KR100440842B1

KR100440842B1 - 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법

Info

Publication number: KR100440842B1
Application number: KR10-2001-0013544A
Authority: KR
Inventors: 고지 하시모또
Original assignee: 가부시끼가이샤 도시바
Priority date: 2000-03-16
Filing date: 2001-03-16
Publication date: 2004-07-21
Also published as: KR20010090446A; EP1134294A2; EP1134294A3; US6489160B2; US20010024788A1

Abstract

본 발명은 기판상에 고정된 제1의 핵산쇄를 사용하고 상기 제1의 핵산쇄에 따라 제2의 핵산쇄를 합성하고 이 합성된 제2의 핵산쇄를 전계를 이용하여 별도의 어레이 기판상에 고정함으로써 간편하고 또한 저비용으로 핵산쇄 고정화 담체를 제조하는 것이다. 또한, 기판을 전극으로 형성함으로써 전기적인 DNA 검출이 가능한 DNA 담체를 얻는 것이다.

Description

핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법{Method for Preparing a Carrier Immobilized With Nucleic Acid Chain}

본 발명은 소정의 염기 배열을 갖는 핵산쇄를 기판상에 고정화한 핵산쇄 고정화 담체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근, DNA 어레이에 의한 유전자 검사 기술이 주목을 받고 있다 (Beatie et al. 1993, Fodor et al 1991, Khrapko et al. 1989, Southern et al. 1994). 이DNA 어레이는, 수 cm 각의 유리 기판 또는 실리콘 기판의 표면에 배열이 다른 10¹내지 10⁵종류의 DNA 프로브를 고정화하여 이루어지는 담체로 이루어지고 최근 유전자 해석 기술의 발전에 매우 크게 기여하고 있다. 그 원리의 개략은 다음과 같다.

우선, DNA 어레이상에 있어서, 그 DNA 프로브와 형광 색소 또는 방사선 동위원소 (RI) 등으로 표지한 시료 유전자를 반응시킴으로써 DNA 프로브의 염기 배열에 대하여 상보적인 배열을 갖는 시료 유전자를 DNA 프로브에 결합시킨다. 이에 따라 시료 유전자가 어레이상의 DNA 프로브에 대하여 상보적인 배열을 가질 때에는 어레이상의 특정 부위에서 상기 표지에 유래하는 신호를 얻을 수 있다. 따라서, 고정화하여 놓은 DNA 프로브의 배열과 위치를 미리 알고 있으면, 시료 유전자 중에 존재하는 염기 배열을 간단히 조사할 수 있다. 또한 DNA 어레이를 사용하면 1회의 시험만으로 염기 배열에 관한 많은 정보를 얻을 수 있다는 것으로 부터 단순한 유전자 검출 기술에 그치지 않고, 시퀀싱 기술로서도 매우 기대되고 있다 (Pease et al. 1994, Parinov et al. 1996).

한편, 어레이 상으로의 DNA 프로브의 고정화에 관해서는 (1) 어레이 상에서 DNA 프로브의 DNA 쇄를 단위 뉴클레오티드 마다 순차적으로 연장하는 방법 (미국 특허 제5,889,165 호), (2) 미리 합성하여 놓은 DNA 프로브를 어레이 상에 고정화하는 방법 (미국 특허 제 5,807,522 호)의 2 종류가 보고되고 있다. 전자의 방법은 포토리소그래피 기술을 이용하여 1/2 인치 각의 어레이 내에, 배열이 다른 DNA 프로브를 100 Å의 간격으로 20×20 ㎛ 마다 고정화할 수 있기 때문에 약 4 ×1O⁵종류의 프로브로 이루어지는 어레이를 제작할 수 있다(Chee et al. 1996). 포토리소그래피 기술은 현재 O.1 ㎛ 정도의 패터닝도 가능해지고 있으므로 앞으로 더욱 프로브의 집적화가 진행될 가능성이 있다. 또한 후자의 방법은 미리 다종류의 프로브를 준비할 필요가 있다는 것, 프로브의 집적도가 전자의 방법보다 낮다는 (120 ㎛의 간격으로 60×60 ㎛ 마다) 등의 문제는 있지만 겔의 매트릭스 내에 3 차원적으로 프로브를 고정화할 수 있기 때문에 반응 효율면에서는 우수하다 (Guschin et. al. 1997). 또한, 겔 대신에 다공질의 실리콘에 3 차원적 프로브를 고정화하는 방법도 보고 되고 있다 (Beattie et al. 1995).

상기와 같이 DNA 어레이는 1회의 시험으로 복수의 정보를 얻을 수 있다는 등의 이점을 갖고 있지만 그 제작에는 복잡한 반응 제어가 필요하기 때문에 종래의 DNA 어레이는 매우 고가의 것이었다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해서 이루어진 것으로, 그 목적은 종래의 DNA 어레이 제작 기술을 개량하고 비용, 간편성, 감도면에서 우수한 핵산쇄 고정화 담체를 제공하는 것을 가능하게 하는 것이다.

도 1은, 본 발명의 실시예에 있어서, 핵산쇄 고정화 어레이의 제조에 사용하는 전극 기판을 모식적으로 나타낸 도이다.

도 2는, 본 발명의 실시예에 의해 기판 전극을 사용하여 핵산쇄 고정화 어레이를 제조하는 방법의 한 실시 형태를 나타낸 도이다.

도 3은, 본 발명에 의해 기판 전극을 사용하여 핵산쇄 고정화 어레이를 제조하는 방법의 또 하나의 실시 형태를 나타낸 도이다.

도 4는, 본 발명에 의해, 기판 전극을 사용하여 핵산쇄 고정화 어레이를 제조하는 방법의 또 하나의 실시 형태를 나타낸 도이다.

