[go: up one dir, main page]

KR100403708B1 - 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도 - Google Patents

재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도 Download PDF

Info

Publication number
KR100403708B1
KR100403708B1 KR1019960704129A KR19960704129A KR100403708B1 KR 100403708 B1 KR100403708 B1 KR 100403708B1 KR 1019960704129 A KR1019960704129 A KR 1019960704129A KR 19960704129 A KR19960704129 A KR 19960704129A KR 100403708 B1 KR100403708 B1 KR 100403708B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
aav
helper virus
gene
animal
genome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
KR1019960704129A
Other languages
English (en)
Inventor
데스캉 벵상
페리코데 미셀
Original Assignee
아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아방티 파르마 소시에테 아노님 filed Critical 아방티 파르마 소시에테 아노님
Application granted granted Critical
Publication of KR100403708B1 publication Critical patent/KR100403708B1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10344—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

아데노-수반 바이러스(AAV)로부터 유도된 벡터를 제조하기 위한 신규한 방법, 그를 위해 사용된 세포 및 특히 유전자 및/또는 세포 치료법에서 결과 얻어진 벡터의 용도가 공개된다.

Description

재조합 아데노-수반 바이러스(AAV) 제조 방법 및 이의 용도{METHOD FOR PREPARING RECOMBINANT ADENO-ASSOCIATED VIRUSES(AAV),AND USED THEREOF}
도 1 : 플라즈미드 pREP-CAP의 예시도,
도 2 : 플라즈미드 pAAV-EPO-NEO의 예시도,
도 3 : 플라즈미드 pAd-RepCap의 예시도,
본 발명은 아데노-수반 바이러스(AAV)로부터 유도된 벡터를 제조하는 신규한 방법 및 이 목적을 위해 사용된 세포에 관한 것이다. 보다 특별히, 본 발명은 동물 헬퍼 바이러스를 사용하여 재조합 AAV를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 유전자 및/또는 세포 치료를 위한 얻어진 재조합 AAV의 용도에 관한 것이다.
유전자 치료는 관련된 세포 또는 기관내로 유전 정보를 도입하므로써 결함 또는 기형(돌연변이, 이상 발현등)을 교정하는 것으로 구성되거나, 치료학적으로 관심이 있는 단백질의 발현을 확증하는 것으로 구성된다. 이 유전 정보는 기관으로부터 추출된 세포내로 시험관내에(이후에, 변형된 세포는 유기체내로 재도입된다), 또는 적당한 조직내로 생체내에 직접 도입될 수 있다. DNA와 DEAE 텍스트란(Pagano 일행, J. Virol. 1 (1967) 891), DNA와 핵 단백질(Kaneda 일행, Science 243(1989) 375), DNA와 지질(Felgner 일행, PNAS 84 (1987) 7413), 및 DNA와 폴리리신의 복합체를 수반하는 다양한 형질감염 기술, 리포좀의 사용(Fraley 일행, J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431)등을 포함하는, 이 유전 정보를 전이하기 위한 여러가지 기술이 서술되어 왔다. 보다 최근에, 유전자 전이용 벡터로서 바이러스의 사용은 이들 물리화학적 형질감염 기술에 대한 가망있는 대안으로서 나타났다. 이 면에서, 다양한 바이러스, 특히 레트로바이러스(RSV, HMS, MMS 등), HSV 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-수반 바이러스는 특정 세포 집단을 감염시키는 그들의 능력에 대해 테스트되었다.
이들 바이러스중에, 아데노-수반 바이러스(AAV는 "아데노-수반 바이러스"를 나타낸다)는 유전자를 전이하기 위한 이용에 관해 매력적인 특정 특성들을 제공한다. AAV는 안정한 부위-특이성 방식으로 그들이 감염된 세포의 게놈내로 통합되는 비교적 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 그들은 세포 성장, 세포 형태 또는 세포 분화에 임의 영향을 미치지 않고 다양한 세포를 감염시킬 수 있다. 더욱이, 그들은 사람 질병에 연관되지 않는 것처럼 보인다.
AAV의 게놈은 클로닝되고, 서열분석되고 특성화되었다. 그것은 약 4,700 염기를 포함하고, 각 말단에서 바이러스의 복제의 기원으로서 작용하는 약 145 염기의 역 반복 영역(ITR)을 함유한다. 게놈의 나머지는 캡시드화 기능을 운반하는 2개의 필수 영역으로 나눠진다: 바이러스의 복제 및 바이러스 유전자의 발현에 연관된 rep 유전자를 함유하는 게놈의 왼쪽 부분; 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 함유하는 게놈의 오른쪽 부분. 시험관내 및 생체내에 유전자를 전이하기 위한 AAV로부터 유도된 벡터의 사용은 문헌에서 서술되었다(특히, WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, SP 488 528를 참고하라). 이들 출원서는, 작제물에서 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 관심있는 유전자에 의해 치환되는, AAV로부터 유도된 다른 작제물들 및 시험관내 (배양액내 세포에)또는 생체내 (유기체내에 직접) 관심있는 상기 유전자를 전이시키기 위한 그들의 용도를 서술한다.
그럼에도 불구하고, 유전자 전이용 벡터로서 AAV의 치료학적 사용은, 특히 야생형 헬퍼 바이러스로 재조합 AAV를 오염시키는 위험때문에, 그리고 재조합 바이러스를 생산하기 위해 잠재적 종양 발생의 사람 세포계를 사용하기 때문에 현재 제한된다. 복제를 위해, AAV는 헬퍼 바이러스의 존재를 요구한다. 용어 헬퍼 바이러스는 AAV를 복제하기 위해 요구된 기능을 트랜스 방식으로 공급할 수 있는 임의 바이러스를 가리킨다. 이는 특히 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 종두 바이러스일 수 있다. 이 성질을 가진 헬퍼 바이러스의 부재하에는, AAV는 감염된 세포의 게놈내에 잠복 형태로 남아 있으나, 복제할 수 없어서 바이러스 입자 --를 생성할 수 없다. 그러므로, 일반적으로 재조합 AAV는, 사람 헬퍼 바이러스(예컨대 아데노바이러스)로 감염된 세포계에서, 두 AAV 역 반복 영역(ITR)에 의해 접해진 관심있는 유전자를 함유하는 플라즈미드 및 AAV 캡시드화 유전자(rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라즈미드로의 동시형질감염에 의해 생성된다. 그리고나서, 생성된 재조합 AAV는 통상의 기술을 사용하여 정제된다. 그러나, 이 방식으로 얻어진 AAV는 일반적으로 생성자 세포에 의해 또한 생성된 야생형 헬퍼 바이러스에 의해 오염된다. 이 헬퍼 바이러스의 존재는 예컨대 병원성 또는 면역원성 효과같은 생체내에서 매우 나쁜 결과를 가질 수 있다. 이 헬퍼 바이러스는 또한 재조합 과정에 관여하거나, 그렇지 않으면 재조합 AAV의 복제, 따라서 그의 전달 및 전파를 유발할 수 있다.
본 발명은 이 문제에 대한 유리한 해결책을 제공한다. 출원인은 야생형 사람 헬퍼 바이러스를 함유하지 않는 재조합 AAV의 저장물을 생성하는 것을 가능하게 하는 재조합 AAV를 생성하는 방법을 사실상 개발했다. 본 발명의 방법은 또한 잠재적 종양 발생의 생성자 세포를 사용하는 것을 피하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 재조합 AAV가 동물 기원의 헬퍼 바이러스를 사용하므로써 생성될 수 있다는 증거를 부분적으로 기초로 한다. 출원인온 놀랍게도 동물 기원의 바이러스가 사람 AAV를 트랜스보충(transcomplement)할 수 있고, 이 이유때문에, 사람 재조합 AAN를 생성하기 위한 헬퍼 바이러스로서 이 바이러스를 사용하는 것이 가능하다는 것을 사실상 증명했다. 이 결과는 헬퍼 바이러스로서 사용된 동물 바이러스가 사람 세포에서 증식될 수 없고, 동물 헬퍼 바이러스로의 감염에 따라 사람병리 현상이 관찰되지 않았기 때문에 특히 유리하다. 이 이유때문에, 얻어진 재조합 AAV 제조물이 헬퍼 바이러스에 의해 오염될 수 있을지라도, 후자는 생체내 임의 원치않는 부작용을 일으킬 수 없을 것이다. 게다가, 본 발명의 방법은 현재 이용가능한 사람 계에 임의 공지된 종양발생 효과를 가지지 않는 동물 생성자 세포계를 사용하는 것을 가능하게 한다. 본 발명은 또한 재조합 AAV를 생성하는데 특히 유리한 세포계 및 헬퍼 바이러스의 개발을 기초로 한다.
