KR100409092B1 - 단백질의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질의 제조방법에 관한 것으로서, 내포체 및 변성제를 포함한 세포파쇄액으로부터 단일 공정으로 재접힘된 단백질을 수득하여, 활성을 가지는 단백질을 짧은 시간에, 간단히 그리고 경제적인 방법으로 제조할 수 있는 단백질의 제조방법을 제공하기 위하여, (가) 내포체의 형태로 생성된 단백질을 포함하는 숙주세포를 파쇄하고, 파쇄된 숙주세포에 변성제를 첨가하여 응집된 단백질을 푸는(unfolding) 공정, (나) 상기 변성제 및 풀려진 단백질을 포함하는 세포 파쇄액을 세포찌꺼기 보다 높은 밀도의 고체 매트릭스가 액체 중에 평형상태로 부유되어 있는 칼럼의 상부방향으로 유입시켜, 상기 고체 매트릭스에 상기 풀려진 단백질을 흡착시키는 공정, (다) 상기 칼럼 내로 변성제를 포함한 완충용액을 상부 방향으로 유입시켜 흡착된 단백질을 제외한 세포파쇄액을 상기 칼럼으로부터 제거하는 공정, (라) 상기 칼럼 내로 변성제를 포함하지 않은 완충 용액을 상부 방향으로 공급하여 변성제의 농도를 점차적으로 줄임으로써 풀려진 단백질을 재접힘하는 공정, 및 (마) 상기 재접힘된 단백질을 상기 칼럼으로부터 수득하는 공정을 포함하는 단백질의 제조방법을 제공한다.

Description

단백질의 제조 방법{A process for producing a protein}

본 발명은 단백질의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터로 형질 전환된 숙주세포 내에서 응집된 내포체 형태로 생성된 재조합 단백질을 생물학적 활성을 가지는 천연 형태의 단백질로 전환하는 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

단백질은 펩티드 결합으로 연결된 아미노산의 체인 형태로 존재하며, 생물학적활성을 가진 정상적인 단백질은 열역학적으로 안정한 형태의 3차원적 구조를 가지도록 수소결합, 이온결합 등 원자간의 비교적 약한 힘에 의해 접혀진(folding) 형태를 갖는다. 이들 단백질은 각종 동, 식물로부터 분리 또는 추출되어 질병의 치료 등에 활용되고 있으며, 근래에는 유전자 재조합 기술의 발달과 함께, 이종(heterologous)의 유전물질을 발현하는 숙주세포를 배양하여 상업적으로 가치 있는 단백질을 대량으로 생산하고 있다. 그러나 E. coli(대장균) 등과 같은 숙주세포를 이용하여 단백질을 대량 생산하는 경우, 숙주세포 내에서 단백질이 생물학적 활성이 없는 내포체(inclusion body: IB)의 형태로 응집(aggregate)되어 생성되는 경우가 있으므로, 이들 비용해성 단백질 응집체를 생물학적 활성을 갖는 용해성 천연형태의 단백질로 재접힘(refolding) 하는 단계를 거쳐야 한다.

이와 같이 내포체의 형태로 생성되어, 변형된 3차원적 구조를 가지는 단백질 응집체를 생물학적 활성을 가지는 천연 형태로 전환하는 방법으로서, 변성제(denaturant)를 포함한 완충용액으로 단백질 응집체를 용해시켜 단백질의 폴리펩티드 체인을 펼친(unfolding) 다음, 희석, 투석(dialysis) 등의 방법으로 변성제를 제거하거나, 변성 조건을 되돌림으로서 단백질을 천연 형태로 재접힘시키는방법이 알려져 있다. 이와 같은 액상(solution-phase)에서의 단백질 재접힘 방법은 재접힘 과정 중에 단백질 분자간의 상호 작용으로 인하여 서로 잘못 결합(mismatching)하여 응집될 수 있는데 이러한 비정상적인 응집을 방지하기 위하여 통상 매우 희석된 용액 상태에서, 또는 매우 낮은 단백질 농도에서 수행되어야 한다. 따라서 상기 액상 단백질 재접힘 방법은 대형 설비 및 대량의 용액을 취급하여야 하므로, 단백질의 제조비용이 증가하여 대량생산에 적합하지 못할 뿐만 아니라, 희석된 용액을 사용하더라도 단백질의 상호작용에 의한 비정상적인 응집현상을 완전히 제거할 수 없는 문제점이 있다. 이와 같은 응집(aggregation) 현상은 내포체 단백질의 대규모 액상 재접힘 공정에서 주요한 손실중의 하나이다.

