KR100423615B1 - 인간 에리트로포이에틴의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 유전자로 형질전환된 세포주를 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine) 및/또는 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아세틸누라미닉산(2,3-dihydro-2-deoxy-N-acetylneuraminic acid) 존재하에서 배양시킨 다음, 정제하여 hEPO를 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 재조합 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 유전자로 형질전환된 세포주를 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine) 및/또는 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아세틸누라미닉산(2,3-dihydro-2-deoxy-N-acetylneuraminic acid) 존재하에서 배양시킨 다음, 정제하여 hEPO를 제조하는 방법에 관한 것이다.
인간 에리트로포이에틴(human erythropoietin, 이하 "hEPO"라 약칭함)은 적혈구계 세포에 특이적인 조혈호르몬으로서, 골수 중의 적아구(erythroblast)계 전구세포의 분화와 증식을 조절하여 적혈구의 생성을 자극하는 당단백호르몬이며 (Carnot 등, Compt. Rend., 143, 348, 1906), 신장성 빈혈 등의 임상적 치료에 유용하게 이용되고 있다. 현재, 유전자 재조합 기술과 세포배양 기술을 이용하여 hEPO를 제조하는 방법이 알려져 있다.
hEPO는 165개의 아미노산으로 구성되어 있으며 3개의 N-결합 당쇄와 1개의 O-결합 당쇄를 포함하고 있으며 전체 당쇄는 hEPO 분자량의 40%에 해당한다. 천연형 hEPO는 산성(acid), 단일형의 당단백질로서 전체 분자량이 약 34,000달톤 정도이며, 당을 제외한 단백질 부분만의 분자량은 약 18,000달톤이다 (Wang 등, Endocrinology, 116, 2286, 1985). 또한 hEPO는 아미노산 Asn24, Asn38 및 Asn83의 위치에 3개의 N-결합 당쇄와 Ser126 위치에 하나의 뮤신형(mucin-type) O-결합 당쇄를 가지고 있다.
hEPO 분자량의 약 40%를 구성하는 당쇄부분은 인간 EPO의 생체내 활성에 필수적인 역할을 담당하고 있으며, 당함량이 감소될 경우 hEPO의 생물학적 반감기가 급격히 감소되어 생체내 생물학적 활성이 소실되는 것으로 보고 되고 있다 (Goto 등, Biotechnology, 6, 67, 1988). 특히, 말단의 시알산(sialic acid) 잔기는 hEPO의 두 번째 갈락토오스기를 보호함으로써 간세포 수용체에 의한 갈락토오스기의 분해를 차단하여 hEPO의 생체내 반감기를 연장시켜 hEPO 생체내 활성도에 영향을 미친다(Goldwaser 등, J. Bio. Chem., 249, 4202, 1974; Lowy 등, Nature, 185, 102, 1960). 따라서, hEPO 생체내 활성도를 증진시키기 위해 시알산 함량이 높은 hEPO 의 개발이 요구되고 있다.
