
먼저, 분리된 간균를 통한 탈색 및 분해 반응을 살펴보기 위해서는,
간균 분리시 사용한 배지와 동일한 배양 배지가 요구되며, 이러한 배양 배지에는 실제 염색 폐수의 상태와 동일한 환경을 조성하기 위한 pH제제 첨가물이 추가된다.
이러한 간균의 탈색 및 분해 반응에 적용되는 배양 배지는,
LB 2％ 농도의 배양 배지에 염료와 증류수의 혼합 비율이 100㎎/ℓ농도를 가지는 폐수 견본과 산성도 설정을 위한 pH제제를 첨가하여 198㎖를 조성한다.
이러한 배양 배지는 산성도 pH5에서부터 pH12까지 각각 구비하며, 폐수 견본에 첨가되는 염료는 3색의 기본 구조인 반응성 염료 Reactive Red-4, Reactive Blue-2, Reactive Yellow-2 세 종류를 기준으로 실시한다.
-실시예 1-
먼저, 상기 각 색상별, 산성도별로 조성된 배양 배지 가운데 Reactive Red-4 염료가 첨가된 배양 배지 198㎖에 분리된 간균 2㎖를 접종하여, 각 12시간, 24시간, 36시간을 배양한다.
상기와 같이 각 시간별로 배양된 배양액을 14,000rpm으로 3분간 원심 분리한 후 상등액을 취하여 3nm 간격으로 계측(survey scan)하여 염료의 최대 흡수 파장을 통한 흡광도 및 색도 감소률을 측정하였다.
이와 같은 실시예를 통하여 측정된 각 배양 시간대별로의 흡광도 및 색도 감소률은 아래 표에서와 같이 도출되었다.
표 1
CLOSTRIDIUM spp.에 의한 Reactive Red-4의 pH에 따른 흡광도 감소와 탈색률
| 12시간 후 | 24시간 후 | 36시간 후 | |||||||
| pH | 대조군흡광도 | 실험군흡광도 | 탈색률% | 대조군흡광도 | 실험군흡광도 | 탈색률% | 대조군흡광도 | 실험군흡광도 | 탈색률% |
| pH5 | 1.296 | 1.291 | 0.39 | 1.288 | 1.277 | 0.85 | 1.294 | 1.294 | 0 |
| pH6 | 1.301 | 1.298 | 0.23 | 1.292 | 0.195 | 84.91 | 1.299 | 0.042 | 96.77 |
| pH7 | 1.294 | 1.087 | 16 | 1.283 | 0.103 | 91.97 | 1.282 | 0.053 | 95.87 |
| pH8 | 1.286 | 0.483 | 62.44 | 1.276 | 0.042 | 96.71 | 1.273 | 0.044 | 96.54 |
| pH9 | 1.291 | 0.165 | 87.22 | 1.275 | 0.034 | 97.33 | 1.28 | 0.042 | 96.72 |
| pH10 | 1.288 | 0.122 | 90.53 | 1.278 | 0.037 | 97.1 | 1.274 | 0.042 | 96.7 |
| pH11 | 1.274 | 0.037 | 97.1 | 1.254 | 0.036 | 97.13 | 1.257 | 0.047 | 96.26 |
| pH12 | 1.208 | 0.704 | 41.72 | 1.2 | 0.066 | 94.5 | 1.201 | 0.051 | 95.75 |
이상에 실험 결과를 토대로 흡광도 감소와 더불어 탈색 반응이 진행됨에 따라 그래프상에 중간대사산물은 관찰되지 않고 흡광도가 점진적으로 감소함을 알 수 있으며,
이는 적색 계열의 경우 도 1에서와 같이 pH조건이 pH9에서 pH11에서 가장 좋은 탈색률를 나타내며, pH5조건하에서는 탈색이 거의 일어나지 않음을 알 수 있다.
-실시예 2-
Reactive Yellow-2 염료가 첨가된 배양 배지 198㎖에 분리된 간균 2㎖를 접종하여, 각 12시간, 24시간, 36시간을 배양한다.
상기와 같이 각 시간별로 배양된 배양액을 14,000rpm으로 3분간 원심 분리한 후 상등액을 취하여 3nm 간격으로 계측(survey scan)하여 염료의 최대 흡수 파장을 통한 흡광도 및 색도 감소률을 측정하였다.
이와 같은 실시예를 통하여 측정된 각 배양 시간대별로의 흡광도 및 색도 감소률은 아래 표에서와 같이 도출되었다.
