KR100441689B1

KR100441689B1 - 분해균 보지담체의 제조방법

Info

Publication number: KR100441689B1
Application number: KR10-2001-7001662A
Authority: KR
Inventors: 타카기가즈히로; 요시오카유우이치
Original assignee: 토요 덴카 코교 가부시키가이샤; 도쿠리츠교세이호진 노교간쿄기쥬츠겐큐쇼; 타카기 가즈히로
Priority date: 1999-06-22
Filing date: 1999-06-22
Publication date: 2004-07-27
Anticipated expiration: 2019-06-22
Also published as: WO2000078923A8; WO2000078923A1; EP1106682A4; AU751850B2; CA2342805A1; JP3773449B2; AU4169599A; US6569333B1; KR20010106434A; EP1106682A1

Abstract

본 발명은, 예로서 농약등의 유기 화합물로 오염된 토양에 있어서, 그 유기화합물을 분해균에 의해 분해하므로써, 토양을 회복하여 지하수의 오염을 방지하는 것을 목적으로 하고 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정의 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균을, 해당 유기 화합물을 흡착시키는 것이 가능하고 또한 해당 분해균이 붙어 성장하기 용이한 상태의 세공이 무수히 존재하는 다공질재에 집적시키는, 분리한 분해균의 집적방법에 있어서, 다공질재에 당해 분해균만을 접종하고, 접종된 다공질재로 이루어진 집적층을 형성하여, 이 집적층에 상기 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 배지를 환류시키므로써, 해당 분해균을 다공질재에 상승된 정도로 집적시키고, 그에 따라 얻은 분해균 보지담체를 직접 오염토양에 이설하였다.

Description

분해균 보지담체의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING CARRIER HOLDING DEGRADING BACTERIUM}

종래부터 농약 등의 유기화합물로 오염된 토양을 분해균에 의해 회복시키는 것이나, 그 유기화합물에 의한 지하수 오염의 방지를 도모하는 것은 유용한 기술로서 생각되어 왔다. 예로서, 토양중에 생식하는 미생물 중에는 농약 등의 유기화합물을 분해하거나 무해하게 만드는 분해균이 존재하고, 이와같은 분해균의 능력을 이용하면 농약 등의 오염물질을 토양중에서 제거하는 것이 가능하다.

그러나, 자연 상태에서는 특정 유기화합물에 대한 분해능력이 있는 분해균의 밀도가 낮아, 오염물질이 환경내에 잔류되거나 확산되는 것을 효율적으로 방지하는 정도까지는 도달하지 않는 것이 통상적이다.

그 때문에, 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 분해균을 분해활성을 가진 상태로 보다 밀도높게 집적하는 것이 가능하다면, 오염된 토양의 회복이나 지하수 오염 방지를 효율적으로 실현시키는 것이 가능하다.

그러나, 종래부터 수행되고 있는 분해균의 배양방법, 예로서 특정 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 액체배지나 고체배지에 특정 분해균만을 접종시켜 증식시키는 방법에서는, 특정 분해균만을 고밀도로 배양할 수 있어, 그 배양된 분해균만을 오염토양과 같은 환경중에 직접 적용시킨다 해도, 그 분해 활성을 장기간 안정적으로 발현하는 것은 거의 이룰 수 없는 것으로 알려져 왔다.

이는, 특정 분해균만을 오염토양에 직접 적용한 경우, 오염토양의 이화학성질의 영향을 받기도 하고, 오염토양중에 다수 생식하는 원생동물 등으로부터의 포식 또는 다른 미생물과의 경합에 의해 적합한 위치(주거;niche)를 획득하지 못하는 것 등에 의해, 특정 분해균이 사멸하기 때문이다. 또한, 특정 분해균의 영양원(탄소원 및 질소원)이 되는, 목적의 유기화합물이 토양 고상(固相)에 흡착하여 특정 분해균에 공급되지 않는 상태, 즉, 미생물학적 이용성(bioavailability)이 낮은 상태여서, 그 특정 분해균에 의한 분해활성의 발현이 유지될 수 없게 되기 때문이기도 하다.

본 발명은, 예로서 농약 등의 유기화합물로 오염된 토양에 있어서, 그 유기화합물을 분해균에 의해 분해하므로써 토양을 회복하고, 그리고 지하수의 오염을 방지하는 기술에 관한 것으로, 특히, 토양중에 포함된 난분해성 유기오염물질을 분해할 수 있는 종류의 분해균만을 신속하고도 효율적으로 집적, 분리하는 기술 및 분리한 분해균을 집적한 분해균 보지담체를 직접 오염토양에 적용하므로써, 오염토양을 회복하고, 지하수 오염의 방지를 도모하는 기술에 관한 것이다.