한편, 미국특허 제5,856,298호에서는 분자당 1-14개의 시알산을 가지며 하나의 등전점을 갖는 에리트로포이에틴 동형체(erythropoetin isoform)가 개시된 바 있다. 미국특허 제5,856,298호에서는 유전자 변형기술을 사용하여 얻어진 재조합 에리트로포이에틴으로부터 등전집속(isoelectric focusing) 방법을 통해 상기 에리트로포이에틴 동형체를 얻고 있다. 그러나, 상기 선행기술에서 사용한 등전집속 방법은 단순한 분리방법으로서, 이를 이용하여 시알산 함량이 높은 hEPO를 대량으로 제조하는 것은 곤란한 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 간단한 방법으로 시알산 함량이 높은 hEPO를 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 재조합 hEPO 유전자로 형질전환된 세포주를 일정한 조건에서 배양하였을 때, 시알산 함량이 높은 hEPO를 간단한 방법으로 대량제조할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 재조합 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 유전자로 형질전환된 세포주를 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine) 존재하에서 배양시키거나, N-아세틸만노사민 및 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아세틸누라미닉산(2,3-dihydro-2-deoxy-N-acetylneuraminic acid) 존재하에서 배양한 다음, 정제하여 시알산 함량이 높은 hEPO를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도1은 대조군 배양액 및 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 hEPO 배양액의 등전집속 (isoelectric focusing) 후의 웨스턴 블럿 결과를 나타내는 도면이고,
1: 대조군 배양액
2: 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 hEPO 배양액;
도2는 고속액상 크로마토그래피(FPLC) 결과를 나타내는 도면이고;
도3은 고속액상크로마토그래피의 분취분획 (7-10)의 등전집속 (isoelectric focusing) 결과를 나타내는 도면이고;
도4는 고속액상크로마토그래피에서 분획된 hEPO의 시알산 분석 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 재조합 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 유전자로 형질전환된 세포주를 N-아세틸만노사민 존재하에서 배양시킨 다음, 정제하여 hEPO를 제조하는 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 hEPO 제조방법은 공지의 재조합 hEPO 유전자로 형질전환된 세포주를 사용할 수 있으며, 예를들어, 한국과학기술원에 기탁된 KCTC 0181BP를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 시알산의 전구체로서 N-아세틸만노사민을 배양액에 함유시켜 재조합 hEPO 유전자로 형질전환된 세포주를 배양하는 것을 포함한다. 배양액중의 N-아세틸만노사민의 함량은 다량으로 함유될 수록 높은 함량의 시알산을 함유한 hEPO가 얻어지게 되나, 제조의 효율성을 감안하여 20mM 이상으로 함유시켜 제조하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 제조방법은 N-아세틸만노사민 뿐 아니라, 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아세틸누라미닉산를 함께 첨가하여 배양시키는 것이 더욱 바람직하다. 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아세틸누라미닉산은 시알리데이즈 저해제(sialidase inhibitor)로 알려진 물질로서, 이를 배양액에 함유시켜 hEPO 유전자로 형질전환된 세포주를 배양할 경우 더욱 높은 함량의 시알산을 함유한 hEPO를 제조할 수 있다.
배양조건은 hEPO 배양에 관하여 공지된 배양조건을 사용할 수 있으며, 예를들어 37℃에서 CO2-배양기(CO2-incubator)를 사용하여 배양할 수 있다. 한편, 배양방법으로는 플라스크 배양(flask culture) 및 롤러배양(roller culture) 모두 사용할 수 있으나, 높은 함량의 시알산을 함유한 hEPO를 손쉽게 대량배양하기 위해서는 롤러배양이 더욱 바람직하며, 무혈청 배지에서 롤러배양을 하는 것이 더욱 바람직하고, 무단백 배지를 사용한 롤러배양이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 방법은 통상의 정제방법, 예를들어 한외여과에 의한 농축, 흡착 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 행하는 정제방법을 사용할 수 있다. 여기에서 흡착 크로마토그래피로서 블루-세파로스(Blue-sepharose) 흡착 크로마토그래피를 수행하여 배양액을 직접 흡착시킬 경우, 농축과정을 생략할 수 있어 더욱 간단하게 hEPO를 정제할 수 있다. 또한, 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한 다음, 고속 액상 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography)를 추가적으로 수행할 경우 단시간내에 hEPO를 효과적으로 정제할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 재조합 세포주의 무혈청 플라스크 배양에 의한 hEPO의 제조
총 10개의 플라스크를 37℃에서 CO2-배양기를 사용하여 3일동안 5% 소태아혈청이 포함된 배지로 재조합 세포주(KCTC 0181BP)를 배양한 다음, 배지를 완전히 제거한 후 피이비에스(PBS) 용액으로 세포단층을 세척하였다. 10개의 플라스크를 각각 2개씩 5개의 군으로 나누어, 제1군은 무혈청 디엠이엠/에프-12배지 15ml을 가한 대조군이며(대조군-1-1), 제2군은 플라스크에 0.2mM N-아세틸만노사민이 첨가된 무혈청 디엠이엠/에프-12배지 15ml을 가한 군이고(실험군-1-1), 제3군은 2mM N-아세틸만노사민이 첨가된 무혈청 디엠이엠/에프-12배지 15ml을 가한 군이며(실험군-1-2), 제4군은 20mM N-아세틸만노사민이 첨가된 무혈청 디엠이엠/에프-12배지 15ml을 가한 군이고(실험군-1-3), 제5군은 40mM N-아세틸만노사민이 첨가된 무혈청 디엠이엠/에프-12배지 15ml을 가한 군이다(실험군-1-4). 이들 실험군을 24시간 간격으로 각 플라스크에서 hEPO를 함유하고 있는 배양 상등액을 회수하고 새로운 배지로 교환해주면서 7일동안 배양하였다. 최종 7일 배양액에서 측정한 단위 세포당 역가 및 시알산의 함량은 다음 표1과 같다.