유럽특허 221 114호는 이와 같은 액상에서의 단백질 재접힘 방법의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 단백질 분자가 특정 고체 매트릭스 표면에 가역적으로 흡착되는 것을 이용한 고체상 단백질 재접힘 방법(solid-phase or matrix-assisted protein refolding)을 제시하고 있다.

상기 방법은 천연 형태의 단백질을 제조하기 위하여, 먼저 단백질을 내포체의 형태로 생성하는 세포를 세척하고, 이를 파쇄한 (disrupt or lysis) 다음, 원심 분리하여 세포찌꺼기(cell debris)가 제거된 내포체 펠렛(pellet)을 얻는다. 이와 같이 얻어진 내포체 펠렛을 세척하고, 물 등의 용매로 현탁시킨 후, 다시 원심 분리하여 내포체 펠렛을 정제하며, 이와 같은 세척/정제 과정을 세포찌꺼기가 모두 제거될 때까지 수회 반복한다. 정제된 내포체 펠렛을 용해 완충용액과 변성제 용액에 현탁시켜 응집된 단백질을 펼친(unfolding) 후, 아가로스, 셀룰로오스 등의이온 교환 수지에 충진하여 단백질을 이온 교환 수지에 흡착시킨다. 다음으로, 펼쳐진 단백질이 흡착된 이온 교환 수지를 완충 용액으로 세척하여 변성제를 제거함으로서 단백질을 재접힘(refolding)시킨다. 이와 같이 재접힘된 단백질을 칼럼으로부터 수득하고, 이를 한외여과(ultrafiltration)하여 미량의 응집체를 제거함으로서 최종 재접힘된 단백질 모노머를 얻는다.

상기 방법은 변성제에 의해 풀린 단백질을 이온간의 상호 작용을 이용해 고체 매트릭스 표면에 결합시켜, 단백질 사이의 분자간 작용(intermolecular interaction)을 줄인 후, 변성제를 제거함으로써 단백질이 고체 매트릭스 표면에서 서서히 재접힘되는 원리를 이용한 것으로서, 말 싸이토크롬(horse cytochrome C), 오브알부민(ovalbumin), 프로키모신(prochymosin), 재조합 돼지성장호르몬과 같은 단백질의 재접힘에 성공적으로 적용되었다.

그러나, 상기 방법은 기존의 액상(solution-phase) 재접힘과 비교해 보았을 때, 약 300배 이상의 단백질 농도에서 재접힘 공정을 수행하므로, 공정부피를 획기적으로 줄일 수 있었음에도 불구하고, 상기 방법을 적용하기 위해서는 세포파쇄액으로부터 세포 찌꺼기(cell debris)를 완전히 제거하여 내포체 단백질을 분리한 후, 이를 수회 반복하여 세척하는 공정을 거친 후에야 단백질 재접힘을 수행하여야 하므로, 시간과 인력이 많이 소모될 뿐만 아니라 단백질의 제조수율이 감소하는 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 세포 찌꺼기보다 밀도가 높은 고체 매트릭스를 이용하여 변성제를 포함하는 세포파쇄액을 칼럼의 상부 방향으로 유입시킴으로써 고체인 세포찌꺼기를 제거함과 동시에 목적 단백질을 흡착시킨 후 재접힘 할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 풀려진 단백질의 재접힘(refolding) 공정에 있어서, 재접힘 과정과 동시에 세포 찌꺼기를 제거할 수 있으므로, 세포찌꺼기를 제거하는 별도의 공정이 불필요한 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 풀려진 단백질의 비정상적인 응집현상을 억제하여 재접힘된 단백질을 정제할 필요가 없는 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 단백질 내포체 및 변성제를 포함한 세포파쇄액으로부터 단일 공정으로 재접힘된 단백질을 수득하여, 짧은 시간에, 간단히 그리고 경제적인 방법으로 활성을 가지는 단백질을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 팽창층 흡착(EBA) 크로마토그래피 칼럼을 이용한 단백질의 제조방법을 도시한 개략도.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 EBA-매개 재접힘공정에서의 용출 프로파일을 UV 검출기로 검출한 흡광 스펙트럼.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 EBA-매개 재접힘공정에서의 용출액의 SDS PAGE 결과를 보여주는 사진.

도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 수득한 단백질 단량체와 응집체의 농도를 비교 분석한 FPLC 스펙트럼.

