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KR100355407B1 - Hiv감염을저해하는합성펩티드 - Google Patents

Hiv감염을저해하는합성펩티드 Download PDF

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KR100355407B1
KR100355407B1 KR1019950705528A KR19950705528A KR100355407B1 KR 100355407 B1 KR100355407 B1 KR 100355407B1 KR 1019950705528 A KR1019950705528 A KR 1019950705528A KR 19950705528 A KR19950705528 A KR 19950705528A KR 100355407 B1 KR100355407 B1 KR 100355407B1
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메튜스토마스제이
와일드칼티
바르네이쉐인오린
람버트데니스엠
피테웨이스테판알쥬니어
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Abstract

본 발명은 강력한 항-레트로바이러스 활성을 나타내는 펩티드에 관계한다. 본 발명의 펩티드는 HIV-1 gp41 단백질의 아미노산 638-673 에 상응하는 DP-178 (SEQ ID:1) 펩티드와 DP-178 의 단편, 유사체와 동사체로 구성된다. 본 발명은 사람과 비-사람 레트로바이러스 특히 HIV 을 감염안된 세포로의 전송의 저해물질로써 이와 같은 펩티드의 용도에 관계한다.

Description

HIV 감염을 저해하는 합성 펩티드
제 1 도는 HIVLAI에서 유도한 DP-18(SEQ ID:1) 아미노산 서열 ; HIV-1SF2(DP-185; SEQ ID:3), HIV-1RF(SEQ ID:4), HIV-1MN(SEQ ID:5)에서 유도한 DP-178 유사체; 두 개 프로토타입 HIV-2 분리체 즉 HIV-2rod(SEQ ID:6)와 HIV-2NIHZ(SEQ ID:7)에서 유도한 DP-178 유사체; 콘트롤 펩티드; 스크램블 서열에서 DP-178의 아미노산 잔기에 결합하는 펩티드인 DP-180(SEQ ID:2); HIV-1 세포없는 바이러스 감염을 저해하는 DP-178 과 무관한 DP-118(SEQ ID:10); HIV-1 무세포 바이러스 감염을 저해하는 DP-178과 무관한 DP-125(SEQ ID:8); (W1Ld et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10, 537-10, 541); 세포없는 바이러스 감염 검사를 사용하여 HIV-1 감염의 저해에 음성으로 나타내는 DP-178과 무관한 DP-116(SEQ ID:9)(W1Ld et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10, 537-10, 541). 전체 도면에서 한문자 아미노산 코드를 사용하였다.
제 2 도는 합성 펩티드에 의해 HIV-1 무세포 바이러스 감염의 저해를 나타낸다. IC50은 처리안된 콘트롤과 비교할 때 감염된 세포에서 RT 생산을 50% 저해하는 펩티드 농도를 말한다. 콘트롤: 처리된 배양물로써 동일수준의 바이러스를 감염된 미처리된 세포 배양물에 의해 생산되는 RT 수준.
제 3 도는 합성 펩티드 DP-178(SEQ ID:1)에 의해 HIV-1 와 HIV-2 무세포 바이러스 감염의 저해를 나타낸다. IC50: 처리안된 콘트롤과 비교할 때, RT 생산을 50% 저해하는 펩티드 농도. 콘트롤 : 처리된 배양물로써 동일수준의 바이러스에 의해 감염된 미처리된 세포배양물에 의해 생산된 RT 수준.
제 4A 도는 융합 저해검사. DP-178(SEQ ID:1)는 HIV-1 프로토타입 분리물 중개된 합포체형성을 저해한다. 데이터는 세포당 바이러스에 의해 유도된 합포체의 수를 나타낸다.
제 4B 도는 융합저해검사. DP-180(SEQ ID:2); 스크램블된 콘트롤 펩티드. DP-185(SEQ ID:3); HIV-1SF2분리물에서 유도된 DP-178 유사체. 콘트롤 : 펩티드없이 생산된 합포체의 수.
제 5 도는 융합저해검사 : HIV-1 대 HIV-2. 데이터는 웰당 바이러스 유도된 합포체의 수를 나타낸다.
ND : 실시하지 않음.
제 6 도는 CEM 세포에서 DP-178(SEQ ID:1)와 DP-116(SEQ ID:9)의 세포독성 연구. 세포증식 데이터를 제공함.
제 7 도는 HIV-gp41 와 말토즈 결합 단백질(MBP)-gp41 융합단백질을 도식으로 나타낸 것이다. DP107과 DP178은 gp41의 2개 추정 나선에 기초한 합성 펩티드이다. DP107 박스에서 분자 P 는 578 아미노산 위치에서 1Le 이 Pro 로 돌연변이한 것을 나타낸다. 아미노산 잔기는 Meyers et al., Human Retroviruses and alDS,1991, Theoret. Biol. and BiopHys. Group, Los alamos Natl. Lab., Los alamos, NM 에 따라 번호를 붙인다.
제 8 도는 M41 의 구조와 M41의 항-HIV 활성을 변경시키는 위치 돌연변이가 된다.
제 9 도는 DP-178 항 HIV 활성 폐기. 세포융합검사는 10nM DP178 존재하 그리고 다양한 농도의 M41 △178 에서 실시하였다.
제 10 도는 ELISA 으로 분석한 gp41 의 루이신 지퍼에 DP178 의 결합을 나타낸다.
제 11A-B 도는 HIV-1TM 단백질에서 구조적 전이모델을 나타낸 것이다. 두 모델은 자극과정(CD4에 gp120이 결합할 가능성)후에 고유 올리고머에서 융합된 상태로 구조적 전이를 나타내는 두 개 모델이 제시되었다. 두 모델의 일반특징은 다음과 같다: (1) 고유상태는 gp120/41 이형량체를 형성하기 위한 단백질-단백질간 비공유 상호작용과 gp120/41 복합포체의 바이러스 표면상에 동형-올리고머를 형성하기 위해 주로 gp41 상호작용부위를 통한 다른 상호작용에 의해 함께 유지된다; (2) 고유상태, N-단부(F)에서 소수성 융합성 펩티드의 차단; (3) 융합단계에서만이 동형 올리고머 코일드 코일로써 루이신 지퍼 도메인(DP107)이 존재한다. 두 모델의 주요 차이는 구조적 상태(고유 또는 융합)를 포함하는데, 구조적 상태에서는 DP107과 DP178 도메인이 서로 복합되어 있다. 제 1 모델(A; 도면 11A)에서, 이와 같은 상호작용은 고유상태에서 일어나고, B 모델에서는 융합상태에서 일어난다. 자극된 경우에, (A)에서 설명하는 모델에서 융합복합포체는 균일한 DP107 도메인에서 코일드-코일 상호작용의 형성을 통하여 발생하고, 결과적으로 연장된 α--사슬이 된다. 이와 같은 모양의 변화는 세포막과의 상호작용을 위해 융합펩티드를 배치시킨다. 제 2 모델(B; 도면 11B)에서, 융합포체 복합포체는 DP107 코일드-코일과 DP178 도메인이 연합됨으로써 안정화된다.
제 12 도는 공지의 코일드 코일의 아미노산의 모티프 디자인이다.
제 13 도는 DP-107과 DP-178 의 아미노산의 제시된 헵티드 반복위치를 이용한 모티프 디자인이다.
제 14 도는 GCN4 와 DP107 의 교차하는 하이브리드 모티프 디자인이다.
제 15 도는 GCN4 와 DP178 의 교차하는 하이브리드 모티프 디자인이다.
제 16 도는 DP-107과 DP-178의 교차하는 하이브리드 모티프 디자인 107×178×4 이다. 이 모티프는 연관 DP-107 유사체와 DP-178-유사 펩티드 부분의 확인시에 가장 변화가 없는 것으로 밝혀졌다.
제 17 도는 GCN 4, DP-107 와 DP-178의 교차하는 하이브리드 모티프 디자인 alLMOTI5 이다.
제 18 도는 GCN4, DP-107, DP-178, cFos c-Jun, c-Myc, Flu Loop 36의 교차하는 하이브리드 모티프 디자인이다.
제 19 도는 N-단부 프롤린-루이신 지퍼 모티프를 확인하기 위해 고안된 디자인이다.
제 20 도는 HIV-1(BRU-분리체) 외피 단백질 gp41 에 대한 조사결과이다. 서열조사 모티프 지시는 다음과 같다. 스페이드(♠): 107×178×4; 하트(♥)alLMOTI5; 클로바(♣): P}ZIP; 다이아몬드(◆): 막통과 부분(가상 막통과 도메인은 이와 같은 펩티드 부분에 대한 조사를 위한 PC/유전자 프로그램을 사용하여 확인하였다). 아스트릭(*): 루파스 방법. 각 모티프에 의해 확인된 아미노산 서열은 반복특징에 의해 ( )를 했다. 모든 연구에 기본이 되는 선택된 대표적인 서열은 밑줄을 해두었고 굵게 표시해 두었다. DP-107 와 DP-178 서열은 표시해 두었고 추가로 이중 밑줄을 해두었다.
제 21 도는 사람 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 균주 A2 융합단백질 F1 에 대한 연구결과이다. 서열조사 모티프는 도면 20 과 같다.
제 22 도는 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV) 외피단백질 gp41(AGM3)분리체에 대한 연구결과이다. 서열조사 모티프는 도면 20 과 같다.
제 23 도는 고양이 디스텝퍼 바이러스(straln Onderstepoort)의 조사결과이다. 서열조사 모티프는 도면 20 과 같다.
제 24 도는 뉴캐슬 질병 바이러스(균주 오스트레일리아-빅토리아/32)의 연구결과이다. 서열조사 모티프는 도면 20 과 같다.
제 25 도는 사람 파라인플루엔자 3 바이러스(균주 NIH 47885) 융합 단백질 F1 에 대한 조사결과이다. 서열조사 모티프는 도면 20 과 같다.
제 26 도는 인플루엔자 A 바이러스(straln A/alCHI/2/68)헤마글루티닌 전구체 HA2 에 대한 연구결과이다. 서열조사 모티프는 도면 20 과 같다.
제 27 도는 여기에서 상술한 컴퓨터에 의한 조사를 이용하여 확인된 서열을 가지는 48-아미노산 RSV F2 펩티드의 서열을 이용하여 35-mer 펩티드의 항-RSV 항바이러스 활성과 코일드-코일 구조 유사성이 합성되었다. 이용된 모티프와 정확한 위치는 도면 21을 참고한다. "+"는 구조적 유사성 또는 항바이러스 활성의 지시를 나타내고 상당수의 "+"는 상대적으로 높은 유사성 또는 항바이러스 활성을 나타낸다.
제 28 도는 여기에서 상술한 컴퓨터에 의한 조사를 이용하여 확인된 서열을 가지는 53-아미노산 RSV F2 펩티드의 서열을 이용하여 35-mer 펩티드의 항-RSV 항바이러스 활성과 코일드-코일 구조 유사성이 합성되었다. 이용된 모티프와 정확한 위치는 도면 21을 참고한다. "+"는 도면 27에서 설명한 것과 같다.
제 29 도는 여기에서 상술한 컴퓨터에 의한 조사를 이용하여 확인된 서열을 가지는 56-아미노산 HPF3 펩티드의 서열을 이용하여 35-mer 펩티드의 사람 파라인플루엔자 3 바이러스(HPF3) 활성과 코일드-코일 구조 유사성이 합성되었다. 이용된 모티프와 정확한 위치는 도면 25을 참고한다. "+"는 도면 27에서 설명한 것과 같다.
제 30 도는 여기에서 상술한 컴퓨터에 의한 조사를 이용하여 확인된 서열을 가지는 70-아미노산 HPF3 펩티드의 서열을 이용하여 35-mer 펩티드의 항-HPF3 항바이러스 활성과 코일드-코일 구조 유사성이 합성되었다. 이용된 모티프와 정확한 위치는 도면 25을 참고한다. "+"는 도면 27 에서의 설명과 같다.
1. 개요
본 발명은 DP-178(SEQ ID:1) HIV-1LAI막통과 단백질(TM) gp41의 아미노산 638 내지 673 에 상응하는 펩티드, DP-178(SEQ ID:1)의 일부분, 유사체 및 동사체에 관계하고, 이 모든 펩티드는 항-바이러스 활성을 나타낸다. 이와 같은 항-바이러스 활성은 감염안된 CD-4+세포에 HIV 전달을 저해하는 것이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 또한 본 발명은 인체 레트로바이러스 및 비인체 레트로바이러스 특히 HIV 가 감염안된 세포로 전염되는 것을 막는 저해물질로 DP-178(SEQ ID:1), DP-178의 단편, 유사체 또는 동사체를 이용하는 것에 관계한다. 또한 본 발명은 HIV 서브타입-특이적 진단물로써 DP-178의 이용에 관계한다. 본 발명은 다른 외피에 싸인 바이러스에 존재하는 HIV-1LAI막통과 단백질(TM) gp41 의 아미노산 558-595 에 상응하는 펩티드, DP-107와 유사한 항-바이러스 펩티드에 관계한다. 본 발명은 DP-178과 DP-107 또는 DP-107 유사체-펩티드와 DP-178 유사 펩티드 사이의 상호작용을 파괴하는 항바이러스 조성물을 확인하는 방법에 관계한다. 본 발명은 실시예를 이용하여 설명하는데, 실시예에서 DP-178(SEQ ID:1)와 DP-178에 유사체인 펩티드는 감염안된 CD-4+ 세포에 HIV-1 전달의 강력한 비-세포독성 저해물질로 나타낸다. 본 발명은 실시예에 의해 설명하는데, 실시예에서 DP-107 와 DP-178와 구조적으로 유사성을 가지거나 항바이러스를 가지는 펩티드가 확인되었다.