| 시험군 | N-아세틸만노사민(mM) | 단위세포당 역가(IU/106cell) | 시알산 함량(mM/L) |
| 1 | 0 | 116 | 20 |
| 2 | 0.2 | 115 | 24 |
| 3 | 2 | 103 | 25 |
| 4 | 20 | 114 | 70 |
| 5 | 40 | 111 | 139 |
상기 표1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 hEPO는 동등수준의 단위세포당 역가를 나타내나, 시알산 함량이 7배까지 높아진 hEPO을 얻을 수 있다.
실시예 2. 재조합 세포주의 무혈청 롤러 배양에 의한 hEPO의 제조
총 4개의 1750㎠ 롤러 바틀을 롤러 배양기(37℃)에 장착하고 0.5rpm속도로 회전시키면서 3일동안 혈청이 포함된 디엠이엠/에프-12배지에서 재조합 세포주(KCTC 0181BP)를 배양한 다음, 배지를 완전히 제거한 후 피비에스(PBS)를 이용하여 세포단층을 세척하였다. 이를 4개의 군으로 나누어, 제1군은 무혈청 디엠이엠/에프-12배지 200ml을 가한 것을 대조군이고(대조군-2-1), 제2군은 20mM N-아세틸만노사민이 첨가된 무혈청 디엠이엠/에프-12배지 200ml을 가한 군이며(실험군-2-1), 제3군은 2mM N-아세틸만노사민과 0.5mM 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아시틸누라미닉산이 첨가된 무혈청 디엠이엠/에프-12배지 200ml을 가한 군이며(실험군-2-2), 제4군은 20mM N-아세틸만노사민과 0.5mM 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아시틸누라미닉산이 첨가된 무혈청 디엠이엠/에프-12배지 200ml을 가한 군(실험군-2-3)으로 하였다. 24시간 간격으로 각 롤러 바틀에서 hEPO를 함유하고 있는 배양 상등액을 회수하고, 무혈청 배지로 교환해주면서 7일동안 배양하였다. 회수한 배양상등액은 무균여과(0.22 ㎛)하여 4℃에 냉장보관하였다. 대조군-2-1과 실험군-2-3의 배양상등액을 등전집속 분석을 수행한 후, 웨스턴 블럿 분석을 수행하였으며 그 결과는 도1과 같다.
도1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 hEPO의 등전점이 약 3.0 - 5.0 로서 대조군에 비해 더욱 강한 산성을 띠고 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 hEPO는 음 극성을 갖는 시알산 함량이 높은 것을 확인할 수 있다. 최종 7일 배양액에서 측정한 단위 세포당 역가 및 시알산의함량은 다음 표2와 같다.
| 시험군 | 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아세틸누라미닉산(mM) | N-아세틸만노사민(mM) | 단위세포당 역가(IU/106cell) | 시알산 함량(mM/L) |
| 1 | 0 | 0 | 140 | 15 |
| 2 | 0 | 20 | 152 | 73 |
| 3 | 0.5 | 2 | 137 | 100 |
| 4 | 0.5 | 20 | 222 | 180 |
상기 표2에서 확인할 수 있는 바와 같이, N-아세틸만노사민 및 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아세틸누라미닉산을 함유시켜 배양하였을 경우 hEPO의 단위세포당 역가를 약 60% 증가시킬 수 있고, 시알산 함량도 10배이상 높아진 hEPO를 얻을 수 있다.