도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 수득한 단백질을 정제하였을 때의 FPLC 스펙트럼.

도 5는 표준 융합단백질과 본 발명의 제조방법에 따라 재접힘된 융합단백질의 2차 구조를 비교한 far-UV 스펙트럼.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (가) 내포체의 형태로 생성된 단백질을 포함하는 숙주세포를 파쇄하고, 파쇄된 숙주세포에 변성제를 첨가하여 응집된 단백질을 푸는(unfolding) 공정, (나) 상기 변성제 및 풀려진 단백질을 포함하는 세포파쇄액을 세포찌꺼기 보다 높은 밀도의 고체 매트릭스가 액체 중에 평형상태로 부유되어 있는 칼럼의 상부방향으로 유입시켜, 상기 고체매트릭스에 상기 풀려진 단백질을 흡착시키는 공정, (다) 상기 칼럼 내로 변성제를 포함한 완충용액을 상부방향으로 유입시켜 흡착된 단백질을 제외한 세포파쇄액을 상기 칼럼으로부터 제거하는 공정, (라) 상기 칼럼 내로 변성제를 포함하지 않은 완충 용액을 상부 방향으로 공급하여 변성제의 농도를 점차적으로 줄임으로서 풀려진 단백질을 재접힘하는 공정, 및 (마) 상기 재접힘된 단백질을 상기 칼럼으로부터 수득하는 공정을 포함하는 단백질의 제조방법을 제공한다.

여기서 상기 고체 매트릭스는 디에틸아미노에틸(DEAE) 세파로우스 레진, DEAE-셀룰로오즈 레진, 카르복시메틸 셀룰로오스 레진, 카르복시메틸 아가로스 레진 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 상기 변성제를 함유한 완충용액의 사용량은 상기 고체매트릭스의 1 내지 5부피이고, 상기 변성제를 함유하지 않은 완충용액의 사용량은 상기 고체매트릭스의 6 내지 15부피인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따라 단백질을 제조하기 위하여, 먼저 응집된 내포체의 형태로 생성된 단백질을 포함하는 숙주세포를 적절한 완충용액에 현탁시킨 다음, 고압균질기(high-pressure homogenizer)를 통과시키는 등의 통상의 방법에 따라 파쇄한다. 상기 내포체는 숙주세포 내에 응집되어 생성된 불용성 단백질로서, 천연 상태의 단백질과 같은 3차원 구조 및 활성을 가지지 못하는 단백질을 의미하며, 상기 완충 용액은 숙주세포의 파쇄를 용액 또는 슬러리 상태에서 수행하기 위하여 첨가하는 것으로서, 비한정적으로 Tris HCl, 중탄산나트륨 염(sodium bicarbonate)용액 등 당업계에 통상적으로 알려진 완충용액을 사용할 수 있다.

이와 같이 파쇄된 숙주세포에 변성제를 첨가하여 응집된 내포체 단백질을 용해시킨다(unfold). 상기 변성제(denaturant)는 단백질의 가역적인 풀림을 유도할 수 있는 화합물로서, 단백질의 종류 및 단백질을 흡착하는 팽창층흡착 크로마토그래피 칼럼의 종류에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 6 내지 10M 농도의 우레아 수용액, 구아니딘 염산염(guanidine HCl) 또는 SDS(sodium dodecyl sulfate)을 사용한다. 이때 파쇄된 세포 찌꺼기 및 풀려진 단백질 용액이 팽창층 흡착 크로마토그래피 칼럼에 용이하게 충진될 수 있도록 적절한 현탁도를 가지는 것이 바람직하며, 이와 같이 세포파쇄액의 현탁도를 조절하기 위하여 완충 용액을 추가로 투입할 수도 있다.

다음으로 상기 완충용액, 변성제 및 풀려진 단백질을 포함하는 세포파쇄액을 세포 찌꺼기보다 밀도가 높은 고체 매트릭스가 충진된, 팽창층 흡착(Expanded bed adsorption: EBA) 크로마토그래피 칼럼으로 지속적으로 유입시키면서, 상기 칼럼 내의 고체 매트릭스(absorbent)에 상기 풀려진 단백질을 흡착시킨다. 상기 팽창층 흡착(EBA) 크로마토그래피는 칼럼의 하부로부터 상부방향으로 유동성 액체를 지속적으로 공급하여, 칼럼 내의 고체매트릭스 (absorbent)를 평형상태(equilibrium)로 부유시키고, 여기에 액체의 유동방향과 동일한 방향으로 목적 단백질을 포함하는 세포파쇄액을 공급함으로서 목적 단백질은 고체매트릭스에 흡착되고, 세포 찌꺼기는 유동성 액체와 함께 칼럼 상부를 통하여 밖으로 배출되는 원리를 이용한 것으로서, 본 발명에서는 이와 같은 팽창층 흡착 크로마토그래피 칼럼을 이용하여 세포찌꺼기의 제거 및 단백질의 재접힘을 연속적으로 수행함으로서, 단일 칼럼 내에서 단일 공정으로 재접힘된 순수한 단백질을 얻을 수 있다.