이리하여, 본 발명의 주요 목적은 동물 헬퍼 바이러스의 존재하에 생성되는 방법에 따라 재조합 AAV를 생성하기 위한 방법이다.
보다 바람직하게, 생성은 동물 헬퍼 바이러스를 감염된 동물 세포계에서 실행된다.
본 발명은 또한 일반적인 방식으로 제조합 AAV를 제조하기 위한 동물 헬퍼 바이러스의 사용에 관한 것이다.
상기 지시된 바와 같이, 본 발명의 의미내에 용어 헬퍼 바이러스는 AAV를 복제하기 위해 요구된 기능을 트랜스 방식으로 공급할 수 있는 임의 바이러스를 가리킨다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 헬퍼 바이러스는 개, 소, 쥐, 양, 돼지, 새 또는 심지어 원숭이 기원의 바이러스일 수 있다. 그것은 바람직하게 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 종두 바이러스중에 선택된다.
본 발명의 범위내에, 동물 기원의 아데노바이러스를 사용하는 것이 특히 유리하다. 본 발명의 범위내에 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 다양한 기원, 특히 개, 소, 쥐(예컨대: Mavl, Beard 일행, Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 새 또는 심지어 원숭이(예컨대: SAV) 기원을 가질 수 있다.
보다 특별하게, 새 아데노바이러스중에, ATCC, 예컨대 Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830) 및 K-11 (ATCC VR-921) 균주 또는 그렇지 않으면 ATCC VS-831 내지 835로서 표시된-균주로부터 입수가능한 혈청형 1 내지 10을 인용하는 것이 가능하다.
소 아데노바이러스중에, 여러가지 공지된 혈청형, 특히 기탁 번호 ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 및 769 하에 ATCC (유형 1 내지 8)로부터 입수가능한 것들이 사용될 수 있다.
쥐 아데노바이러스 FL (ATCC VR-550) 및 E20308 (ATCC VR-528), 유형 5(ATCC VR-1343) 또는 유형 6 (ATCC VR-1340) 양 아데노바이러스, 돼지 아데노바이러스 (5359) 또는 원숭이 아데노바이러스, 예컨대 특히 ATCC 기탁 번호 VR-591-594, 941-943, 195-203 등을 갖는 아데노바이러스를 사용하는 것이 또한 가능하다.
바람직하게, 개 기원의 아데노바이러스는 본 발명의 범위내에 헬퍼 바이러스로서 사용되고, 보다 바람직하게 CAV1 및 CAV2 아데노바이러스의 모든 균주[예컨대, Manhattan 균주 또는 A26/61 (ATCC VR-800) 균주]가 사용된다. 개 아데노바이러스는 많은 구조 연구의 피험체이었다. 결과로서, CAV1 및 CAV2 아데노바이러스의 완전한 제한 지도는 선행 기술(Spibey 일행, J. Gen, Virol. 70 (1989) 165)에서 서술되었고 E1a 및 E3 유전자 뿐만 아니라 ITR 서열은 클로닝되고 서열분석되었다(특히, Spibey 일행, Virus Res 14 (1989) 24; Linne, Virus Res. 23 (1992)119, WO 91/11525 참고). 하기 실시예가 나타내는 바와 갈이, 개 아데노바이러스는 그들이 복제할 수 있도록 AAV를 트랜스보충하는데 매우 효과적이다.
이들 다른 동물 기원의 바이러스는, 예컨대 기탁기관에 기탁된 균주로부터 얻어지고나서, 컴피턴트 세포계에서 증폭되고, 요구되는 대로 변형된다. 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스를 생성하고, 분리하고 변형시키기 위한 기술은 문헌에 서술되어 있고, 본 발명의 범위내에서 사용될 수 있다[Akli 일행, Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet 일행, Human Gene Therapy 1(1990) 241; EP 185 573, Levrero 일행, Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle 일행, Science 259 (1993) 988; Roemer and friedmann, Eur. J. Biochem 208 (1992) 211; Dobson 일행, Neuron 5 (1990) 353; Chiocca 일행, New Biol. 2 (1990) 739;Miyanohara 일행, New BioL 4 (1992) 238; WO 91/18088, WO 90/09441, WO 88/10311, WO 91/11525]. 그리고나서, 이들 다른 바이러스는 예컨대 결실, 치환, 첨가등에 의해 변형될 수 있다. 특히, 특정 경우에서, 이들 바이러스는 변형되어 그들이 그들의 복제에서 결손될 수 있다.
상기 지시된 바와 같이, 본 발명의 방법에 따른 재조합 AAV는 바람직하게 헬퍼 바이러스로 감염된 동물 세포계에서 생성된다.
일반적으로, 사용된 세포계 및 헬퍼 바이러스는 같은 종으로부터 유래된다. 이 면에서, 본 발명의 범위내에 사용될 수 있는 여러가지 동물 세포계는 문헌에 서술되었다. 이리하여, 개 세포계중에, 이점이 있는 그레이하운드 신장 세포계 GHK(Flow 실험실) 또는 MDCK 세포계(ATCC no. CRL 6253)가 인용될 수 있다. 이들 세포를 배양하고 바이러스 또는 바이러스 DNA를 제조하기 위한 조건은 문헌에 서술되었다(특히, Macartney 일행, Science 44 (1988) 9; Fowlkes 일행, J. Mol. BioL 132 (1979) 163 참고). 다른 동물계(예컨대, 기탁기관에서 이용가능한)가 또한 사용될 수 있다.
유리하게, 본 발명의 방법은 개 아데노바이러스로 감염된 개 세포계를 이용한다.
보다 바람직하게, 본 발명의 방법은 개 세포계로서 MDCK 또는 GHK 계 또는 이들 계의 유도체로 이행된다. 유도된 계는 이들 계로부터 얻어진 임의 계를 의미하는 것으로 이해되고, 적당한 조건에서 배양되고 감염되고/되거나 형질감염될때 재조합 AAV를 생성하는 그들의 능력을 보유한다. 특히, 유도된 계는 필요할때 외인성 유전자를 삽입하므로써, 돌연변이생성으로써, 및/또는 서브클론을 선별하므로써 얻어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 사용된 세포계는 또한 AAV 캡시드화 기능을 소유한다.
상기 지시된 바와 같이, 재조합 AAV는 일반적으로, 헬퍼 바이러스로 감염된 세포계에서, 두 AAV 역 반복 영역(ITR)에 의해 접해진 관심있는 유전자를 함유하는 플라스미드 및 AAV 캡시드화 기능을 운반하는 플라스미드로 동시 형질감염시키므로서 생성된다. 캡시드화 기능이 재조합 AAV로부터 결실되고 플라즈미드에 트랜스 방식으로 공급된다는 사실은, 표적 세포를 감염시킨 후에 감염성 바이러스 입자를 생성할 수 없는 결손된 재조합 AAV를 제조하는 것을 사실상 가능하게 한다. AAV 캡시드화 기능은 본질적으로 rep 및 cap 유전자, 또는 임의 기능의 상동성 유전자로 구성된다. rep 유전자는 바이러스 복제 뿐만 아니라 바이러스 유전자의 발현에 관련되고, cap 유전자는 바이러스의 엔벨로프 단백질을 암호화한다(VP1, VP2 및 VP3). 이들 유전자는 특성화되었고, 그들의 서열은 문헌에서 서술되었다(Srivastava 일행, J. Virol. 45 (1983) 555). 기능적 상동성 유전자는 rep 또는 cap 유전자의 변형(돌연변이, 억제, 첨가등)에 의해 얻어지고 같은 성질의 활성을 보이는 임의 유전자이다. 상기 기능적 상동성 유전자는 또한 똑같이 rep 또는 cap 유전자에 상응하는 합침을 사용하여 핵산 뱅크로부터의 하이브리드화에 의해 얻어진 운전자일 수 있다.
결손 재조합 AAV를 생성하는 것을 가능하게 하기 위해, 세포계는 본 발명에따라 유리하게 AAV 캡시드화 기능을 소유한다. 보다 바람직하게, 사용된 세포계는 AAV rep 및 cap 유전자의 또는 기능적 상동성 유전자의 하나 이상의 복사물을 소유한다.
본 발명에 따라, AAV 캡시드화 기능은 사용된 캡시드화 플라즈미드 및/또는 동물 헬퍼 바이러스에 의해 공급되고/되거나 세포계의 게놈내로 통합될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 모든 캡시드화 기능은 캡시드화 플라스미드로 칭해지는 플라즈미드에 의해 공급된다. 이 경우에서, 본 발명의 방법은 유리하게 동물 헬퍼 바이러스로 감염된 동물 세포계를 관심있는 유전자 및 적어도 하나의 AAV ITR를 운반하는 벡터 및 상기 AAV 캡시드화 플라스미드로 동시형질감염시키는 것으로 구성된다. 보다 바람직하게, AAV 캡시드화 플라즈미드는 적어도 AAV rep 및 cap 유전자 또는 기능적 동족체를 운반한다.
본 발명의 또 다른 특히 유리한 실시양태에서, 캡시드화 기능은 사용된 동물 헬퍼 바이러스에 의해 공급되고/되거나 세포계의 게놈내에 통합된다. 이 경우에, 본 발명의 방법은 동물 헬퍼 바이러스로 감염되고, (게놈내로 통합되고/되거나 헬퍼 바이러스에 의해 운반된) 캡시드화 기능을 함유하는 세포계내로 관심있는 유전자 및 적어도 하나의 AAV ITR를 운반하는 벡터를 형질감염시키는 것으로 구성된다. 이 실시양태는 캡시드화 플라즈미드가 사용될 필요가 없기 때문에 특히 유리하다.
