KR100456981B1

KR100456981B1 - 식물추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR100456981B1
Application number: KR10-2001-0042620A
Authority: KR
Inventors: 홍은경; 정영신; 최희숙
Original assignee: (주) 메드빌
Priority date: 2001-07-14
Filing date: 2001-07-14
Publication date: 2004-11-10
Also published as: KR20030006736A

Abstract

본 발명은 나리(Liliaceae)과의 아네마레나 리조마(Anemarrhena Rhizoma; 知母)와 꿀풀과의 레오누러스 시비리쿠스 (Leonurus sibiricus L.; 益母草) 등의 혼합 추출물에 의해 이루어지는 골다공증의 예방 및 치료 효과를 나타내는 치료 조성물과 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 골다공증 환자의 골형성을 증진시키며 골다공증으로 인한 통증에도 효과를 나타내어 통증을 완화시킨다. 본 발명은 생약 추출물로서 부작용이 적으면서 소염 및 진통효과를 나타내어, 장기 복용 및 투여가 가능하다. 또한 의존성 및 내성을 초래하지 않고, 말초 조직에 특이성을 갖는다.

Description

식물추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물 및 그 제조 방법{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OSTEOPOROSIS COMPRISING PLANT EXTRACTS AND METHOD OF PREPARING THE SAME}

본 발명은 나리과(Liliaceae)의 아네마레나 리조마(Anemarrhena Rhizoma; 知母)와 꿀풀과의 레오누러스 시비리쿠스(Leonurus sibiricus L.; 益母草) 등의 혼합 추출물 및 비타민 D₃(vitamine D₃) 보강에 의해 이루어지는 골다공증의 예방 및 치료 약물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 아네마레나 리조마는 원산지가 중국이며 한국의 중부지방에서 재배되는 다년초인데, 한국명은 지모라고 한다. 그의 대표적인 것은 아네마레나 아스포데로리디스 본지(Anemarthena asphodelorides BUNGE)로 이의 근경은 약전(KP, JP)에서 소염, 해열, 지사. 이뇨, 요통, 전정에 사용되고 있다. 본 발명에서는 지모의 근경을 건조하여 사용한다. 이 약용식물에는 아스포닌(Asphonin) 6% 이외에도, 살사사포닌(Sarsasaponin), 말코게닌(Markogenin; 2-hydroxy sarsasapogenin) 등의 스테로이드 사포게닌, 플라보노이드(Flavonoids), 탄닌 등이함유되어 있다. 동의보감이나 본초강목 등에서는 지모를 골증노열(骨蒸勞熱)에 사용하였는데, 골증노열(骨蒸勞熱)이란 용어를 해석하면 골중(骨中)에서 골다공증 (Osteoporosis)이 발증되어 만성의 동통을 호소하는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 약용식물인 꿀풀과의 레오누러스 시비리쿠스 식물은 높이 약 1m에 이르는 이년생 초본으로서 첫해는 심장모양의 뿌리잎이 돋아나고 다음해에 줄기가 자라며, 전국 각지의 길섶, 들, 풀밭, 산기슭에서 자란다. 꽃피기 전 5-6월에 줄기를 베서 말린 전초를 사용하며, 여성들의 건강에 좋은 약초라하여 익모초라고 한다. 주요 성분으로는 알칼로이드인 레오누린, 레오누리닌, 레오누리딘, 스타히드린이 있고 쓴맛 물질로 피토스테린, 정유, 사포닌, 기름 0.5%, 역한 냄새나는 물질, 수지, 루틴, 유기산 등이 있다. 또한 쿠마린, 플라보노이드 배당체(루틴) 등이 들어있다.

전초의 수(水) 및 알콜 추출액은 중추신경계통에 대한 진정작용이 있으며, 심장 박동을 느리게 하고, 심장을 수축하며 혈압을 내리는 작용이 있다. 성분 중 레오누린이 심장 수축을 세게 하며 미주신경 말초를 흥분시켜 억제한다. 따라서 혈압을 내리고 이뇨작용을 하는, 즉 강심이뇨작용이 있다. 스타히드린 성분 역시 알칼로이드로 동물의 자궁에 대한 수축성과 긴장성을 높인다는 보고와 함께 자궁수축작용과 지혈작용을 하여 산후출혈, 월경과다에 많이 쓰이고, 진정작용과 혈압강하작용이 있어서 고혈압 예방치료에 좋은 산후보약으로 쓰인다. 익모초는 전통적으로 부인과 질환에 사용하여 왔으며 생리조절 작용을 나타낸다. 그 외에도 습진, 가려움증에도 사용한 예가 있다.