본 발명에서는 상기 목적을 달성하기 위해서 제1 기판상에 고정된 제1 핵산쇄를 소위 주형으로서 사용하고 핵산 프로브쇄가 되는 제2 핵산쇄를 합성하고 이 합성된 제2 핵산쇄를 전계를 이용하여 다른 제2 기판상에 고정함으로써 핵산쇄 고정화 담체를 제조하였다.

즉, 본 발명은 소정의 염기 배열을 갖는 제2 핵산쇄를 제2 기판상에 고정한 핵산쇄 고정화 담체를 제조하는 방법으로:

제1 기판 상에, 상기 제2 핵산쇄의 염기 배열에 대하여 상보적인 염기 배열을 갖는 제1 핵산쇄를 고정화한 제1 핵산쇄 고정화 담체를 준비하는 공정과,

핵산쇄 합성 용액 중에 있어서 상기 제1 핵산쇄 고정화 담체의 제1 핵산쇄에 따라 이것에 상보적인 배열을 갖는 제2 핵산쇄를 합성하는 공정과,

상기 제1 기판의 제1 핵산쇄 측에 대면시켜 제2 기판을 배치하는 공정과,

상기 제2 기판으로부터 상기 제1 기판에 향하는 전계를 인가함으로써 상기 제1 핵산쇄에 따라 합성된 제2 핵산쇄를 상기 제2 기판 표면에 영동시켜 제2 기판표면에 고정화하는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 것이다.

본 발명에 있어서 상기 전계를 인가하는 수단으로서 한쌍의 전극을 사용한다. 이 전극은 상기 제2 기판 및 상기 제1 기판의 외측에 배치하여 사용한다. 또는 상기 제2 기판 및(또는) 상기 제1 기판을 전극 재료로 형성함으로써 전극과 기판을 일체화한 기판 전극으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 핵산 프로브쇄는 복수로 있으며 그들은 같은 배열을 갖는 것일 수 있지만 바람직하게는 각각이 다른 배열을 갖는다. 그 경우 전극과 기판이 일체화한 상기 기판 전극을 사용할 때는 그 기판 전극의 표면을 절연층으로 다수의 전극 영역으로 분할하여 각각의 전극 영역에 다른 핵산 프로브쇄를 고정한다. 또는 동일한 전극상에 다른 프로브를 고정화할 수도 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 핵산쇄는 RNA, DNA, PNA (peptide nucleic acid), 또한 이들의 유사 화합물의 어느 것이어도 좋지만 바람직하게는 DNA이다. 또한 상기 제1 핵산쇄는 특히 한정되는 것이 아니고, 합성 올리고뉴클레오티드, cDNA, RNA, PNA, 메틸포스포네이트 핵산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 제1 기판 및 제2 기판에 있어서, 사용하는 기판 재료는 특히 한정되는 것이 아니다. 예를 들면 유리, 석영 유리, 알루미나, 사파이어, 포르스테라이트, 탄화규소, 산화규소, 질화규소 등의 무기 절연 재료를 사용할 수 있다. 또한 폴리에틸렌, 에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리이소부틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 불포화폴리에스테르, 불소 함유 수지, 폴리염화비닐, 폴리염화비닐리덴, 폴리아세트산비닐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세탈, 아크릴 수지, 폴리아크릴로니트릴, 폴리스티렌, 아세탈수지, 폴리카보네이트, 폴리아미드, 페놀 수지, 우레아 수지, 에폭시 수지, 멜라민 수지, 스티렌·아크릴로니트릴 공중합체, 아크릴로니트릴부타디엔스티렌 공중합체, 실리콘 수지, 폴리페닐렌옥사이드, 폴리술폰 등의 유기 재료를 사용할 수 있다. 또한 니트로셀룰로오스막, PVDF막 등, 핵산 프로팅 (nucleic acid plotting)에 사용되는 막을 사용할 수도 있다.

또한 이하에서 설명하는 전극 재료를 사용하여 기판과 전극을 겸용한 기판 전극으로 할 수도 있다. 이러한 기판 전극의 경우, 기판 전극의 표면을 절연층 영역으로 분리하고 분리된 각각의 전극 영역에, 각각 다른 핵산쇄를 고정하는 것이 바람직하다.

전극 재료는 특별히 한정되는 것이 아니다. 예를 들면 금, 금의 합금, 은,백금, 수은, 니켈, 팔라듐, 실리콘, 게르마늄, 갈륨, 텅스텐 등의 금속 단체 및 이들의 합금, 또는 그라파이트, 글래시카본 등의 탄소 등 또는 이들의 산화물, 화합물을 사용할 수 있다. 또한 산화규소 등의 반도체 화합물이나 CCD, FET, CMOS 등 각종 반도체 디바이스의 사용도 가능하다.

절연 기판상에 전극막을 형성하고 기판과 전극을 일체화한 기판 전극을 사용할 경우, 이 전극막은 도금, 인쇄, 스퍼터, 증착 등으로 제작할 수 있다. 증착을 할 경우는 저항 가열법, 고주파 가열법, 전자빔 가열법에 의해 전극막을 형성할 수가 있다. 또한 스퍼터링을 행할 경우는 직류 2극 스퍼터링, 바이어스 스퍼터링, 비대칭 교류 스퍼터링, 게터 스퍼터링, 고주파 스퍼터링 등에 의해 전극 막을 형성할 수 있다. 또한 폴리피롤, 폴리아닐린 등의 전해 중합막이나 도전성 고분자도 사용이 가능하다.

본 발명에 있어서, 전극 표면을 분리하기 위해서 사용되는 절연 재료는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 포토폴리머, 포토레지스트 재료인 것이 바람직하다. 레지스트 재료로서는, 광 노광용 포토레지스트, 원자외선용 포토레지스트, X선용 포토레지스트, 전자선용 포토레지스트가 사용된다. 광 노광용 포토레지스트로서는 주원료가 환화 고무, 폴리계피산, 노볼락 수지인 것을 들 수 있다. 원자외선용 포토레지스트에는 환화 고무, 페놀 수지, 폴리메틸이소프로페닐케톤 (PMIPK), 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA) 등이 사용된다. 또한 X선용 레지스트에는 COP, 메타크릴레이트 이외에 박막 핸드북 (오옴사)에 기재된 물질을 사용할 수 있다. 또한 전자선용 레지스트에는 PMMA 등 상기 문헌에 기재된 물질의 사용이 가능하다.