보다 바람직하게, 본 발명의 방법에서, AAV rep 유전자, 또는 이 유전자의 기능적 동족체는 세포계의 게놈내로 통합되고, AAV cap 유전자 또는 이 유전자의 기능적 동족체는 동물 헬퍼 바이러스에 의해 운반된다. 본 발명의 이행의 또다른바람직한 변형에서, 게놈내로 삽입된, AAV rep 및 cap 유전자 또는 기능적 동족 유전자를 포함하는 세포계가 사용된다. 이 바람직한 실시양태에서, AAV rep 및 cap 유전자, 또는 그들의 기능적 동족체는 단일 작제물, 또는 순차적으로 개개의 작제물에 도입될 수 있다. 이들 다른 실시양태에서, 캡시드화 기능은 그들 자선의 프로모터, 이종 프로모터 또는 인공 프로모터의 조절하에 놓여질 수 있다. 유리하게, 캡시드화 기능은 유도가능한 전사 조절 요소의 조절하에 놓여져서, 조건에 따라 캡시드화 기능의 발현을 유발하거나 억제하는 것을 가능하게 한다. 특히 유사한 실시양태에서, AAV rep 유전자 또는 기능적 상동성 유전자는 유도가능한 프로모터의 조절하에 본 발명의 작제물에 놓여진다.
본 발명의 이행의 또 다른 바람직한 변화에서, 게놈내에 AAV rep 및 cap 유전자, 또는 기능적 상동성 유전자를 포함하는 헬퍼 바이러스가 사용된다.
출원인은 사실상 캡시드화 기능들 또는 그둘중 특정한 것을 사용된 헬퍼 바이러스의 게놈내로 직접 삽입하는 것이 가능하다는 것을 증명했다. 같은 방식에서, 출원인은 또한 캡시드화 기능들, 또는 그들중 특정한 것을 안정한 방식으로 사용된 세포계의 게놈내로 직접 삽입하는 것이 가능하다는 것을 증명했다.
이 면에서, 본 발명의 목적은 재조합 AAV를 생성하기 위해 헬퍼 바이러스에 의해 감염될 수 있고, 게놈내로 통합된 AAV 캡시드화 기능의 모두 또는 일부를 함유하는 임의 동물 세포계이다. 바람직하게, 본 발명은 게놈내로 통합된 AAV rep 유전자 또는 기능적 동족 유전자를 포함하는 임의 동물 세포계에 관한 것이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 게놈내로 통합된 AAV rep 및 cap 유전자, 또는 기능적 동족 유전자를 포함하는 임의 동물 세포계에 관한 것이다.
세포계는 특히 유리하게, 예컨대 MSCK 또는 GHK 계로 부터 얻어진 계같은 개 세포계이다.
본 발명의 세포계는 발현 시그날의 조절하에 AAV 캡시드화 기능을 운반하는 DNA 단편으로 형질감염시키므로써 얻어질 수 있다. 형질감염은 당업자에게 공지된 임의 기술(인산칼슘 침전, 리포팩션(lipofection), 전기투공법(electroporation), 리포좀의 사용등)에 의해 실행될 수 있다. 바람직하, 형질감염은 인산칼슘의 존재하에 수행된다 (실시예 5 참고). 여러가지 발현 시그날은 캡시드화 기능의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이들 발현 시그날은 rep 또는 cap 유전자의 천연 프로모터, 이종 프로모터 또는 심지어 합성 프로모터일 수 있다. 하나의 특히 유리한 실시양태에서, AAV 캡시드화 기능은 유도가능한 프로모터(LTR-MMTV, Tc 등)의 조절하에 본 발명에 따른 세포계에 놓여진다. 이 유형의 프로모터의 사용은, 이것이 특별히 사용된 헬퍼 바이러스에 대한 rep 유전자의 효과를 조절하는것을 가능하게 하기 때문에 특히 유리하다. 이리하여, 본 발명의 목적은 재조합 AAV를 생성할 목적을 위해 헬퍼 바이러스에 의해 감염될 수 있고, 하나 이상의 유도성 프로모터의 조절하에 게놈내로 통합될 AAV 캡시드화 기능 모두 또는 일부를 포함하는 임의 세포계이다.
AAV rep 및 cap 유전자 (또는 기능적 동족체)를 포함하는 계의 경우에, 이들 유전자는 단일 작제물, 또는 순차적 방식으로 두 분리된 작제물에 형질감염될 수 있다. 이 제조의 제 2 방법은 그것이 가능한한 많이 재조합 과정을 제한하기 때문에 특히 유리하다. 그러므로, 이 방식으로 얻어진 계는 특히 안정하다. 게다가, 형질 감염을 위해 사용된 작재물은 또한 유리하게 변형된 세포를 선별하는 것을 가능하게 하는 유전자 및 예컨대 제네티신(geneticin)에 대한 내성의 유전자를 운반한다. 내성 유전자는 또한 제 1 단편으로 동시형질감염된 다른 DNA 단편에 의해 운반될 수 있다.
형질 감염후에, 형질전환된 세포는 (예컨대 제네티신에 대한 그들의 내성을 기초로) 선별되고, 그들의 DNA는 게놈내로 DNA 단편 또는 단편들 (2 분리된 작제물이 사용될때)의 통합을 확증하기 위해 노던·블로팅에 의해 분석된다. 그리고나서, 생성된 세포의 AAV 캡시드화 능력은 상기 기능이 결여된 재조합 AAV로 감염시키므로써 테스트될 수 있다.
본 발명의 목적은 또한, 게놈내로 삽입된, AAV 캡시드화 기능 모두 또는 일부를 포함하는 재조합 AAV를 생성하기 위한 임의 헬퍼 바이러스이다. 보다 바람직하게, 본 발명은, 게놈내로 삽입된, AAV rep 유전자 또는 기능적 상동 유전자를 포함하는 재조합 AAV를 생성하기 위한 임의 헬퍼 바이러스에 관한 것이다. 또한 바람직하게, 본 발명은, 게놈내로 삽입된, AAV rep 및 cap 유전자 또는 기능적 상동 유전자를 포함하는 재조합 AAV를 생성하기 위한 임의 헬퍼 바이러스에 관한 것이다.
유리하게, 재조합 AAV를 생성하기 위한 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스이다. 본 발명에 따른 AAV 캡시드화 기능을 포함하는 아테노바이러스는, 특히 상기 캡시드화 기능을 운반하는 플라즈미드와 아데노바이러스 사이에 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다. 적당한 세포계내로 상기 아데노바이러스와 플라즈미르의 동시형질감염에 따라 동종 재조합이 일어난다. 계의 예로서, 특히 게놈내로 통합된, Ad 5 아데노바이러스의 게놈의 왼쪽 부분(12%)을 함유하는 사람 배(胚) 신장 계 293 (Graham 일행, J. Gen. ViroL 36 (1977) 59), 또는 MDCK 계가 언급될 수 있다. 연속적으로, 복제된 벡터는 분자 생물학의 통상의 기술에 의해 회수되고 정제된다. 훨씬 더 특별히, 아데노바이러스는 바람직하게 Ad 2및 Ad 5 아데노바이러스로 부터 선택되는 사람 기원의 아데노바이러스; 바람직하게 개 아데노바이러스(CAV1 및 CAV2)로 부터 선택되는 동물 기원의 아데노바이러스이다. AAV 캡시드화 기능은 본 발명의 헬퍼 바이러스의 게놈의 다른 영역내로 도입될 수 있다. 유리하게, 캡시드화 기능은 AAV를 트랜스보충하는 바이러스의 능력이 붕괴되지 않는 영역내로 삽입된다. 헬퍼 바이러스의 게놈의 기능적 영역내로 캡시드화 기능을 삽입하는 것이 또한 가능하고, 이때 영역은 사용된 플라즈미드 또는 세포계에 의해 트랜스 방식으로 공급된다. 이리하여, 사람 아데노바이러스 Ad 2 또는 Ad 5에 대해, 예컨대 E1 유전자를 대신하도록 rep 유전자, cap 유전자 또는 rep 및 cap 유전자를 삽입하는 것이 가능하다. 결과 얻어진 아데노바이러스는, 게놈내에 E1 유전자를 운반하는, 세포계 293에서 재조합 AAV를 생성하기 위한 헬퍼 바이러스로서 사용될 수 있다 (실시예 6 참고).
이리하여, 본 발명의 방법은 치료적으로 사용될 수 있는 재조합 AAV를 생성하는 것을 가능하게 한다. 얻어진 제조합 AAV는 게놈이 적어도 관심있는 유전자를 삽입하므로써 변형될 수 있는 임의 AAV 일 수 있다. 상기 지적된 바와 같이, 여러 유형의 재조합 AAV는 선행 기술에서 서술되었다 (WO 91/18088; WO 93/09239; US4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). 일반적으로, 이들 AAV는 rep 및/또는 cap 유전자에 있어서 부분 또는 전체 결실을 포함하고, 이 결실부위에서 관심있는 유전자가 삽입된다. 이들 재조합 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3 및 AAV4 같은 다른 AAV 혈청형, 및 바람직하게 AAV2 균주로 부터 제조될 수 있다. 관심있는 유전자는 특히 치료학적 유전자일 수 있다.
본 발명의 의미내에, 치료학적 유전자는 특별히 치료학적 효과를 갖는 단백질 생성물을 암호화하는 이의 유전자를 의미하는 것으로 이해된다. 이 방식으로 암호화된 단백질 생성물은 단백질, 펩티드등일 수 있다. 이 단백질 생성물 (즉, 표적 세포가 임의 병변을 보이지 않을때 표적 세포내 정상적으로 발현된 생성물)은 표적 세포에 대해 상동일 수 있다. 이 경우에, 단백질의 발현은 예컨대 변형되었기 때문에 불활성인 또는 약간 활성인 단백질의 발현 또는 세포내 불충분한 발현을 보충하거나, 심지어 상기 단백질을 과발현시키는 것을 가능하게 한다. 치료학적 유전자는 또한 향상된 안정도, 변형된 활성등을 갖는 세포 단백질의 돌연변이체를 암호화할 수 있다. 단백질 생성물은 또한 표적 세포에 대해 이종일 수 있다. 이 경우에, 발현된 단백질은, 예컨대 세포내 부족한 활성을 보충하거나 공급할 수 있어서, 세포가 병리학적 과정을 견디거나, 그렇지 않으면 면역 반응을 촉진하게 한다.