다음은 골다공증을 설명한다.

골(bone)은 근육과 연합되어 있는 석회화된 결체조직으로서, 표면은 두껍고 단단한 석회화 조직으로 신체균형을 이루는 지주역할을 하며, 장기를 보호한다. 골의 안쪽은 골수조직으로 칼슘대사의 중심이 되는 부위이다. 골은 콜라겐, 오스테오칼신, 오스테오넥틴 등 유기질(organic substance)과 칼슘, 인, 불소 등의 무기질 (inorganic substance) 및 수분으로 구성되어 있다. 생체에서는 항상 골형성(bone formation)과 골흡수(bone resorption)가 일어나고 있다. 골형성은 소량의 부갑상선 호르몬이나 안드로겐, 에스트로겐, 불소, 인 등에 의하여 촉진되며, 골흡수는 물리적 감압, 무중력상태, 다량의 부갑상선 호르몬, 부신피질 스테로이드 등에 의하여 촉진된다. 따라서 골대사에는 이들 사이의 균형(balance)이 중요하다.

골다공증은 골형성이 감소되고 골흡수가 증가되어 골기질(bone matrix)이 감소됨으로써 골질량(bone mass)이 전반적으로 감소되는 질환으로서 대사성 골질환 중 가장 흔하다.

골기질의 감소로 인해 골의 강도가 약해져서 쉽게 골절이 생기므로 임상적으로 많은 어려움이 있으며, 특히 가벼운 충격에 의해서도 척추의 압박골절과 대퇴골 경부 및 전자부의 골절이 발생할 수 있는 질환이다.

골다공증의 원인은 원발성(primary)과 속발성(secondary)으로 나누며 원발성 골다공증은 주로 노년기 골다공증과 폐경기 후의 골다공증이고 속발성 골다공증은 갑상선 기능항진, 부갑상선 기능항진, 부신피질 기능항진, 임신, 장기간의 고정(예, 석고붕대 고정 등), 영양부족, 약물, 종양과 그 밖의 만성질환의 합병증으로발생될 수 있다.

노인성 골다공증(폐경 후의 것도 포함)은 원인이 분명치 않으나 여러 인자가 관여한다고 인식되어 왔다. 노화에 의한 골대사의 평형의 붕괴와 더불어 칼슘부족, 부갑상선 호르몬의 과잉, 칼시토닌(calcitonine)의 결핍, 활성형 비타민 D의 부족, 여성호르몬의 결핍, 운동부족 등 여러 가지 요인이 복합적으로 관여하여 발생하는 것으로 생각되고 있다. 칼슘대사에 강한 영향을 미치는 인자로서는 부갑상선 호르몬(PTH), 칼시토닌(CT), 1,25-(OH)₂D₃등이다. 칼슘의 대사에 관여하는 부갑상선 호르몬과 갑상선의 C세포에서 분비되는 칼시토닌은 서로 길항적으로 작용한다. 칼시토닌은 폴리펩타이드로 분자량이 3500-4000 정도이며 뼈에 작용하여 칼슘염이 뼈에 침착되도록 도와준다. 그 결과 혈중 칼슘과 마그네슘이 감소하고 소변 내의 인산과 하이드록시프롤린(Hydroxyproline)도 감소한다.부갑상선호르몬(Parathyroid hormo ne; PTH)도 폴리펩타이드로서 분자량이 8447 정도이다. 부갑상선 호르몬은 뼈에 작용하여 파골세포(Osteoclast)를 활성화하여 골흡수를 증가시키고, 소장 점막에서 비타민 D₃의 작용을 상승시킨다. 따라서 혈중 칼슘과 마그네슘이 증가하고 소변 내의 하이드록시프롤린(Hydroxyproline)과 인산(PO₄ ^3-)도 증가한다. 난소에서 분비되는 스테로이드인 에스트라디올은 뼈에서 조골세포(Osteoblast)를 활성화시켜 골흡수를 막는다.