여기서 사용하는 레지스트의 막 두께는, 100 Å 이상 10 mm 이하인 것이 바람직하다. 포토레지스트로 전극을 피복하고 리소그래피를 행함으로써 면적을 일정하게 하는 것이 가능해진다. 이에 따라 핵산쇄의 고정화량이 각각의 전극 사이에서 균일해지고 재현성이 우수한 측정이 가능하다. 종래 레지스트 재료는 최종적으로는 제거하는 것이 일반적이지만 기판 전극에서는 레지스트 재료는 제거하는 일 없이 전극의 일부로서 사용하는 것도 가능하다. 이 경우는 사용하는 레지스트 재료에 내수성이 높은 물질을 사용할 필요가 있다. 전극 상부에 형성하는 절연층에는 포토레지스트 재료 이외의 것이라도 사용이 가능하다. 예를 들면 Si, Ti, Al, Zn, Pb, Cd, W, Mo, Cr, Ta, Ni등의 산화물, 질화물, 탄화물, 기타 합금의 사용도 가능하다. 이들 재료를 스퍼터, 증착 또는 CVD 등을 사용하여 박막을 형성한 후 포토리소그래피로 전극 노출부의 패터닝을 하고 면적을 일정하게 제어한다.

본 발명의 방법으로 얻어지는 핵산쇄 고정화 담체는 그 기판으로서 기판 전극을 사용한 경우, 1개의 소자 상에 몇개의 전극 영역을 구성하고 그 각각에 다른 프로브 핵산쇄를 고정화함으로써 한번에 여러 종류의 표적에 대하여 검사를 할 수 있다. 또한 1개의 소자 상에 몇개의 전극부를 구성하여 동일 프로브 핵산쇄를 고정화함으로써 한번에 여러 검체의 검사를 할 수도 있다. 이 경우 포토리소그래피를 사용하여 미리 기판 상에 여러개의 전극 패터닝을 해 놓는다. 이 때, 이웃끼리의 전극이 접촉하지 않도록 절연막으로 구획을 붙이는 것이 효과적이다. 구획의 높이는 O.1 마이크론에서 100 마이크론 정도가 바람직하다.

상기 제1 핵산쇄를 제1 기판의 표면에 고정화한 소위 주형으로서 작용하는제1 핵산쇄 고정화 담체의 제작 방법은 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 광학 활성인 시약을 사용한 포토리소그래피에의한 직접 합성법이나 (Fodor et al. 1991), 미리 제작한 핵산쇄를 마이크로피페트, 잉크 제트 등의 방법으로 제1 기판상에 적하하여 고정화하는 방법을 사용할 수 있다. 고정화하는 제1 핵산쇄와 제1 기판과의 사이에는 스페이서가 존재하는 것이 바람직하다.

다음으로, 이상과 같이하여 제작한 핵산쇄 합성용의 주형이 되는 제1 핵산쇄고정화 담체를 프라이머, 핵산 합성 효소 및 뉴클레오티드 모노머 및 전해질 등을 함유하는 전해질 용액, 즉 핵산 합성 용액중에 침지하여 반응시킴으로써 제1 핵산쇄에 대하여 상보적인 배열을 갖는 제2 핵산쇄의 합성을 한다.

계속해서 제2 핵산쇄를 고정화하기 위한 제2 기판을 준비하고 전해질 용액중에서 제1 기판의 근방 또는 인접하여, 바람직하게는 이것에 대면시켜 설치한다. 이 때의 제1 기판과 제2 기판과의 간격은 핵산쇄의 길이에 의해서도 다르지만 핵산쇄의 이동 거리가 약 1 mm 이하가 되도록 접촉시키거나 또는 1O nm 내지 1 mm의 간격으로 하는 것이 바람직하다.

계속해서 전해질 용액을 이중쇄 DNA가 변성하는 조건, 예를 들면 온도 조건을 바람직하게는 90 ℃이상으로 한다. 이 변성에는 수산화 나트륨 등을 포함하는 알칼리성 용액이나 요소 등을 사용할 수도 있다. 또한, 전위 인가로 변성시킬 수도 있다.

이 때, 제2 기판에서 제1 기판으로 향하는 전계가 가해지도록, 제2 핵산쇄를 고정화하기 위한 제2 기판에는 플러스의 전위를 제1 기판에는 마이너스의 전위를인가한다. 이 때 제1 기판 및 제2 기판은 함께 기판 전극일 필요가 있다. 전위 구배는 O.1 내지 1OO V/cm 정도인 것이 바람직하다. 핵산쇄는 일반적으로 마이너스에 대전하고 있기 때문에 이 조작에 의해, 제1 기판상에서 합성된 제2 핵산쇄는 제2 기판 표면에 이행하여 결합한다.

이 제2 핵산쇄와 제2 기판 표면과의 결합에는, 공유 결합, 친화성 결합, 또는 정전적 결합 등을 포함하는 당업자에게 주지의 수단을 사용할 수가 있다. 즉, 제2 핵산쇄의 말단을, 아미노기, 카르복실기, 티올기와 같은 반응성의 관능기; 비오틴, 아비딘 등의 특이적 친화성 쌍을 형성하는 단백질로 수식하여 두고, 또한 핵산쇄를 고정화하는 제2 기판의 표면에도 실란 커플링제 등의 반응성 관능기를 갖는 분자; 비오틴, 아비딘 등의 특이적 친화성 쌍을 구성하는 단백질; 마이너스에 대전한 아미노산 등으로 수식을 실시하여 둠으로써 보다 강고하게 고정화하는 것이 가능해 진다. 그 때, 기판과 관능기와의 사이에 적당한 스페이서, 예를 들면 폴리아세틸렌, 폴리피롤, 폴리티오펜, 폴리아닐린 등의 도전성 고분자나 알킬기, 폴리에틸렌 등을 도입함으로써 검출의 효율을 향상시킬 수도 있다. 또한 기판 전극으로서 금을 사용할 경우에는 제2 핵산쇄의 말단에 금에 대하여 큰 친화성을 갖는 유황을 결합시켜 두는 것이 바람직하다.