발명의 개시

본 발명은 이와 같은 이유를 배경으로 하였으며, 그 목적은 특정 유기화합물에 대한 분해능력이 있는 종류의 분해균을 분해활성이 장기간 안정적으로 발현하는 상태로, 신속하고도 효율적으로 집적할 수 있는 기술을 제공하는 데 있으며, 또한 그 분해균을 집적한 분해균 보지담체를 이용하여 오염토양중의 유기화합물을 분해하고, 오염토양을 회복하여 지하수의 오염방지를 수행하는 것에 있다.

본 발명은 본 발명자들이 이전에 제안한 개량토양환류법(특원평 9-30176호)의 연구에 따라 얻은 새로운 가능성에 기초하고 있다. 본 발명자들이 제안한 개량토양환류법이라는 것은 특정 유기화합물을 흡착하는 기능이 있고, 또한 이 유기화합물에 대한 분해능력을 가진 분해균이 정주하기 용이한 상태의 세공을 무수히 갖고 있는 다공질재를 사용하여, 이 다공질재와 해당 분해균이 생식하는 토양에 의해 집적용 토양층을 형성하고, 이 집적용 토양층에 목적하는 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염배지를 연속적으로 환류시키므로써, 분해균을 상기 다공질재에 신속하게 집적시킨다는 것이다.

이에 의해 본 발명자들은 종래의 토양환류법으로는 실현될 수 없었던 분해균의 집적, 분리속도를 대폭 향상시킨 것이다. 요컨대, 이러한 개량토양환류법에서는 다공질재가 무기염배지에 포함된 탄소원과 질소원, 즉 토양의 오염물질에 존재하는 유기화합물을 그 무수한 세공 내에 효율적으로 흡착하여, 그 세공이 제공하는 바람직한 조건에 따라 세공 내에서, 흡착된 유기화합물을 영양원(탄소원 및 질소원)으로 하여 분해균이 활발하게 증식하고 활동하게 되어, 이러한 것들이 협동하여 세공내에 효율적으로 흡착된 유기화합물을 세공내의 분해균이 효율적으로 자화분해하여, 신속한 집적이 실현되는 것이다.

이러한 개량토양환류법에 의해 다공질재에 집적되어 있는 분해균은, 특정 유기화합물에 대한 분해능력을 가지는 종류의 분해균이 선택적으로 집적되어있는 상태이기는 하다. 그러나, 이렇게 하므로써 다공질재에 집적된 분해균은 실제로는 분해에 직접 기여하지 않는 많은 종류의 세균과 혼재되어 있는 상태에 있다.

그래서, 특정 유기화합물을 분해하는 것이 가능한 종류의 분해균만을 정제시킨 상태에서 집적하기 위하여, 본 발명자들은 상기 개량토양환류법의 응용을 시도하였다. 구체적으로는, 먼저 상기 토양환류법에 의해 분해에 직접 기여하지 않는 많은 종류의 세균과 혼재되어 있는 상태에서, 특정의 분해균이 집적되어 있는 다공질재를 접종원으로서, 새로운 다공질재(분해균이 집적되지 않은 상태의 것)에 접종하고, 그 특정 분해균의 영양원이 되는 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염배지를 환류시켜서, 새로운 다공질재 내에 특정 분해균만을 순화토록 하여 집적을 수행하였다.

이와같이 순화하여 다공질재에 집적된 분해균은 단독의 분해균으로 존재하는 경우도 고려되지만, 통상적으로 2~3종류의 분해균이 존재하고 있는 상태이기 때문에, 또한 특정 유기화합물을 분해하는 분해균만을 집적하기 위하여, 그런 순화한 분해균이 집적되어 있는 다공질재를 분쇄하여 인산 버퍼에 희석한 액을, 특정 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 한천배지에 혼합하여 넣어, 무기염 한천배지에 형성된 분해활성이 높은 부분(클리어 존; clear zone)으로부터 균을 모아서 특정의 분해균만을 분리하였다.

그리하여, 무기염 한천배지에 형성되는 클리어 존으로부터 떼어 분리한 특정 분해균만을 접종원으로서 새로운 다공질재에 접종하고, 그 다공질재에 특정 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염배지를 환류시켰다. 그 결과, 최종적으로 다공질재에는 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균만이 극히 순화된 상태로 고밀도로 집적될 수 있다는 것이 판명되었다. 그리고, 이에 따라 다공질재에 극히 순화된 상태로 고밀도로 집적된 분해균은 다공질재에 흡착되는 유기화합물을 안정시켜 분해하는 것이 판명되었다.

이상과 같은 본 발명자들의 연구결과로부터, 다음과 같은 분해균의 집적기술이 가능하다는 것이 판명되었다. 먼저, 청구항 1에 기재한 것과 같이, 특정 유기화합물과 함께 해당 분해균이 정주하기 용이한 세공을 무수히 가진 다공질재에 해당 분해균만을 접종하고, 그 접종된 다공질재로부터 집적용층을 형성하고, 그 집적용층에 상기 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염배지를 환류시킨다.