여성의 폐경기 이후에는 에스트로겐의 분비가 저하되어 그 결과 혈중 칼시토닌이 감소하고 신장에서의 1,25-(OH)₂D₃합성이 감소하며, 부갑상선 호르몬의 분비가 증가한다. 이에 따라 인터루킨 6(IL-6)과 프로스타글란딘(Prostaglandin)의 생성이 증가하여 소장내에서의 칼슘 흡수율이 저하되며, 파골세포가 활성화됨으로써 골흡수가 증대되어 골소실율이 항진되므로 골다공증의 발생율이 높아진다. 일반적으로 골흡수가 골형성보다 활발해지면 관절기능에 장해가 생기고 척추가 점진적으로 기형이 되며 척추와 기타 부위에 미세한 골절이 유발되고, 통증(특히 요배통)이 심해져 운동성이 저하되며, 척추 후만이 일어나 신장이 줄어든다.

현재까지 골다공증에 대한 치료제로 사용되는 것은 에스트로겐요법, 칼슘요법, 칼시토닌 요법이 주로 사용되고 있으며 최근에는 비스포스포네이트계 약물과 SERM(simillar estrogen receptor modulator)약제로 랄록시펜(Raloxifene)이나 드롤록시펜(Droloxifene)등이 임상시험 중이다.

에스트로겐 요법의 경우 일시적으로 골흡수를 막는 효과는 있으나 유방암 발생율이 상대적으로 증가되어 사용하기 전에 유방암에 대한 사전 조사가 필요하다. 칼시토닌 요법은 안전하고 진통효과가 뛰어나지만 그 효과가 폐경 직후의 항진된 골흡수 억제에는 미흡하고, 폐경 후 약 5년 이후에서 효과를 나타내며, 가격이 비싸 비경제적인 단점이 있다. 비스포스포네이트 제제는 흡수율이 매우 낮고 골흡수의 억제 효과가 있으나 골연화증을 유발하여 골절율을 증가시킨다.

현재까지의 약제들은 주로 골흡수를 억제함으로써 골밀도를 유지하기 때문에많은 부작용이 있다. 따라서, 새로운 치료제는 골밀도 감소를 억제할 뿐만 아니라 감소된 골량을 복원시키는 기능을 갖추는 것이 이상적이다.

본 발명의 익모초와 지모의 혼합 추출물은 골흡수를 저해하고 골형성을 증가시켜 골다공증을 치료 및 예방할 수 있을 것으로 보인다.

위에서 본 바와 같이, 각각의 식물에 대하여 골증에 대한 효과 및 부인질환에 대한 효과가 보고된 바 있으나, 두 식물의 혼합 추출물에 대한 골다공증의 치료 및 예방 효과가 검증된 바 없고 그 처방도 보고된 바 없다. 그러나, 본 발명자는 상기 두 식물의 혼합 추출물이 세포 실험에서 조골세포의 분열과 활성화에 뛰어난 효과를 나타냄을 확인하였으며 동물실험에서 골다공증에 탁월한 효과가 있음을 발견하였다. 그 외에도 임상 증례를 통하여 두 식물의 혼합 추출물이 골다공증에 탁월한 효과가 있음을 확인하였다. 동시에 동물실험을 통해 그 독성이 없음을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 유효성분으로 사용되는 지모와 익모초의 혼합 추출물은 다음과 같은 방법에 의해 수득된다.

즉, 지모와 익모초의 혼합 추출물을 제조하고자 하는 경우에는, 지모와 익모초의 혼합물을 물로 추출하고 여과한 후에 여액을 고압 하에서 포화시켜 생성된 응고단백질의 침전물을 원심 분리하여 제거하고, 여액에 유기용매를 가하여 유기용매 가용성 물질을 제거한 다음에 수층을 분리하여 동결 건조시킴으로서 분말상으로 혼합 추출물을 수득하거나 알코올로 추출하여 수득할 수 있다.