2. 발명의 배경
2.1. 사람 면역결핍 바이러스
사람 면역결핍 바이러스(HIV)는 후천성 면역결핍증(alDS)라 칭하는 서서히진행되는 퇴행성 면역 시스템 질환의 주요 원인이 간주되어 왔다(Barre-Sinoussi, F. et al., 1983, Science 220:868-870; Gallo, R. et al., 1984, Science 224:500-503). HIV에는 적어도 두가지 별개 종류가 있는데 HIV-1(Barre-Sinoussi, F. et al., 1983, Science 220:868-870; Gallo R. et al., 1984, Science 224:500-503) 와 HIV-2(Clavel, F. et al., 1986, Science 233:343-346; Guyader, M. et al., 1987, Nature 326:662-669)가 된다. 또한 상당량의 유전성 이형성이 이들 타입의 각 집단내에 존재한다. HIV 바이러스가 사람 CD-4+ T-임파세포에 감염되면 세포형이 고갈되고, 이는 궁극적으로 선택적 감염, 신경이상, 신조직 생장, 종국에는 죽음을 유도한다.
HIV 는 레트로바이러스의 렌티바이러스 족이다(Teich, N. et al., 1984, RNA Tumor Viruses, Weises, R. et al., eds., CSH-Press, pp. 949-956). 레트로바이러스는 이합포체, 단일-가닥 RNA 게놈을 포함하는 작은 외피 바이러스이고, 바이러스에 의해 인코드된 역전사효소, RNA-의존성 DNA 중합효소에 의해 생산되는 DNA 중간물질에 의해 복제한다(Varmus, H., 1988, Science 240:1427-1439). 다른 레트로바이러스에는 예를 들면 사람 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV-1, -Ⅱ, -Ⅲ) 고양이 백혈병 바이러스와 같은 온코젠 바이러스를 포함한다.
HIV 바이러스 입자는 캡시드 단백질로 구성된 바이러스 코어로 구성되는데 여기에는 바이러스 RNA 게놈과 초기 복제 사건에 요구되는 효소로 구성된다. 미리스틸화된 Gag 단백질은 바이러스 코어 주변의 외측 바이러스 쉘을 형성하고, 이는 다시 감염된 세포막에서 유도된 지질막 외피에 의해 에워싸이게 된다. HIV 외피 표면 당단백질은 한 개의 160kd 전구체 단백질로 합성되는데, 이는 바이러스 버딩동안에 세포 프로테아제에 의해 두 개 당단백질 gp41 와 gp120 으로 분리된다. gp41은 막통과 단백질이고, gp120은 삼량체 또는 다량체형으로 gp41와 비공유적으로 연합을 유지하고 있는 세포외 단백질이다(Hammarskjold, M. and Rekosh, D., 1989, Biochem. BiopHys. Acta 989:269-280).
HIV 는 CD-4 세포표면 단백질이 HIV-1 바이러스에 대한 세포수용체로 작용하기 때문에 CD-4+ 세포의 표적이 된다(Dalgleish, A. et al., 1984, Nature 312:763-767; Klatzmann et al., 1984, nature 312:767-768; Maddon et al., 1986, Cell 47:333-348). 세포내로 바이러스의 침입은 세포 CD-4+ 수용체 분자에 결합하는 gp120 에 따라 달라지고(McDougal, J.S. et al., 1986, Science 231:382-385; Maddon, P.J. et al., 1986, Cell 47:333-348), 따라서 CD-4+ 세포에 대한 HIV's 의 향성(트로피즘) 설명하고, gp41 은 바이러스 막에 외피 당단백질 복합포체를 고정한다.
2.2. HIV 치료
HIV 감염은 유행하는 질병이고, HIV 연관 질병은 주요 세계적 건강문제로 대두된다. 효과적인 치료요법을 성공적으로 만들기 위해 상당한 노력을 기울이고는 있으나 현재 alDS 에 대한 항-레트로바이러스 치료 약물이 없다. 이와 같은 약물의 개발시도에서, HIV 라이프 사이클의 몇 단계가 치료요법적 중재를 위한 표적으로 간주되고 있다(Mitsuya, H. et al., 1991, FASEB J. 5:2369-2381). 가령, 바이러스성 인코드된 역전사효소는 약물 개발의 한 초점이 되어 왔다. AZT, ddI, ddC, d4T와 같은 2',3'-디데옥시뉴클레오시도 유사체를 포함하는 상당수의 역전사효소-표적약물이 개발되어 왔고, HIV 에 대해 활성이 있는 것으로 나타났다(Mitsuya, H. et al., 1991, Science 249:1533-1544). 유익한 점은 있으나 이들 뉴클레오시드 유사체는 약물 저항성 HIV 돌연변이가 빠르게 나타나기 때문에 치료성이 없다(Lander, B. et al., 1989, Science 243:1731-1734). 또한, 약물은 종종, 골수억제, 구토, 간기능 이상과 같은 독성 부작용을 나타낸다.
HIV 감염 최초단계인 세포로 바이러스 삽입을 저해할 수 있는 약물을 개발하려는 시도가 있다. 여기에서 초점이 되는 것은 HIV 의 세포표면 수용체인 CD4 이다. 가령, 재조합 가용성 CD4 는 일부 HIV-1 균주에 의해 CD-4+ T-세포의 감염을 저해시킨다는 것을 보여주었다(Smith, D.H. et al., 1987, Science 238:1704-1707). 그러나, 특정 주요 HIV-1 분리체는 재조합 CD-4 에 의해 저해에 상대적으로 덜 민감하다(Daar, E. et al., 1990, Proc. natl. Acad. Sci. USA 87:6574-6579). 또한 재조합 가용성 CD-4 임상시도 역시 결정적인 결과를 얻지 못하였다(Schooley, R. et al., 1990, Ann. Int. Med. 112:247-253; Kahn, J.O. et al., 1990, Ann, Int. Med. 112:254-261; Yarchoan, R. et al., 1989, Proc. Vth Int. Conf. on alDS, p. 564, MCP 137).
특정 바이러스 단백질의 결정적인 바이러스-특이적 2차 프로세싱에 관계하는 HIV 복제의 나중단계는 항-HIV 약물표적으로써의 가능성이 있다고 제시하고 있다. 나중 단계 프로세싱은 바이러스 프로타제의 활성에 따라 달라지고 이와 같은 프로테아제를 저해시키는 약물을 개발하고 있다(Drickson, J., 1990, Science 249:527-533). 이들 추천 약물의 임상적인 소득은 아직 의문이 남아 있다.
HIV 감염치료용 백신 개발에 주의가 주목된다. HIV-1 외피 단백질(gp160, gp120, gp41)은 alDS 환자에 있는 항-HIV 항체에 대해 주요 항원인 것으로 나타났다(Barin, et al., 1985, Science 228:1094-1096). 따라서, 이들 단백질은 항-HIV 백신 개발에 대해 항원으로 작용하는 가장 유망한 추천물로 보인다. 이 목적을 위해, 몇몇에서는 숙주 면역시스템의 면역원 표적으로써 gp160, gp120, 또는 gp41 의 다양한 부분을 이용하기 시작하였다. Ivanoff, L. et al., U.S. Pat. No. 5,141,867; Salth, G. et al., WO 92/22,654; Schafferman, A., WO 91/09,872; Formoso, C. et al., WO 90/07,119. 그러나 이와 같은 추천물질 백신에 관한 임상결과는 여전히 남아 있다.
따라서 항-레트로바이러스 약물의 고안과 테스트에 대해 상당한 노력이 있음에도 불구하고, 정말 효과적이고 비-독성치료가 여전히 필요하다.
3. 발명의 요약
본 발명은 HIV-1 분리체 LAI에서 막통과 단백질(TM) gp41의 아미노산 638-673 에 상응하는 36개 아미노산 합성펩티드인, DP-178(SEQ ID:1) 관련하는데, 이는 효과적인 항-HIV-1 활성을 나타낸다. 하기 단락 6에서 제시한 실시예에 나타나는 것과 같이, DP-178(SEQ ID:1)의 항-바이러스 활성은 상당히 크고, 중량에 기초하여, DP-178(SEQ ID:1)가 이의 저해효과를 나타내는 농도와 같이 아주 낮은 농도에서 효과가 있는 공지의 항-HIV 물질은 없다. 본 발명은 또한 여전히 항바이러스 활성을 가지고 있는 DP-178의 일부분, 유사체, 동사체에 관계한다. 이와 같은 DP-178일부분, 유사체, 동사체의 항바이러스 활성은 감염안된 CD-4+ 세포에 HIV 전달을 억제하는 것을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 본 발명은 DP-178(SEQ ID:1)와 이의 단편, 동사체 또는 유사체의 이용에 관계한다. 이와 같은 용도에는 인체용, 비-인체용 레트로바이러스 특히 HIV 의 감염안된 세포로의 전달을 억제하는 저해제로써 단백질 용도; 타입 또는 서브타입-특이적 진단도구로써 사용될 수 있으나 이에 국한시키지 않는다.
본 발명의 구체예를 하기에서 설명하는데 실시예에서 DP-178의 극미량 농도와 상당히 낮은 농도의 DP-178(SEQ ID:1) 유사체가 HIV-중개된 CD-4+ 세포-세포융합(예로써 합포체형성)과 무세포 바이러스에 의한 CD-4+ 세포의 감염의 강력한 저해물질이 된다는 것을 보여준다. 또한, 저해성 DP-178(SEQ ID:1)농도보다 약 3 logs 높은 농도에서도 조차도 DP-178(SEQ ID:1)는 세포에 독성이 없다는 것을 보여준다.
또한, 본 발명은 유사한 항바이러스 활성을 설명하는 다른 외피바이러스에 있는 유사 DP178 펩티드에 관계한다.
또한 본 발명은 다른 외피 바이러스에 존재하고, 항바이러스 성질을 설명하는 gp41의 HIV-1LAI막통과 단백질(TM)의 아미노산 558-595 에 상응하는 펩티드 DP-107에 유사 펩티드에 관계한다. 또한 본 발명은 gp41 단백질의 DP-107과 DP-108 도메인의 비공유적 복합포체와 이들의 상호작용이 바이러스의 정상적인 활성에 필수적이라는 놀라운 발견에 일부 기초한다. 따라서, 본 발명은 DP-107와 DP-108 그리고/또는 DP-107 유사체와 DP-178 유사체 펩티드의 상호작용을 파괴하는 항바이러스 화합물을 확인하는 방법에 관계한다.
본 발명의 구체예는 하기에서 설명하는데, 구체예에서는 DP-107와 DP-178 의 구조적유사성을 가지는 펩티드가 확인되었다.
3.1. 정의
여기서 펩티드는 펩티드 결합에 의해 두 개 이상의 아미노산이 공유적으로 결합된 유기화합물로 정의할 수 있다. 펩티드는 구성 아미노산의 수로 말할 수도 있는데, 예를 들면, 디펩티드는 두 개 아미노산 잔기를 포함하고, 트리펩티드는 3개 아미노산 잔기를을 포함한다. 10개 이하의 아미노산 잔기를을 포함하는 펩티드는 올리고펩티드라 하고, 10개 이상의 아미노산 잔기를을 포함하는 펩티드는 폴리펩티드라 한다.
여기에 정의된 펩티드 서열은 다음과 같이 아미노산 잔기에 대한 한문자 심볼로 나타낸다.
A (알라닌)
R (아르기닌)
N (아스파라긴)
D (아스파르트산)
C (시스테인)
Q (글루타민)
E (글루타민산)
G (글리신)
H (히스티딘)
I (이소루이신)
L (루이신)
K (리신)
M (메티오닌)
F (페닐알라닌)
P (프로린)
S (세린)
T (트레오닌)
W (트립토판)
Y (티로신)
V (발린)
5.발명의 상세한 설명
강력한 항바이러스 활성을 나타내는 펩티드를 설명한다. 이들 펩티드에는 DP-178(SEQ ID:1), gp41-유도된 36 아미노산 펩티드, DP-178 의 단편 또는 유사체, DP-178에 일치하는 펩티드를 포함한다. 또한 이들 펩티드에는 HIV-1LAI막통과 (TM) gp41 단백질의 잔기 558-595 에 상응하는 38 아미노산 펩티드인 DP-107 에 유사한 항-바이러스 활성을 나타내고, 다른 외피 바이러스 단백질에 있는 펩티드를 포함한다. 여기에서 또한 설명하는 것은 이와 같은 펩티드의 항바이러스 활성을 테스트하는 검사에 대해 상술하고 있다. 본 발명은 바이러스의 정상적인 활성에 있어서 비공유적 단백질-단백질 상호작용을 경유한 gp41 단백질 복합포체의 DP-107와 DP-108 도메인이 필수적인 것이라는 놀라운 발견에 기초한다. 여기에서 DP-107 와 DP-108 펩티드; 그리고 DP-107 유사 펩티드와 DP-178 유사 펩티드 사이의 상호작용을 파괴하는 항바이러스 화합물의 확인방법을 상술하고 있다. 마지막으로 인체 및 비-인체 바이러스, 레트로바이러스 특히 HIV 의 전달의 저해물질로써 본 발명의 펩티드 용도를 상술하고, 또한 특정 바이러스 특히 레트로바이러스의 존재의 진단 지시물로써 펩티드의 용도에 대해 상술하고 있다.
어떠한 작용이론에도 국한되지 않고, 실시예에 상술된 실험에 일부 기초하여, DP178의 강력한 항 HIV 활성을 설명하기 위해 다음의 모델이 제시되었다. 바이러스성 단백질 gp41에서 DP178는 gp41-엑토도메인의 C-단부에서 위치한 가상 α-나선 부분에 상응하고, DP178은 gp41상의 말단부위와 연합된 것으로 보이는데, 이들 상호작용 구조는 루이신 지퍼, 코일드코일구조(DP107이라고 칭함)에 의해 영향을 받는다. 이들 두 도메인의 연합은 융합과정에 바로 관련된 분자 연결 또는 "분자죄임"을 반영한다. gp41의 C-말단 α-나선 모티프(즉 D178 도메인)에서 돌연변이는 gp41의 융합능을 강화시키고, 반면에 루이신 지퍼부분(즉 DP107 도메인)에서의 돌연변이는 바이러스 단백질의 융합능력을 감소시키거나 또는 상쇠시키는 경향이 있다는 것은 흥미로운 사실이다. 루이신 지퍼 모티프는 막 융합에 관련되어 있고, C-말단 α-나선 모티프는 바이러스에 의해 유도된 막 융합동안에 루이신 지퍼의 이용성을 조절하는 분자 안전장치로 작용하는 것으로 보인다.