이와 같이, 단백질을 팽창층흡착 크로마토그래피 칼럼 내의 고체매트릭스에 흡착시킨 후, 상기 칼럼의 하부로부터 변성제를 포함한 완충용액을 유입시켜 흡착된 단백질을 제외한 세포찌꺼기를 상기 칼럼으로부터 제거한다.

도 1은 본 발명의 팽창층흡착 크로마토그래피 칼럼을 이용한 재접힘된 단백질의 제조방법을 개략적으로 도시한 것으로서, 도 1에 도시한 바와 같이, 먼저 하부에 침전되어 있는 고체매트릭스를 포함하는 칼럼(도 1의 가)에 하부로부터 상부방향으로 완충 용액, 예를 들면 pH 9.0의 0.1M Tris-HCl용액을 지속적으로 유입시켜, 고체매트릭스가 팽창(expanded)되어 평형상태로 부유하도록 한다(도 1의 나). 이와 같이 평형상태에 있는 칼럼에 완충용액의 유동방향과 동일한 방향으로 펼쳐진 단백질 내포체를 포함하는 세포파쇄액을 유입시키면, 단백질 내포체는 고체매트릭스에 흡착되고, 세포파쇄액의 찌꺼기 및 불순물 단백질은 완충 용액과 함께 칼럼의 상부로 배출된다(도 1의 다). 이때 세포파쇄액의 밀도는 파쇄액의 칼럼 내에서의 유동성을 고려하여 칼럼의 평균밀도 보다 작은 것이 바람직하며, 완충 용액의 유속은 80 내지180cm/hr인 것이 바람직하다. 이와 같이 세포 찌꺼기 및 불순물 단백질을 제거하고, 변성제를 포함한 완충 용액을 칼럼 하부로부터 상부로 유입시킴으로서 칼럼 내에 남아 있는 세포 찌꺼기(cell debris) 및 기타 고체 입자들을 완전히 제거한다(도 1의 라). 이때, 변성제를 함유한 완충용액의 사용량은 칼럼 내 레진(고체매트릭스)의 1 내지 5부피, 바람직하게는 1 내지 2부피에 해당하는 양을 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 팽창층흡착 크로마토그래피에 사용되는 고체매트릭스로는 목적 단백질의 종류, 변성제와의 흡착성 등을 고려하여 적절히 선택 사용할 수 있으며, 대표적으로는 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl: DEAE)-세파로우스레진, DEAE-셀룰로오즈 레진, 카르복시메틸(carboxymethyl: CM) 셀룰로오스 레진, 아가로스 레진 등과 같은 이온 교환 수지를 광범위하게 사용할 수 있으며, 목적 단백질의 종류에 따라 protein A와 같은 친화성 상호작용을 이용하는 것이나, 소수성 상호작용을 이용한 고체매트릭스도 사용할 수 있다.

이와 같이 칼럼 내에서 세포찌꺼기를 완전히 제거한 후, 변성제를 포함하지 않은 완충 용액을 칼럼 하부로부터 상부로 유입시켜, 칼럼 내의 변성제 농도를 점차적으로 줄임으로서, 고체매트릭스에 흡착된 풀려진 단백질을 천연 상태의 3차원적 구조를 가지도록 재접힘(refold)시킨다(도 1의 마). 이때, 변성제를 함유하지 않은 완충용액의 사용량은 칼럼 내 고체매트릭스의 6 내지 15부피, 바람직하게는 8 내지 10부피에 해당하는 양을 사용하는 것이 좋다.