이 때, 지모와 익모초는 중량 기준으로 1:0.2-5, 바람직하게는 1:1-2의 중량 비로 배합하여 사용한다. 특히, 본 발명에서는 지모와 익모초를 1:1의 중량 비로 배합하여 추출하는 것이 바람직하다.

이하에서는 본 발명에 따른 각각의 혼합 추출물의 제조방법을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명의 추출방법에 따르면 혼합 수추출물은 제1 단계에서, 건조한 지모와 익모초를 혼합하여 분쇄하고, 상수 또는 증류수와 같은 물을 추출용매로 하여 가열하여 추출하거나 가열하여 포화수증기압(100∼140℃) 하에서 추출한다. 지모와 익모초의 혼합물을 추출하는데 사용하는 물의 양은 건재의 10∼45배, 바람직하게는 5∼10 배, 특히 바람직하게는 7 배를 사용한다.

다음, 제2 단계에서 추출물을 원심 분리하여 침전물을 제거하고 추출물은 다시 포화수증기압(100∼140℃) 하에서 비등시켜 잔존하는 단백질을 응고시킨 후, 원심 분리 등에 의해 여과하여 제거한다.

제3 단계에서는 분리된 여액을 클로로포름, 헥산, 디클로로메탄, 사이클로헥산 등의 유기용매, 바람직하게는 클로로포름 또는 헥산을 사용하여 추출함으로써 수지, 섬유질 등의 불순물을 제거하고, 수층을 다시 탈크 등을 이용하여 정제한 후에 동결 건조시킴으로써 목적하는 혼합 수추출물을 얻는다.

본 발명의 다른 방법으로서 지모와 익모초 혼합물을 추출용매로 알코올을 사용하는 알코올 추출물도 상기 수추출물과 동일한 효과를 얻을 수 있다. 그 방법은 다음과 같다.

지모와 익모초 등의 약용식물을 각기 분쇄하여, 중량비 5:1 내지 1:5의 비율로 혼합한다. 바람직하게는 2:1 내지 1:2의 비율로 혼합하고 1종 또는 2종의 알코올, 바람직하게는 70∼80% 알코올로 실온에서 48∼72 시간 동안 때때로 교반하면서 용출한다. 용출액은 경사법으로 따라내고, 다시 잔사에 같은 농도의 알코올을 넣어 위의 방법으로 재추출하고, 용출액을 경사법으로 따라내어, 첫 번째 용출액과 혼합한다. 혼합액에서 알코올을 회수하고 남은 용출액에 탈크를 가하여 교반한 후, 원심분리하여 상층액 만을 따라내어 여과한다. 여액은 알코올을 제거하여 분말화한다.

상기한 바와 같은 방법들에 의해 얻은 지모와 익모초의 혼합 추출물(수추출물 또는 알코올추출물)은 전술한 바와 같이 약물학적으로 유용한 골다공증 치료 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명자는 상기 혼합 추출물이 골다공증에 대한 치료효과를 가지는 동시에 소염, 진통효과를 발휘함을 확인하였고 급성독성 시험을 통하여 본 발명의 혼합 추출물이 매우 안전한 약물임을 확인하였다.

본 발명에 의한 지모와 익모초의 혼합 추출물은 임상적으로 이용시에, 치료학적 유효량을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 의해 적합한 약제학적 조성물의 형태로 제형화하여 바람직하게는 경구로 투여할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 경구투여에 적합한 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제 또는 시럽제의 형태로 제형화시킬 수 있으며, 또한 음료의 형태로 제조할 수도 있다.

본 발명에 의한 혼합 추출물의 투여용량은 질환의 정도, 투여대상 환자의 성별, 연령, 체중, 및 목적하는 효과가 어떤 것인지에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로는 성인에게 경구 투여하는 경우, 체중 1 kg당 1 일 5-50 mg, 바람직하게는 10 내지 40 mg의 용량으로 투여할 수 있다.