전술한 것에 기초하면, 도면 11A-B에서 그림으로 나타낸 것과 같이 gp41-중개된 막융합의 두가지 모델을 제시한다. 두 모델을 제시하는 이유는 DP107 및 DP107 으로 정의된 부분간에 상호작용의 일시적인 성질이 아직 정확하게 나타나지 않기 때문이다. 각 모델은 gp41에 대해 두 개 모양을 상상하고 있는데 하나는 휴식 비리온에서 볼 수 있는 "고유"상태이고, "융합"상태인 또 다른 하나는 gp120이 CD4에 결합한후 그리고 표적 세포막과 융합하기 바로 직전에 시작된 모양변화를 반영한 것이다. gp120 과 CD4 사이 강한 결합 친화성은 세포안 소포내에서 융합하는 바이러스에서 발생하는 것과 같은 pH 변화 요구를 없애는 융합과정에 대한 촉진제로 실제 나타낼 수 있다. 두 모델의 주요특징은 다음과 같다: (1) 상당히 안전한 코일드-코일을 만들기 위해, 올리고머 외피의 각 사슬에 있는 루이신 지퍼 서열(SP107)은 고유상태에는 서로 떨어져 있도록 하고 융합상태에서만 서로 접근하는 것을 허용하고; 그리고 (2) gp41 에 있는 DP178 과 DP107 부위의 연합은 고유 또는 융합상태에서 일어난다. 도면 11A 는 분자류로써 고유상태에서 DP178/DP107 의 상호작용을 나타낸다. 한편, 융합상태에서 외피의 가장 안정한 형태가 발생하는 경우 도면 11B 의 모델을 고려할 수 있다.
펩티드로 합성된 경우 DP107와 DP178 은 바이러스 gp41과 복합포체를 형성하는 능력과 이의 융합과정을 간섭하는 능력 덕분에 HIV 감염과 융합의 강력한 저해가 되고; 예로써 고유 구조에서 융합상태로의 바이러스 단백질의 구조적 전이동안에 DP178와 DP107 펩티드는 바이러스 gp41상에 이들 각 결합부위에 접근하여, 분열성 영향을 발휘한다. 항-HIV 활성을 설명하는 DP107 펩티드는 1992년 8월 7일자 출원된 본 출원인의 No 07/927,532에 상술하고 있으며, 전문을 참고문험으로 여기에 첨부한다.
하기 실시예에서 설명하는 것과 같이, DP107 와 DP178 도메인을 포함하는 gp41 의 엑토도메인(gp41의 융합펩티드, 막통과 부분, 세포질 도메인을 제외한)에 상응하는 절두형 재조합 gp41 단백질은 HIV-1 유도성 융합을 저해하지 않았다. 그러나, 단일 돌연변이가 DP107 도메인의 코일드-코일 구조를 파괴시키기 위해 - DP107 펩티드의 생물학적 활성의 전체를 손실하는 돌연변이-도입된 경우 비활성 재조합 단백질은 HIV-1 유도된 융합의 활성 저해물질로써 형질변환된다. 이와 같은 형질변환은 DP107 도메인인 루이신 지퍼와 분자 클랩에서 강력한 DP178 도메인을 해방시킴으로 일어날 수 있다.
토론을 명확히 하기 위해, 본 발명은 HIV 의 DP178 펩티드 저해를 설명한다. 그러나, 하기 표 5-10에서 나열한 펩티드를 포함하는 바이러스를 포함한 다른 융합성 외피 바이러스에도 비슷하게 적용될 수 있는 원리를 이용하나, 바이러슨ㄴ 이에 국한되지 않는다.
5.1. DP-178와 DP178 유사 펩티드
본 발명의 펩티드 DP-178(SEQ ID:1)은 HIV-1LAI분리체에서 막통과 단백질 gp41 의 아미노산 638 내지 673 에 상응하고 36 아미노산 서열(아미노 말단에서 카르복시 말단으로)을 가진다.
NH2-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (SEQ ID:1)
전체길이 DP-178(SEQ ID:1) 36-mer 에 추가하여, 본 발명의 펩티드는 항바이러스 활성을 나타내는 DP-178(SEQ ID:1) 펩티드의 절두부분을 포함한다. 이와 같은 절두형 DP-178(SEQ ID:1) 펩티드는 3 내지 36개 아미노산 잔기(예로써, 트리펩티드부터 36-mer 폴리펩티드까지 크기 범위의 펩티드)로 구성되고, 여기에는 하기 표 1 과 Ⅱ 에 나열된 것을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이 테이블에서 펩티드 서열은 아미노(좌측)에서 카르복시(우측) 단부까지 나열한 것이다. "X" 는 아미노기(-NH2)와 "Z"는 카르복시기를 나타낸다. 또는, 하기에서 설명한 것과 같이, "X" 및 "Z"는 소수성기, 아세틸기, FMOC 기, 아미도기, 공유적으로 부착된 거대분자를 나타낸다.
표 1
DP-178(SEQ ID:1) 카르복시 절두형
X-YTS-Z
X-YTSL-Z
X-YTSLI-Z
X-YTSLIH-Z
X-YTSLIHS-Z
X-YTSLIHSL-Z
X-YTSLIHSLI-Z
X-YTSLIHSLIE-Z
X-YTSLIHSLIEE-Z
X-YTSLIHSLIEES-Z
X-YTSLIHSLIEESQ-Z
X-YTSLIHSLIEESQN-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQ-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQ-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQE-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEK-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKN-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNE-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-Z
X-YTSLIHSLIEESQQEKNEQEL-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWA-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
· 한문자 아미노산 코드를 사용함.
· "X"는 카르보벤조옥실, 단실, 또는 T-부틸옥시카르보닐을 포함한 아미노기, 소수성기; 아세틸기; 9-플로오렌메톡시-카르보닐(FMOC)기; 지방-지방산 공액체, PEG 또는 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는 거대분자 캐리어를 나타냄.
· "Z"는 카르복실기; 아미노기; T-부틸옥시카르보닐기; 지질-지방산 공액체, PEG, 또는 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는 거대분자 캐리어를 나타냄.
표 2
DP-178(SEQ ID:1) 아미노 절두형
X-NWF-Z
X-WNWF-Z
X-LWNWF-Z
X-SLWNWF-Z
X-ASLWNWF-Z
X-WASLWNWF-Z
X-KWASLWNWF-Z
X-DKWASLWNWF-Z
X-LDKWASLWNWF-Z
X-ELDKWASLWNWF-Z
X-LELDKWASLWNWF-Z
X-LLELDKWASLWNWF-Z
X-ELLELDKWASLWNWF-Z
X-QELLELDKWASLWNWF-Z
X-EQELLELDKWASLWNWF-Z
X-NEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-KNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-EKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-QQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-NQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-QNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-EESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-IEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-LIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-SLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-HSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-IHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
· 한문자 아미노산 코드를 사용함.
· "X"는 카르보벤조옥실, 단실, 또는 T-부틸옥시카르보닐을 포함한 아미노기, 소수성기; 아세틸기; 9-플로오렌메톡시-카르보닐(FMOC)기; 지방-지방산 공액체, PEG 또는 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는 거대분자 캐리어를 나타냄.
·"Z"는 카르복실기; 아미노기; T-부틸옥시카르보닐기; 지질-지방산 공액체, PEG, 또는 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는 거대분자 캐리어를 나타냄.
본 발명의 항바이러스 펩티드는 DP-178(SEQ ID:1)서열 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 DP-178 절두된 서열을 포함하는 펩티드이나 이에 국한되지 않는 DP-178 유사체 또는 DP-178 절두형 유사체를 포함한다. 하기에서 설명하는 DP-178 상동물 유사체는 본 발명의 범위에 속한다. 본 발명의 DP-178 유사체는 항바이러스 활성을 나타내고, 증가된 생체이용성, 증가된 안전성 또는 감소된 숙주 면역 인지와 같은 유익한 특징을 추가로 가질 수도 있다.
HIV-1 와 HIV-2 외피 단백질은 구조적으로 별개의 것 HIV-1 와 HIV-2 의 DP-178 상응하는 부분내에 뚜렷한 아미노산 보존부분이 나타난다. 아미노산 보존은 사대적인 특징으로 이는 구조 또는 기능이 일부 보존된다는 것을 암시한다. 따라서, 아미노산 치환의 가능한 한 종류는 본 발명의 DP-178 펩티드 구조를 안정시키는 것으로 예상되는 이들 아미노산 변화를 포함한다.
아미노산 치환은 보존된 또는 보존안된 특징일 수 있다. 보존된 아미노산 치환은 DP-178(SEQ ID:1) 펩티드 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 유사한 하전, 크기 또는 소수성을 가지는 아미노산으로 대체되는 것으로 가령, 글루타민산(E)에서 아스파르트산(D) 아미노산 치환과 같다. 보존된 치환마 만들어진 경우, 생성 펩티드는 DP-178(SEQ ID:1)와 기능적으로 등가이거나 이에서 유도된 DP-178 펩티드와 기능적으로 등가이다. 비-보존된 치환은 DP-178(SEQ ID:1) 펩티드 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 대체되는 것으로, 하전, 크기 또는 소수성 성질이 다른 아미노산으로 가령, 글루타민산(E)에서 발린(V) 아미노산 치환이 된다.
아미노산 삽입은 길이가 2 내지 15개 아미노산 범위 또는 단일 아미노산 잔기로 구성된다. 하나 이상의 삽입체가 DP-178(SEQ ID:1), DP-178 단편, 유사체 또는 동산체내로 유입될 수 있다.
DP-178(SEQ ID:1), 단편, 유사체, 동사체(하기에서 설명)의 결실 또한 본 발명의 영역에 속한다. 이와 같은 결실은 DP-178 또는 DP-178-유사 펩티드 서열에서 하나 이상 아미노산을 제거하는 것인데, 생성된 펩티드 서열 길이의 하한 선은 4∼6개 아미노산이다. 이와 같은 결실은 한 개 이상의 분명한 펩티드 서열부분 또는 단일 인접부분이 관계한다.
본 발명의 펩티드에는 항바이러스 활성을 나타내는 DP-178 절두형 또는 DP-178(SEQ ID:1) 동사체를 포함한다. 이와 같은 DP-178 동사체는 다른 바이러스(HIV-1LAI이외의)에 있는 펩티드의 아미노산 서열로 구성된 펩티드로, 이 펩티드는 DP-178(SEQ ID:1)에서 유도되는 gp41 펩티드 부분에 상응한다. 이와 같은 바이러스에는 다른 HIV-1 분리체와 HIV-2 분리체를 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 다른 HIV-1 분리체(비-HIV-1LAI)의 상응하는 gp41 펩티드 부분에서 유도한 DP-178 동사체는 하기의 펩티드 서열과 같은 것을 포함한다.
NH2-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH(DP-185; SEQ ID:3);
NH2-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-COOH (SEQ ID:4);
NH2-YTSLIYSLLEKSQIQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (SEQ ID:5).
SEQ ID:3(DP-185), SEQ ID::4, and SEQ ID:5 는 HIV-1SF2, HIV-1RF, HIV-1MN분리체에서 각각 유도되었다. 밑줄친 아미노산 잔기는 DP-178(SEQ ID:1) 펩티드에 상응하는 위치와는 상이한 잔기를 의미한다. DP-178 동사체, DP-185(SEQ ID:3) 중 하나는 하기 단락 6에서 있는 실시예에서 설명하는데 이 실시예에서는 DP-185(SEQID:3)이 항바이러스 활성을 나타낸다는 것을 설명하는 것이다. 본 발명의 DP-178 동사체에는 상기에서 설명한 것과 같이 절두, 아미노산 삽입, 치환, 결실을 포함한다.
또한, 도면 1에서 볼 수 있는 것과 같이, DP-178 서열에 상응하는 HIV-1 와 HIV-2 분리체 부분내에 놀랄만한 유사성이 존재한다. HIV-2NIHZ분리체로부터 유도된 DP-178 동사체는 36 아미노산 서열을 가진다(아미노에서 C-말단으로 읽음).
NH2-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-COOH (SEQ ID:7)
표 3 과 4 에서는 HIV-2NIHZDP-178 동사체의 일부가능한 절두형을 나타내는데 이는 3 내지 36 아미노산으로된 펩티드로 구성된다(즉 트리펩티드에서 36mer 폴리펩티드의 크기를 가지는 펩티드). 표에서 펩티드 서열은 아미노(좌)부터 카르복시(우)말단으로 나열한 것이다. "X"는 아미노기(-NH2)와 "Z"는 카르복시 (-COOH)기를 나타낸다. 또는, 하기 설명에서와 같이 "X" 또는 "Z"는 소수성기, 아세틸기, FMOC기, 아미도기 또는 공유적으로 부착된 거대분자를 나타낸다.
표 3
HIV-2NIHZDP-178 동사체 카르복시 절두형
X-LEA-Z
X-LEAN-Z
X-LEANI-Z
X-LEANIS-Z
X-LEANISQ-Z
X-LEANISQS-Z
X-LEANISQSL-Z
X-LEANISQSLE-Z
X-LEANISQSLEQ-Z
X-LEANISQSLEQA-Z
X-LEANISQSLEQAQ-Z
X-LEANISQSLEQAQI-Z
X-LEANISQSLEQAQIQ-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQ-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQE-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEK-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKN-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNM-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMY-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYE-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYEL-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQ-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQK-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLN-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSW-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWD-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDV-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFT-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTN-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNW-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
· 한 문자 아미노산 코드를 사용함.