다음으로, 상기 칼럼과의 흡착성이 강한 용출 완충 용액을 상기 칼럼의 상부로부터 하부로 유입시킴으로서, 고체매트릭스를 하부 방향으로 침전시킴과 동시에, 상기 고체매트릭스에 흡착된 재접힘된 단백질을 이탈(desorption)시키고, 이를 칼럼 하부로부터 수득하여 재접힘된 순수한 단백질을 얻는다(도 1의 바). 이때 상기 용출 완충 용액으로는 사용되는 칼럼의 종류 및 수득되는 단백질의 종류에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있으나, 사용되는 칼럼이 이온교환수지인 경우에는 NaCl수용액 등 이온성이 강한 염을 포함하는 완충 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 상기 용출 완충 용액은 시간에 따라 점차 적으로 진한 농도의 용액이 투입되도록, 즉 농도 구배를 가지도록 칼럼에 투입하는 것이 재접힘된 단백질의 수득률을 높일 수 있으므로 바람직하다.

이와 같이 재접힘된 단백질을 수득한 후, 통상의 방법에 따라 세정액을 이용하여 침전된 고체매트릭스를 재생(regeneration)함으로서, 팽창층흡착 크로마토그래피를 추후의 단백질 제조공정에 사용될 수 있도록 준비한다. 이때 사용되는 세정액으로는 고체매트릭스가 이온교환수지인 경우에는 1M NaCl 및 0.5M NaOH 수용액을 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질 제조방법은 비용해성 응집체 형태로 생성된 모든 단백질, 특히 유전자 재조합 기술에 의하여 생산된 단백질이나 융합단백질 등에 광범위하게 적용될 수 있으며, 특히 숙주세포 내에서 내포체의 형태로 응집된 단백질의 천연 형태로의 전환에 유용하게 적용될 수 있다. 이와 같은 단백질의 예로는 비한정적으로 재조합 인간성장호르몬(rhGH)과 글루타티온 트랜퍼라제(glutathione S tansferase: GST)의 융합단백질(hGH-GST), 인터페론, 프로키모신(prochymosin), 오브알부민 (ovalbumin), 말 싸이토크롬C(horse cytochrome C)등이 있으며, 상기 공정은 단일 체인 폴리펩티드(single-chain polypeptide), 응집성 단백질(affinity-tagged protein)등과 같은 단백질에도 적용될 수 있다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.본 실시예에 사용된 모델 단백질과 팽창층흡착 크로마토그래피 칼럼은 다음과 같다.

모델 단백질: hGH-GST(69개 아미노산 잔기로 구성된 프래그먼트(fragment))의 융합단백질을 모델 단백질로 사용하였다. 정제된 rhGH 단량체, 융합단백질의 세척된 내포체, 그리고 융합단백질 내포체를 포함하는 E.coli 세포파쇄액 (융합단백질은 아라비노즈 프로모터를 사용한 E. coli BL21 안에 내포체 형태로 발현시켰으며, 융합단백질의 발현율은 전체 단백질의 약 40%임, 참고문헌: 김창성, 김윤하, 이은규 "내포체 단백질의 재생을 위한 용해 및 재접힘 공정의 비교분석" 한국생물공학회지 제13권 제2호, pp. 133-140 (1998)) 등 세 가지의 다른 물질을 가지고 재접힘 실험을 수행하였고, 이 모든 재료는 (주)녹십자에서 제공받았다.

팽창층 흡착(EBA) 크로마토그래피 칼럼: EBA 크로마토그래피 칼럼으로 사용한 STREAMLINE 25 칼럼은 Amersham Pharmacia Biotech AB사(Uppsala, Sweden)로부터 구입하였고, 레진으로는 같은 회사의 제품인 STREAMLINE DEAE를 사용하였다. 이 레진은 100-300㎛의 다양한 입자 크기를 갖고 있고(평균직경은 200㎛) 밀도는 1.20g/ml이다. 사용한 레진 부피는 50ml이었고, 이때 베드의 침강높이(settled height)는 약 10cm였다. 단백질 로딩량은 50ml부피의 레진에 50 에서 500mg의 총 단백질(즉 1-10mg/ml)로 변화시켰다. 로딩 단계의 베드 팽창률은 3으로하였으며, 세척 단계의 상부 방향(upflow) 유속도는 168cm/h이었다.

[대조예]

우레아(변성제)로 풀린 단백질이 고체매트릭스(흡착제)에 흡착되는지, 그리고 우레아를 제거함으로 재접힘이 되는지를 확인하기 위하여 hGH 단량체를 이용하였다. 동결 건조된 hGH 분말을 소듐 중탄산염(Sodium bicarbonate) 완충(46mM, pH 8.0)에 1.8 mg/ml 농도로 용해시키고, 8M 우레아로 평형화시켜 얻은 풀린 hGH 단량체 용액 20 ml을 10 ml의 STREAMLINE DEAE가 충진된 일반칼럼에 주입하여 흡착시켰다. 매트릭스에 결합된 단백질을 우레아가 없는 같은 완충액(고체 매트릭스 매질 부피의 8배)을 이용하여 세척함으로서 단백질을 재접힘시켰다.