실시예

다음은 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 이들은 단지 본 발명을 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 지모와 익모초의 혼합 수추출물 제조

건조된 지모와 익모초를 각각 분쇄하고 5:4의 중량비율로 혼합하여 90 g을 분취하고, 여기에 증류수 또는 상수 3000 ㎖을 가한 후, 고압솥에서 온도 121 ℃, 포화수증기압 15 psi의 조건으로 40∼60 분간 고압 추출한 후, 추출액을 분취하고 잔사는 제거하였다.

추출액을 원심분리하여 침전물을 제거하고 수액은 여과한 다음에 전량이 1500 ㎖가 되도록 증발농축하고 여과하였다. 이 여액을 다시 고압솥에서 온도 121℃, 포화수증기압 15 psi의 조건으로 15 분간 포화시켜 생성된 응고 단백질을 포함한 침전물을 생성시킨 후 원심분리하여 침전물을 제거한 후에 여과하였다.

상기 여액을 분액깔대기에 넣고 클로로포름 400 ㎖을 가하여 수지 및 섬유질 등을 용출시키고 클로로포름 층을 분리 제거하였다. 이와 같은 방법을 2 회 반복한 후 수층에 다시 n-헥산 200 ㎖을 가하여 잔존하는 수지, 섬유질 및 n-헥산 가용물질 등을 용출시켰다.

수층을 회수하여 60∼80℃로 가온시키고, 탈크(talc) 500 g을 가하여 교반한 후에, 감압여과하여 탈크는 제거하고 여액은 다시 서서히 여과하여, 여액을 동결건조시켜 분말화하였다.

상기 방법에 의하여 지모와 익모초의 혼합 추출물에서 약 17%의 수율(건조 중량 기준)로 총 추출물 15 g을 수득하였다.

실시예 2: 지모와 익모초 혼합물의 알코올 추출물 제조

건조된 지모와 익모초를 각각 분쇄하여 1:1의 비율로 혼합한 것에, 80 % 에탄올을 1.2 ℓ 넣고 실온에서 때때로 교반하면서 48∼72 시간 동안 용출하였다. 용출액은 경사법으로 따라내고, 남은 잔사에 다시 80% 에탄올을 정량 가하고, 위와 같은 방법을 반복하여 재용출하였다.

재용출액을 경사법으로 따라서 첫 번째 용출액과 합하여 환류냉각장치에서 에탄올은 회수하고, 남은 용출액에 탈크를 가하여 교반한 후, 원심분리하여 침전물은 제거하고, 남은 상층액은 여과하였다.

여액에 헥산과 클로로포름을 가하여 수지와 단백질, 섬유질 등을 제거하고 남은 액체를 동결건조하여 분말화한다. 이 때 갈색 분말을 20%의 수율로 얻었다.

실시예 3: 지모와 익모초의 혼합 추출물의 조성

다음은 본 발명에 의한 지모와 익모초의 혼합 추출물로 된 제형의 예를 구체적으로 나타낸다.

제형 1: 정제

실시예 1에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 혼합 추출물 250 mg을부형제 직타용 락토즈 260 mg 과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 35 mg, 붕해보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 15 mg, 결합제인 직타용 L-HPC(Low- hydroxyprophylce llulose) 80 mg을 섞어 U형 혼합기에 넣고 20분간 혼합하였다. 혼합완료 후 활탁제 마그네슘 스테아레이트 10 mg를 추가로 넣고 3분간 혼합하였다. 정량시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여, 1정당 혼합 추출물 250 mg을 함유하는 정제를 제조하였다.

제형 2: 시럽제

일정량의 물에 적당량의 백당을 용해시키고, 여기에 보존제로서 파라옥시메틸벤조에이트 80 ㎎ 및 파라옥시프로필벤조에이트 16 ㎎을 가한 다음, 실시예 1에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 혼합 추출물 4.5 g을 넣어 60℃로 유지시켜 완전히 용해시킨 후에 냉각시키고, 증류수를 가해 150 ㎖로 만들어 시럽제를 제조하였다.

제형 3: 캅셀제

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 동결 건조된 분말상의 혼합 추출물 300 ㎎ 을 담체로서 락토즈 200 ㎎과 혼합시켜 경질 젤라틴 캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

제형 4: 음료 조성물

상기 실시예 1에서 제조된 본 발명의 동결건조된 분말상의 혼합 추출물 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 고과당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다.