이로써, 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균만을 신속하고 효율적으로, 고밀도로 다공질재에 집적할 수 있다. 그리고, 이와같이 하여 다공질재에 집적된 분해균은 다공질재에 흡착되는 유기화합물에 대하여 안정된 분해활성을 발현유지할 수 있는 것이다.

이상 및 이하에서, 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균이라는 것은, 많은 종류의 분해균이 혼재하여 있는 경우를 비롯하여 단독의 분해균만이 존재하는 경우도 포함하는 개념으로서 사용된다.

특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균만을 다공질재에 접종하는데에는, 그와같은 분해균만을 특정하는 것이 요구되어진다. 이런 경우에는, 청구항 2에 기재한 것과 같이, 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균을 포함하는 세균군을 해당 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 한천배지에 접종하고, 무기염 한천배지중에 형성되는 분해활성이 높은 부분(클리어 존)으로부터 균을 떼어내어 분리한 분해균만을 접종하는 것이 바람직하다.

무기염 한천배지에 형성되는 분해활성이 높은 부분, 즉, 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균이 생식하고 있는 부분으로부터 균을 떼어내어 분리한 것, 예로서, 클리어 존 부분을 무기염 한천배지와 함께 절취해낸 것을 다공질재에 접종하면, 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균만을 다공질재에 신속하고 효율적으로 집적할 수 있다. 소위 액체배지에서 분리한 분해균을 증식시켜 접종하는 방법도 있으나, 현 시점에서 본 발명자들의 연구에 의하면 무기염 한천배지에서 형성된 클리어존을 한천과 함께 절취하여 접종하는 방법이 본 발명에서 확실하게 효과적인 집적을 수행하는 것으로 확인되었다.

또한, 특정 유기화합물이 오염토양에 포함될 수 있는 유기오염물질이고, 이 유기오염물질을 분해할 수 있는 종류의 분해균만을 오염토양중으로부터 선택하여 집적하는 경우에는, 청구항 3에 기재한 것과 같이, 상술된 개량토양환류법에 따라 얻은 분해균을 집적한 집적완료 다공질재를 집적용 토양층으로부터 취해내고, 이 집적용 토양층에 해당 유기오염물질만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 배지를 환류시키므로써 상기 다공질재에 해당 분해균을 집적시키고, 이 집적완료 다공질재를 집적용 토양층으로부터 취해내어, 이 취해낸 집적완료 다공질재에 흡착된 토양을 제거하는 세정처리를 하고, 세정처리를 한 집적완료 다공질재를 접종원으로서 새로운 다공질재만으로 형성된 집적용층에 접종하고, 그 집적용층에 해당 유기오염물질만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염배지를 환류시켜, 새로운 다공질재에 순화하여 집적된 세균군을 사용하고, 청구항 2에 기재한 무기염 한천배지를 이용하여 분리하는 것이 바람직하다.

이와같이 하여, 특정 유기오염물질에 대하여 높은 분해활성을 갖는 분해균만을 오염토양내에 생식하는 세균들로부터 선택하여, 신속하고 효율적으로, 그리고 고밀도로 다공질재에 집적할 수 있는 것이다. 이는, 토양 오염물질로 알려져 있는 농약 등의 유기염소계 화합물을 분해하는 경우에 효율적이며, 본 발명자들의 연구에 따라, 난분해성 유기염소계 화합물에 존재하는 시마진(CAT) 및 킨토젠(Quintozene)(PCNB)을 함께 사용하고 있는 토양을 이용하므로써 실증된 것이다.

본 발명에 따른 분리한 분해균의 집적방법에 의해, 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균만이 집적된 다공질재는, 분해균 보지담체로서 다음과 같은 잇점을 갖고 있다. 이러한 잇점은 분해균이 매우 취급하기 쉽게 된다는 것과, 토양에의 적용이 용이하게 수행된다는 것이다. 또한, 다공질재로서 목탄등의 목질재를 사용하는 경우, 직접 적용하는 토양에 악영향을 미치지 않는다는 것과, 오염물질에 존재하는 유기화합물질을 효율적으로 흡착하는 특성을 갖는 점을 들 수 있다.

그리하여, 청구항 6에 기재한 것과 같이, 본 발명에 관련된 분리한 분해균의 집적방법에 의해 얻은 특정의 분해균만을 집적한 다공질재를 분해균 보지담체로서 목적하는 유기화합물을 포함하는 오염토양에 이설하고, 오염토양중에 존재하는 유기화합물을 분해하여, 오염토양의 회복 및 지하수 오염을 방지할 수 있는것이다.

본 발명에 관련된 분해균 보지담체를 오염토양에 이설하는 경우, 오염토양과 잘 혼화시켜 이설하는 것이 바람직하다. 이와 같이 잘 혼화하여 오염토양에 이설하면, 오염토양과 분해균 보지담체와의 접촉이 밀접하게 되어, 목적하는 유기화합물이 다공질재에 고루 흡착되어지기 때문이다. 또한, 분해균 보지담체를 이설한 오염토양에, 목적하는 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 배지를 환류하는 것도 바람직하다. 이와같이 하면, 신속하고 효율적으로 오염토양의 회복처리가 수행되기 때문이다. 그리고, 이와 같은 무기염 배지의 환류를 수행하지 않아도, 살수 및 비의 침투에 의하여 오염토양에 포함된 유기화합물이 토양내에서 유동하기 때문에, 단지 본 발명에 관련된 분해균 보지담체를 이설해놓기만 해도, 오염토양에 포함된 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 것이다.