[실시예 1]

세척된 내포체(융합단백질 함량 40%) 46 mg을 소듐 중탄산염 완충(46mM, pH 9.0)에 넣은 후 8M 우레아를 첨가하여 용해하였다. 용해된 내포체 용액 50 ml을 DEAE 레진(STREAMLINE DEAE)이 채워진 평형상태의 EBA칼럼(STREAMLINE 25)에 아래에서 위 방향으로 주입하였다. 주입이 끝난 후 용해되지 않은 고형 물질들을 제거하기 위해 8M 우레아가 포함된 완충 100 ml(매질 부피의 2배)을 칼럼 하부로부터 상부 방향으로 주입하였다.

다음으로, 우레아가 없는 동일한 완충 400 ml(매질부피의 8배)를 칼럼 하부로부터 상부 방향으로 주입하여, 변성제인 우레아를 제거하여 단백질의 재접힘을 유도하였다. 그 후, 레진을 침강시키고, NaCl이 함유된 완충용액을 농도 구배를주어 칼럼의 상부로부터 하부방향으로 공급하였다. 불순 단백질은 0.2M NaCl 완충액이 공급되었을 때 용출되었으며, 재접힘된 융합단백질은 0.4M NaCl 완충액이 공급되었을 때 용출되었다. 목적 단백질을 수득한 후, 칼럼은 0.5M NaOH용액과 1.0M NaCl용액을 사용하여 재생시켰다.

[실시예 2]

8M Urea가 함유된 완충액 100 ml당 융합단백질 내포체를 포함하는 E. coli 세포(wet cell) 10g을 투입하여 슬러리를 제조한 후, 고압균질기 (high-pressure homogenizer, model FA-078-El, SLM Instruments Inc., USA)에 800 bar에서 상기 슬러리를 2번 통과시켜 파쇄하였다. 세포파쇄액(40 ml)은 50 ml의 DEAE 레진(STREAMLINE DEAE)이 채워진 EBA칼럼(STREAMLINE 25 칼럼)에 아래에서 위 방향으로 흐름을 주어 공급하였다. 레진사이에 끼이거나 물리적으로 부착된 세포 찌꺼기 고체들은 8M 우레아가 포함된 소듐 중탄산염 완충(46ml, pH 9.0) 100 ml(또는 2 매질부피)을 추가로 흘려줌으로써 제거하였다. 그 이후 우레아 세척, 융합단백질 용출, 그리고 칼럼 재생은 실시예 1과 동일한 방법을 사용하였다.

여기서 STREAMLINE DEAE 레진의 밀도는 우레아가 미함유된 완충액의 밀도보다는 높기 때문에 평형 단계에서 레진은 칼럼 내부에서 안정화 될 수 있다. 반면에 8몰 우레아가 함유된 세포파쇄액(밀도 1.37 g/ml)은 레진보다 밀도가 높기 때문에 만약 파쇄액이 연속적으로 공급된다면, 즉 칼럼 내부가 8M 우레아가 함유된 세포파쇄액으로 충진된 경우 레진은 칼럼 내부에서 부유되어 유실될 것이다. 그러나레진에 흡착되는 융합단백질의 양이 제한되어 있기 때문에 일정한 부피의 파쇄액만을 유입(loading)시켰다 (보통 40에서 150ml). 이 경우 주입되는 물질이 칼럼 내의 완충액에 의해 희석되기 때문에 이 동상의 밀도는 레진보다 더 낮게되고, 따라서 베드의 안정성이 유지되게 된다. 실시예 2에서 칼럼에 공급되는 40 ml의 세포파쇄액의 평균 밀도는 약 1.10 g/ml로서, STREAMLINE DEAE 레진의 평균 밀도 1.20 g/ml보다 낮았다.

EBA-mediated 재접힘 공정 수율

환원된(또는 풀린) 단백질과 산화된(또는 재접힘된) 단백질을 분리하고 정량화 하는데 Cl8 칼럼(Macrosphere 300, 5 micron, 4.6×140 mm, Alltech Inc., USA)이 장착된 역상 HPLC와 UV 검출기(220nm)를 사용하였다. 완충 용액 A는 탈이온화된 증류수(deionized water)에 0.1%(v/v) 트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid: TFA)을, 완충 용액 B는 아세토니트릴에 0.1%(v/v) TFA를 넣어 만들었다. 완충용액 B를 24∼75%까지 35분간 선형 농도구배를 주면서 용출시켰다.