· "X"는 카르보벤조옥실, 단실, 또는 T-부틸옥시카르보닐을 포함하나 이에 국한되지 않는 아미노기, 소수성기; 아세틸기; 9-플로오렌메톡시-카르보닐(FMOC)기; 지방-지방산 공액체, PEG 또는 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는 거대분자 캐리어기를 나타냄.
·"Z"는 카르복실기; 아미노기; T-부틸옥시카르보닐기; 지질-지방산 공액체, PEG, 또는 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는 거대분자 캐리어기를 나타냄.
표 4
HIV-2NIHZDP-178 동사체 아미노 절두형
X-NWL-Z
X-TNWL-Z
X-FTNWL-Z
X-VFTNWL-Z
X-DVFTNWL-Z
X-WDVFTNWL-Z
X-SWDVFTNWL-Z
X-NSWDVFTNWL-Z
X-LNSWDVFTNWL-Z
X-KLNSWDVFTNWL-Z
X-QKLNSWDVFTNWL-Z
X-LQKLNSWDVFTNWL-Z
X-ELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-YELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-MYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-NMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-KNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-EKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-IQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-AQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-EQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-LEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-SLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-QSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-SQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-ISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-NISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-ANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-EANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
X-LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-Z
· 한 문자 아미노산 코드를 사용함.
· "X"는 카르보벤조옥실, 단실, 또는 T-부틸옥시카르보닐을 포함하나 이에 국한되지 않는 아미노기, 소수성기; 아세틸기; 9-플로오렌메톡시-카르보닐(FMOC)기; 지방-지방산 공액체, PEG 또는 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는 거대분자 캐리어기를 나타냄.
·"Z"는 카르복실기; 아미노기; T-부틸옥시카르보닐기; 지질-지방산 공액체, PEG, 또는 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는 거대분자 캐리어기를 나타냄.
5.2. DP-107와 DP-178 유사성 항바이러스 펩티드
5.1에서 상술한 바와 같이 본 발명의 DP-178 서열에 기능적으로 상응하여 DP-178 서열에 유사한 펩티드 서열은 다른 비-HIV-1 외피 바이러스에서 발견될 수도 있다. 또한 HIV-1 유도된 항바이러스 펩티드 DP-107 에 기능적으로 상응하여, DP-107에 유사한 펩티드 서열은 다른 비-DP-107 외피 바이러스에서 발견될 수도 있다. DP-107은 HIV-1LAI막통과(TM) gp41 단백질의 558-595에 상응하는 38개 아미노산 펩티드로 강력한 항-바이러스 활성을 나타낸다. DP-107은 미국출원 07/927,532에서 좀더 충분히 설명하고 있다. 외피 바이러스의 TM 단백질에 있는 DP-107-유사 펩티드와 DP-178-유사 펩티드는 항-바이러스 활성을 가지는데 적절하게는 이들의 고유서열이 발견되는 바이러스에 특이적인 항바이러스 활성이 있다.
DP-107-유사 펩티드 및 DP-178-유사 펩티드는 단락 9부터 17에 제시된 실시예에서 설명된 것과 같이 컴퓨터의 도움을 받은 조사 전략을 이용하여 확인될 수 있다. 이와 같은 전략으로 DP-107 및 DP-178에 예상 2차 구조와 유사한 부분을 다른 바이러스에서 확인할 수 있다.
이와 같은 조사전략은 9단락에서 제시한 실시예에서 충분히 설명하였다. 이와 같은 조서 전략은 DP-107 및 DP-178에서 유추한 주요 아미노산 모티브에 부분적으로 기초된 것이나, 이와 같은 단백질 서열 상동성이 바이러스의 주요 그룹 사이가 아니라 주요 그룹 내에 존재하기 때문에 주요 아미노산 서열 상동성에 대한 조사에 전적으로 기초하지는 않는다. 가령, 주요 아미노산 서열 상동성은 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)의 상이한 분리체의 TM 단백질내에서 또는 HIV-1의 상이한 균주의 TM 단백질내에서 그러나, HIV-1 와 SIV 사이의 주요 아미노산 서열 상동성은 이용할 수 없을 정도로 너무 낮다. 따라서, 주요 서열 상동성에만 기초하여, 구조적으로 또는 다른 것으로든 간에 다른 바이러스내에서 DP-107 또는 DP-178 유사 펩티드를 찾는 것은 불가능하다.
또한, 특이적 아미노산 자체에 기초하는 것보다는 상이한 종류의 아미노산의 물리적 화학적 특징에 기초하여 아미노산의 주요 서열 배열을 확인하는 것이 유익할 수 있는데, 예를 들면, 펩티드 서열의 코일드-코일 특징에 집중할 수 있고, 코일드-코일 성향을 확인하기 위해 Lupas(Lupas, A., et al., 1991 Science 252:1162-1164)에 의해 고안된 컴퓨터 알고리즘은 DP-107 또는 DP-178 에 유사한 단백질 부분을 확인하는데에는 부적절하다.
특히, Lupas 알고리즘을 이용한 HIV-1 gp160(gp120 과 gp41 모두를 포함하는) 분석은 DP-107 내에 코일드-코일부분을 확인할 수 없다. 그러나, C-말단에서 8개 아미노산으로 끝나고 DP-178 의 시작에서 8개 아미노산 N-말단으로 시작하는 DP-178 내에 부분을 확인할 수 있다. DP-107 펩티드는 안정한 코일드 코일을 형성한다는 것을 실험적으로 보여주었다. 따라서, Lupas 조사 알고리즘에 기초한 조사는 DP-107 코일드 코일 부분을 확인할 수 없다. 역으로, Lupas 알고리즘은 잠재적코일드 코일 모티프로써 DP-178 부분을 확인하였다. 그러나, 이 부분에서 유도된 펩티드 DP-178은 용액에서 코일드-코일을 형성하지 못하였다. HIV-1 TM 내에 정확하게 코일드-코일 서열을 확인하기 위해 Lupas 조사 알고리즘의 무능력에 대해 가능한 설명은 Lupas 알고리즘이 본 발명의 목적인 바이러스, 항바이러스 펩티드(e.g. DP-107 와 DP-178)의 TM 단백질에 구조적 또는 기능적으로 유사하지 않은 단백질로부터 코일드 코일구조에 기초하는 것이다.
하기 단락 9에서 16 까지 제시한 실시예에 설명한 것과 같이, 본 발명의 컴퓨터 조사 전략은 DP-107 또는 DP-178 과 유사한 바이러스성 TM 단백질의 부분을 성공적으로 확인하는 것이다. 이와 같은 조사 전략은 상업적으로 이용할 수 있는 서열 데이터베이스 패키지, 적절하게는 PC/Gene 함께 사용하도록 고안된 것이다. 일련의 모티프는 단락 9에서 논의된 것과 같이 매우 정밀한 범위부터 매우 광범위한 부분까지 할 수 있도록 고안되고 조작되었다.
컴퓨터 지원을 받은 DP-107 유사와 DP-178 유사 항바이러스 펩티드 조사에서 이용될 수 있는 단백질 서열 조사 모티프는 170×17×4 모티프, ALLMOT15 모티프, P}ZIP 모티프 시리즈인데, 이들 각각은 단락 9에서 설명하고 있고, 107×178×4 가 적절하다.
코일드-코일드 서열은 헵타드 아미노산 반복체로 구성된 것으로 간주된다. 설명을 좀더 용이하게 하기 위해 헵타드 반복체내에 아미노산 위치는 A에서 G 까지로 나타내는데, 제 1 위치는 A, 제 2 위치는 B 가 된다. DP-107-유사와 DP-178 유사 서열을 확인하는데 사용되는 모티프는 이와 같은 헵타드 반복체를 특이적으로조사하고, 확인하도록 고안된 것이다. 여기에서 상술하는 각 모티프 설명에서, []안의 아미노산은 주어진 헵타드 위치에서 수용할 수 있는 아미노산만을 의미하고; {}안의 아미노산은 주어진 헵타드 위치에서 수용할수 없는 아미노산만을 의미한다. {} 또는 [] 아미노산 다음에는 ()에 포함된 수가 붙어있는데, 이 숫자의 의미는 지정된 아미노산 세트내에 위치하는 아미노산이 가지는 세트의 연속 아미노산 수를 나타내는 것으로, 예를 들면, (2)는 그 다음 2개 펩타드 아미노산이 위치한다는 것이다.
ALLMOTI5 는 다음과 같이 표시할 수 있다.
{CDGHP] - {CFP} (2) - {CDGHP} - {CFP} (3) -
{CDGHP] - {CFP} (2) - {CDGHP} - {CFP} (3) -
{CDGHP] - {CFP} (2) - {CDGHP} - {CFP} (3) -
{CDGHP] - {CFP} (2) - {CDGHP} - {CFP} (3) -
{CDGHP] - {CFP} (2) - {CDGHP} - {CFP} (3) -
이 모티프를 해석해 보면, 헵타드의 제 1 (A)위치에서 C,D,G,H 또는 P를 제외한 어떤 아미노산도 수용가능하고; 그 다음 2개(B) 아미노산 위치에서는 C,F 또는 P를 제외한 어떤 아미노산도 수용가능하고; 네번째 헵타드 위치(D)에서는 C,D,G,H 또는 P를 제외한 어떤 아미노산도 수용가능하고; 그 다음 세 개(E,F,G) 아미노산 위치에서 C,F 또는 P를 제외하고 어떤 아미노산도 수용가능하다. 이와 같은 모티프는 5 개 연속 헵타드 반복체(즉, 헵타드 반복체 제 1 라인 5회)를 조사를 할 수 있도록 고안되어, 이는 35-mer 크기의 펩티드를 조사할 수 있다는 것을 말한다.또한, 최초 모티프를 4회만 반복시킴으로써 28-mer 크기 펩티드를 조사할 수 있도록 되어 있다. ALLMOTI5 모티프에 대해 35-mer 조사가 적절하다. ALLMOTI5 모티프와 같은 모티프를 통하여 확인된 바이러스 서열을 이 단락 끝부분에 있는 표 5 에 나열하였다. 표 V 에 나열된 바이러스 서열은 잠재적으로 항바이러스 활성을 나타내고, 항바이러스 조성물을 확인하는데 이용하고, 이는 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 본다.
170×178×4 모티프는 다음과 같이 나타낼 수 있다.
[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP} (2) - [EFIKLNQSTVWY] - {CFMP} (3) -
[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP} (2) - [EFIKLNQSTVWY] - {CFMP} (3) -
[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP} (2) - [EFIKLNQSTVWY] - {CFMP} (3) -
[EFIKLNQSTVWY]-{CFMP} (2) - [EFIKLNQSTVWY] - {CFMP} (3) -
이 모티프를 해석하기 위해 헵타드 제 1(A) 위치에서는 E,F,I,K, L, N, Q, S, T, V, W, Y를 제외한 아미노산을 수용할수 있고, 그 다음 두(B, C) 아미노산 위치에서는 C, F, M 또는 P를 제외한 아미노산 잔기를 수용할 수 있고, 제 4 위치(D)에서는 E, F, I, K, L, N, Q, S, T, V, W, Y를 제외한 아미노산이 수용될 수 있고, 그 다음 3개(E, F, G) 아미노산 위치에서는 C, F, M 또는 P를 제외한 아미노산 잔기를 수용할 수 있다. 이와 같은 모티프는 4개 연속 펩타드 펩티드(즉, 헵타드 반복제 제 1 라인, 5회)를 조사할 수 있도록 고안되어, 이는 28-mer 크기 펩티드를 조사할 수 있다는 것을 말한다. 또한, 초기 모티프를 4회만 반복시킴으로써 35-mer 펩티드를 조사할 수 있도록 되어 있다. 107×178×4 모티프에 대해서는 28-mer 조사가 적절하다. 107×178×4 모티프와 같은 모티프를 통하여 확인된 바이러스 서열을 이 단락 끝에 있는표 5 에 나열하였다. 표 V 에 나열된 바이러스 서열은, 잠재적으로 항바이러스 활성을 나타내고 항바이러스 조성물을 확인하는데 이용할 수 있고, 이는 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 본다.
PLZIP 일련의 모티프는 도면 19 에 나열된 것과 같다. 이들 모티프는 루이신 지퍼 코일드-코일 유사 헵타드를 확인하도록 고안되었는데 이때 적어도 하나의 프롤린 잔기는 반복체의 N 말단으로부터 어느정도 예정된 거리에 위치한다. 이와 같은 PLZIP 모티프는 막통과 고정기의 바로 N-단부에 일반적으로 위치한 HIV-1 DP-178 에 유사성을 가지는 단백질 부분을 찾을 수 있다. 이들 모티프는 전술한 동일한 규정에 따라 해석될 수 있다. 도면 19에 나타낸 각 라인은 하나의 완전한 조사 모티프를 나타낸다. 이들 모티프에서 "X"는 임의 아미노산 잔기를 나타낸다. 모티프가 ()내에 두 개 숫자가 가지는 경우, 이는 아미노산 잔기의 가변 숫자를 의미한다. 예를 들면, X(1, 12)는 그 다음 1 내지 12개 아미노산 잔기(1과 12번 아미노산 잔기 포함하며)는 임의 아미노산이 될 수 있다는 것으로 해석할 수 있다.
이 단락의 끝부분에 있는 표 6-10 에서는 이와 같은 PLZIP 모피프와 일치하는 것을 나열한 것이다. 표 6-10에 나열된 바이러스 서열은 잠재적으로 항바이러스 활성을 나타내고, 항바이러스 화합물을 확인하는데 이용할 수 있으며, 이는 본 발명의 영역에 속하는 것으로 간주한다.