또한 제1 핵산쇄는 전극 이외의 재료 예를 들면 유리, 실리콘, 산화규소, 질화규소, 합성 고분자, 니트로셀룰로오스막, 나일론막 등으로 이루어지는 제1 기판에 고정화하는 것도 가능하다. 이 경우, 제1 기판에서 합성한 제2 핵산쇄를 제2 기판상으로 이행시키는 단계에서, 제2 기판을 전극으로 하고 또한 또 하나의 별도의 전극을 준비하고 제1 핵산쇄를 고정화한 제1 기판을 사이에 두고 그 전극을 제2 기판의 반대측에 설치하고 제2 기판과의 사이에 전위를 인가하면 된다. 이 때, 제2 기판을 플러스로 설정한다.

합성한 제2 핵산쇄는 전극 이외의 재료 예를 들면 유리, 실리콘, 산화규소, 질화규소, 합성 고분자, 니트로셀룰로오스막, 나일론막 등으로 이루어지는 제2 기판에 고정화하는 것도 가능하다. 이 경우는 전극으로 이루어지는 제1 기판상에서 합성한 핵산쇄를 제2 기판에 이행시키는 단계에서, 또 하나의 별도의 전극을 준비하고 그 전극을, 제1 기판과 반대측에 설치하여, 이것과 제1 기판과의 사이에 전위를 인가하면 된다. 이 때, 제 l 기판을 마이너스로 설정한다.

또한 이들을 조합하여, 제1 기판 및 제2 기판의 양자 모두 전극 이외의 재료를 사용하는 것도 가능하다. 이 경우는 제1 기판 및 제2 기판의 외측에 각각 전극을 설치하고 제1 기판의 외측의 전극으로부터 제2 기판의 외측의 전극에 향하여 전위를 인가하면 된다. 이 때, 제2 기판의 외측의 전극을 플러스로 설정한다.

본 발명에 있어서, 제1 핵산쇄로부터 제2 핵산쇄를 합성하기 위해서 사용하는 핵산 합성 효소는 특별히 한정되는 것이 아니고, 여러가지의 DNA 합성 효소, RNA 합성 효소로부터 선택할 수가 있다.

제1 핵산쇄에 cDNA를 사용한 경우에는 랜덤프라이머로 핵산쇄를 합성할 수 도 있다. 또한 제1 핵산쇄에 올리고뉴클레오티드를 사용한 경우에는, 미리 말단에 폴리벤질글루타메이트 (PBLG)나 폴리에틸렌글리콜 등의 스페이서 분자를 결합시켜 놓는 것도 가능하다. 또한, 제1 핵산쇄 중에 공통의 배열을 넣어 두는 것으로 그배열에 상보적인 프라이머를 사용하여 핵산쇄의 합성을 행하는 것이 가능하다.

본 발명에 의해 제조된 핵산 고정화 담체는, 각종 유전자의 검출에 사용할 수 있으며 검출하는 유전자는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 간염 바이러스 (A, B, C, D, E, F, G형), HIV, 인플루엔자 바이러스, 헤르페스군 바이러스, 아데노 바이러스, 인간의 폴리오마 바이러스, 인간의 파필로마 바이러스, 인간의 파르보 바이러스, 멈푸스 바이러스, 인간의 로타 바이러스, 엔테로 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 댕그 바이러스, 풍진 바이러스, HTLV 등의 바이러스 감염증, 황색 포도구균, 용혈성 연쇄구균, 병원성 대장균, 장염 비블리오균, 헬리코박터피롤리균, 캄필로박터, 콜레라균, 적리균, 살모넬라균, 에르시니아, 임균, 리스테리아균, 레프토스피라, 레지오넬라균, 스필로헤이터, 폐렴 마이코플라즈마, 리켓티어, 클라미디아, 말라리아, 적리 아메바, 병원진균 등의 세균 감염증, 기생충, 진균의 검출에 사용할 수 있다. 또한 유전성 질환, 망막아세포종, 바이러무스 종양, 가족성 대장 포리포시스, 유전성 비포리포시스 대장암, 신경선 유종증, 가족성 유방암, 색소성 건피증, 뇌종양, 구강암, 식도암, 위암, 대장암, 간장암, 췌장암, 폐암, 갑상선 종양, 유선 종양, 비뇨기 종양, 남성기 종양, 여성기 종양, 피부 종양, 뼈·연부 종양, 백혈병, 임파종, 고형 종양 등의 종양성 질환의 검사가 가능하다. 또한 RFLP, SNPs 등의 다형 해석, 염기 배열의 해석 등에도 적응이 가능하다. 또한, 의료 이외로도 식품 검사, 검역, 의약품 검사, 법의학, 농업, 축산, 어업, 임업 등에서 유전자 검사가 필요한 것에 모두 적응 가능하다. 또한 PCR, SDA, NASBA 법 등으로 증폭한 유전자의 검출에 대해서도 사용은 가능하다. 또한 표적 유전자는 미리 전기 화학적으로 활성인 물질이나 FITC, 로다민, 아크리딘 등의 형광 물질, 알카리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 글루코스옥시다아제 등의 효소, 하프텐, 발광 물질, 항체, 항원, 금 콜로이드 등의 콜로이드 입자, 금속, 금속 이온 또한 트리스비피리딘, 트리스페난트롤린, 헥사아민 등과의 금속 킬레이트 등으로 표지하여 두는 것이 가능하다.