대조예의 단량체 hGH의 경우, 칼럼으로부터 점차적으로 우레아를 제거함으로써 8M 우레아에 의해 풀린 단백질이 고체 상에서 재접힘되었으며, 이 재접힘 공정의 hGH 수율은 81%이었다. 수율의 계산은 한국생물공학회지, 13(2), 134-135쪽에 기재된 방법에 따라 수행하였으며, in vitro 재접힘에서 비교적 높은 값의 수율이 얻어짐을 알 수 있다. 같은 방법을 실시예 1의 세척된 내포체에 적용해 본 결과 84%의 수율을 얻었으며, 실시예 2의 내포체를 포함하는 세포파쇄액에 적용해 본 결과 75%의 수율을 얻었다. 따라서 내포체 내에 존재하는 불순물들이 단백질의 고체상 재접힘을 방해하지 않음을 알 수 있다. 따라서 EBA칼럼을 사용한 본 발명의 단백질 제조방법은 효율의 저하없이, 간단한 공정을 통해, 고체상 불순물의 제거 및 단백질의 재접힘을 동시에 수행할 수 있다.

EBA 크로마토그래피에서의 용출 프로파일

도 2는 실시예 2에 따른 EBA-매개(mediated) 재접힘공정에서의 용출 프로파일을 UV 검출기로 280nm에서 모니터링한 것으로서, 영역 A는 세포파쇄액의 충진, 영역 B는 8M 우레아가 포함된 완충용액 용출, 영역 C는 우레아가 포함되지 않은 완충용액 용출, 영역 D는 0.2M NaCl이 함유된 완충용액 용출, 영역 E는 0.3M NaCl이 함유된 완충용액 용출, 영역 F는 0.4M NaCl이 함유된 완충용액 용출, 영역 G는 1.0M NaCl이 함유된 완충용액 용출 영역을 나타낸다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포파쇄액의 충진 단계 A에서 흡착제와 결합하지 못한 단백질은 완충액 용출 단계 B에서 모두 용출되었고, 대부분의 불순 단백질 및 고형 불순물들은 0.2M NaCl 농도에서, 융합단백질은 0.4M NaCl 농도에서 용출되었다.

도 3은 상기 각 단계 용출액의 SDS PAGE(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, Mini Protein II, Bio-Rad, USA) 결과를 나타낸 것으로서, 1레인은 표준 분자량 마커, 2레인은 8M 우레아를 포함하는 세포파쇄액의 용출액, 3레인은 세포파쇄액 충진시의 용출액, 4레인은 우레아가 포함된 완충용액 용출액, 5레인은 우레아가 포함되지 않은 완충용액의 용출액, 6레인은 0.2MNaCl이 함유된 완충용액의 용출액, 7레인은 0.4M NaCl이 함유된 완충용액의 용출액을 나타낸다. 도 3으로부터 0.4M NaCl이 함유된 완충용액의 용출과 함께 재접힘된 순수한 hGH-GST 단백질이 수득됨을 알 수 있다.

도 4a는 단백질 재접힘 후 융합단백질 단량체와 응집체의 농도를 비교분석하기 위하여, 0.4M NaCl에서의 용출액을 Superose 12 HR10/30 칼럼을 사용한 FPLC 시스템(Fast Protein Liquid Chromatography, Amersham Pharmacia Biotech, model P-500)에 의해 분석한 것이다. 도 4a로부터 응집체의 농도는 융합단백질 단량체 농도보다 현저히 낮음을 볼 수 있다. 융합단백질의 일부를 동일한 FPLC로 2차 정제하였을 때 비교적 대칭적인 단일 피크를 얻었고(도 4b), 이 피크의 융합단백질 농도는 0.87 mg/ml이었다. 즉, EBA-매개 재접힘 공정을 통해 높은 수율과 함께 높은 순도의(또는 aggregation이 덜 일어나는) 단백질 용액을 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 방법에 의해 응집(aggregation)이 일어나는 문제점을 본질적으로 해결할 수 있기 때문에 응집물(aggregate) 제거와 같은 재접힘 후 정제공정을 줄일 수 있고, 희석과정이 필요 없으므로 공정 부피가 획기적으로 줄어드는 장점이 있다.