이와같이 본 발명에 따른 분해균 보지담체를 직접 오염토양에 이설하여도, 다공질재에 집적된 특정 분해균에 의해, 오염토양중의 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 것은 다음과 같은 이유에 의한 것이라고 생각된다.

먼저, 본 발명에 따른 분해균 보지담체에는 다공질재의 세공내에 분해균이 생식하고 있기 때문에, 다공질재가 소위 은신처(shelter)의 역할을 하여, 오염토양의 이화학 성질의 영향 및 오염토양에 다수 생식하는 원생동물 등의 포식, 다른 미생물과의 주거 획득의 경합 등으로부터, 그 집적된 특정 분해균을 보호하는 것으로 추측되고 있다. 그리고, 다공질재가 오염토양중의 유기화합물을 효율적으로 흡착하기 때문에, 특정 분해균의 영양원(탄소원 및 질소원)이 세공내에 공급되게 되고, 미생물학적 이용성이 높은 상태가 되어, 안정적으로 분해활성을 발현유지할 수 있는 것으로 추측되고 있다.

따라서, 본 발명에 의하면 오염토양의 회복처리를 신속하고 효율적으로 수행하게 되며, 농약 등의 유기화합물이 다시 오염토양에 살포되더라도, 분해균 보지담체를 오염토양중에 이설하여두면, 살포와 동시에 유기화합물은 분해되어 토양중에의 잔류나 확산이 방지된다. 그리고, 토양중의 유기화합물이 지하수에 혼입되는 것도 피할 수 있어, 지하수 오염의 방지 또한 도모하는 것이 가능하게 된다. 이와같은 본 발명의 특징으로부터 다음과 같은 응용을 생각할 수 있다. 예로서, 물과 관련해서는, 생활배수로, 수경밭 지대의 농업배수로, 골프장의 배수로 등, 토양과 관련해서는, 환경오염물질 등이 존재하는 표층 및 하층 토양, 골프장의 그린(green)면의 하층토양, 산업폐기물 처리장의 하층토양, 공장 등에 있어서의 유기폐액 유치장소의 하층 토양 등, 또한 토양ㆍ물에 관련되어서는, 유출기름 오염 해안 지역의 토양 등에 본 발명과 관련된 분해균 보지담체를 직접 적용하여 환경보전이 충분히 도모된다.

이상의 설명된 본 발명에 있어서의 현상은, 미생물을 이용하는 기술분야에서, 세계적으로 보아도 극히 드문 사례이다. 그 때문에, 전 지구적인 규모로 확대하는 환경오염을 짧은시간에 신속히 방지하여, 오염환경을 회복(bioremediation)하는 것이 간절히 요구되는 오늘날에 있어서, 본 발명은 특히 유익한 기술이라고 할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은, 시마진의 구조식이다.

도 2는, 본 실시형태에서 사용된 각 인공 마이크로서식지(microhabitat)의 물성표이다.

도 3은, 본 실시형태의 집적ㆍ분리 및 분해시험에 사용하는 환류장치의 모식도이다.

도 4는, 본 실시형태의 집적ㆍ분리에 사용하는 환류장치의 모식도이다.

도 5는, 분해시험에 사용된 공시 토양의 이화학성을 나타내는 표이다.

도 6은, 시마진 분해균 보지담체가 인공 마이크로서식지 A를 사용한 경우의 시마진의 분해상태를, 시마진 농도, 클로라이드(chloride) 농도, 니트레이트(nitrate) 농도로 관측한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7은, 시마진 분해균 보지담체가 인공 마이크로서식지 B를 사용한 경우의 시마진의 분해상태를, 시마진 농도, 클로라이드 농도, 니트레이트 농도로 관측한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 8은, 시마진 분해균 보지담체가 인공 마이크로서식지 C를 이용한 경우의 시마진의 분해상태를, 시마진 농도, 클로라이드 농도, 니트레이트 농도로 관측한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 9는, 미집적 인공 마이크로 서식지 A를 이용한 경우에 있어서, 시마진의분해상태를, 시마진 농도, 클로라이드 농도, 니트레이트 농도로 관측한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 10은, 미집적 인공 마이크로 서식지 B를 이용한 경우에 있어서, 시마진의 분해상태를 시마진 농도, 클로라이드 농도, 니트레이트 농도로 관측한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 11은, 킨토젠의 구조식이다.