본 발명에 의해 얻어지는 핵산 고정화 담체를 사용한 유전자 검출에 있어서, 사용하는 시료는 특히 한정되지 않고, 예를 들면 혈액, 혈청, 백혈구, 뇨, 변, 정액, 타액, 조직, 배양 세포, 객담 등을 사용할 수 있으며, 이들 검체 시료로부터 핵산 성분의 추출을 행하는 추출 방법은 특히 한정되는 것이 아니며 페놀-클로로포름법 등의 액-액 추출법이나 담체를 사용하는 고액 추출법을 사용할 수 있다. 또한 시판의 핵산 추출 방법 QIA amp (QIAGEN사 제조), 스마이데스트 (스미또모 금속사 제품) 등을 이용할 수도 있다.

다음으로 추출한 핵산 성분과 유전자 검출용 담체의 사이에서 하이브리다이제시션 반응을 행한다. 반응 용액은 이온 강도 0.01 내지 5의 범위에서, pH 5 내지 10의 범위의 완충액 중에서 행한다. 이 용액 중에는 하이브리다이제이션 촉진제인 황산덱스트란이나 연어 정자 DNA, 소 가슴선 DNA, EDTA, 계면 활성제 등의 첨가가 가능하다. 이것에 추출한 핵산 성분을 첨가하고 90 ℃ 이상에서 열변성시킨다. 유전자 검출용 전극의 삽입은 변성 직후, 또는 0 ℃로 급냉 후에 행할 수 있다. 또한 기판상에 액을 적하함으로써 하이브리다이제션 반응을 할 수도 있다. 반응 중에 교반 또는 진탕 등의 조작으로 반응 속도를 높일 수도 있다. 반응 온도는 10 ℃ 내지 90 ℃의 범위이고, 또한 반응 시간은 1 분 이상으로 부터 하루밤 정도 행한다. 하이브리다이제이션 반응 후, 전극을 취출하여 세정한다. 세정에는 이온 강도 0.01 내지 5의 범위에서, pH 5 내지 10의 범위의 완충액을 사용한다.

본 발명에 의해 얻어지는 핵산쇄 고정화 담체 중, 기판 전극을 사용한 경우의 핵산 고정화 전극은 전기 화학적으로 활성인 DNA 결합 물질을 사용한 검출을 행하는 경우에 유용하다. 전기 화학적으로 활성인 DNA 결합 물질을 사용한 검출은 이하와 같은 순서로 검출한다. 핵산 고정화 어레이를 세정 후, 기판 전극 표면에 형성한 이중쇄 부분에 선택적으로 결합하는 DNA 결합 물질을 작용시켜 전기 화학적인 측정을 한다. 여기서 사용되는 DNA 결합 물질은 특별히 한정되는 것이 아니지만 예를 들면 헥스트 33258, 아크리딘 오렌지, 퀴나크린, 도우노마이신, 메탈로인터카레이터, 비스아크리딘 등의 비스인터카레이터, 트리스인터카레이터, 폴리인터카레이터 등의 사용이 가능하고 또한 이들의 인터카레이터를 전기 화학적으로 활성인 금속 착체, 예를 들면 페로센, 바이올로겐 등으로 수식하여 놓은 것도 가능하다. DNA 결합 물질의 농도는 그 종류에 따라서도 다르지만 일반적으로는 1 ng/㎖ 내지 1 mg/㎖의 범위에서 사용한다. 이 때, 이온 강도 0.001 내지 5의 범위에서 pH 5 내지 10의 범위의 완충액을 사용한다. 전극을 DNA 결합 물질과 반응시킨 후, 세정하여, 전기 화학적인 측정을 행한다. 전기 화학적인 측정은 3 전극 타입, 즉 참조 전극, 쌍극, 작용극, 또는 2 전극 타입, 즉 쌍극, 작용극으로 행한다.

이 측정으로는 DNA 결합 물질이 전기 화학적으로 반응하는 전위 이상의 전위를 인가하고 DNA 결합 물질에 유래하는 반응 전류치를 측정한다. 이 때의 전위는정속으로 소인(sweep)하거나 또는 펄스로 인가하거나 혹은 정전위를 인가할 수가 있다. 측정에는 포텐쇼스테드, 디지털멀티미터, 펑션 제네레이터 등의 장치를 사용하여 전류, 전압을 제어한다. 얻어진 전류치를 기초로 검량선으로부터 표적 유전자의 농도를 산출한다. 유전자 검출용 전극을 사용한 유전자 검출 장치는 유전자 추출부, 유전자 반응부, DNA 결합 물질 반응부, 전기 화학 측정부, 세정부 등으로 구성된다.

본 발명에 의해 얻어지는 핵산 고정화 담체는, 또한 샘플을 미리 형광 표지하거나 또는 제2 프로브로서 형광 표지한 핵산쇄를 사용함으로써 형광 강도를 지표로 유전자의 검출이 가능해 진다. 이 때, 형광 현미경 등을 조합하여 사용하면 핵산쇄의 집적도를 높일 수가 있다.

이상과 같이, 본 발명에 의한 핵산쇄 합성 방법을 사용함으로써 동일 담체상에서 연속적으로 배열이 다른 핵산쇄를 합성할 수 있게 되고 핵산쇄의 합성 조작이 간편해짐과 동시에 핵산쇄 합성을 저비용으로 행할 수 있게 된다. 또한 본 발명의 방법으로 제작한 핵산 고정화 전극을 사용하면 전기 화학적인 유전자 검출이 가능해지며, 간편하고, 고감도인 핵산 배열의 검사가 가능해진다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

<실시예 1 : 주형 핵산쇄 고정화 필터>

고정화에는 대장균의 rDNA를 증폭한 단편 1.5 kb와, 합성 DNA를 사용하였다. rDNA에 대해서는 2 종류의 샘플을 조제하였다. 1개는 열변성시킨 100 ㎍/mL (0.2 mo1/L의 염화나트륨, 5 mmol/L의 인산 완충액 (pH 7))의 rDNA이고 또 하나는 알칼리 변성시킨 100 ㎍/mL (0.2 mo1/L의 수산화 나트륨)의 rDNA이다. 또한 합성 DNA에는 20 ㎍/mL의 90 mer의 올리고 뉴클레오티드 (10 mmo1/L의 인산 완충액 (pH 7))을 사용하였다. 각각 1 μL 씩을 나일론 필터상에 스폿하여 자연 건조 후, 하이브리다이제션 완충액 (2xSSC-1 mmo1/L의 EDTA(pH7))로 세정하였다. 그리고, 80 ℃의 오븐으로 1 시간 베이킹하였다.