실험예 1: 본 발명의 혼합 추출물의 골다공증에 대한 효과 (동물실험)

9 주령 SD 래트를 1주일 동안 순화시킨 후 10주가 되었을 때 난소를 적출하고 다음날부터 3주 동안 추출물을 경구투여하였다. 양성 대조군으로는 에스테론을 피하(s.c)로 같은 기간을 투여하였다. 비교 정상군으로서는 수술하고 난소는 적출하지 않은 샴-오퍼레이션(Sham-operation)을 수행하였다.

추출물을 마지막 투여하고 다음날 칼슘 글루코네이트를 50 mg/kg을 복강 주사하고 30분 후 동물을 마취하고 채혈하여 혈청에서 칼슘과 칼시토닌의 양을 측정하였다. 혈청 중의 칼슘의 양은 흡광도를 이용하여 측정하고 칼시토닌은 항체를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 양성 대조군에 비해 난소적출을 실시한 쥐에서는 혈중 칼슘농도가 유의적으로 낮아진 반면, 에스테론을 투여한 쥐에서는 정상 쥐와 같은 혈중 칼슘농도를 유지하였고, 본 발명의 혼합 추출물 50 mg/kg이나 100 mg/kg를 경구 투여받은 쥐도 정상 쥐와 같은 혈중 칼슘농도를 유지하였다. 혈중의 칼시토닌의 양도 비슷한 양상을 나타내었다.

표 1. 본 발명의 혼합 추출물의 경구투여에 의한 혈액의 칼슘 및 칼시토닌의 변화

	혈청 칼슘(mg/dl)	혈청 칼시토닌 (pg/ml)
양성 대조군	16.50 ± 0.73	2030 ± 149
난소 적출	13.45 ± 0.37	1740 ± 135
난소적출-에스테론	16.96 ± 1.17	2133 ± 142
난소적출-본 발명 혼합 추출물(50 mg/kg)	17.78 ± 0.45	2120 ± 130
난소적출-본 발명 혼합 추출물(100 mg/kg)	18.22 ± 0.76	2252 ± 118

뼈조직을 분석한 결과, 난소를 적출한 쥐에서는 뼈의 무게 및 강도에 있어서 현저한 저하가 나타났으나 본 발명의 혼합 추출물을 경구투여한 쥐에서는 뼈의 무게 및 강도에 있어서 에스테론 투여나 정상 쥐에서와 유의한 차이가 없음이 관찰되었다.

실험예 2: 본 발명의 혼합 추출물의 조골세포(osteoblast)에 대한 효과

래트의 두개관 세포(calvarial cells)를 배양하여 대조군에는 생리식염수를 1 ㎍/㎖ 농도로 처치하고, 비교군에는 각각 지모 추출물 1 ㎍/㎖, 익모초 추출물 1 ㎍/㎖, 본 발명의 혼합 추출물 1 ㎍/㎖을 투여한다. 48시간 후에 세포 균질물(cell homogenate)을 초음파 처리(sonicate)하고, 키트를 이용하여 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase, ALP) 활성을 측정하였다.

그 결과, 표 2에서처럼 본 발명의 혼합 추출물은 각각의 추출물보다 조골세포의 분화가 유의적으로 촉진됨을 관찰하였다.

표 2. 본 발명의 혼합 추출물의 조골세포 세포분화에 미치는 영향

	알칼라인 포스파타제 활성도(U/㎍ 단백질)
대조군	0.11 ± 0.03
지모추출물	0.17 ± 0.04
익모초 추출물	0.09 ± 0.04
본 발명의 혼합 추출물	0.23 ± 0.07

실험예 3: 본 발명의 혼합 추출물의 골다공증에 대한 효과 (임상증례)

폐경 10년이 경과하고 척추골 농도 0.332g/cm²(정상인의 29%, 골다공증)이며 10분 이상 걷지 못하는 환자에게 본 발명의 혼합 추출물 20 mg/kg를 1일 2회씩 12주간 경구투여하였다. 그 결과 환자의 골농도가 0.332g/cm²에서 0.476g/cm²로 증가한 것이 관찰되어 골세포의 증가율이 13% 상승한 것으로 나타났고 임상적으로는 30분 이상 걸을 수 있었다.