실시예 3. 흡착 크로마토그래피에 의한 1차 정제
블루-세파로스 레진 40ml을 컬럼에 충진시킨 후 평형 용액(포스페이트 버퍼 셀라인 용액(PBS 용액)에 20μM CuSO4와 0.02% 트윈 20 첨가) 0.4L를 사용하여 평형화시켰다. 실시예 2에서 제조한 대조군-2-1 및 시험군-2-3의 회수액 각각 1L를 컬럼에 통과시킨 후, 컬럼을 평형용액을 사용하여 세척하였다.
20mM의 트리스와 0.15M의 NaCl이 함유된 세척용액(pH 9.0)으로 1차 세척하고 20mM의 NaHPO4와 0.15M의 NaCl이 함유된 세척용액(pH 7.0)으로 2차 세척하였다. 20mM NaHPO4와 0.75M의 NaCl이 함유된 용리용액(pH7.0) 200ml를 사용하여 hEPO를 용리시켰다 (대조군-3-1 및 시험군-3-3).
실시예 4. 소수성 크로마토그래피에 의한 2차 정제
C4 레진 40ml을 컬럼에 충진시킨 후, 20mM의 NaHPO4(pH 7.0)가 함유된 평형 용액을 사용하여 컬럼을 평형화시켰다. 평형용액으로 평형화된 컬럼에 실시예 3에서 얻은 용액(대조군-3-1 및 시험군-3-3) 200ml을 통과시켰다.
20mM의 NaHPO4(pH 7.0)가 함유된 평형 용액을 사용하여 컬럼을 세척하였다. 20mM의 NaHPO4용액에 50%의 에탄올이 함유된 세척용액 (pH7.0)으로 다시 컬럼을 세척하였다. 20mM의 NaHPO4용액에 60%의 에탄올이 함유된 용리용액 (pH7.0)을 이용하여 hEPO를 용리시켰다 (대조군-4-1 및 시험군-4-3).
실시예 5. 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 3차 정제
마크로프렙 Q 레진(Macroprep Q resin, 바이오래드사) 40ml을 컬럼에 충진시킨 후, 20mM의 NaHPO4(pH7.0)가 함유된 평형 용액을 사용하여 컬럼을 평형화시켰다. 평형 용액으로 평형화된 컬럼에 실시예 4에서 얻은 용액(대조군-4-1 및 시험군-4-3) 200ml를 통과시켰다.
20mM의 NaHPO4(pH 7.0)가 함유된 평형 용액을 사용하여 컬럼을 세척하였다. 20mM의 소듐 아세테이트와 10mM의 NaCl이 함유된 세척용액(pH4.5)으로 1차 세척하였다. 20mM의 소듐 아세테이트와 5mM의 NaCl이 함유된 세척용액(pH7.0)으로 2차 세척하였다. 20mM의 NaHPO4와 70mM의 NaCl이 함유된 용리용액(pH7.0)을 이용하여 hEPO를 용리시켰다 (대조군-5-1 및 시험군-5-3).
실시예 6. 고속 액상 크로마토그래피에 의한 정제
고속액상 크로마토그래피 (fast protein liquid chromatography) 기계(아머샴 파마시아)에 모노 Q 5/5 음이온-교환 컬럼(아머샴 파마시아)을 연결한 후, 50mM 트리스-HCl (pH 7.2) 용액 20배 부피를 흘려주어, 컬럼을 평형시켰다.
실시예 5에서 얻은 용액 (대조군-5-1 및 시험군-5-3)을 50 mM 트리스-HCl (pH 7.2)를 이용하여 10배 희석한 다음, 1배 부피가 되도록 농축하였다. 농축된 시료를 0.45 ㎛ 여과장치를 이용하여 여과한 다음, 고속액상 크로마토그래피 기계를 통해 분당 1 ml의 속도로 컬럼에 흘려준 후, 20배 부피의 50 mM 트리스-HCl (pH 7.2) 용액으로 세정하였다. 다시 50 mM 트리스-HCl (pH 7.2) 용액을 흘려주면서, 0.3M 염화나트륨을 20배 부피에 걸쳐서 선형증가(linear gradient)시켰다. 선형증가 과정이 진행되는 동안 1분간격으로 자동분취기를 이용하여 컬럼에서 빠져나오는 시료를 회수하였다 (대조군-6-1 및 시험군-6-3) (제 2도).