<실시예 2 : 주형 핵산쇄 고정화 전극>

고정화에는 대장균의 rDNA를 증폭한 단편 1.5 kb와, 합성 DNA를 사용하였다. rDNA에 대해서는 2 종류의 샘플을 조제하였다. 하나는 열 변성시킨 100 ㎍/mL (0.2 mo1/L의 염화나트륨, 5 mmo1/L의 인산 완충액 (pH 7))의 rDNA이고 또 하나는 알칼리 변성시킨 100 ㎍/mL (0.2 mo1/L의 수산화나트륨)의 rDNA이다. 또한 합성 DNA에는 20 ㎍/mL의 90 mer의 티올화 올리고 뉴클레오티드 (10 mmo1/L의 인산 완충액 (pH 7))를 사용하였다. 각각 0.2 μL씩을 5 mm 각의 금 전극상에 스폿하여 자연 건조시켰다.

<실시예 3 : 주형 핵산쇄 고정화 필터상에서의 핵산쇄 합성>

핵산쇄를 고정화한 실시예 1의 나일론 필터 상에서 핵산쇄의 합성을 하였다. 합성에는 파마시아사 제품의 핵산쇄 표지 키트 (플루올레세인이소티오시아네이트 FITC)를 사용하였다. 뉴클레오티드 믹스와 랜덤프라이머, 폴리머라아제 (klenow)로 이루어지는 시약 100 μL를 필터에 적하하고 하이브리 백 내에서 37 ℃, 1 시간 반응시켰다. 블로킹, 세정 후, 알칼리포스파타아제 표지 항 FITC 항체와 1 시간 반응시켰다. 세정 후, 발광 기질 CDP-Star를 적하하였더니 DNA를 스폿한 부분에서만 발광이 확인되고 필터 상에서 핵산쇄의 합성이 가능하다는 것을 알았다. 그러나 합성 DNA의 스폿으로부터는 발광이 확인되지 않았고, 합성되어 있지 않다고 생각되었다.

<실시예 4 : 주형 핵산쇄 고정화 전극 상에서의 핵산쇄 합성>

핵산쇄를 고정화한 실시예 2의 5 mm 각의 금 전극상에서 핵산쇄의 합성을 하였다. 합성에는 파마시아사 제품의 핵산쇄 표지 키트 (플루오레세인이소티오시아네이트 FITC)를 사용하였다. 뉴클레오티드 믹스와 랜덤프라이머, 폴리머라아제 (klenow)로 이루어지는 시약 20 μL을 전극상에 적하하고 건조하지 않도록 37 ℃, 1 시간 반응시켰다. 블로킹, 세정 후, 알칼리포스파타아제 표지 항 FITC 항체와 1 시간 반응시켰다. 세정 후, 발광기질 CDP-Star를 적하하였더니 DNA를 스폿한 부분에서만 발광이 확인되었다. 또한 금 전극상에서는 합성 DNA의 스폿에서도 발광이 확인되어 합성할 수 있다는 것이 확인되었다.

<실시예 5 : 주형 핵산쇄 고정화 필터로부터의 전사>

실시예 4의 방법으로 합성한 나일론 필터상의 핵산쇄를 별도의 나일론 필터에 전사하였다. 우선, 주형의 나일론 필터를 전사측의 나일론 필터와 접촉시켜 안에 전계가 걸리도록 전기 영동조에 배치하였다. 전계의 방향은 주형측에서 전사측에 향하여 마이너스→플러스로 설정하였다. 약 20 V/cm의 전위 구배로 1 분간 전사를 행한 후, 전사측의 필터를 80 ℃로 베이킹하였다. 실시예 4와 동일한 발광 검출계를 사용한 결과, 전사측에 필터에 합성한 핵산쇄가 전사되어 있는 것이 확인되었다. 주형의 필터는 적어도 3회 반복하여 재이용이 가능하였다.

<실시예 6 : 주형 핵산쇄 고정화 금 전극으로부터의 전사>

실시예 4의 방법으로 합성한 금 전극상의 핵산쇄를 나일론 필터에 전사하였다. 우선, 주형의 금 전극을 전사측의 나일론 필터와 접촉시켜 안에 전계가 걸리도록 전기 영동조에 배치하였다. 전계의 방향은 주형측에서 전사측에 향하여 마이너스→플러스로 설정하였다. 약 10 V/cm의 전위 구배로 3 분간 전사를 행한 후, 전사측의 필터를 80 ℃로 베이킹하였다. 실시예 4와 동일한 발광 검출계를 사용한 결과, 전사측에 필터상에서 합성한 핵산쇄가 전사되어 있는 것이 확인되었다. 주형의 전극은 적어도 3회 반복하여 재이용이 가능하였다.

<실시예 7: 복제한 필터상에서의 핵산쇄의 검출>

핵산쇄를 복제한 필터를 사용하여 유전자 검출을 행하였다. 타겟 유전자에는 rDNA의 PCR 산물을 사용하고 미리 FITC에서 표지를 하였다. 열변성시킨 타겟 유전자 100 μL을 필터에 적하하고 하이브리백내에 있어서 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. 블로킹, 세정 후, 알칼리포스파타아제 표지 항 FITC 항체와 1 시간 반응시켰다. 세정 후, 발광 기질 CDP-Star를 적하하였더니 DNA를 스폿한 부분에서만 발광이 확인되고 복제한 필터상에서 핵산쇄의 검출이 가능하다는 것을 알았다. 전극으로부터 복제한 필터도 거의 같은 정도로 검출이 가능하였다.