실험예 4: 본 발명의 혼합 추출물의 진통효과

본 발명의 혼합 추출물의 진통효과를 알아보기 위하여 테일-플릭(tail-flick)법을 이용하여 조사하였다. 백서를 이용하여 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 추출물을 투여하고 30분 후에 백서 꼬리 끝 2-5 cm 부위에 고밀도 빔을 비췄을 때 꼬리를 옆으로 피할 때까지 걸리는 시간(잠복시간;latency)을 역치로 측정한다. 아래의 식을 이용하여 퍼센트 억제효과(% inhibition)를 계산한다.

퍼센트 억제효과 =

100 x [(잠복시간)_{본 발명}- (잠복시간)_대조군] / [10 - (잠복시간)_대조군]

표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물은 각각의 추출물에 비해 상승된 진통효과를 나타내었다.

표 3. 본 발명의 혼합 추출물의 진통 효과

	시간(초)
대조군	2.0 ± 0.2
지모추출물	3.4 ± 0.4
익모초 추출물	2.8 ± 0.4
본 발명의 혼합 추출물	7.8 ± 0.7

실험예 5: 본 발명의 혼합 추출물의 소염 효과

본 발명의 혼합 추출물의 소염효과를 카라기닌 포-에데마(carrageenin paw-edema)법을 사용하여 조사하였다. 백서를 이용하여 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 추출물을 투여하고 발목까지의 용량을 용량측정기(plethysmometer)로 측정한다. 곧바로 1% 카라기닌의 식염수 용액 0.1 ml를 발바닥 피내에 주사하고, 1시간 후에 부종이 생긴 발목까지의 용량을 측정하여 발 부종의 부피를 계산한 다음, 아래 식을 이용하여 퍼센트 억제효과(% inhibition)를 구한다.

퍼센트 억제효과 =

100 - (부피 차이)_{본 발명}/ (부피 차이)_대조군x 100

표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 혼합 추출물은 각각의 추출물에 비해 상승된 소염 효과를 나타내었다.

표 4. 본 발명의 혼합 추출물의 소염 작용

	% 저해도
대조군	2.1 ± 0.2
지모추출물	58.7 ± 10.4
익모초 추출물	53.9 ± 9.8
본 발명의 혼합 추출물	64.3 ± 8.7

실험예 6: 본 발명의 혼합 추출물에 대한 급성독성 검사(단회 투여 독성 실험)

정상 ICR 마우스(수컷, 22±1 g) 36 마리를 1 개 군에 6 마리씩 A 내지 F의 6 개 군으로 나누어, A 군은 대조군으로 생리 식염수를 투여하였고, B 군에는 체중 1 ㎏당 실시예 1의 지모와 익모초의 혼합 추출물 1 g을 투여하는 것으로부터 등차적으로, C 군에는 2.5 g, D 군에는 5 g, E 군에는 7.5 g 및 F 군에는 10 g을 각각 경구투여한 다음, 1주일간 관찰한 결과, 10 g/kg를 투여한 군에서도 이상이 있는 동물이 없었다. 따라서 본 발명의 지모와 익모초의 혼합 추출물의 경구투여에 의한 LD₅₀치는 10 g/㎏ 이상으로 생체에 매우 안전한 물질임을 알 수 있었다. 즉, 본 발명에 따르는 지모와 익모초의 혼합 수추출물은 독성이 거의 없이 안전하게 투여될 수 있는 것임을 명백히 알 수 있다.

또한, LD₅₀치의 측정 시에 사용한 실험동물에 대해 부검 및 병리 조직학적 시험을 다음과 같은 방법으로 시행하였다.