도 12는, 킨토젠의 분해균 보지담체가 인공 마이크로서식지 A를 이용한 경우의 킨토젠의 분해상태를, 킨토젠 농도, 클로라이드 농도, 니트레이트 농도로 관측한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 13은, 미집적 인공 마이크로서식지 A를 이용한 경우에 있어서, 킨토젠의 분해상태를, 킨토젠 농도, 클로라이드 농도, 니트레이트 농도로 관측한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 14는, 킨토젠의 분해시험 후의 킨토젠 잔류량을 측정한 결과를 나타내는 표이다.

도 15는, 킨토젠의 분해시험에 있어서 환류액 내의 킨토젠 분해균의 유출량을 측정한 결과를 나타내는 표이다.

부호의 설명

1 토양층 탱크

1' 집적층 탱크

2 집적용 토양층

2' 집적용층

2" 분해용 토양층

3 무기염 배지

4 저장액 탱크

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하 본 발명의 실시형태에 관해서 설명한다. 먼저, 제 1의 실시형태로서 난분해성 유기염소계 농약인 시마진(CAT)의 경우에 관해 설명한다.

제 1 실시형태: 본 발명자 등이 제안하는 개량토양환류법에 의한 시마진을 분해하는 분해균의 집적은, 이하의 표 1에 나타낸 조건으로 수행하였다.

또한, 집적할 때 이용된 다공질재(이하, 인공 마이크로서식지라고 함)는 도 2에 나타낸 물성을 각각 갖는 인공 마이크로서식지 A~C를 사용하였다. 도 2의 인공마이크서식지 A~C는 이하의 표 2에 나타내고 있다.

제 1 실시형태에 있어서 시마진을 분해하는 분해균은, 우선, 집적용 공시토양으로부터 다음과 같이 하여 인공 마이크로서식지 B에 집적하였다. 도 3에 나타나는 것과 같이, 용량 500㎖의 토양층 탱크(1)에 집적용 토양층(2)을 형성하였다. 이 집적용 토양층(2)은, 5~10㎜ 정도로 분쇄한 인공 마이크로서식지 B 2g을 집적용 공시토양 40g에 혼입하여 형성시킨 것이다. 그리고, 공시농약 시마진을 유일한 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염배지(3)(시마진 농도 5㎎/l, 액량 300㎖)를 저장액 탱크(4)로부터 집적용 토양층(2)으로 환류시켜, 25℃ 암소에 집적하였다. 환류액인 무기염배지(3)는 매 1주마다 새로운 것으로 교환하고, 약 3주동안 집적을 수행하였다.

이러한 집적처리를 수행한 후에, 집적용 토양층(2)으로부터 인공 마이크로서식지 B를 취해내어, 이를 멸균증류수에 침적하여 초음파 세정처리하므로써 부착된 토양의 제거를 수행하였다. 그리고, 이러한 세정처리후 집적완료 인공 마이크로서식지 B로부터 시마진을 분해하는 분해균(이하, 시마진 분해균이라고 함)만을 분리, 집적하는 처리는 다음과 같이 수행되었다.

도 4에 나타낸 것과 같이, 5~10㎜ 정도로 분쇄된 미집적 인공 마이크로서식지 B만을, 용량 500㎖ 집적용 탱크(1')에 7.5g을 충진하여 집적용층(2')을 형성하였다. 그리고 상기한 집적완료 인공 마이크로서식지 B를 이 집적용층(2')에 접종하고, 시마진을 유일한 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 배지(3)(시마진 농도 5㎎/l, 액량 300㎖)를 저장액 탱크(4)로부터 집적용층(2')에 환류시켜, 25℃의 암소에서 집적을 수행하였다. 환류액인 무기염 배지(3)는, 매 1주마다 새로운 것으로 교환하고, 약 3주동안 집적을 수행하였다. 이와같이 하여, 집적용층(2')에 충진되어있는 새로운 인공 마이크로서식지 B에, 어느정도 순화한 상태의 시마진 분해균을 집적하였다.

그 후, 이 순화한 상태의 집적완료된 인공 마이크로서식지 B 1.0g을 분쇄하여, 인산완충액에 적당히 희석하였다. 그리고, 시마진을 유일한 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 한천배지에 이 희석액을 혼합하여 섞었다. 배양한지 2~3주 후에 평판배지에 형성된 클리어 존으로부터 균을 모아서, 동일한 조성의 무기염 한천배지에 다시한번 접종하여 배양하는 조작을 수행하였다. 이 조작을 2~3회 되풀이하고, 최종적으로 무기염 한천배지에 형성된 클리어존의 부분을 무기염 한천배지와 함께 2~3개 절취해내어, 접종원으로 하였다. 이 때 클리어존 부분을, 시마진을 유일한 탄소원 및 질소원으로 하는 액체 배지에 접종하여 배양한 후, 미리 고화시켜 둔 육즙 엑기스 한천배지상에 배양액의 일회 백금이 선을 긋고, 단일 콜로니가 형성되어 있는 것을 관측하고, 시마진 분해균만이 분리되어지는 것을 확인하였다.