보다 특별히, 본 발명의 의미내에 인용될 수 있는 치료학적 생성물은 효소, 혈액 생성물, 호르몬, 림포킨; 인터루킨, 인터페론, TNF 등 (FR 9203120),성장 인자(에리트로포이에던, G-CSF, M-CSF, GM-CSF 등) 신경전달물질 또는 그들의 전구체 또는 그들을 합성하는데 책임이 있는 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF,GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀(pleiotrmphin) 등; 아포리포프로테인; ApoAI, ApoAIV, ApoE 등 (FR 93 05125), 리포프로테인 리파제(LPL), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 9111947), 낭포성섬유증과 연관된 CFIR 단백질, 종양-억제 유전자: p 53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등 (FR 93 04745), 응혈과 관련된 하기 인자를 암호화하는 유전자: Factors VII, VIII, IX, DNA의 수복을 조정하는 유전자, 자기 불활화 유전자(티미딘 키나제 또는 시토신 디아미나제)등을 포함한다.
치료학적 유전자는 또한 표적 세포내 발현이 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절하는 것을 가능하게 하는 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있다. 상기 서열은, 예컨대 특허 EP 140 308 에서 서술된 기술에 따라, 세포 mRNA의 상보적 RNA로 표적 세포에서 전사되어 단백질로의 그들의 해독을 차단할 수 있다. 안티센스 서열은 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 리보짐을 암호화하는 서열을 포함한다 (EP 321 201).
관심있는 유전자는 또한 사람 또는 동물에 면역 반응을 생성할 수 있는 항원성 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 서열을 함유할 수 있다. 본 발명의 이 특정 실시양태에서, 재조합 AAV는 사람 또는 동물에, 특별히 미생물, 바이러스 또는 암에 대해 적용된 백신 또는 면역치료학적 치료제를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이들 백신 또는 면역치료학적 치료제는 특히 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스 (EP 185 513), 의-광견병 바이러스에 특이적인 또는 달리 종양(EP 259 212)에 특이적인 항원성 펩티드일 수 있다.
바람직하게, 관심있는 유전자는 또한 원하는 세포 또는 기관내 그의 발현을 허용하는 서열을 포함한다. 이들은 이들이 감연된 세포에서 기능할 수 있을때 문제의 유전자의 발현에 천연적으로 책임이 있는 서열일 수 있다. 그들은 또한 다른 기원을 갖는 서열 (다른 단백질 또는 심지어 합성 서열의 발현에 책임이 있는 서열)일 수 있다. 그들은 특별히 진행 세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예컨대, 그들은 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터 생기는 프로모터 서열일 수 있다. 달리, 그들은 바이러스의 게놈으로부터 생기는 프로모터 서열일 수 있다. 이 면에서, 유전자 E1A, MLP, CMV 또는 LTR-RSV 등의 프로모터가 예로써 언급될 수 있다. 게다가, 이들 발현 서열은 활성화 서열, 조절 서열 또는 관심있는 유전자에 조직-특이성 발현을 제공하는 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
더욱이, 관심있는 유전자는 또한 합성된 치료학적 생성물을 표적 세포의 분비 경로로 향하게 하는 시그날 서열을 포함할 수 있다. 이 시그날 서열은 치료학적 생성물의 천연 시그날 서열일 수 있으나, 그것은 또한 임의 다른 기능적 시그날 서열 또는 그렇지 않으면 인공 시그날 서열일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 재조합 AAV는 관심있는 유전자는 시험관내, 생체외 또는 생체내로 전이하기 위해 사용될 수 있다. 시험관내, 그들은 예컨대 재조합 단백질을 생성할 목적으로 유전자를 세포계에 전이시키는 것을 가능하게 할 수 있다. 생체외에서, 그들은 세포를 유기체로 재 투여하기 위해 이들 세포에 원하는 특성을 제공할 목적으로, 유기체로 부터 제거되고, 적당하다면, 선택되고 증식된 세포 집단에 유전자를 전이시키기 위해 사용될 수 있다. 생체내에서, 그들은 정제되고, 적당하다면, 하나 이상의 제약학적 기초첨가제와 결합되는 용액을 직접 투여하므로써 유전자를 전이하기 위해 사용될 수 있다. 이 후자의 경우에, 재조합 AAV는 국소적, 피부, 경구, 직장, 질, 비경구적, 비내(鼻內), 정맥내, 근육내, 피하, 안내(眼內), 경피등 경로에 의해 그들을 투여할 목적을 위해 배합될 수 있다. 바람직하게, 그들은 주입가능한 배합물에 대해, 특별히 원하는 기관내로 직접 주입을 위해 허용가능한 제약학적 기초첨가제와 결합된다. 이들 배합물은 특히, 상황에 따라 멸균수 또는 생리학적 혈청의 첨가로써 주입가능한 용액을 제조하는 것을 가능하게 하는 멸균 또는 등장성 용액 또는 특별히 동결 건조된 건조한 조성물일 수 있다. 주입에 사용된 AAV의 투여량뿐만 아니라 투여 횟수는 여러가지 파라미터에 따라, 특별히 사용된 투여 방법, 관련된 병변, 발현될 유전자 또는 그렇지 않으면 필요로 하는 치료 기간에 따라 응용될 수 있다.
이리하여, 본 발명은 상기 질병을 치료할 수 있는 유전자를 함유하는 재조합 AAV의 생체내 투여로 구성되는, 특별히 질병을 치료하기 위한 방법에서, 치료학적으로 사용될 수 있는 재조합 AAV를 제조하기 위한 특히 유리한 방법을 제공한다. 보다 특별히, 이 방법은 단백질 또는 핵 생성물 결핍으로 인한 질병에 적용될 수 있고, 이때 관심있는 유전자는 상기 단백질 생성물을 암호화하거나, 상기 핵 생성물을 함유한다.
본 발명은 하기 실시예의 도움으로 보다 상세히 서술될 것이고, 이는 설명적이고 제한적이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
[분자 생물학의 일반적 기술]
분자 생물학에서 통상적으로 사용되는 방법, 예컨대 플라즈미드 DAN의 예비 추출, 염화세슘 구배내 플라즈미드 DNA의 원심분리, 아가로스 또는 아크릴아미드 겔상 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편의 정제, 페놀 또는 페놀/클로로포름으로의 단백질의 추출, 에탄올 또는 이소프로판올을 사용한 생리식염수 매질내 DNA의 침전, 대장균내로의 형질전환등은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 문헌에서 풍부하게 서술된다 [Msniatis T. 일행, "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982; Ausubel F. M. 일행 (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
pBR322 및 pUC 유형의 플라즈미드 및 M 13 시리즈의 파아지는 상업적으로 얻어졌다 (Bethesda Research Laboratories).
연결을 위해, DNA 단편은 아가로스 또는 아크릴아미드 겔상 전기영동에 의해 그들의 크기에 따라 분리되고, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물로 추출되고, 에탄올을 사용하여 침전되고나서, 공급자의 추천에 따라 파아지 T4 DNA 리가제(Biolabs)의 존재하에 항온처리될 수 있다.
5' 돌출된 말단은 공급자의 시방서에 따라 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I(Biolabs)의 클레나우 단편을 사용하여 채워질 수 있다. 3' 돌출 말단은 제작자의 추천에 따라 사용된 파아지 T4 DNA 폴리머라제 (Biolabs)의 존재하에 제거된다. 5' 돌출 말단은 S1 누클레아제로 주의 깊게 처리하므로써 제거된다.
합성 올리고데옥시누클레오티드를 사용하는 시험관내 부위-지향성 돌연변이유발은 Amersham에 의해 공급된 키트를 사용하여 Taylor 일행 [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]에 의해 개발된 방법에 따라 수행될 수 있다.
PCR [polymerase-catalyzed chain reaction, Saiki R. K. 일행, Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K. B. 및 Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987)335-350]로 칭해지는 기술에 의해 DNA 단편의 효소적 증폭은 제작자의 시방서에 따라 DNA 열 사이클러(Perkin Elmer Cetus)를 사용하여 수행될 수 있다.
누클레오티드 서열은 Amersham에 의해 공급된 키트를 사용하여 Sanger 일행 [Proc. Natl. Acad. Si, USA, 74 (1977) 5463-5457]에 의해 개발된 방법에 의해 확인될 수 있다.
실시예 1 - 캡시드화 플라즈미드 pREP-CAP의 작제.
이 실시예는 재조합 AAV를 캡시드화시키기 위해 필요한 기능을 운반하는 캡시드화 플라즈미드를 칭해진 플라즈미드의 작제를 서술한다. 보다 정확하게, pREP-CAP로 지시된 이 플라즈미드는 AAV2의 rep 및 cap 유전자를 운반한다.