하기 단락 17 와 18 에 제시한 실시예에서는 컴퓨터 조사를 통하여 확인된 호흡기 합포체 바이러스와 파라인플루엔자 바이러스 서열이 DP-107 또는 DP-178 의것과 유사한 항바이러스 또는 구조적 특징을 나타내었다고 설명한다.
또한, DP-107-유사와 DP-178 유사 펩티드에는 5.1에서 상술한 것과 같이 DP-178에 대한 추가 기를 포함할 수 있다. 가령, 이들 펩티드에는 표 1-4 의 "X"로 나타낸 임의의 추가된 아미노-단부기를 포함하고, 표 1-4 의 "Z"로 나타낸 C-단부기를 포함할 수도 있다.
또한, DP-107-유사와 DP-178-유사 펩티드에는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함하는 표 5-10에 나열된 것과 같은 DP-107-유사 또는 DP-178 유사펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 또한, DP-107-유사와 DP-178 유사 펩티드의 유사체는 본 발명의 영역내에 속하는 것으로 본다. 본 발명의 이와 같은 유사체는 증가된 항바이러스 활성을 나타내고 또한 증가된 생체이용성 및 안정성, 또는 감소된 면역인지성을 보유한다.
단락 5.1에서 설명한 DP-178에 대해 설명한 것과 같이 DP-107 유사체와 DP-178 유사 아미노산 삽입, 치환과 결실을 설명한다. 하기 5.3 에서는 유사체 변형에 대해 상술한다.
표 5
107×178×4 와 ALLMOTI5 모티프의 조사결과 요약
주) 표 설명;
첫째 칸에는 해당 모티프의 이름이 기재되어 있고;
첫째 열에는 이용된 라이브러리 이름이 나열되어 있는데, 이때 라이브러리 이름은 두 부분으로 구성되는데, 그 앞부분은 확인된 단백질의 이름에 해당되고,이어져 있는 뒷부분은 확인된 펩티드가 유도된 바이러스의 이름을 적은 것이다.
그 다음 열에는 확인된 펩티드의 아미노산 잔기 범위를 나타내는데, 그 범위가 한 개이상인 경우도 있다.
표 6
PCTLZIP, PICTLZIP, P2CTLZIP 모티프의 조사결과 요약
주) 표 설명;
첫째 칸에는 해당 모티프의 이름이 기재되어 있고;
첫째 열에는 이용된 라이브러리 이름이 나열되어 있는데, 이때 라이브러리 이름은 두 부분으로 구성되는데, 그 앞부분은 확인된 단백질의 이름에 해당되고, 이어져 있는 뒷부분은 확인된 펩티드가 유도된 바이러스의 이름을 적은 것이다.
그 다음 열에는 확인된 펩티드의 아미노산 잔기 범위를 나타내는데, 그 범위가 한 개이상인 경우도 있다.
표 7
P3CTLZIP, P4CTLZIP, P5CTLZIP, P6CTLZIP 모티프의 조사결과 요약
주) 표 설명;
첫째 칸에는 해당 모티프의 이름이 기재되어 있고;
첫째 열에는 이용된 라이브러리 이름이 나열되어 있는데, 이때 라이브러리 이름은 두 부분으로 구성되는데, 그 앞부분은 확인된 단백질의 이름에 해당되고, 이어져 있는 뒷부분은 확인된 펩티드가 유도된 바이러스의 이름을 적은 것이다.
그 다음 열에는 확인된 펩티드의 아미노산 잔기 범위를 나타내는데, 그 범위가 한 개이상인 경우도 있다.
표 8
P7CTLZIP, P8CTLZIP, P9CTLZIP 모티프의 조사결과 요약
주) 표 설명;
첫째 칸에는 해당 모티프의 이름이 기재되어 있고;
첫째 열에는 이용된 라이브러리 이름이 나열되어 있는데, 이때 라이브러리 이름은 두 부분으로 구성되는데, 그 앞부분은 확인된 단백질의 이름에 해당되고, 이어져 있는 뒷부분은 확인된 펩티드가 유도된 바이러스의 이름을 적은 것이다.
그 다음 열에는 확인된 펩티드의 아미노산 잔기 범위를 나타내는데, 그 범위가 한 개이상인 경우도 있다.
표 9
P12CTLZIP 모티프의 조사결과 요약
주) 표 설명;
첫째 칸에는 해당 모티프의 이름이 기재되어 있고;
첫째 열에는 이용된 라이브러리 이름이 나열되어 있는데, 이때 라이브러리 이름은 두 부분으로 구성되는데, 그 앞부분은 확인된 단백질의 이름에 해당되고, 이어져 있는 뒷부분은 확인된 펩티드가 유도된 바이러스의 이름을 적은 것이다.
그 다음 열에는 확인된 펩티드의 아미노산 잔기 범위를 나타내는데, 그 범위가 한 개이상인 경우도 있다.
표 10
P23CTLZIP 모티프의 조사결과 요약
주) 표 설명;
첫째 칸에는 해당 모티프의 이름이 기재되어 있고;
첫째 열에는 이용된 라이브러리 이름이 나열되어 있는데, 이때 라이브러리 이름은 두 부분으로 구성되는데, 그 앞부분은 확인된 단백질의 이름에 해당되고, 이어져 있는 뒷부분은 확인된 펩티드가 유도된 바이러스의 이름을 적은 것이다.
그 다음 열에는 확인된 펩티드의 아미노산 잔기 범위를 나타내는데, 그 범위가 한 개이상인 경우도 있다.
5.3. 펩티드의 합성
본 발명의 펩티드는 본 기술에 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다. Creighton, 1983, Porteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY. 가령 짧은 펩티드는 고형 서포트상에서 또는 용액내에서 합성될 수 있다. 긴 펩티드는 재조합 DNA 기술을 사용하여 만들 수 있다. 여기에서 본 발명의 펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 본 기술에 공지된 기술에 따라 합성되고 클론되고 그리고 발현될 수 있다. Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols, 1-3, Cold Spring har-bor Press, NY.
또한, 본 발명의 펩티드는 펩티드의 아미노산 잔기를 연결시키는 하나 이상의 결합에 의해 합성될 수 있는데 이때 결합은 비-펩티드 결합이 된다. 이와 같은 또다른 비-펩티드 결합은 본 기수에 공지된 반응을 이용하여 만들 수 있는데 여기에서 이미노결합, 에스테르결합, 하이드라지드결합, 세미카르바지드결합와 아조결합등이 포함될 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 또다른 구체예에서 전술한 서열로 구성된 펩티드는 펩티드의 C 와 A 단부에 있는 추가의 화학기와 함께 합성될 수 있는데 가령, 펩티드의 안전성, 생체이용성, 저해활성이 강화될 수 있다. 가령, 카르보벤조옥실, 단실 또는 t-부틸옥시카르보닐기와 같은 소수성기가 펩티드의 아미노단부에 추가될 수도 있다. 유사하게 아세틸기 또는 9-플로로에닐메톡시-카르보닐기는 펩티드 아미노단부에 위치할 수 있다(표 1-4 의 "X"). 또한, 소수성기, t-부틸옥시카르보닐 또는 아미노기는 펩티드의 카르복시 단부에 추가될 수 있다(표 1-4의 "Z"). 또한, 본 발명의 펩티드는 이들의 공간적 모양이 변경될 수 있도록 합성될 수 있다. 가령, 통상의 L-이성체 대신에 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 D-이성체가 사용될 수도 있다. 또한 본 발명의 펩티드의 아미노산 잔기중 적어도 하나는 잘 알려진 자연적으로 발생하는 것이 아닌 아미노산 잔기중 하나로 치환될 수 있다. 이와 같은 변경은 본 발명 펩티드의 안전성, 생체이용성, 저해활성을 증가시키도록 작용할 수 있다.
추가로 상기 설명된 펩티드중 임의 펩티드는 이들의 아미노 또는 카르복시단부에 공유적으로 결합된 비-펩티드 거대분자 캐리어기를 가질 수 있다. 이와 같은 거대분자 캐리어기에는 지질-지방산 공액체, 폴리에틸렌글리콜, 또는 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 표 1-4 의 "X"는 펩티드의 아미노 단부에 공유적으로 결합된 임의 거대분자 캐리어기를 추가로 나타낼 수 있다. 유사하게 표 1-4 의 "Z"는 전술한 거대분자 캐리어기중 임의의 것을 추가로 나타낼 수 있다.
5.4 항바이러스 활성 검사
본 발명의 펩티드에 의해 나타나는 항바이러스 활성은 하기에서 상술하는 바와 같은 용이하게 실시할 수 있는 시험관 검사를 통하여 측정될 수 있는데, 이 테스트는 무세포 바이러스에 의해 감염을 억제하는 능력 또는 합포체형성을 억제하는 능력을 검사한다. 이들 검사를 이용하여, 펩티드의 관련 항바이러스 활성으로써 이와 같은 변수는 주어진 바이러스 균주에 대해 나타내고 또는 펩티드의 균주 특이적 저해활성이 결정될 수 있다. 세포 융합검사는 시험관에서 HIV-유도된 합포체 형성을 저해하는 펩티드 능력을 검사하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 검사는 검사될 만성적인 HIV-감염된 세포와 펩티드 존재하에 감염안된 CD-4+ 세포(가령 Molt 또는CEM 세포)를 배양하는 것으로 구성된다. 각 펩티드에서 펩티드 농도범위를 테스트할 수 있다. 이 범위는 펩티드가 첨가안된 콘트롤 배양물도 포함되어야 한다. 본 기술에 공지된 배양을 위한 표준 조건을 이용할 수 있다. 적정기간(37℃ 24h) 동안 배양후에, 배양물은 다핵 거대 세포의 존재를 현미경으로 검사하는데, 다핵 거대 세포는 세포융합 및 합포체 형성되었다는 것을 나타낸다.
역전사효소(RT) 검사는 무세포 HIV 에 의해 CD-4+ 세포의 감염을 저해하는 펩티드 능력을 테스트하는데 이용될 수 있다.
이와 같은 검사는 테스트한 펩티드 존재하에 적정농도(TCID50)의 바이러스 및 CD-4+ 세포를 배양하는 것으로 구성된다. 본 기술에 공지된 배양 조건을 이용할 수 있다. 전술한 것과 같이, 펩티드가 추가안된 콘트롤 배양물과 함께 다양한 농도의 펩티드가 이용될 수 있다. 배양물을 적정시간(7 일) 배양후에, 무세포 상층액을 표준과정에 따라 준비하고 성공적인 감염의 측도로써 RT 활성의 존재에 대해 검사한다. RT 활성은 Goff et al.(Goff, S. et al., 1981, J. Virol, 38:239-248) and/or Willey et al.(Willey, R. et al., 1988, J. Virol. 62:139-147)에 상술한 것과 같은 표준기술을 사용하여 테스트할 수 있다. 이들은 참고문헌으로 전문이 여기에 포함된다.
비-레트로바이러스 활성을 검사하는데에는 본 기술에 잘 알려진 표준방법을 사용할 수 있다. 호흡기 합포체 바이러스와 파라인플루엔자 바이러스 활성검사기술에 대해 논의하고 있는 Pringle et al.(Pringle, C.R. et al., 1985, J. MedicalVirology 와 이와 같은 기술의 복습인 "Zinsser Microbiology", 1988, Joklik, W.K. et al., eds., Appleton & Lange, norwalk, CT, l9th ed.에서 볼 수 있다. 이들 문헌은 참고문헌으로 전문이 여기에 첨부하였다.
5.5. 본 발명 펩티드의 용도
본 발명의 DP-178(SEQ ID:1), 이의 단편, 유사체, 동사체는 강력한 항바이러스 활성을 나타낸다. 본 발명의 DP-107 유사 펩티드와 DP-178 유사 펩티드는 적절하게는 항바이러스 활성을 나타낸다. 이와 같이 이들 펩티드는 감염안된 세포로의 사람과 비-사람 바이러스 및 레트로바이러스, 특히, HIV 의 전달을 지배하는 저해물질로 이용될 수 있다.
본 발명의 펩티드에 의해 전달이 저해되는 사람 레트로바이러스에는 HIV-1와 HIV-2, HILV-1 와 Ⅱ의 모든 균주를 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 본 발명의 펩티드에 의해 전달이 저해되는 비-사람 레트로바이러스에는 소 루코시스 바이러스, 고양이 육종과 루키미아 바이러스, 양 진행성 폐렴 바이러스를 포함하나 이에 국한시키지 않는다.
본 발명의 펩티드에 의해 수송이 저해되는 비-레트로바이러스에는 사람 호흡기 합포체 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 뉴캐슬 질병 바이러스, 사람 파라인플루엔자 바이러스와 인플루엔자 바이러스를 포함하나 이에 한정시키지 않는다. 또한 표 5-10에 나열한 펩티드를 포함하는 임의 바이러스 또는 레트로바이러스는 본 발명의 펩티드에 의해 저해될 수도 있다.
단락 5.5.1 와 8에서 충분히 설명하는 것과 같이 DP-107 및 DP-178 와 DP-107-유사펩티드와 DP-178 유사 펩티드는 바이러스의 정상 활성에 요구되는 비-공유적 단백질-단백질 상호작용을 형성한다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 이와 같은 단백질-단백질 상호작용을 간섭하는 화합물을 확인하는 성분으로 이용될 수 있고, 따라서 항-바이러스제로 작용할 수 있다. 이 검사는 하기 단락 5.5.1에서 논의한다.