또한, 멸균처리(오토클레이브 처리)한 새로운 인공 마이크로서식지 A~C의 각7.5g을 멸균 증류수에 세정처리한 후, 부착되는 염소의 제거처리를 하고, 그 멸균 및 염소 제거처리를 한 새로운 인공 마이크로서식지 A~C 각각을 도 4에 나타낸 집적용 탱크(1')에 충진하여, 집적용층(2')을 형성하고, 먼저 접종원으로서 절취해 낸 것을 클리어존마다(무기염 한천배지와 함께) 균주로서 집적용층(2')에 접종하였다. 그 후, 시마진을 유일한 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 배지(3)(시마진 농도 5㎎/l, 액량 300㎖)를 저장액 탱크(4)로부터 집적용층(2')에 환류시켜 25℃의 암소에서 집적을 수행하였다. 환류액인 무기염배지(3)는, 매 1주마다 새로운 것으로 교환하고, 3주간 집적을 수행하였다. 이 집적 처리동안에는, 시마진 농도와 Cl^-농도를 측정하여, 시마진 분해균의 집적상황을 확인하였다.

여기에서 특별히 나타내지는 않지만, 상기한 새로운 인공 마이크로서식지 A~C 각각으로 수행한 집적처리에서는 환류 2주째 이후에 있어서 환류액중의 시마진 농도가 격감하고, 시마진의 분해산물인 Cl^-농도가 상승하는 현상이 생겨, 분명하게 시마진 분해균이 새로운 인공 마이크로서식지 A~C 각각에 집적되어 있는 것을 확인하였다.

이상과 같이 하여, 인공 마이크로서식지 A~C 각각에 시마진 분해균을 집적하므로써, 시마진 분해균 집적 보지담체를 형성하였다. 이후, 이 시마진 분해균 집적 보지담체를 직접 오염토양에 처리하여, 오염토양 중의 시마진을 분해한 분해시험결과에 관해서 설명한다. 공시토양으로서는, 도 5에 나타낸 이화학성을 나타내는 시마진이 사용되어 있는 골프장으로부터 채취한 것을 사용하였다. 따라서, 이 골프장으로부터 채취한 공시토양에는 약간의 시마진이 포함되어 있다.

이 공시토양에, 시마진을 5㎎/㎏ d.s.이 되도록 첨가하여 분해용 오염토양으로 하였다. 이 분해용 오염토양중의 시마진의 분해는 분해용 오염토양 40g에 대하여 시마진 분해균 집적 보지담체로 이루어진 인공 마이크로서식지 A~C를 건조중량으로 0.5g을 잘 혼화시켜 도 3에 나타낸 토양층 탱크(1)에 충진하여, 분해용 토양층(2")을 형성하였다. 멸균증류수 500㎖로 1일간 환류를 수행하여 분해용 오염토양층과 시마진 분해균 집적 보지담체가 갖고 있는 Cl^-의 제거처리를 수행한 후, 시마진을 유일한 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염배지(3)(시마진 농도 5㎎/l, 액량 300㎖)를 저장액 탱크(4)로부터 분해용 토양층(2")으로 환류시켜, 25℃의 암소에서 시마진의 분해상태를 확인하였다. 환류액인 무기염배지(3)는 약 1주마다 새로운 것으로 교환하고, 3주동안 집적을 수행하였다. 비교를 위하여, 미집적 인공 마이크로서식지와 분해용 오염토양을 잘 혼화하므로써 분해용 토양층(2")을 형성하여, 상술한 같은 조건에서 시마진의 분해상황을 확인하였다.

이 시마진의 분해상황에 있어서는, 환류액중의 시마진 농도, 시마진의 분해부산물인 C1^-(클로라이드)와 NO₃ ^-(니트레이트)의 농도를 시간에 따라 측정하여 확인하였다. 도 6~도 8에 나타낸 그래프는 시마진 분해균 집적 보지담체의 경우이고, 도 9~도 10은 미집적 인공 마이크로서식지의 경우를 나타내고 있다.

도 6은 시마진 분해균 집적 보지담체로서 인공 마이크로서식지 A를 이용한 경우, 도 7은 시마진 분해균 집적 보지담체로서 인공 마이크로서식지 B를 이용한경우, 도 8은 시마진 분해균 집적 보지담체로서 인공 마이크로서식지 C를 이용한 경우를 각각 나타내고 있다. 그리고, 비교예로서 수행한 도 9는 미집적 인공 마이크로서식지 A를 이용한 경우, 도 10은 미집적 인공 마이크로서식지 B를 이용한 경우를 각각 나타내고 있다.