표 2
CLOSTRIDIUM spp.에 의한 Reactive Yellow-2의 pH에 따른 흡광도와 탈색률
| 12시간 후 | 24시간 후 | 36시간 후 | |||||||
| pH | 대조군흡광도 | 실험군흡광도 | 탈색률% | 대조군흡광도 | 실험군흡광도 | 탈색률% | 대조군흡광도 | 실험군흡광도 | 탈색률% |
| pH5 | 10078 | 1.066 | 1.11 | 1.078 | 1.08 | 0 | 1.095 | 1.103 | 0 |
| pH6 | 1.105 | 1.097 | 0.72 | 1.109 | 0.924 | 16.68 | 1.127 | 0.525 | 53.42 |
| pH7 | 1.149 | 1.12 | 2.52 | 1.154 | 0.845 | 26.78 | 1.175 | 0.311 | 73.53 |
| pH8 | 1.166 | 1.032 | 11.49 | 1.169 | 0.583 | 50.13 | 1.188 | 0.156 | 86.87 |
| pH9 | 1.144 | 0.85 | 25.7 | 1.152 | 0.246 | 78.65 | 1.169 | 0.1 | 91.45 |
| pH10 | 1.104 | 0.76 | 31.16 | 1.114 | 0.176 | 84.2 | 1.132 | 0.109 | 90.37 |
| pH11 | 1.086 | 0.895 | 17.59 | 1.102 | 0.323 | 70.69 | 1.127 | 0.125 | 88.91 |
| pH12 | 1.066 | 0.996 | 6.57 | 1.086 | 0.626 | 42.36 | 1.103 | 0.114 | 89.66 |
염색 폐수의 황색 계열인 Reactive Yellow-2는 pH5 조건하에서는 탈색 및 분해반응이 거의 불가능하며, pH9-pH10사이의 조건이 가장 적합한 것으로 확인되었다.
-실시예 3-
Reactive Blue-2 염료가 첨가된 배양 배지 198㎖에 분리된 간균 2㎖를 접종하여, 각 12시간, 24시간, 36시간을 배양한다.
상기와 같이 각 시간별로 배양된 배양액을 14,000rpm으로 3분간 원심 분리한 후 상등액을 취하여 3nm 간격으로 계측(survey scan)하여 염료의 최대 흡수 파장을 통한 흡광도 및 색도 감소률을 측정하였다.
이와 같은 실시예를 통하여 측정된 각 배양 시간대별로의 흡광도 및 색도 감소률은 아래 표에서와 같이 도출되었다.
표 3
CLOSTRIDIUM spp.에 의한 Reactive Blue-2의 pH에 따른 흡광도감소와 탈색률
| 12시간 후 | 24시간 후 | 36시간 후 | |||||||
| pH | 대조군흡광도 | 실험군흡광도 | 탈색률% | 대조군흡광 | 실험군흡광도 | 탈색률% | 대조군흡광 | 실험군흡광도 | 탈색률% |
| pH5 | 0.915 | 0.915 | 0 | 0.924 | 0.914 | 1.08 | 0.909 | 0.927 | 0 |
| pH6 | 0.92 | 0.92 | 0 | 0.917 | 0.896 | 2.29 | 0.932 | 0.787 | 21.3 |
| pH7 | 0.924 | 0.95 | 0 | 0.922 | 0.855 | 7.27 | 0.93 | 0.719 | 22.69 |
| pH8 | 0.921 | 0.922 | 0 | 0.928 | 0.797 | 14.12 | 0.932 | 0.498 | 46.57 |
| pH9 | 0.927 | 0.83 | 10.46 | 0.93 | 0.71 | 23.66 | 0.936 | 0.361 | 61.43 |
| pH10 | 0.936 | 0.787 | 15.92 | 0.936 | 0.477 | 49.04 | 0.952 | 0.113 | 88.13 |
| pH11 | 0.936 | 0.803 | 14.21 | 0.936 | 0.407 | 56.52 | 0.953 | 0.089 | 90.66 |
| pH12 | 0.907 | 0.899 | 0.88 | 0.918 | 0.462 | 49.67 | 0.939 | 0.145 | 84.56 |
청색 계열인 Reactive Blue-2는 탈색 및 분해반응에 미치는 pH조건이 pH10-pH12사이에서 가장 좋은 효과를 나타내는 반면, pH5에서는 탈색이 거의 나타나지 않음을 알 수 있다.
상기 실험에서의 탈색 반응 정도는 각 염료의 광밀도(optical density)감소 정도를 백분률로 환산하여 정량하며,
광밀도 측정은 색도 분해의 최적 산성도(pH)조건을 pH5-pH12 사이의 조건에서 pH1간격으로 각각 12시간, 24시간, 36시간 배양 후, Spectronic GENESYS 5(MILTON ROY)를 사용항 흡광도 감소를 측정함으로써 수행한다.
또한 배양 배지에 첨가되는 pH제제는 가압 멸균 후 NaOH와 HCl용액을 사용하여 조정하고, filtration kit를 사용하여 여과처리한다.
이상에서와 같이,
염색 폐수 배출 지역의 토양으로부터 분리한 절대혐기성 간균인 CLOSTRIDIUM spp.은 염색 폐수의 탈색에 있어 산성도가 pH9-pH12에 이르는 강산성에서 반응 시간 36시간 이후에서 탁월한 탈색 및 분해능력을 나타내고 있음을 알 수 있다.