<실시예 8: 핵산쇄를 고정화하는 전극의 구조>

도 1은, 본 발명에 있어서 핵산쇄를 고정화하기 위해서 사용하는 제1 및 제2의 기판 전극의 한 예를 모식적으로 나타내는 평면도이다. 이 도에 있어서, 참조번호 (1)은 1 cm 각의 유리 기판이다. 상기 기판 (1) 상에는 100 마이크론각의 금전극 (2)가 30×30 개 패터닝되어 있다. 각 전극 (2)의 사이는 50 마이크론의 절연막 (3)으로 구획되어 있고, 각 전극으로부터는 리드선 (도시하지 않음)이 배면에서 취출되어 있다.

<실시예 9 : 전극을 사용한 핵산쇄의 합성>

도 2는, 기판 전극을 사용한 핵산쇄 고정화 어레이의 제조 공정과 핵산쇄 합성의 메카니즘의 한 예를 모식적으로 나타낸 설명도이다. 프로브 핵산쇄의 주형이 되는 제1 핵산쇄 (5)를 고정화한 제1 기판 전극 (4)는, 도 1의 기판 전극의 각 전극 2 개에, 배열이 다른 30 mer의 올리고 뉴클레오티드 (5)의 용액을, 마이크로 피페트로 적하함으로써 제작하였다. 올리고 뉴클레오티드 (5)의 말단에는 분자량 1000의 폴리벤질글루타메이트 (PBLG) (21)이 미리 결합되어 있고, 또한 PBLG의 말단에는 티올기 (22)가 도입되어 있다.

다음으로 제1 핵산쇄를 고정화한 제1 기판 전극 (4)를, dNTPs, DNA 합성 효소 (23), 및 프라이머 (9)를 포함하는 용액 중에 침지하고 상보쇄 (제2 핵산쇄)를 합성하였다. 합성시에는 우선 올리고 누클레오티드 (5)에 프라이머 (9)가 부착하고 또한 DNA 합성 효소 (23)가 작용하여 상보쇄 (6)이 합성된다. 합성한 제2 핵산쇄의 말단에는 티올기 (7)을 도입하였다. 다음으로 이 제1 핵산쇄를 고정화한 제1 기판 전극 (4)와, 제2 기판 전극 (8)을 그 금 전극면이 제1의 기판 전극의 금 전극면에 대향하도록 1 ㎛ 간격으로 배치하고 100 mmo1/L의 인산 완충액 중에 침지하였다. 95 ℃로 가열하면서 제1 기판 전극 (4)을 쌍극으로 하여 다른 쪽의 제2 기판 전극 (8)에 플러스 500 mV의 전위를 인가하였다 (24). 이에 따라 제2 기판 전극으로부터 제1 기판 전극으로 향하는 방향의 전계가 발생하였다. 이 조작에 의해, 제2 핵산쇄가 제2 기판 전극으로 이동하고 티올기 (7)이 금 전극에 부착하여 30 ×30 개의 패턴 전극으로 각각 다른 배열의 제2 핵산쇄를 고정화할 수 있었다. 제1 핵산쇄를 고정화한 제1 기판 전극 (4)는 적어도 반복 50 회는 재사용이 가능하였다.

<실시예 10 : 전극 상에서의 간접적인 핵산쇄의 합성>

도 3은, 기판 전극을 사용하여 핵산쇄 고정화 어레이를 제조하는 또 하나의 예를 모식적으로 나타낸 설명도이다. 이 실시예 10에서는 제1 기판으로서 주형이 되는 제1 핵산쇄를 유리 기판에 고정화한 제1 유리 기판 (10)을 사용한다. 이 제1 유리 기판 (10)은, 다른 cDNA(l1) 용액을, 마이크로 피페트를 사용하여 30 ×30 개의 패터닝으로 적하함으로써 제작하였다. 다음으로 제1 핵산쇄를 고정화한 제1 유리 기판 (10)을 dNTPs, DNA 합성 효소 (25), 랜담 프라이머 (12)를 포함하는 용액 중에 침지하여, 상보쇄 (제2 핵산쇄 (13))을 합성하였다. 합성한 상보쇄의 말단에는 티올기 (14)를 도입하였다. 이 제1 유리 기판 (10)을 사이로 하고 실시예 1에서 설명한 것과 마찬가지의 제2 기판 전극 (15)과 또 하나의 전극 (16) (쌍극)을 pH 12의 글리신 NaOH 완충액 중에 침지하고 대향 전극과 제2 기판 전극 사이에 플러스 500 mV의 전위 (쌍극에 대하여)를 인가하였다 (26). 이 조작에 의해, 제1 유리 기판 상에서 합성된 제2핵산쇄는, 30 ×30 개의 패턴의 제2 기판 전극 (15) 상에 이행하여 고정화할 수 있었다. 이 제1 핵산쇄를 고정화한 제1 유리 기판 (10)은 적어도 반복하고 50 회는 재사용 가능하였다.