도 6~도 8로부터, 시마진 분해균 집적 보지담체를 이용한 경우에는, 첫번째 환류액 교환 이후에 환류액 중의 시마진 농도는 격감하여, 거의 측정할 수 없는 정도로 되어 있었다. 그리고, 시마진의 분해 부산물인 Cl^-의 농도에 주목하면, 시마진 5㎎/l이 완전분해한 경우에 발생하는 이론 Cl^-농도 0.88㎎/l에 점점 가까운 농도로 되는 것이 확인되었다. 이러한 모든 것으로부터, 시마진 분해균 집적 보지담체를 사용한 경우, 분해용 오염토양중의 시마진은 서서히 완전하게 분해되어지는 것이 판명되었다. 또한, 각각의 분해시험에 있어서, 3주간 환류한 후의 분해용 오염토양 중의 시마진 잔류량을 측정한 결과, 검출한계(0.01㎎/l) 이하인 것이 확인되었다.

한편, 도 9~도 10에 나타나는 바와 같이, 미집적 인공 마이크로서식지 A와 B를 분해용 오염토양에 혼화하여 이설하여도, 시마진 농도는 별로 감소되지 않고, 분해 부산물인 Cl^-의 농도의 증가도 확인되지 않았다. 따라서, 시마진의 분해는 일어나지 않는 것으로 판명되었다.

이어서, 제 2 실시형태로서 난분해성인 유기염소계 농약 킨토젠(PCNB)의 경우에 대하여 설명한다. 킨토젠의 구조식을 도 11에 나타내었다.

제 2 실시형태: 킨토젠의 집적ㆍ분리조작 및 킨토젠 분해균 집적 보지담체의형성에 대해서는 제 1 실시형태의 시마진에서 설명한 것과 동일한 조작으로 수행되므로, 다시말하면 제 1 실시형태의 설명중에서 시마진 부분을 킨토젠으로 치환하는 것과 같기 때문에, 상세한 설명은 생략한다. 단지, 킨토젠의 분해용 오염토양은 시마진의 경우와 같은 골프장으로부터 채취한 것을 공시토양으로 하여, 킨토젠을 10㎎/kg d.s.이 되도록 첨가하여 만든 것을 사용하였다. 또한, 환류액으로서는 킨토젠 농도 0.5㎎/l의 것을 사용하였다.

도 12 및 도 13은 킨토젠의 분해상황을 관측한 분해시험 결과를 나타내는 것이다. 도 12는 킨토젠 분해균 집적 보지담체가 인공 마이크로서식지 A를 이용한 경우를, 도 13은 비교예로서, 미집적 인공 마이크로서식지 A를 이용한 경우의 것을 나타내고 있다.

도 12에 나타낸 것과 같이, 킨토젠 분해 집적 보지담체를 이용한 경우, 첫번째 환류액 교환 후, 환류액 중의 킨토젠 농도가 격감하여, 두번째 환류액 교환후에는 킨토젠이 거의 측정되지 않았다. 또한, 킨토젠의 분해부산물인 Cl^-의 농도에 주목하면, 킨토젠 0.5㎎/l이 완전분해된 경우에 발생하는 이론 Cl^-농도 0.3㎎/l을 넘는 농도치로 되어있는 것이 확인되었기 때문에, 킨토젠은 완전하게 분해되는 것이 판명되었다. 한편, 도 13에 나타낸 것과 같이, 미집적 인공 마이크로서식지 A를 분해용 공시토양에 혼화하더라도, 킨토젠 농도는 감소하는 경향을 나타냈지만, 분해부산물인 Cl^-의 농도증가는 완전히 확인되지 않았기 때문에 킨토젠의 분해는 거의 일어나지 않은 것이 판명되었다.

도 14에는, 도 12 및 도 13에 나타낸 킨토젠의 분해시험을 위한 환류처리를 수행한 후, 각 분해용 오염토양, 킨토젠 분해균 집적 보지담체, 비교예로서 사용된 미집적 인공 마이크로서식지 A, 각각에 포함된 킨토젠의 잔류량을 조사한 결과를 나타내고 있다. 도 14에 나타낸 것과 같이, 킨토젠의 분해를 수행한 분해용 오염토양에는, 초기농도 10㎎/kg d.s.의 킨토젠이 포함되어 있었다. 그러나, 킨토젠 분해균 보지담체를 사용하는 분해시험을 수행한 후의 분해용 오염토양에는 0.035㎎/kg d.s.의 극미량만이 잔류되어 있었다. 또한, 분해용 오염토양에 이설한 킨토젠 분해균 집적 보지담체중에도, 킨토젠이 0.004㎎/kg d.m.으로 거의 잔류되어있지 않은 것이 확인되었다. 이처럼, 킨토젠 분해균 집적 보지담체를 사용한 경우, 킨토젠의 분해제거율은 99.61%에 이르는 것이 판명되었다. 한편, 비교예로서 미집적 인공 마이크로서식지 A를 사용한 경우에는, 분해시험 후에 분해용 오염토양 중에 킨토젠이 8.70㎎/kg d.s. 잔류되어 있고, 미집적 인공 마이크로서식지 A 중에도 0.32㎎/kg d.m.으로 잔류되어 있는 것이 확인되었다. 이 경우의 분해제거율을 산출해보았더니, 9.84% 밖에 되지 않았으며, 킨토젠은 거의 분해되어있지 않은 것이 확인되었다.