이와 같이 염색 폐수의 색도 분해능이 뛰어난 간균인 CLOSTRIDIUM spp.를 직접 염색 폐수 처리 공정에 적용하기 위해서는,
우선, 분리 배양된 간균인 CLOSTRIDIUM spp.를 LB 고체 또는 액체 배지에 접종한 후, 혐기 조건하에서 37℃를 유지하여 24시간 배양한다.
더불어 간균의 배양과 함께 배양된 간균이 염색 폐수내에서 활발한 색분해능을 발휘할 수 있도록 염색 폐수의 조건을 설정하는데,
이를 위해 염색 폐수에 2ＸLB 액체 배지를 동일 분량으로 첨가하여 교반하고, 교반된 염색 폐수에는 6NHCl(염산)을 투입하여 수소이온농도가 10이 되도록 염색 폐수의 조건을 설정한다.
상기와 같이 색도 분해 조건을 갖춘 염색 폐수에 전배양된 간균을 전체 염색 폐수 부피의 2%에 해당하는 양을 투입하여 혐기 상태로 37℃의 기온을 유지하여 24시간 배양하여 염색 폐수에 포함된 다양한 색도를 분해하여 탈색하도록 한다.
이상과 같은 본 발명인 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해 미생물의 배양 방법은 전체 폐수 배출에 의한 오염도에서 상당한 부분을 차지하는 염색 폐수의 다양한 색도를 제거함으로써,
환경친화적인 산업 구조로의 전환을 유도하여 산업 전반에 걸친 경쟁력 향상과 수질 오염을 억제할 수 있는 유용한 발명이다.
Claims (5)
- 염색 폐수 색도 분해 미생물의 배양 방법에 있어서;상기 염색 폐수 색도 분해 미생물은,폐수 방출지역의 토양을 채취한 후 증류수와 1:10의 비율로 현탁한 후 30분 동안 정치시키고, 정치된 현탁액중 2%를 취출하고,상기 취출된 현탁액을 취출된 현탄액 대비 99배의 부피를 가지는 멸군 복합배양 배지에 접종하며,상기 접종된 배지에는, 배지 부피 대비 1/99부피를 가지는 광유를 중층하여 30℃에서 정치 배양하며,상기 배양액을 98well microtiter plate(BECTON DIKINSON)에 순차적으로 희석하여 1.5％agar가 첨가된 영향 한천 평판배지에 도말하여 투명환을 생성하는 간균를 분리하여 얻는 것을 특징으로 하는 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해 미생물의 배양 방법.
- 제 1 항에 있어서;상기 분리된 간균는,그람 염색 작업과,LB평판 배지에 24시간 배양 후 포자 염색 시약(Malachite green, sapranin)을 이용하여 7-10여분 가열 염색하는 포자 염색 및,분리 간균의 동정을 위해 API(Analytical Profile Index)20A를 이용하여 기질 이용능 및 생리 생화학적 검사를 수행하여 확인되는 절대혐기성 간균인 CLOSTRIDIUM spp.인 것을 특징으로 하는 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해 미생물의 배양 방법.
- 제 1 항에 있어서;상기 복합 배양 배지는 2％의 LB배지(DIFCO, Lennox)이고,첨가 염료는 멸균 증류수 1ℓ에 염료 100㎎의 비율로 혼합되어 사용하는 것을 특징으로 하는 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해 미생물의 배양 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서;상기 분리된 간균인 CLOSTRIDIUM spp.의 염색 폐수에 잔류하는 색도 분해 작용에 있어서,상기 간균인 CLOSTRIDIUM spp.는 염색 폐수에 투입된 36시간 후에 산성도 pH9-pH12사이의 강산성 조건하에서 3색의 기본 구조인 적색, 황색, 청색의 탈색률이 모두 90% 이상을 발현하는 것을 특징으로 하는 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해 미생물의 배양 방법.
- 간균인 CLOSTRIDIUM spp.를 이용한 염색 폐수 처리 공정은,분리 배양된 간균인 CLOSTRIDIUM spp.를 LB 고체 또는 액체 배지에 접종한 후, 혐기 조건하에서 37℃를 유지하여 24시간 배양하고,염색 폐수에 2ＸLB 액체 배지를 동일 분량으로 첨가하여 교반하고,교반된 염색 폐수에 6NHCl(염산)을 투입하여 수소이온농도를 10이 되도록 형성하여,상기 전배양된 간균을 전체 염색 폐수 부피의 2%에 해당하는 양을 투입하여 혐기 상태로 37℃의 기온하에서 24시간 배양하는 처리공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 염색 폐수 방출 지역의 토양을 기조로 한 색도 분해 미생물을 이용한 염색 폐수 처리 방법.
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