플라즈미드 pREP-CAP를 하기 방식으로 제조했다 : ITR이 결실된 AAV2 게놈을 효소 XbaI로 분해시키므로써 플라즈미드 p201로 부터 분리시켯다. 플라즈미드 p201은 플라즈미드 pEMBL8의 PvuII 부위에서 클로닝된 전체 AAV2 게놈을 함유한다 (Samulski 일행, J. Virol. 61 (1987) 3096). 그리고나서, rep 및 cap 유전자를 운반하는 이렇게 얻어진 단편을 Bluescript 플라즈미드(Stratagene)의 XbaI 부위로 클로닝시켰다. 이 플라이즈미드의 구조는 도 1에서 묘사된다.
실시예 2 - AAV 플라즈미드 pAAV-EPO-NEO의 작제
이 실시예는 에리트로포이에틴 암호화 cDNA, 마커 유전자, 및 두 AAV2 ITR를 운반하는 AAV 플라즈미드의 작제를 서술한다. 이 플라즈미드는 pAAV-EPO-NEO로 칭했다 (도 2).
이 플라즈미드를 작제하기 위해, Rous 육종 바이러스(RSV)의 LTR의 조절하에 있는 에리트로포이에틴 암호화cDNA (시노몰거스(cynomolgus)), 그 뒤에 SV 40 바이러스의 초기 프로모터의 조절하에 있는 네오마이신에 대한 내성을 제공하는 유전자 neo를 함유한 발현 카세트를 제조했다. 그리고나서, 이 카세트를 플라즈미드 p201의 SacII/KpnI 부위내로 삽입하여, rep 및 cap 유전자를 함유하는 상응하는 단편을 대체시켰다 (도 2).
실시예 3 - 세포계 MDCK에서 개 아데노바이러스 CAV2의 생성
이 실시예는 개 세포계 MDCK에서 개 아테노바이러스 CAV2의 생성을 서술한다.
MDCK 세포를 10% 송아지 혈청으로 보충된 DMEM 배지에서 배양했다 (또한, 배양 조건을 위해 Macartney 일행, Science 44 (1988) 9 참고). 그리고나서, 융합 세포를 CAV2 바이러스의 현탁액 (약 5 pfu/세포)으로 감염시켰다. 감염 30 내지 48시간후에, 감염된 세포를 수거하고, 원심분리에 의해 농축시켰다. 얻은 펠릿을 염화세슘상 CAV2 아데노바이러스를 정제하기위해 사용할 수 있다. 그러나, 역가가 너무 약하면, 펠릿을 바람직하게 동결 및 해동의 순환에 적용시키고나서, 결과 얻은 상등액을 CAV2 바이러스를 증폭시키기 위해 사용한다. 이를 위해, 상등액을 같은 조건하에 MDCK 세포를 재감염시키는데 사용하고나서, 바이러스를 회수하기 위해 상기 서술된 프로토콜을 반복한다. 이 절차는 재조합 AAV를 생성하기 위해 헬퍼 바이러스로서 사용될 수 있는 CAV2 아데노바이러스의 정제 용액을 얻는것을 가능하게 한다.
실시예 4 - 개 헬퍼 아데노바이러스로 감염된 MDCK 세포계에서 에리트로포이에틴 유전자를 운반하는 재조합 AAV의 생성
이 실시예는 개 아데노바이러스 CAV2로 감염된 MDCK 세포계에서 에리트로포이에틴 유전자를 운반하는 AAV 재조합의 생성을 서술한다.
MDCK 세포 (50% 융합에서)를 5-10 pfu/세포에서 실시예 3의 조건하에 제조한 CAV2 아데노바이러스로 감염시켰다. 감염 4 내지 6 시간 후에, 세포를 플라즈미드 pAAV-EPO-NEO 5㎍ 및 플라즈미드 pREP-CAP 5㎍로의 리포펙션(Fegner 일행, PNAS 84 (1987) 7413)에 의해 동시형질감염시켰다. 이 48 내지 72 시간후에, 세포를 수확하고, 여러 순환의 동결 및 해동에 적용시켰다. 결과 얻은 현탁액을 연속하여 원심분리하고나서 (4000 rpm에서 15분), 재조합 AAV를 함유하는 상등액을 회수하고, 30분동안 56℃에서 가열했다.
감염성 및 에리트로포이에틴 발현을 확립하기위해, 상등액의 샘플을 Hela 세포를 감염시키는데 사용했다. Hela 세포를 사람 상피 암종으로 부터 유도한다. 이 계는 그것을 배양하기 위한 조건에 따라 ATCC (ref. CCL2)로 부터 얻어질 수 있다. 세포 및 상등액을 감염 24 시간후에 수확했다. 이들 세포에서 AAV-EPO 재조합 게놈의 존재를 Hirt 기술 (Ghuzman and Van Doren, J. ViroL 45 (1983) 91)에 의해 추출된 세포 DNA에 대한 서어던 블롯 하이브리드화 실험을 수행하므로써 연속적으로 확증했다. 게다가, 상등액내 에리트로포이에틴의 존재를 생물학적 테스트에 의해 증명했다.
이들 결과는, 재조합 AAV가 동물 시스템 (세포계 및 헬퍼 바이러스)에서 효율적으로 제조될 수 있다는 것을 명백하게 보인다.
실시예 5 - AAV 캡시드화 기능을 함유하는 세포계의 작제
이 실시예는 AAV 캡시드화 기능 모두 또는 일부를 함유하는 세포계의 작제를 서술한다. 이들 계는 캡시드화 플라즈미드를 사용하지 않고 이들 영역이 결실된 본 발명에 따른 재조합 AAV의 작제를 허용한다. 이들 바이러스는 생체내 재조합에 의해 얻어지고, 긴 이종 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 계를 전사 프로모터 및 터미네이터 (폴리아데닐화 부위)의 조절하에 지시된 유전자를 운반하는 DNA 단편으로 적당한 세포를 형질감염시키므로써 작제한다.
특별히 인산칼슘의 존재하에 리포팩션, 전기투공법등에 의해 다른 방식으로 형질감염을 실행할 수 있다. 이 실시예에서, 형질감염을 인산칼슘의 존재하에 수행한다.
터미네이터는 형질감염된 유전자의 천연 터미네이터 또는 다른 터미네이터, 예컨대 SV40 바이러스의 초기 메센저(messenger)의 터미네이터일 수 있다.
서술된 세포계에서, rep 및/또는 cap 유전자를 텍사메타손에 의해 유발된 유도가능한 프로모터; MMTV의 LTR (Pharmacia)의 조절하에 놓는다. 다른 프로모터, 특별히 예컨대 이종 조절 영역(특별히 인핸서 영역)을 운반하는 MMTV의 LTR의 변이체, 또는 그렇지 않으면 테트라사이클린(Tc) 프로모터가 사용될 수 있다는 것이 이해된다. 더욱이, 서술에서 지시되는 바와 같이, 프로모터는 또한 사용된 유전자의 천연 프로모터일 수 있다.
유리하게, DNA 단편은 또한 형질 전환된 세포의 선별을 허용하는 유전자를 운반한다. 특히, 이 유전자는 예컨대 제네티신에 대한 내성을 암호화하는 유전자같은 항생물질에 대한 내성에 대한 유전자일 수 있다. 이 마커 유전자는 또한 제1 단편으로 동시 형질감염된 다른 DNA 단편에 의해 수행될 수 있다.
형질감염후에, 형질전환 세포를 선별하고(제네티신에 대한 내성), DNA 단편 또는 단편들(2개의 분리된 작제물이 사용될때)의 게놈내로의 혼입을 확증하기 위해 그들의 DNA를 노어던 블로팅에 의해 분석한다. 그리고나서, 세포를 적당한 헬퍼 바이러스로 감염시키고 적당한 AAV 플라즈미드로 형질감염시킨후에 재조합 AAV를 캡시드화하는 그들의 능력에 대해 테스트 한다.
이 기술은 하기 세포계를 얻는 것을 가능하게 한다 :
1. MMTV의 LTR의 조절하에 rep 유전자를 소유하는 MDCK 세포;
2. MMTV의 LTR의 조절하에, 같은 DNA 단편상에, rep 및 cap 유전자를 소유하는 MDCK 세포;
3. MMTV의 LTR의 조절하에, 두개의 다른 DNA 단편상에, rep 및 cap 유전자를 소유하는 MDCK 세포.
실시예 6 - AAV 캡시드화 기능을 함유하는 아데노바이러스의 작제
이 실시예는 게놈내로 삽입된 AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 아데노바이러스의 작제를 서술한다. 아데노바이러스 Ad-RSV. Rep-Cap을 돌연변이체 아데노바이러스 AA d11324 (Thimmappaya 일행, Cell 31 (1982) 543]와 벡터 pAd. RSV. Rep-Cap 사이에 생체내 상동 재조합에 의해 얻는다.
6.1 플라즈미드 pAd. RSV. Rep-Cap의 작제 (도 3)
AAV rep 및 cap 유전자를 운반하는 DNA 단편을 β-gal 유전자로 치환하므로써 플라즈미드 pAd. RSV. βGal [Stratford-Perricandet 일행, J. Clim. Invest (1992) 626]로부터 플라즈미드 pAd. RSV. Rep-Cap를 제조했다.
이를 행하기 위해, ITR이 결실된 AAV2 게놈을 함유하는 XbaI 단편을 프라즈미드 p201로부터 분리했다(실시예 1 참고). 그리고나서, 이 단편을 Bluescript 플라즈미드의 XbaI 부위내로 서브클로닝시켰다. 그리고나서, 이 단계는 NotI/ClaI 단편의 형태로 AAV rep 및 cap 유전자를 포함하는 단편을 분리하는 것을 가능하게 한다. 그리고나서, 이 단편을 벡터 pAd. RSV. βGal의 XbaI (왼쪽 ITR의 위치된 다운스트림) 및 ClaI (Ad5의 PIX의 위치된 업스트림) 부위내로 클로닝시켜, rep 및 cap 유전자에 의한 βgal 유전자의 치환을 초래했다.
6.2 결손 재조합 아데노바이러스 Ad. RSV. Rep-Csp의 작제
상동 재조합이 일어나는 것을 가능하게 하기 위해 효소 ClaI로 선형화된 플라즈미드 pAd. RSV. Rep-Cap 및 아데노바이러스 Ad. d11324를 인산칼슘의 존재하에 계 293 내로 동시형질감염시킨다. 이 방식으로 생성된 재조합 아데노바이러스를 플라크 정제에 의해 선별한다. 분리 후에, 재조합 아데노바이러스의 DNA를 세포계 293에서 증폭시킨다.
일반적으로, 바이러스 입자를 공지된 기술(특히, Graham 일행, Virology 52(1973) 456 참고)에 따라 염화세슘 구배로 원심분리시키므로써 정제한다. Ad. RSV. Rep-Cap 아데노바이러스를 -80℃에서 20% 글리세롤내에 보존할 수 있다.
rep 또는 cap 유전자중 하나만을 삽입하면서 같은 방법을 반복할 수 있다. 더욱이, 삽입을 아데노바이러스 게놈내 다른 자리에서 수행할 수 있다.