또한, 환류액 중에의 분해균 유출의 유무를 조사한 결과에 대해 설명한다. 도 15는, 도 12 및 도 13에서 나타낸 킨토젠의 분해시험에 있어서, 각각의 환류액중에 포함된 킨토젠 분해균의 균수를 매 각 주마다 측정한 결과를 나타내고 있다. 도 15를 보면 알 수 있듯이, 어느쪽의 경우에 있어서도 환류액중에 킨토젠 분해균은 확인되지 않았다. 이에 의해, 킨토젠을 분해하는 분해균은 인공 마이크로서식지내부로부터 유출되어 토양 내에 확산되지 않는 것이 판명되었다. 따라서, 본 실시형태에 있어서의 분해균 집적 보지담체를 직접 오양토양에 이설하여도, 킨토젠 분해균 자체의 유출이 없기 때문에, 세균에 의한 지하수의 오염을 일으키는 것도 없는 것으로 확인되었다.

마지막으로, 킨토젠을 분해하는 분해균에 대해 설명하면, 본 발명자들은 이 분해균의 동정을 끝내어 두고, 그 분해균은 학명 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia KTYY97 수탁일 1998년 5월 18일 생명공학연구소 국내수탁번호 FERM P-16809호, 그 후 1999년 5월 14일에 국제기탁으로 이관 국제수탁번호 FERM BP-6721으로 변경완료)이다. 이 분해균의 특성에 대해서는, 본 발명자들에 의한 특허원 평성 10년 제 135156호(특허번호 특허 제 2904432호)에 기재되어 있다.

산업상 이용가능성

이상 설명한 것과 같이 본 발명에 의하면, 특정 유기화합물에 대한 분해능력이 있는 종류의 분해균을 분해활성이 장기간 안정적으로 발현하는 상태로 신속하고 효율적으로 분리ㆍ집적할 수가 있다. 그리고, 그 분해균을 집적한 분해균 보지담체를 직접 오염토양에 적용하고, 오염토양중의 유기화합물을 분해하여, 신속하고 효율적으로 오염토양의 회복 및 지하수의 오염방지를 수행하는 것이 가능하게 되기 때문에, 오염환경의 수복(바이오리메디에이션)을 보다 촉진시킬 수 있다.

Claims

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특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균을 높은 집적도의 상태로 보지하는 분해균보지담체의 제조방법에 있어서,

상기 유기화합물을 흡착할 수 있고, 상기 유기화합물을 분해할 수 있는 분해균이 정주하기 용이한 세공을 다수 갖는 다공질재에 상기 분해균만을 접종하고, 상기 분해균을 접종한 다공질재로 이루어진 집적용층을 형성하여, 이 집적용층에 상기 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 배지를 환류시키는 것을 특징으로 하는, 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 분해균을 높은 집적도의 상태로 보지하는 분해균보지담체의 제조방법.
제 7항에 있어서, 특정 유기화합물을 분해할 수 있는 종류의 분해균을 포함하는 세균군을, 상기 유기화합물만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 한천배지에 접종하고, 무기염 한천배지중에 형성된 분해활성이 높은 부분(클리어 존)으로부터 균을 모아 분리한 분해균만을 접종하도록 하는 것을 특징으로 하는 분해균보지담체의 제조방법.
제 8항에 있어서, 특정 유기화합물은 토양에 포함될 수 있는 유기오염물질이고, 상기 세균군은

상기 유기오염물질을 분해할 수 있는 종류의 분해균이 생식하는 토양에 상기 분해균이 집적되지 않은 다공질재를 혼입시켜 집적용 토양층을 형성하고, 이 집적용 토양층에 상기 유기오염물질만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 배지를 환류시켜 상기 다공질재에 상기 분해균을 집적시키고,

이 집적완료된 다공질재를 집적용 토양층으로부터 취해내어, 이 취해낸 집적완료 다공질재에 부착된 토양을 제거하는 세정처리를 하고,

이 세정처리를 한 집적완료 다공질재를 분해균이 집적되지 않은 새로운 다공질재만으로 형성된 집적용층에 접종하고,

이 집적용층에 상기 유기오염물질만을 탄소원 및 질소원으로 하는 무기염 배지를 환류시켜 상기 새로운 다공질재에 상기 분해균을 순화시켜 얻은 것임을 특징으로 하는 분해균보지담체의 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 유기오염물질은 난분해성의 유기염소계 화합물인 것을 특징으로 하는 분해균보지담체의 제조방법.
제 10항에 있어서, 난분해성 유기염소계 화합물이 시마진 또는 킨토젠중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 분해균보지담체의 제조방법.
제 7항 내지 제 11항중 어느 한 항에 있어서, 다공질재가 목질탄화재인 것을 특징으로 하는 분해균보지담체의 제조방법.