재접힘된 융합단백질의 2차 구조 분석

(주) 녹십자에서 제공받은 표준 융합단백질과 EBA에 의해 재접힘된 융합단백질의 2차 구조를 비교하기 위해, 0.5mm path length로 spectropolarimeter (Jasco, model J-715)를 사용하여 표준 융합단백질과 재접힘된 융합단백질의 far-UV 스펙트럼을 얻었으며, 그 결과를 도 5에 도시하였다. 도 5에 도시된 바와 같이 두 스펙트럼은 최대흡수파장, 흡수광도 및 분광학적 프로파일(profile)이 동일함을 알 수 있다. 208nm와 220nm에서 관찰되는 α-헬릭스(helix)의 조성은 동일하였다. 195nm에서 관찰되는 β-시이트(sheet)의 경우 약간의 차이가 남에도 불구하고 두 가지 형태는 같은 2차원적 구조를 갖는다고 볼 수 있다.

본 발명은 팽창층흡착(EBA) 크로마토그래피 칼럼 내에 세포파쇄액을 주입하여, 그 안에 있는 내포체 형태의 목적 단백질을 고체상(solid-phase)에서 재접힘하는 동시에, 세포 찌꺼기 등의 고체 입자를 제거할 수 있다. 이 새롭고 간단한 EBA-매개 재접힘 방법은 우선 세포파쇄액을 직접 칼럼에 적용시켜 단일 단계로 재접힘을 수행할 수 있으며, 응집현상을 획기적으로 줄이고, 재접힘의 수율과 순도를 향상시키며, 고농도 상태의 단백질의 재접힘을 수행할 수 있다. 따라서 공정부피를 크게 줄이고, 또한 모든 공정 단계가 하나의 칼럼 내에서 수행되므로 공정 단계를 줄일 수 있으므로, 공정이 단순화되면서 결과적으로 공정 수율, 비용 및 시간을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 높은 공정 재생산성을 가진다.

Claims (7)

1. 내포체의 형태로 생성된 단백질을 포함하는 숙주세포를 파쇄하고, 파쇄된 숙주세포에 변성제를 첨가하여 응집된 단백질을 푸는(unfolding) 공정;

   칼럼의 상부 방향으로 액체가 유입될 경우, 세포찌거기는 칼럼 상부로 이동하고, 고체매트릭스는 칼럼 내에서 평형상태로 부유될 수 있도록, 세포찌꺼기 보다 높은 밀도를 가지는 고체 매트릭스가액체 중에 평형상태로 부유되어 있는 칼럼의 상부 방향으로, 상기 변성제 및 풀려진 단백질을 포함하는 세포파쇄액을 유입시켜, 상기 고체매트릭스에 상기 풀려진 단백질을 흡착시키는 공정;

   변성제를 포함한 완충용액을 상기 칼럼의 상부 방향으로 유입시켜, 흡착된 단백질을 제외한 세포파쇄액을 상기 칼럼으로부터 제거하는 공정;

   변성제를 포함하지 않은 완충 용액을 상기 칼럼의 상부 방향으로 공급하여 변성제의 농도를 점차적으로 줄임으로서 풀려진 단백질을 재접힘하는 공정; 및

   상기 칼럼과 흡착성이 강한 용출 완충 용액을 상기 칼럼의 상부로부터 하부로 유입시킴으로서, 고체매트릭스를 하부 방향으로 침전시킴과 동시에, 상기 고체매트릭스에 흡착된 재접힘된 단백질을 이탈(desorption)시키고, 이를 칼럼 하부로부터수득하는 공정을 포함하는 단백질의 제조방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 고체매트릭스는 디에틸아미노에틸(DEAE) 세파로우스레진, DEAE-셀룰로오즈 레진, 카르복시메틸 셀룰로오스 레진, 아가로스 레진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 인간성장호르몬(rhGH)과 글루타티온 트랜퍼라제(GST)의 융합단백질(hGH-GST), 인터페론, 프로키모신, 오브알부민, 및 말싸이트크롬C로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질의 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 변성제는 6 내지 10M 농도의 우레아 수용액인 것인 단백질의 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 변성제를 함유한 완충용액의 사용량은 칼럼 내 고체매트릭스의 1 내지 5부피이고, 상기 변성제를 함유하지 않은 완충용액의 사용량은 칼럼 내 고체매트릭스의의 6 내지 15부피인 것인 단백질의 제조방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포를 파쇄한 후, 세포파쇄액을 세정하는 공정을 더욱 포함하는 단백질의 제조방법.