5.5.1 PKD1 유전자 산물과 상호작용하는 화합물을 위한 항바이러스 화합물 스크리닝 검사
하기 8에서 나타낸 실시예에서 설명하는 것과 같이, TM 단백질 gp41의 DP-107와 DP-178 부분은 비-공유적 단백질-단백질 상호작용을 형성한다. 설명한 것과 같이, 이와 같은 상호작용의 유지는 보통 바이러스 감염성에 필수적이다. 따라서, DP-107, DP-178 에 결합하고 보통 DP-107/DP-178 단백질-단백질 상호작용을 파괴하기 위해 작용하는 화합물은 특허성 항바이러스 물질로써 작용할 수 있다. 하기에서 설명하는 것은 이와 같은 화합물 확인을 위한 검사이다. 여기에서 논의를 명확히 하기 위해 DP-107 와 DP-178 펩티드는 설명한한 검사의 성분으로 이용될수 있으나 5.1 과 5.2에서 상술한 DP-107-유사 펩티드와 DP-178 유사 펩티드 또한 항바이러스 화합물의 이와 같은 선별의 일부로써 이용될 수 있다.
DP-107, DP-178 에 결합하는 능력 또는 DP-107/DP-178 의 상호작용을 파괴하는 능력을 테스트 받고 그리고 잠재적으로 항바이러스 활성을 가지는 화합물은 D- 와 L-모양 아미노산으로된 펩티드(가령, 무작위 펩티드 라이브러리형, Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354:82-84); 인지질(가령, 무작위 또는 부분적인 퇴행성, 인펩티드 라이브러리; Songyang Z. et al., 1993, Cell 72:767-778), 항체와 작은 유기 또는 무기분자를 포함하나 이에 한정시키지는 않는다. 여기에서 상술하는 것과 같은, 다양한 방식으로 합성화합물 천연 산물, 잠재적으로 효과적인 물자의 다른 소스 등이 스크린될 수 있다. 5.4에서 상술하는 것과 같은 바이러스 검사를 이용하여 바이러스 활성을 저해하는 능력에 대해 화합물, 항체 또는 다른 확인된 분자가 테스트될 수 있다.
테스트될 펩티드 가운데에는 DP-107 또는 DP-178 도메인으로 구성된 가용성 펩티드; 도메인 둘 중 하나 또는 모두에 하나 이상의 돌연변이를 가지는 DP-107 와 DP-178 로 구성된 펩티드, 가령, DP-178 서열내에 이소루이신이 프롤린으로 돌연변이된 단락 8 에 제시한 M41-P 펩티드가 될 수 있다.
이와 같은 스크린 방법의 구체예에서, 바이러스 활성에 대해 테스트 받는 화합물을 확인하는 방법은
(a) DP-107 펩티드에 화합물의 결합을 허용할 수 있도록 충분한 시간 동안 DP-107 펩티드로 구성된 펩티드에 적어도 하나의 화합물을 노출시키고;
(b) 결합안된 화합물을 제거하고; 그리고
(c) DP-107 펩티드에 결합된 화합물의 존재를 결정하고 따라서 항바이러스 활성에 대해 검사받는 물질을 확인하는 단계로 구성된다.
스크린 방법의 제 2 구체예에서, 항-바이러스 활성을 테스트 받는 화합물을 확인하는 방법은
(a) DP-178 펩티드에 화합물의 결합을 허용할 수 있도록 충분한 시간 동안 DP-178 펩티드로 구성된 펩티드에 적어도 하나의 화합물을 노출시키고;
(b) 결합안된 화합물을 제거하고; 그리고
(c) DP-178 펩티드에 결합된 화합물의 존재를 결정하고 따라서 항바이러스 활성에 대해 검사받는 물질을 확인하는 단계로 구성된다.
이와 같은 DP-107 결합 또는 DP-178 결합 화합물의 분리에서 따르게 되는 이와 같은 접근방식을 이용하는 한 방법은 아가로즈 또는 플라스틱 비드, 미량적정 플레이트 웰, 배양접시 또는 나일론 및 니트로셀룰로오즈로 구성된 막과 같은 고형 매트릭스에 DP-107 또는 DP-178 펩티드를 부착시키는 것을 포함하는 검사이다. 이와 같은 검사시스템에서 DP-107 또는 DP-178 단백질은 고형표면에 고정시키고, 테스트 물질 또는 화합물은 고정시키지 않고 직접 도는 간접으로 라벨시킨다. 실제 미량적정 플레이트가 편리하게 이용될 수 있다. 고정된 성분은 공유 또는 비공유적 부착에 의해 고정될 수 있다. 비-공유적 부착은 단백질 용액으로 고형면에 피복시키고 건조시키면 간단히 얻을 수 있다. 또는 단백질에 특이적인 고정된 항체, 적절하게는 단 클론 항체는 고형면에 단백질을 고정하는데 사용될 수 있다. 표면은 미리 준비하고 저장할 수도 있다.
검사를 실행하기 위해, 라벨된 화합물은 고정된 DP-107 또는 DP-178 펩티드를 포함하는 피복된 표면에 첨가될 수 있다. 반응이 완료된 후에, 형성된 임의 복합포체가 고형 표면에 움직이지 않은 상태로 있는 조건하에 반응안된 성분은 제거한다(세척에 의해). 고형표면에 고정된 복합포체의 감지는 다양한 방법에 의해 실행될 수 있다. 화합물이 사전-라벨된 경우, 표면에서 고정된 라벨의감지는 복합포체가 형성되었음을 의미한다. 라벨된 성분이 미리-라벨안된 경우, 간접 라벨을 표면에 고정된 복합포체를 감지하는데 이용할 수 있는데; 예로써 화합물에 특이적인 라벨된 항체를 이용한다(한 예로 항체는 라벨된 항-Ig 항체로 직간접 라벨될 수 있다).
또는, 이와 같은 검사는 액상에서 실행될 수 있는데, 반응 산물은 반응안된 성분에서 분리되고, 복합포체는 감지된다; 예를 들면, DP-107 또는 DP-178 어느것이든 주어진 검사에 적절한 것에 특이적인 고정된 항체를 이용하여; 또는 용액내에서 형성된 임의 복합포체를 고정시키기 위해, 화합물에 특이적인 ab 항체, 예로써 테스트 물질을 이용하여; 그리고 고정된 복합포체를 감지하기 위해 복합포체의 다른 부분에 특이적인 라벨된 항체를 이용할 수 있다.
이와 같은 과정을 이용함으로써, 상당수의 분자는 DP-107 또는 DP-178 결합 능력, 따라서 잠재적인 항바이러스 활성에 대해 동시에 스크린 될 수 있다.
또한 화합물은 DP-107/DP-178 복합포체의 형성을 저해하거나 대신 복합포체를 파괴하는 능력에 대해 스크린받는다. 이와 같은 화합물은 그 다음 항바이러스 능력에 대해서도 테스트 받을 수 있다. 설명의 용이성을 위해, DP-107 과 DP-178 은 "결합 짝"으로 칭할 것이다. 이와 같은 상호작용을 파괴하는 화합물은 항바이러스 활성을 나타낼 수도 있다. 이와 같은 화합물에는 항체, 펩티드 및 전술한 유사물질과 같은 분자를 포함하나 이에 한정하지는 않는다.
DP-107 과 DP-178 펩티드 사이의 상호작용을 간섭하는 화합물을 확인하는데 사용되는 검사 시스템의 기본원리는 두 개의 펩티드가 상호작용하여, 결합하고, 복합포체를 형성할 수 있는 충분한 시간 및 조건하에 펩티드를 포함하는 반응혼합물을 준비하는 것과 관련된다. 파괴성 활성에 대해 화합물을 테스트하기 위해, 반응은 테스트 화합물의 유무하에 실시하는데; 예를 들면 테스트 화합물은 반응화합물에 처음부터 포함될 수도 있고 또는 결합짝중 하나를 첨가한 후 연이어 추가할 수도 있고; 콘트롤은 테스트 화합물 없이 또는 위약으로 배양될 수도 있다. 결합짝 사이의 임의 복합포체 형성이 감지된다. 테스트화합물을 포함하는 반응혼합물이 아닌 콘트롤 반응에서 복합포체의 형성은 화합물이 DP-107 와 DP-178 펩티드 사이의 상호작용을 방해하는 것을 나타낸다.
결합짝과 상호작용을 방해하는 화합물의 검사는 이형 또는 동형 포맷에서 실행될 수 있다. 이형성 검사는 고형 상위에 결합짝중 하나를 고정시키고 반응 종료시에 고형상에 고정된 복합포체를 감지하는 것을 포함한다. 동형검사에서는 전체반응은 액상에서 실시한다. 둘중 어떤 방식이건 반응물의 첨가 순서는 테스트될 화합물에 대한 상이한 정보를 얻기 위해 다양하게 할 수 있다. 가령, 경쟁에 의해 결합짝 사이의 상호작용을 방해하는 테스트 화합물은 테스트 물질의 존재하에 반응을 실행함으로써 확인될 수 있는데; 반응 혼합물에 테스트 물질을 결합짝 첨가전에 또는 동시에 첨가한다. 한편, 복합포체로부터 결합짝중 하나를 대체하는 더 높은 결합 상수를 가지는 화합물과 같은 미리 형성된 복합포체를 파괴하는 테스트 화합물은 복합포체가 형성된 후에 반응혼합물에 테스트 물질을 첨가함으로써 테스트 할 수 있다. 하기에는 다양한 포맷에 대해 간략하게 상술하고 있다.
이형 검사 시스템에서 한 개 결합짝(DP-107 또는 DP-178 펩티드)을 고형표면에 고정시키고, 고정안된 이의 결합짝은 직간접으로 라벨시킨다. 실제 미량적정 플레이트가 편리하게 이용된다. 고정된 종은 비-공유적 또는 공유적 부착으로 고정시킨다.
비-공유적 부착은 단백질 용액을 고형표면에 피복하고 건조시킴으로써 간단히 실행할 수 있다. 또는 단백질에 특이적인 고정된 항체는 고형표면에 단백질을 고정시키는데 사용할 수 있다. 표면은 미리 준비하거나 저장할 수 있다.
검사를 실행하기 위해 고정된 종의 결합짝은 테스트 화합물 유무에 관계없이 피복된 표면에 첨가될 수 있다. 반응이 완료된 후에 고형표면에 고정된 형성된 복합포체는 남아있게 하는 조건하에 반응안된 성분을 제거한다(세척에 의해). 고형표면에 고정된 복합포체의 감지는 다양한 방법에 의해 실행될 수 있다. 화합물이 사전-라벨된 경우 표면에서 고정된 라벨의 감지는 복합포체가 형성되었음을 의미한다. 결합짝이 미리-라벨안된 경우, 간접 라벨을 이용하여 표면에 고정된 복합포체를 감지하고; 예로써 화합물에 특이적인 라벨된 항체를 이용하는데 (차례로 항체는 라벨된 항-Ig 항체로 직간접 라벨할 수 있다)
대안으로 반응은 테스트 화합물의 유무하에 액상에서 실시될 수 있는데 반응산물은 반응반된 성분으로부터 분리시키고, 복합포체를 감지한다; 예로써 용액에 형성된 임의 복합포체를 고정시키기 위해 하나 결합짝에 특이적인 고정된 항체를 이용하고, 그리고 고정된 복합포체를 감지하기 위해 다른 결합짝에 특이적인 라벨된 항체를 이용한다. 다시 액상에 반응물을 첨가순서에 따라 복합포체를 저해하거나 미리 형성된 복합포체를 파괴하는 테스트 화합물을 확인할 수 있따.
본 발명의 또다른 구체예에서 동질성 검사가 이용될 수 있다. 이 접근방식에서, 미리 형성된 DP-107 와 DP-178 펩티드 복합포체를 준비하고 이때 결합짝중 하나는 라벨하고, 라벨에 의해 발생되는 신호는 복합포체 형성때문에 사라진다(U.S. 특허 4,109,496). 미리 형성된 복합포체에서 결합짝중 하나를 경쟁하고 대체하는 테스트 물질을 추가하면 배경 이상의 신호를 발생하게 된다. 이와 같은 방식으로, DP-107/DP-178 단백질-단백질 상호작용을 파괴하는 테스트물질을 확인할 수 있다.
5.5. 제약학적 조성물과, 약량 및 투여방식
HIV 에 대해 본 발명의 펩티드는 alDS 치료의 요법제로 이용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 공지의 기술을 이용하여 투여될 수 있다. 적절하게는 물질이 조제하여 전신으로 투여될 수 있다. 조제와 투여에 관한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA에서 찾아 볼 수 있다. 적절한 경로는 구강, 직장, 점막을 통해서 또는 내장투여, 비경구 수송 예로 근육내, 피하내, 골수내 주사 뿐만 아니라 포망내, 심실내로 직접, 정맥내, 복막내, 비강내, 망막내로 투여될 수도 있다. 가장 적절한 투여는 정맥내이다. 주사를 위해, 본 발명의 물질은 수용액 적절하게는 한스(Hanks')용액, 링거(Ringer's) 용액 또는 생리적 염완충액과 같은 생리학적으로 양립할 수 있는 완충액에서 형성될수 있다. 점막을 통한 수송을 위해 침투될 장벽에 적절한 침투물질이 제형에 이용될 수 있다. 이와 같은 침투제는 일반적으로 공지의 것이다.
추가로 펩티드는 HIV 바이러스에 급성 노출된 후에 이전에 감염안된 개체에 예방적인 측정으로도 이용될 수 있다. 이와 같은 펩티드의 예방적인 용도의 예로는 모체에서 태아로의 바이러스 전달을 방지하고, 치료용 세팅에서 사고나 실수에 의해 HIV 감염 가능성이 있을 수 있는데 이 경우 작업자는 HIV-포함 혈액산물에 노출되는데 이와 같은 바이러스 감염의 예방을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 이와 같은 경우의 본 발명의 펩티드는 예방적인 백신의 역할을 할 수 있고 이때 숙주는 본 발명의 펩티드에 대해 항체를 만들고 그 다음 이는 추가의 HIV 감염을 저해함으로써 HIV 바이러스를 중화시키는 역할을 할 수 있다. 따라서 본 발명의 펩티드가 예방 백신으로 투여되는 것은 감염된 세포에 HIV 능력을 저해시킴으로써 HIV를 중화시키는데 충분한 면역반응이 일어나게 하는 효과적인 펩티드 농도를 숙주에게 투여하는 것으로 구성된다. 정확한 농도는 투여될 특정 펩티드에 따라 달라지는데 이는 본 기술에 공지된 면역반응의 발생을 검사하는 표준기술을 이용하여 결정할 수 있다. 백신으로 이용되는 펩티드는 통상적으로 근육내 투여된다.