<실시예 11: 주형 기판의 복제>

도 4는 주형 전극 (제1 기판)의 복제 기판 (제2 기판)을 제작하는 방법의 한 예를 나타낸 도이다. 주형이 되는 제1 핵산쇄를 고정화한 유리 기판 (제1 기판)은, cDNA 용액을 마이크로 피페트로 30 ×30 개 패턴에 적하하여 제작하였다. 다음으로 제1 핵산쇄를 고정화한 유리 기판을 dNTPs, DNA 합성 효소 (25), 랜덤프라이머를 포함하는 용액중에 침지하여 상보쇄 (제2 핵산쇄)를 합성하였다. 합성한 상보쇄의 말단에는 분자량 1000의 폴리에틸렌글리콜을 통해 티올기를 도입하였다. 제2 기판은 미리 γ-아미노프로필트리에톡시실란 처리를 행한 후 N-(6-말레이미도카프릴로일옥시)숙신이미드, N-숙신이미딜-6-말레이미도헥사논(EMCS) 처리를 하고 기판 표면에 티올 반응성의 관능기를 도입하였다. 제1 기판의 복제는 우선, 제1 기판인 주형의 유리 기판과, 제2 기판인 복제 기판을 사이로 하고 그 양방의 외측에 전극을 설치하였다. 제1 기판, 제2 기판으로 이루어지는 2장의 전극을 1O mmo1/L 인산 완충액 (pH 7)중에 침지하고, 이 2장의 전극간에 플러스 500 mV의 전위 (쌍극에 대하여)를 인가하면서 80 ℃로 가열하였다. 이 조작으로, 제1 기판상의 합성한 핵산쇄는 각각 30×30 개 패턴으로 제2 기판상에 S-S 결합으로 고정화되었다. 이와 같이 제작한 주형의 복제는, 주형 기판과 마찬가지로 핵산쇄 고정화 기판의 주형으로서 사용할 수가 있으며 적어도 반복하고 50회는 재사용이 가능하였다.

또한 상기 실시예의 방법에 있어서, 10000 프로브 핵산을 이식 배치한 DNA 어레이 1장을 제조하는데 필요로 하는 시간은, 약 5분이었다. 이에 대하여 종래의기술의 항에서 설명한 (1) 어레이 기판상에서 DNA 프로브의 DNA쇄를 단위 뉴클레오티드마다 순차적으로 연장하는 방법 (미국 특허 제 5,889,165 호)로서는 3 일을 요하고 또한 (2) 미리 합성하여 놓은 DNA 프로브를 기판상에 고정화하는 방법 (미국 특허 제 5,807,522호)로서는 60 분을 요하였다.

본 발명에 의한 핵산쇄 합성 방법을 사용함으로써 동일 담체상에서 연속적으로 배열이 다른 핵산쇄를 합성할 수 있게 되고 핵산쇄의 합성 조작이 간편해짐과 동시에 핵산쇄 합성을 저비용으로 행할 수 있게 된다. 또한 본 발명의 방법으로 제작한 핵산 고정화 전극을 사용하면 전기 화학적인 유전자 검출이 가능해지며, 간편하고, 고감도인 핵산 배열의 검사가 가능해진다.

Claims

소정의 염기 배열을 갖는 제2 핵산쇄를 제2 기판상에 고정한 핵산쇄 고정화담체를 제조하는 방법으로서:

제1 기판 상에, 상기 제2 핵산쇄의 염기 배열에 대하여 상보적인 염기 배열을 갖는 제1 핵산쇄를 고정화한 제1 핵산쇄 고정화 담체를 준비하는 공정과,

핵산쇄 합성 용액중에 있어서, 상기 제1 핵산쇄 고정화 담체의 제1 핵산쇄에 따라서 이것에 상보적인 배열을 갖는 제2 핵산쇄를 합성하는 공정과,

상기 제1 기판의 제1 핵산쇄 측에 대면시켜 상기 제2 기판을 배치하는 공정과, 상기 제2 기판으로부터 상기 제1 기판으로 향하는 전계를 인가함으로써, 상기 1 핵산쇄에 따라서 합성된 제2핵산쇄를 상기 제2 기판 표면에 영동시켜, 상기 제2 기판 표면에 결합시키는 공정을 구비한 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 합성된 상기 제2 핵산쇄를 상기 제2 기판 표면에 영동시켜 상기 제2 기판 표면에 결합시키는 공정은, 전해질 용액중에 있어서 이중쇄 핵산이 단일쇄로 변성하는 조건으로 행하여지는 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 전해질 용액 중에서 상기 이중쇄 핵산의 단일쇄로의 변성은 상기 전해질 용액을 가열함으로써 행하는 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 기판으로부터 상기 제1 기판으로 향하는 전계를 인가하기 위해서 상기 제2 기판 및 상기 제1 기판의 외측에 한쌍의 전극을 설치하고 이 전극쌍에 전위를 가하는 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 제2 기판 및 상기 제1 기판의 적어도 한편이 합성 수지 제품 또는 유리 제품의 기판 또는 막인 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 기판으로부터 상기 제1 기판으로 향하는 전계를 인가하기 위해서, 상기 제2 기판 및 상기 제1 기판의 적어도 한쪽에 전극 재료 표면을 갖는 기판 전극을 사용하고 상기 기판 전극에 전위를 가하는 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 기판 전극은, 절연 기판 상에 전극막을 피복하고 상기 전극막의 표면을 절연층 영역에서 복수의 전극 영역으로 분리한 것이고, 분리된 각각의 전극 영역에, 각각 다른 배열의 제2 핵산쇄 또는 제1 핵산쇄를 고정하는 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 기판 전극의 전극 재료 표면이 금으로 이루어지고 상기 제2 핵산쇄와 상기 제2 기판과의 결합은, 상기 제2 핵산쇄에 결합된 유황과 상기 금 표면의 친화성 결합을 통하여 행하여 지는 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
상기 제2 핵산쇄 또는 상기 제1 핵산쇄가 RNA, DNA, PNA 및 이들의 유사 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 핵산쇄와 상기 제2 기판의 결합은 공유 결합, 친화성 결합 및 정전적 결합으로 이루어지는 군에서 선택되는 결합을 통해 행해지는 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산쇄 합성 용액은, 프라이머, 핵산 합성 효소, 뉴클레오티드 모노머 및 전해질을 함유하는 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 핵산쇄를 제2 기판에 고정한 핵산쇄 고정화 담체는 유전자 검사에 사용되고, 상기 제2 핵산쇄는 프로브인 것을 특징으로 하는 핵산쇄 고정화 담체의 제조 방법.