Claims (27)

  1. 사람 세포에서 증식할 수 없는 동물 헬퍼 바이러스의 존재하에 생성되는 것을 특징으로 하는, 재조합 아데노-수반 바이러스(AAV) 생성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 동물 헬퍼 바이러스로 감염된 동물 세포계에서 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 동물 헬퍼 바이러스가 개, 소, 쥐, 양 돼지, 새 또는 원숭이 기원의 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 동물 헬퍼 바이러스가 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 및 종두 바이러스 중에서 선택되는 것을 특징으로하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 동물 헬퍼 바이러스가 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 동물 헬퍼 바이러스가 개 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 방법,
  7. 제6항에 있어서, 동물 헬퍼 바이러스가 CAV-1 및 CAV-2 균주 중에 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 개 세포계에서 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 세포계가 MDCK계 또는 GHK계 또는 이들 계의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포계가 부가적으로 AAV 캡시드화 기능을 소유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, AAV 캡시드화 기능이, 적절하게는 이종 전사 조절 요소의 조절하에 놓여진, AAV rep 및 cap 유전자 또는 기능적 상동체로 구성되는 것을 특징으로하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, AAV 캡시드화 기능이 캡시드화 플라즈미드 및/또는 동물 헬퍼 바이러스에 의해 공급되고/되거나 세포계의 게놈내로 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, AAV rep 유전자 또는 이 유전자의 기능적 상동체가 계의게놈내로 통합되고, AAV cap 유전자 또는 이 유전자의 기능적 상동체가 동물 헬퍼 바이러스에 의해 운반되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, AAV rep 및 cap 유전자 또는 기능적 상동 유전자가 세포계의 게놈내로 통합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, AAV rep 및 cap 유전자 또는 기능적 상동 유전자가 헬퍼 바이러스에 의해 운반되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 재조합 AAV를 생성하기 위해, 사람 세포에서 증식할 수 없는 헬퍼 바이러스로 감염될 수 있고, 게놈 내로 통합된 AAV 캡시드화 기능의 모두 또는 일부를 포함하는 동물 세포계.
  17. 재조합 AAV를 생성하기 위해 사람 세포에서 증식할 수 없는 헬퍼 바이러스로 감염될 수 있고, 하나 이상의 유도성 프로모터의 조절 하에 게놈 내로 통합된 AAV 캡시드화 기능의 모두 또는 일부를 포함하는 동물 세포계.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 게놈 내로 통합된, AAV rep 유전자 또는 기능적 상동 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포계.
  19. 제16항 또는 제18항에 있어서, 게놈 내로 통합된, AAV rep 및 cab 유전자 또는 기능적 상동 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포계.
  20. 제17항에 있어서, 유도성 프로모터가 MMTV의 LTR 또는 Tc 프로모터중에 선택되는 것을 특징으로 하는 세포계.
  21. 제16항에 있어서, MDCK 또는 GHK계로부터 수득됨을 특징으로 하는 세포계.
  22. 게놈 내로 삽입된, AAV 캡시드화 기능의 모두 또는 일부를 포함하는 재조합 AAV를 생성하기 위한, 사람 세포에서 증식할 수 없는 헬퍼 바이러스.
  23. 제22항에 있어서, 게놈 내로 삽입된 AAV rep 유전자 또는 기능적 상동 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 헬퍼 바이러스.
  24. 제22항에 있어서, 게놈 내로 삽입된, AAV rep 및 cap 유전자 또는 기능적 상동 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 헬퍼 바이러스.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 헬퍼 바이러스.
  26. 제25항에 있어서, 동물 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 헬퍼 바이러스.
  27. 제26항에 있어서, 바람직하게는 CAV1 및 CAV2 아데노바이러스 중에 선택되는, 개 아데노바이러스인 것을 특징으로 하는 헬퍼 바이러스.
KR1019960704129A 1994-01-28 1995-01-18 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도 Expired - Fee Related KR100403708B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR94-00934 1994-01-28
FR9400934A FR2716682B1 (fr) 1994-01-28 1994-01-28 Procédé de préparation de virus adéno-associés (AAV) recombinants et utilisations.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100403708B1 true KR100403708B1 (ko) 2004-05-31