펩티드는 면역반응을 강화시키기 위해 적절한 어쥬번트와 같이 형성될 수 있다. 이와 같은 어쥬번트에는 수산화알루미늄과 같은 미네랄겔; 리졸레시틴, 플로닌 폴리올, 올리안이온과 같은 표면활성물질; 다른 펩티드: 오일 에멀전 그리고 GCG 와 코리네박테리아 파르븀과 같은 잠재적으로 유용한 사람 어쥬번트를 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 많은 방법이 여기에서 상술한 백신제형을 유입하는데 사용된다. 이들 방법에는 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 그리고 비강경로를 포함하나 이에 한정하지는 않는다.
또한 본 발명의 펩티드에 대해 발생된 다클론성 또는 단클론성 항체의 효과농도가 HIV 에 의해 감염안된 세포가 감염되지 않도록 숙주에 투여될 수 있다. 이와 같은 항체의 정확한 농도는 각 특이적 항체 준비물에 따라 다양해지나 이는 본기술에 숙지된 자에 의한 표준기술을 사용하여 결정할 수 있다. 항체의 투여는 여기에 상술된 것을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 기술을 이용하여 실행할 수 있다.
투여될 본 발명 펩티드의 효과적인 약량은 생물학적 반감기, 생체이용성 그리고 독성과 같은 변수에 대해 본 기술에 공지된 과정을 통하여 결정될 수 있다. 하기 단락 6에서 제시한 데이터로, DP-178 는 펩티드 ㎖ 당 10 ng 의 순환수준을 얻는데 요구되는 약량에서 생체내 효과를 증명할 수 있다.
치료요법적 효과적인 약량은 환자의 생존을 연장하거나 증상을 감소시킬 수 있는 충분한 양의 화합물을 의미한다. 이와 갈은 화합물의 독성과 요법적 효능은 세포 배양물 또는 실험동물에서 LD50(집단의 50% 치사량)과 ED50(집단의 50% 에 치료요법적 효과적인 양)을 결정하기 위해 표준 제약학적 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료요법적 효과 사이의 약량비는 치료요법적 색인으로써 LD50/ED50 비율로 나타낸다. 치료요법적 색인(지수)가 큰 화합물이 적절하다. 이와 같은 세포배양검사와 동물 연구에서 얻은 데이터는 사람에서 이용할 수 있는 약량의 범위를 조제하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 화합물의 약량은 독성이 거의 없는 ED50을 포함하는 순환농도 범위내에 있는 것이 적절하다. 약량은 이용될 투여경로와 이용될 약제형에 따라 이 범위내에서 다양하다. 본 발명의 방법에 사용된 임의화합물의 경우에 치료요법적 효과적인 약량은 세포배양 검사로부터 초기 평가할 수 있다. 세포배양물에서 결정한 바와 같이, 약량은 IC50(예로써, 복합포체 성분의 활성 또는 세포수준의 l/2 저해또는 PTK/어댑터 단백질 복합포체의 1/2 파괴를 이루는 테스트화합물의 농도이다)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 얻기 위해 동물모델에서 형성될 수 있다. 이와 같은 정보는 사람에서 유용한 약량을 좀더 정확하게 결정하기 위해 이용된다. 혈장에서의 수준은 HPLC 에 의해 결정된다.
정확한 제형, 투여경로와 약량은 환자의 상태에 따라 개별의사에 의해 선택될 수 잇다(Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 pl).
참여의사는 독성 또는 기관 기능이상으로 인해 투여를 어떻게 언제 종료할 것인지, 중단하는지 또는 조절하는지를 알고 있다. 역으로, 의사는 임상반응이 적절하지 않을때(독성제외), 치료를 더 높은 수준으로 조절하는 것도 알고 있다. 소요의 암질병의 조정에서 투여된 약량의 크기는 투여경로와 치료되는 질병의 상황에 따라 다양해질 수 있다. 약량과 빈도는 환자나이, 체중 그리고 개별반응에 따라 다양해질 수 있다. 전술한 것에 픽적하는 프로그램은 수의학에게도 사용될수 있다.
하기 단락6에서 제시하는 실시예의 설명과 같이, 본 발명 펩티드의 항바이러스 활성은 두드러진 타입 및 서브타입 특이성을 나타내는데 예로써 특정 펩티드는 특정 바이러스의 활성을 저해하는데 효과적이다. 본 발명은 특정 바이러스의 활성을 저해하는데 효과적이다. 이와 같은 본 발명의 특징은 많은 장점을 제시한다. 가령 이들 장점중 하나는 진단분야에 있는데, 이 때 바이러스 분리체의 확인을 확신하기 위해 본 발명 펩티드의 항바이러스 특이성을 이용할 수 있다. HIV 에 대해서는, 바이러스 분리체가 HIV-1 또는 HIV-2 균주로 구성되는지를 용이하게 결정할수 있다. 가령, 감염안된 CD-4+ 세포는 HIV DP-178(SEQ ID:1) 펩티드를 포함하는 것으로 확인된 분리체와 공동 감염시키고, 그 다음 세포 상층액의 레트로바이러스성 활성은 상기 5.2에서 상술하는 기술을 이용하여 검사할 수 있다. 레트로 바이러스성 활성이 완전히 저해된 또는 거의 완전하게 분리체에는 HIV-1을 포함한다. 분리체의 바이러스 활성이 변화가 없거나 또는 소량만이 감소된 이들 분리체에는 HIV-1을 포함하지 않는 것으로 보인다. 이와 같은 분리체는 본 발명의 하나 이상의 다른 DP-178 펩티드로 처리하고, 연속하여 이들 바이러스 활성을 테스트하여 바이러스 분리체의 정체를 확인한다.
조직적인 투여에 적합한 약량으로 본 발명의 실행을 위해 여기에서 상술하는 화합물을 만드는데 제약학적으로 수용가능한 캐리어의 사용도 본 발명의 영역내에 있다. 캐리어와 제조과정의 적절한 선택에 의해 본 발명의 조성물, 특히 용액으로 조성된 조성물은 정맥투여와 같은 비경구적으로 투여될 수 있다. 이와 같은 화합물은 구강투여를 위한 적절한 약량으로 본 기술에 공지된 제약학적 수용가능한 담체를 이용하여 손쉽게 제조할 수 있다. 이와 같은 캐리어는 본 발명의 화합물이 치료를 받을 환자가 구강으로 섭취할 수 있도록 정제, 알약, 캡슐, 지질, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액으로 제조할 수 있게 한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 제약학적 조성물에는 소요의 목적을 달성하는 효과량의 활성성분이 포함된 조성물을 포함한다. 효과량을 결정하는 것도 당업자의 능력범위내에 속하고, 특히 여기에서 제공하는 상세한 설명에 숙지된 당업자의 능력 범위에 속한다.
활성성분에 추가하여 이들 제약학적 조성물에는 부형제와 보조제로 구성된적절한 제약학적 캐리어를 포함되어, 활성 화합물을 제약학적으로 이용할 수 있는 조제물로 프로세싱시킬 수 있다. 구강투여를 위해 제조된 준비물은 정제, 당의정, 캡슐, 용액 형이 될 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 자체적으로 잘알려진 방법으로 만들어 질 수 있는데, 예를 들면, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 만들기, 가루만들기, 에멀젼화, 포집호, 포획화, 냉동건조 공정등에 의해 제조될 수 있다.
장관외 투여용 제약학적 조성물은 수용성형으로 활성 화합물의 수용액을 포함할 수 있다. 또한, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 준비될 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 소포에는 참깨오일과 같은 지방유, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드와 같은 합성 지방산 에스테르 또는 리포좀이 포함될 수 있다. 수용성 주사 현탁액은 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점성을 증가시키는 물질이 포함될 수 있다. 선택적으로 현탁액은 농축된 용액을 준비하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 적절한 안정화제를 포함할 수도 있다.
경구용 제약학적 조성들은 활성성분에 고형 부형제를 복합시키고, 선택적으로 생성된 혼합물을 갈고, 과립 혼합물을 프로세싱하고, 필요한 경우 적절한 보조제를 첨가시켜 적절한 정제 또는 당의정을 얻을 수 있다. 특히 적절한 부형제는 충진제 예를 들면, 락토즈, 슈크로즈, 만니톨 또는 소르비톨을 포함한 당; 옥수수 전분, 밀전분, 쌀전분, 감자전분, 겔라틴, 검 트라가칸트, 메틸 셀룰로오즈, 하이드록시 프로필메틸-셀룰로오즈, 카르복시메틸셀룰로오즈 나트륨 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 같은 셀룰로오즈 준비물이 된다. 필요한 경우 분해제 가령 교차연결된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알리기닌산 또는 알라지네이트 나트륨과 같은 이의 염이 첨가될 수 있다.
당의정핵에는 적절한 코팅을 제공할 수 있다. 이 목적을 위해 농축당 용액이 이용되는데 선택적으로 아라비아고무, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, PEG, 그리고 이산화티타늄, 락카용액, 적절한 유기용매 또는 용매혼합물이 포함된다. 안료를 정제 또는 당의정 피복에 첨가시켜 활성 화합물 약량이 다르게 복합된 것을 구분 또는 특징화시킬 수 있다.
경구로 이용할 수 있는 제약학적 조성물은 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트 캡슐과 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제와 젤라틴으로 만들어진 연성 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸쉬-피트 캡슐은 전분과 같은 결합제, 락토즈와 같은 충전제, 활석 또는 스테레이트 마그네슘과 같은 윤활제, 선택적으로 안정화제로 혼합된 활성성분을 포함한다. 연성캡슐에서 활성 화합물은 지방유, 액상 파라핀 또는 액상 PEG 에 용해되거나 현탁된다. 또한 안정화제가 첨가될 수도 있다.
6. 실시예 : DP-178(SEQ ID:1)는 HIV-1 감염의 강력한 저해제이다
이 실시예에서 DP-178(SEQ ID:1)는 무 세포 바이러스에 의한 HIV-1 중개된 CD-4+ 세포-세포융합과 감염의 강력한 저해물질인 것으로 보인다. 융합검사에서 이 펩티드는 1-10ng/㎖ 농도에서 바이러스 유도된 합포체형성을 완전히 차단하였다. 감염 검사에서, 저해농도는 다소 높았고, 90ng/㎖에서 감염을 차단시켰다. DP-178(SEQ ID:1)는 DP-178(SEQ ID:1)의 항바이러스 활성이 HIV-1 에 대해 상당한 특이성을 나타내는 것으로 보인다. 또한 HIV-1-유도된 DP-178 동사체를 나타내는 합성 펩티드, DP-185(SEQ ID:3)는 HIV-1 중재된 합포체형성을 차단하는 것으로 밝혀졌다.
6.1. 재료와 방법
6.1.1. 펩티드 형성
펩티드는 Applied Biosystems Model 431A 펩티드 합성기에서 Fast Moc 화학을 이용하여 합성하였다. 아미데이트된 펩티드는 링크수지(Advanced Chemtech)를 이용하여 준비하고 자유 카르복시단부를 포함하는 펩티드는 Wang(P-알콕시-벤질-알코올) 수지(Bachem)에서 합성되었다. 제 1 잔기는 적절한 수지에 이중결합되고 연속잔기는 단일 결합된다. 각 결합단계는 아세트 안하이드리드 캐핑에 의해 이어진다. 펩티드는 트리플로로아세트산(TFA)(10㎖), 물(0.5㎖), 티오아니졸(0.5㎖), 에탄에디티올(0.25㎖), 결정 페놀(0.75g)으로 처리함으로써 수지에서 절단된다. 정제는 역상 HPLC 에 의해 실행된다. 정제안된 펩티드 약 50mg 샘플은 물/아세토니트릴 0.1% TFA; 선경사로된 Waters Delta Pak C18 column (19mm × 30cm, 15μspherical)에서 크로마토그래피한다. 냉동건조된 펩티드는 데시케이트에 보관하고 펩티드 용액은 1mg/㎖로 물에서 만든다. 일렉트로 스프레이 중량 스펙트로매트에서 하기와 같은 결과가 나왔다 : DP-178(SEQ ID:1):4491.87(calculated 4491.94); DP-180 (SEQ ID:2):4491.45(calculated 4491.94); DP-185(SEQ ID:3): not done (calculated 4546.97).
6.1.2. 바이러스
HIV-1LAI바이러스는 R.Gallo (Popovic, M. et al., 1984, Science 224:497-508)에서 수득하고 10% 태아 송아지 혈청을 포함하는 RPMI 1640에서 배양된 CEM 세포에서 증식시켰다. 감염된 CEM 세포로부터 상층액은 0.2㎛ 필터를 통과시키고 감염성 역가는 바이러스 복제를 지원하는 AA5 세포주를 이용하여 마이크로 감염성 검사에서 측정될 수 있다. 이 목적을 위해 25㎕ 연속 희석된 바이러스는 96-웰 미량적정 플레이트에서 2×105/㎖ 농도에서 75㎕ AA5 세포에 첨가한다. 각 바이러스 희석은 3중으로 테스트한다. 세포는 하루걸러 새로운 배지를 첨가시켜 8일간 배양시켰다. 감염후 8일째 상층액 시료는 상층액으로 배출된 역전사효소 활성에 의해 나타나는 바이러스 복제에 대해 테스트한다. TCID50은 Reed and Muench formula (Reed, L.J. et al., 1983, Am. J. Hyg. 27:493-497)에 따라 계산된다. AA5 세포주에서 측정하였을 때 이들 연구에 이용된 HIV-1LAI와 HIV-MN원액의 역가는 각각 약 1.4×106와 3.8×104TCID50/㎖ 이다.