시험군-6-3으로부터 얻어진 시료(7-10의 분취튜브)를 등전집속 분석을 수행한 결과(제 3도), 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 hEPO의 경우 시알산 함량이 높은 것을 알 수 있다.
실시예 7. 각 분취분획의 시알산 함량 및 hEPO 농도
실시예 6에서 얻어진 시료 (대조군-6-1 및 시험군-6-3)를 분광광도계를 이용하여 280nm의 흡광도에서 측정하여, A280의 값이 0.3 이상이면, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.2)로 희석하여 0.3 이하가 되도록 하였다. 이때의 최종 시료의 부피는 0.5 ml이 되도록 하였다. 또한 농도별로 표준물질을 순차희석하여 준비하였다. 준비된 시료, 표준물질에 0.1 ml의 0.04M 페리오딕산(periodic acid)을 더하고, 4℃에서 35분간 방치하였다. 반응이 끝나면, 1.25ml의 레시놀(resorcinol) 용액을 더하여 잘 섞은 후, 5분간 얼음에 방치하였다. 과정이 끝나면, 15분간 100℃에서 가열한 후, 수돗물에 중탕하여 상온까지 냉각시켰다. 냉각이 끝나면, 1.25ml의 부탄올을 더하여 잘 섞은 후, 37℃에서 3분간 방치하고 상온까지 냉각시킨 후, 분광광도계를 이용하여 630nm의 흡광도로 읽고 표준물질의 흡광수치를 선형회귀식을 이용하여 표준곡선을 작성한 다음, 검체의 시알산양을 측정하였다. 이때, 결정된 시알산 함량을 단위 단백질량으로 나누어서, 단위 hEPO 당 시알산의 양을 결정하였다 (제 4도). 상기에서 얻은 대조군-6-1 및 시험군-6-3에서 세포의 수 및 시알산 함량이 12%이상인 hEPO 함량을 측정한 결과는 다음 표 3과 같다. 회수된 hEPO 중 시알산 함량이 12%이상인 경우 대조군-6-1이 2.396 mg 회수되었고, 실험군이 3.593 mg이 회수되었다. 따라서 대조군에 비해서 생산량이 약 50%가 증가한 시알산 함량이 증가한 hEPO를 얻을 수 있었다. 위의 전과정의 생산공정에서의 효율성을 비교, 요약하면 (표 3)과 같다.
| 대조군-5-1 | 시험군-5-2 | |
| 세포의 수 (X 106세포) | 5.146 | 5.114 |
| 시알산 함량이 12% 이상인 hEPO (mg) | 2.396 | 3.593 |
| 대조군에 대한 상대적 비율 (%) | 100 | 149 |
상기 표3에서 확인할 수 있는 바와 같이, N-아세틸만노사민 및 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아세틸누라미닉산이 첨가된 배지로 배양한 경우, 통상의 배지에 비하여 시알산 함량이 높은 hEPO를 얻을 수 있음을 알 수 있다.
Claims (5)
- 재조합 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 유전자로 형질전환된 세포주를 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine) 존재하에서 배양시킨 다음, 정제하여 hEPO를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 2,3-디하이드로-2-데옥시-N-아세틸누라미닉산(2,3-dihydro-2-deoxy-N-acetylneuraminic acid)를 더욱 첨가하여 배양시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 유전자로 형질전환된 세포주가 KCTC 0181BP 임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 무혈청 플라스크배양 또는 무혈청 롤러배양으로 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 정제단계가 블루-세파로스(Blue-sepharose) 흡착 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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|---|---|---|---|---|
| WO2013058485A1 (en) | 2011-10-18 | 2013-04-25 | Chong Kun Dang Pharmaceutical Corp. | Methods for purifying erythropoietin analogs having lower isoelectric point |
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2001
- 2001-05-16 KR KR10-2001-0026636A patent/KR100423615B1/ko not_active Expired - Fee Related
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