Family

ID=9459501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019960704129A Expired - Fee Related KR100403708B1 (ko) 1994-01-28 1995-01-18 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5789390A (ko)
EP (1) EP0741793B1 (ko)
JP (1) JP3810078B2 (ko)
KR (1) KR100403708B1 (ko)
AT (1) ATE310097T1 (ko)
AU (1) AU706647B2 (ko)
CA (1) CA2181602A1 (ko)
DE (1) DE69534618T2 (ko)
DK (1) DK0741793T3 (ko)
ES (1) ES2252738T3 (ko)
FI (1) FI962990A7 (ko)
FR (1) FR2716682B1 (ko)
IL (1) IL112461A0 (ko)
MX (1) MX9603002A (ko)
NO (1) NO319885B1 (ko)
WO (1) WO1995020671A1 (ko)
ZA (1) ZA95628B (ko)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6814962B1 (en) * 1994-06-02 2004-11-09 Aventis Pharma S.A. Recombinant viruses and their use for treatment of atherosclerosis and other forms of coronary artery disease and method, reagent, and kit for evaluating susceptibility to same
US20020159979A1 (en) 1994-06-06 2002-10-31 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5658785A (en) * 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) * 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
FR2738575B1 (fr) * 1995-09-08 1997-10-10 Centre Nat Rech Scient Cellules pour la production d'adenovirus recombinants
IL116816A (en) * 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US5756283A (en) * 1995-06-05 1998-05-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy
FR2735789B1 (fr) * 1995-06-23 1997-07-25 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant
US6207457B1 (en) * 1995-09-08 2001-03-27 Avigen, Inc. Targeted nucleotide sequence delivery and integration system
US6162796A (en) * 1995-09-27 2000-12-19 The Rockefeller University Method for transferring genes to the heart using AAV vectors
US20060088938A1 (en) * 1995-12-15 2006-04-27 Mitchell Lloyd G Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing in plants
US20030027250A1 (en) * 1995-12-15 2003-02-06 Mitchell Lloyd G. Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing
US5846528A (en) 1996-01-18 1998-12-08 Avigen, Inc. Treating anemia using recombinant adeno-associated virus virions comprising an EPO DNA sequence
US5962313A (en) * 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
US5858351A (en) 1996-01-18 1999-01-12 Avigen, Inc. Methods for delivering DNA to muscle cells using recombinant adeno-associated virus vectors
US20020037867A1 (en) * 1999-02-26 2002-03-28 James M. Wilson Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US5866552A (en) * 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
EP0928202A4 (en) * 1996-09-25 2001-09-05 Cell Genesys Inc NON-INVASIVE ADMINISTRATION OF ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS
EP0950091A2 (en) * 1996-12-18 1999-10-20 Targeted Genetics Corporation Aav split-packaging genes and cell lines comprising such genes for use in the production of recombinant aav vectors
US20040161409A1 (en) * 1997-07-25 2004-08-19 Kurtzman Gary J. Induction of immune response to antigens expressed by recombinant adeno-associated virus
US6242426B1 (en) * 1997-07-25 2001-06-05 Avigen, Inc. Induction of immune response to antigens expressed by recombinant adeno-associated virus
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6251677B1 (en) 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
US6642051B1 (en) 1997-10-21 2003-11-04 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus(AAV) packaging cassettes for the production of recombinant AAV vectors
BR9813391C1 (pt) * 1997-12-03 2021-05-25 Roche Diagnostics Gmbh processo para produzir uma composição de epo e processo para aumentar a atividade específica de uma composição de epo
DE19830141A1 (de) * 1998-07-06 2000-01-13 Regine Heilbronn Rekombinante Herpesviren für die Erzeugung rekombinanter Adeno-Assoziierter-Viren
US6303362B1 (en) 1998-11-19 2001-10-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Adenoviral vector and methods for making and using the same
US6759050B1 (en) 1998-12-03 2004-07-06 Avigen, Inc. Excipients for use in adeno-associated virus pharmaceutical formulations, and pharmaceutical formulations made therewith
US6387368B1 (en) 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
DE19905501B4 (de) 1999-02-10 2005-05-19 MediGene AG, Gesellschaft für molekularbiologische Kardiologie und Onkologie Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus, geeignete Mittel hierzu sowie Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels
US20040043488A1 (en) * 1999-02-17 2004-03-04 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Adeno-associated viral gene-transfer vector system
US6893865B1 (en) 1999-04-28 2005-05-17 Targeted Genetics Corporation Methods, compositions, and cells for encapsidating recombinant vectors in AAV particles
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
US7208315B2 (en) 2000-01-05 2007-04-24 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for efficient AAV vector production
WO2001062942A2 (en) * 2000-02-25 2001-08-30 Ludwig Institute For Cancer Research MATERIALS AND METHODS INVOLVING HYBRID VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR DNAs AND PROTEINS AND SCREENING METHODS FOR MODULATORS
JP2004536553A (ja) * 2000-09-30 2004-12-09 ディヴァーサ コーポレイション 始原ゲノムの本質部分突然変異、突然変異の組合せおよび任意反復による全細胞工学
US6916635B2 (en) * 2000-10-02 2005-07-12 The Research Foundation Of State University Of New York Hybrid adenovirus/adeno-associated virus vectors and methods of use thereof
US20040126774A1 (en) * 2001-01-08 2004-07-01 Mitchell Lioyd G. Correction of factor VIII genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
WO2002082904A2 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of treating or retarding the development of blindness
CA2460157A1 (en) 2001-09-18 2003-03-27 Clontech Laboratories, Inc. Site-specific recombinase based method for producing adenoviral vectors
US7399753B2 (en) * 2002-02-25 2008-07-15 Virxsys Corporation Trans-splicing mediated photodynamic therapy
EP1504016A4 (en) * 2002-05-08 2006-11-22 Intronn Inc USE OF SPLICEOSOM-MEDIATED RNA-TRANS-SPLICING TO GIVE ADENOVIRES A CELLSELECTIVE REPLICATION
WO2004038380A2 (en) * 2002-10-23 2004-05-06 Intronn, Inc. Screening methods for identification of efficient pre-trans-splicing molecules
US20050120398A1 (en) * 2003-09-12 2005-06-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Animal model for HCV infection
US7968334B2 (en) * 2004-01-23 2011-06-28 Virxsys Corporation Expression of apoAI and variants thereof using spliceosome mediated RNA trans-splicing
US20060177933A1 (en) * 2004-01-23 2006-08-10 Madaiah Puttaraju Expression of apoA-1 and variants thereof using spliceosome mediated RNA trans-splicing
WO2005070948A1 (en) * 2004-01-23 2005-08-04 Intronn, Inc. Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing
EP1780269B1 (en) * 2004-02-23 2009-07-08 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
WO2005087808A2 (en) * 2004-03-05 2005-09-22 Ludwig Institute For Cancer Research Growth factor binding constructs materials and methods
US7582442B2 (en) 2004-03-16 2009-09-01 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for using aleveolar macrophage phospholipase A2
US7319015B2 (en) * 2004-03-16 2008-01-15 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for using alveolar macrophage phospholipase A2
JP2008503215A (ja) * 2004-06-18 2008-02-07 ザ ユニバーシティー オブ モンタナ Ａａｖ媒介性の蝸牛細胞への遺伝子送達
WO2006014798A2 (en) * 2004-07-27 2006-02-09 Mount Sinai School Of Medicine Methods and compositions for using sax2
US20060094110A1 (en) * 2004-07-30 2006-05-04 Mcgarrity Gerard J Use of spliceosome mediated RNA trans-splicing for immunotherapy
US20060134658A1 (en) * 2004-08-09 2006-06-22 Garcia-Blanco Mariano A Use of RNA trans-splicing for generation of interfering RNA molecules
FI20050753A7 (fi) 2004-09-03 2006-03-04 Licentia Oy Uudet peptidit
DE102004047492B4 (de) * 2004-09-23 2006-07-20 Jost-Werke Gmbh & Co. Kg Verfahren zum Übertragen von elektrischer, pneumatischer oder hydraulischer Energie sowie ein Energieübertragungssystem
AU2005326784B2 (en) * 2004-10-08 2012-03-15 Virxsys Corporation Use of RNA trans-splicing for antibody gene transfer and antibody polypeptide production
US7871795B2 (en) 2004-10-08 2011-01-18 Virxsys Corporation Targeted trans-splicing of highly abundant transcripts for in vivo production of recombinant proteins
US7531523B2 (en) * 2005-02-17 2009-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Sodium channel protein type III alpha-subunit splice variant
WO2006091722A2 (en) * 2005-02-23 2006-08-31 Uab Research Foundation Alkyl-glycoside enhanced vaccination
EP1869171B2 (en) * 2005-04-11 2015-10-14 Crucell Holland B.V. Virus purification using ultrafiltration
DE602006020881D1 (de) 2005-08-15 2011-05-05 Vegenics Pty Ltd Enen eigenschaften
US7972813B2 (en) * 2005-09-30 2011-07-05 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
US20080200408A1 (en) * 2005-09-30 2008-08-21 Mccormack Kenneth Deletion mutants of tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
ES2352205T3 (es) 2005-12-14 2011-02-16 Licentia Ltd. Usos de una proteína del factor neurotrófico.
US20090214496A1 (en) * 2006-01-30 2009-08-27 Licentia Ltd. Bmx/etk tyrosine kinase gene therapy materials and methods
DK2018184T3 (da) 2006-05-17 2013-10-28 Ludwig Inst Cancer Res Anti-vegf-b-antistof til behandling eller forebyggende behandling af type 2-diabetes eller metabolisk syndrom
FI20070808A0 (fi) 2007-10-25 2007-10-25 Mart Saarma GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt
US20090196854A1 (en) * 2008-02-04 2009-08-06 Kytos Biosystems S.A. Methods and compositions for use of crl 5803 cells for expression of biotherapeutics and encapsulated cell-based delivery
FI20080326A0 (fi) 2008-04-30 2008-04-30 Licentia Oy Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt
JP2011526916A (ja) 2008-06-30 2011-10-20 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 全身性紅斑性狼瘡を同定および処置するための診断標的および治療標的としてのリソソームホスホリパーゼａ２（ｌｐｌａ２）活性
WO2012158989A2 (en) 2011-05-19 2012-11-22 The Regents Of The University Of Michigan Integrin alpha-2 binding agents and use thereof to inhibit cancer cell proliferation
PT2785683T (pt) 2011-11-30 2020-04-16 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Moduladores de célula inkt e métodos para o seu uso
GB201120860D0 (en) 2011-12-05 2012-01-18 Cambridge Entpr Ltd Cancer immunotherapy
WO2013184209A1 (en) 2012-06-04 2013-12-12 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder
US9499817B2 (en) 2012-09-06 2016-11-22 The University Of Chicago Antisense polynucleotides to induce exon skipping and methods of treating dystrophies
MY170528A (en) 2013-02-18 2019-08-09 Vegenics Pty Ltd Vegfr-3 ligand binding molecules and uses thereof
WO2014191630A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Helsingin Yliopisto Non-human animal model encoding a non-functional manf gene
DK3283500T3 (en) 2015-04-08 2020-11-16 Univ Chicago Compositions and methods for correcting limb girdle muscular dystrophy type 2C using exon skipping
AU2019284362A1 (en) 2018-06-11 2021-01-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for treating stress-related disorders and cancer
WO2024228167A1 (en) 2023-05-03 2024-11-07 Iox Therapeutics Inc. Inkt cell modulator liposomal compositions and methods of use
WO2025113643A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Gilead Sciences Inc. Anti-fap-light fusion protein and use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) * 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7906691A (en) * 1990-05-23 1991-12-10 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) * 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors

Also Published As

Publication number Publication date
IL112461A0 (en) 1995-03-30
FI962990L (fi) 1996-07-26
EP0741793A1 (fr) 1996-11-13
JPH09509051A (ja) 1997-09-16
CA2181602A1 (fr) 1995-08-03
FR2716682A1 (fr) 1995-09-01
WO1995020671A1 (fr) 1995-08-03
DE69534618D1 (de) 2005-12-22
MX9603002A (es) 1997-06-28
ZA95628B (en) 1995-10-23
FR2716682B1 (fr) 1996-04-26
FI962990A0 (fi) 1996-07-26
JP3810078B2 (ja) 2006-08-16
FI962990A7 (fi) 1996-07-26
NO319885B1 (no) 2005-09-26
NO962950D0 (no) 1996-07-12
DK0741793T3 (da) 2006-03-27
DE69534618T2 (de) 2006-07-27
ATE310097T1 (de) 2005-12-15
ES2252738T3 (es) 2006-05-16
AU706647B2 (en) 1999-06-17
US5789390A (en) 1998-08-04
NO962950L (no) 1996-07-12
EP0741793B1 (fr) 2005-11-16
AU1539595A (en) 1995-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100403708B1 (ko) 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도
KR100510822B1 (ko) 재조합 아데노바이러스 제조용 세포
KR100514070B1 (ko) 재조합아데노바이러스,에이에이브이제조를위한이의용도,상보성세포주및이러한아데노바이러스를함유하는약학조성물
JP3755827B2 (ja) 組み込み可能な組み換えアデノウィルス、それらの製造及びそれらの治療的利用
JP3565859B2 (ja) 改良されたアデノウイルスおよびその使用法
RU2219241C2 (ru) Дефектный рекомбинантный аденовирусный вектор (варианты)
KR100424803B1 (ko) 생존성오염입자-비함유아데노바이러스,이의제조방법및용도
JP3995259B2 (ja) 動物起源のアデノウイルスベクターおよび遺伝子治療におけるそれらの使用
JP4051416B2 (ja) 遺伝子治療に使用されるヒト組換えアデノウイルス用のパッケージングシステム
US6521426B1 (en) Preparation of recombinant adenovirus carrying a rep gene of adeno-associated virus
JPH10508491A (ja) 新規なアデノウイルスベクター、パッケージング細胞系、組換えアデノウイルスおよび方法
JPH10507928A (ja) ハイブリッドアデノウイルス−ａａｖウイルスおよびその使用方法
KR100796060B1 (ko) 아데노바이러스 벡터 및 상동 재조합 현상을 줄이는 방법
KR20220137046A (ko) Dna 증폭 방법
KR100484441B1 (ko) IVa2유전자가불활성화된결손재조합아데노바이러스
JP2004519201A (ja) キメラアデノウイルスベクター
AU752811B2 (en) Preparation of recombinant adenovirus carrying a rep gene of Adeno-Associated Virus
US20040214162A1 (en) PAV regions for encapsidation and E1 transcriptional control
MXPA00004646A (en) Adenovirus vectors and method for reducing homologous recombination phenomena

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 19960727

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20000117

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20020731

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20030731

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20031017

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20031020

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20061011

Start annual number: 4

End annual number: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20071010

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20071010

Start annual number: 5

End annual number: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee
PC1903 Unpaid annual fee

Termination category: Default of registration fee

Termination date: 20090910