시험종료시 전 생존동물에 대하여 에테르 마취 후 방혈 치사시킨 다음, 장기를 적출하여 육안적으로 모든 장기의 이상을 검사하였다. 병리조직 검사를 위하여 부검한 전 장기들을 10 % 중성포르말린 용액에 10 일 이상 고정시킨 다음 탈수과정을 거쳐 파라핀 포매기(Fisher, Histomatic Tissue Processor, 166A)에서 포매한 후 로터리 마이크로톰(AO Rotary Microtome)으로 5 ㎛ 절편을 만들어 헤마톡실린과 에오신 염색을 하여 관찰하였다.

각 군의 모든 동물을 해부하여 현미경으로 조사한 병리 조직학적 소견은 다음과 같았다. 상기 지모와 익모초의 혼합 수추출물을 마우스 체중 1 kg 당 10 g까지 투여한 조직에 있어서 약물 투여에 의한 이상적인 소견은 관찰되지 않았다. 또한 신장에 있어서도 약물 투여에 의한 이상 소견은 관찰되지 않았으며, 심장의 심근세포에 있어서도 약물투여에 의한 이상 소견은 전혀 관찰되지 않았다. 그 밖의 주요 장기인 위·장관, 췌장, 폐장, 비장, 부신, 뇌, 고환, 난소, 골수 등에 있어서 약물투여에 의한 이상 소견은 관찰되지 않았다.

따라서, 본 발명의 지모와 익모초의 혼합 수추출물은 마우스에 투여할 수 있는 최대 용량인 체중 1 kg당 10 g 투여 시에도 전 장기에 대하여 부작용이 없었으며, 또한 어떠한 장기손상 등의 독성도 유발하지 않는 등 안전한 것으로 나타났다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 지모와 익모초 식물의 혼합 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료 조성물을 제공하며, 본 발명의 조성물은 생약 추출물로서 부작용이 적고, 장기 복용 및 투여가 가능하다. 또한 본 발명의 조성물은 소염, 진통효과를 동반하고 있어 골다공증에 의한 통증에 대해 즉각적인 효과를 나타낼 것으로 기대되고 골다공증 환자의 치료에 큰 도움을 줄 것으로 예상된다. 또한 본 발명의 조성물은 의존성 및 내성을 초래하지 않는다. 이러한 효과는 지모와 익모초 각각의 추출물이 개별적으로 가지는 효과보다 월등히 뛰어난 것이다.

Claims

물 또는 물과 저급 알코올의 혼합용매에 의한 지모와 익모초의 혼합 추출물을 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물이 상기 지모와 익모초를 5:1 내지 1:5의 중량비로 혼합하여 추출한 것인 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하고, 약제학적 단위투여형으로 제형화된 것인 골다공증 예방 또는 치료용 조성물.
a) 지모와 익모초를 중량 기준으로　5:1 ~ 1:5로 혼합하여 물 또는 물과 저급 알코올의 혼합용매로 추출하는 단계；

b) 상기 a)단계의 추출물을 여과하는 단계；

c) 상기 b)단계의 여액을　100 ~ 140℃의 고온 및 고압 하에 포화시켜서 응고 단백질의 침전물을 생성시킨 후 원심분리하여 제거하는 단계；

d) 상기 c)단계의 침전물이 제거된 여액을 유기용매로 추출하고 수층을 분리하여 여액의 유용성 물질을 제거하는 단계; 및

e) 상기 d)단계의 분리된 수층을 동결건조시키는 단계

를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법．
제4항에 있어서,

상기 e)단계의 동결건조된 지모와 익모초의 혼합 수추출물에 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 첨가하여 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 및 식용음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조하는 단계

를 더 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법.
제4항에 있어서,

상기 단계 a)에서 추출용매가 물이고, 지모와 익모초의 혼합물에 대해 1:10-45 중량비로 사용하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법.
제4항에 있어서,

상기 단계 d)의 유기용매로 클로로포름 또는 헥산을 사용하는 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법.
제4항에 있어서,

상기 a)단계의 추출용매가 70∼80 중량% 농도의 탄소수 1 내지 5의 알코올인 골다공증 예방 또는 치료용 조성물의 제조 방법.
물 또는 물과 저급 알코올의 혼합용매에 의한 지모와 익모초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료에 효과가 있는 생약제제．
물 또는 물과 저급 알코올의 혼합용매에 의한 지모와 익모초의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료에 효과가 있는 건강보조식품．