6.1.3. 세포 융합 검사
약 7×104Molt 세포는 이미 상술한 것과 같이 최종용적 100㎕ 배양 배지에서 96-웰 플레이트(1/2 면적 클러스터 플레이트; Costar, Cambridge, MA)에 HIV-1LAI바이러스로 만성감염된 1×104CEM 세포와 함께 배양시켰다. (Mattews, T.J. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5424-5428). 펩티드 저해물질은 10㎕용적으로 첨가되고 세포혼합물은 37℃에서 24시간 배양되었다. 이때, 다핵 거대세포는 단일 필드에서 전체벽을 볼 수 있는 40×배에서 현미경 검사에 의해 평가될 수 있다.
6.1.4. 무세포 바이러스 감염 검사
합성 펩티드는 7일간 0, 0.04, 0.4, 4.0 과 40㎍/㎖ 펩티드 농도에서 HIV-2NIH2와 CEM CD4+ 세포의 25 TCID50Unit 또는 HIV-1LAI바이러스의 247 TCID50(도면 2의 실험)/또는 62 TCID50(도면 3의 실험)으로 37℃에서 배양하였다. 생성된 RT 활성(cpm)은 하기 6.15에서 설명한 검사를 이용하여 결정할 수 있다(See, Reed, L.J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27:493-497 for an explantion of TCID50calculations).
6.1.5 역전사 효소 검사
마이크로-역전사효소(RT) 검사는 Goff et al. (Goff, S. et al., 1981, J. Virol. 38:239-248)와 Willey et al. (Willey, R. et al., 1988, J. Virol. 62:139-147)에서 채택하였다. 바이러스/세포 배양물로부터 상층액은 1% 트리톤 X-100 으로 조정한다. 10㎕ 상층액 시료는 96-웰 U-자형 바닥 미량적정 플레이트에서 RT 칵테일 5㎕ 에 첨가하고 샘플은 90분간 37℃에서 배양시킨다. RT 칵테일에는 75mM KCl, 2mM 디티오트레톨, 5mM MgCl2, 5㎍/㎖ 폴리A(Pharmacia, cat. No. 27-4110-01), 0.25U/㎖ 올리고 dT(Pharmacia, cat. No. 2-7858-01), 0.05% NP40, 50mM트리스-HCl, pH 7.8, 0.5μM 비-방사능활성 dTTP, 10μCi/㎖32P-dTTP(Amersham, cat. No. PB. 10167)을 포함한다.
배양기간후에, 40㎕ 반응혼합물은 GB003(S+S) 필터 페이퍼의 하나 쉬트위에 S+S 미니폴드내에 유지되는 2×SSC 완충액(0.3M NaCl 와 0.003M 시트레이트 나트륨)으로 포화된 Schleicher 와 Schuell (S+S) NA45 막(또는 DE81 페이퍼)에 없고, 부분적으로 진공을 만든다. 미니폴드의 각 웰은 완전한 진공하에 200 ㎕ 2×SSC 로 4회 세척한다. 막은 미니폴드로부터 제거하고 2×SSC 초과량으로 파이렉스 접시에서 2회이상 세척한다. 마지막으로 막은 흡수 페이퍼에서 배수시키고, Whatman #3 페이퍼에 두고, 사란(Saran) 랩을 덮고 -70℃ 에서 하릇밤동안 필름에 노출시킨다.
6.2. 결과
6.2.1. 감염된 세포-유도된 합포체 형성의 펩티드 저해
항 바이러스 활성에 대한 초기 스크린은 감염안된 Molt4 세포를 만성적으로 HIV-1 감연된 CEM세포와 24시간 공-배양함으로써 유도된 합포체형성을 차단하는 펩티드 능력을 검사하였다. 이와 같은 몇가지 실험의 결과는 여기에 제시한다. 이들 실험의 첫 번째로 10㎍/㎖ 과 12.5ng/㎖ 사이 일련의 펩티드농도 DP-178(SEQ ID:1)는 세포 융합과정의 차단에 대해 테스트하였다. 이들 실험에서 HIV-1LAI, HIV-1MN, HIV-1RF, HIV-1SF2바이러스중 하나에 만성적으로 감염된 CEM 세포는 감염안된 Molt4세포와 하룻밤동안 공배양시켰다. 결과(도면4)에서는 DP-178(SEQ ID:1)가 사용된 최저 DP-178(SEQ ID:1)농도까지 HIV-1 분리체의 각각에 대해 완전하게 보호할 수있다는 것을 보여주었다. HIV-1LAI저해를 위해, 테스트된 최저농도는 12.5ng/㎖ 이고; 모든 다른 HIV-1 바이러스에서는 DP-178(SEQ ID:1)의 최저농도는 100ng/㎖ 이다. DP-178(SEQ ID:1)과 동일 아미노산 잔기를 가지나 무작위 순서로 배열된 제 2 펩티드, DP-180(SEQ ID:2)는 40㎍/㎖고 농도에서도 항-융합성 활성에 대한 증거를 나타내지 않았다(제4도). 이와 같은 관측은 DP-178(SEQ ID:1) 저해효과가 주로 서열-특이적이며, 비특이적인 펩티드/단백질 상호작용과는 무관하다는 것을 나타낸다. DP-178 저해작용의 실제 끝점(즉, 최저 효과 저해농도)는 1-10ng/㎖ 범위내에 있다.
그 다음 일련의 실험은 HIV-1유도된 합포체 형성을 저해하는 이들 능력에 대한 DP-178(SEQ ID:1) 동사체의 준비와 테스트에 관계한다. 도면 1에서 보는 것과 같이, DP-185(SEQ ID:3)의 서열은 DP-178(SEQ ID:1)와 약간 상이한데, 이때, 이의 주요 서열은 HIV-1 분리체에서 취한 것으로, N-단부부근에서 DP-178(SEQ ID:1)에 대해 몇 개 다른 아미노산을 포함하고 있다. 도면 4에서 보는 것과 같이 DP-185(SEQ ID:3)은 테스트된 최저농도인 312.5ng/㎖ 에서도 저해활성을 나타낸다.
그 다음 일련의 실험은 DP-178(SEQ ID:1) HIV-1 와 HIV-2 저해활성을 비교한 것이다. 제 5 도에서와 같이, DP-178(SEQ ID:1)은 1ng/㎖ 이하의 펩티드 농도에서 HIV-1 중개된 합포체형성을 차단한다. 그러나, DP-178(SEQ ID:1)은 10㎍/㎖과 같은 높은 농도에서 HIV-2 중개된 합포체형성을 저해하는데 실패하였다. HIV-1 중개된 세포융합의 저해물질로써 DP-178(SEQ ID:1) 놀라운 4log 선택성은 DP-178(SEQID:1)의 작용에 예상치 못한 HIV-1 선택성을 설명한다. HIV-1 중개된 세포융합의 DP-178(SEQ ID:1)의 저해 및 테스트된 농도에서 동일 세포형에 HIV-2 중개된 세포융합을 저해시킬 수 없는 펩티드의 능력은 DP-178(SEQ ID:1)의 항바이러스 활성과 연관된 고도의 선택성에 대해 추가증거를 제공한다.
6.2.2. 무-세포 바이러스에 의한 감염은 펩티드 저해
DP-178(SEQ ID:1)는 무-세포 HIV-1 바이러스에 의한 CD-4+ CEM 세포감염을 차단시키는 이들 능력에 대해 테스트하였다. 도면 2에서 볼 수 있는 결과는 DP-178(SEQ ID:1)가 HIV-1LAI분리체에 의해 CEM 세포의 감염을 차단시키는 이의 능력에 대해 검사한 실험에서 얻은 것이다. 이 실험에는 3개 콘트롤 펩티드가 포함되는데 DP-116(SEQ ID:9), DP-125(SEQ ID:8), DP-118(SEQ ID:10)이다. DP-116(SEQ ID:9)는 이들 검사를 이용한 비활성임을 나타내는 펩티드이고 DP-125(SEQ ID:8, Wild, C. et al., 1992, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 89:10, 537)와 DP-118 (SEQ ID:10)은 이 검사에서 이미 활성임이 나타난 펩티드이다. 각 농도(0, 0.04, 0.4, 4, 40 ㎍/㎖)의 펩티드를 24750TCID Unit HIV-1LAI바이러스, CEM 세포와 배양시켰다. 배양 7일후에, 무세포 상층액은 성공적인 감염의 척도로써 RT 활성의 존재에 대해 테스트하였다. 도면2에서 볼 수 있는 결과는 DP-178(SEQ ID:1)는 90ng/㎖(IC5O=9Ong/㎖)와 같은 낮은 농도에서 HIV-1 바이러스 분리체에 의해 중개된 새로운 감염과정을 저해하는 것을 설명한다. 대조적으로 두 개 양성 콘트롤 펩티드, DP-125(SEQ ID:8)와 DP-118(SEQ ID:10)은 약 5㎍/㎖의 6O배이상 IC5O농도를 가진다.
별도 실험에서 DP-178(SEQ ID:1)의 HIV-1와 HIV-2 저해작용은 CEM 세포 및 HIV-1LAI또는 HIV-2NIHZ로 테스트하였다. 이 실험에는 60 TCID50HIV-1LAI또는 25 GCID50HIV-2NIHZ가 사용되고 7일간 배양하였다. 도면 3에서 볼 수 있는 것과 같이, DP-l78(SEQ ID:1)은 약 31ng/㎖의 IC5O으로 HIV-1 감염을 저해시켰다. 대조적으로, DP-178(SEQ ID:1)은 HIV-2NLHZ에 대해 더 높은 IC5O을 나타내어 이는 DP-178(SEQ ID:1)가 DP-178(SEQ ID:1)를 HIV-2 저해제로 보다는 2 log 이상 더욱 강력한 HIV-1 저해제로 만든다. 이와 같은 발견은 상기 6.2.1.에서 상술한 융합 저해검사 결과와 일치하고 또한 상당한 수준의 선택성(예로 HIV-1 보다는 HIV-2)을 지원한다.
7. 실시예 : HIV-1 저해제, DP-178(SEQ ID:1)은 비-세포-독성이다.
이 실시예에서, 36 아미노산 합성 펩티드 저해제 DP-178(SEQ ID:1)는 테스트된 최대 펩티드 농도 (4O㎍/㎖)에서도 배양물에서 세포에 비-세포 독성임을 나타내었다.
7.1. 재료와 방법
세포증식과 독성 검사 : 각 펩티드 농도에 대해 약 3.8×105CEM 세포를 T25 플라스크에서 37℃ 3일간 배양하였다. 테스트된 펩티드는 도면1에서 설명하는 것과 같이 DP-178(SEQ ID:1)와 DP-116(SEQ ID:9)이다. 사용된 각 펩티드 농도는 0, 2.5, 10, 40㎍/㎖ 이다. 세포수는 0, 24, 48, 72 배양시간에서 취한다.
7.2. 결과
강력한 HIV-1 저해물질 DP-178(SEQ ID:1)가 임의 세포독성 효과를 나타내는지에 대해서는 배양물에서 세포의 증식과 생존능에 이들 펩티드의 영향을 검사하여 평가할 수 있다. CEM 세포는 DP-178(SEQ ID:1), DP-116(SEQ ID:9), HIV 저해제로써 이미 효과가 없었는 것으로 나타낸 펩티드의 다양한 농도하에 배양시켰다(Wild, C. et al., 1992, Proc Latl. Acad. Sci. USA 89:10, 537-10, 541). 또한, 세포는 이들 펩티드없이 배양시켰다.
세포독성 연구결과는, DP-178(SEQ ID:1)가 배양물내의 세포에 세포독성 효과를 나타내지 않음을 알 수 있다. 하기 표 X I에서 볼 수 있는 것과 같이, 테스트한 DP-178(SEQ ID:1) 최대 농도 (40㎍/㎖)하에서 3일간 배양된 세포의 증식과 생존특징 조차도 DP-116(SEQ ID:9) 또는 비-펩티드-콘트롤과 상당한 차이가 없었다. 세포증식 데이터도 도면 6에서 그래프형태로 나타내었다. 상기 단락 6에서 제시된 실시예에서 설명한 것과 같이, DP-178(SEQ ID:1)은 1-10ng/㎖ 펩티드 농도에서 HIV-1 중개 합포체형성을 완전히 저해하고, 적어도 90ng/㎖ 농도에서 무세포-바이러스 감염도 완전히 저해함을 볼 수 있었다. 따라서, 이 연구에서 HIV 저해약량의 3 log 이상의 펩티드 농도에서도 DP-178(SEQ ID:1)는 세포독성 효과를 나타내지 않는다는것을 설며하고 있다.
8, 실시예 : DP178 과 DP107의 상호작용
하기 설명하는 실시예에서 사용된 gp41의 가용성 재조합형은 DP178 펩티드가 gp41 의 상호작용성 구조가 DP107 루이신 지퍼 모티프에 의해 영향을 받는 gp41 상의 단부와 연관한다는 증거를 제공한다. 루이신 지퍼 도메인의 코일드-코일 구조를 파괴하는 단일 돌연변이는 가용성 재조합 gp41 단백질을 HIV-1 융합엔 비활성 저해제에서 활성저해제로 변형시킨다. 이와 같은 변형은 루이신 지퍼 DP107, 결정인자가 있는 분자클랩으로부터 강력한 DP-178 도메인을 유리시킨 것으로 인한 것이다. 결과는 또한, 다양한 gp41 유도체(펩티드와 재조합 단백질)의 항-HIV활성이 바이러스 gp41과 복합포체를 형성하고, 이의 융합과정을 간섭하는 능력으로 인한 것을 나타낸다.
8.1. 재료와 방법
8.1.1. 융합 단백질 및 GP41 돌연변이체의 구조
도면 7에서 나타낸 융합 단백질과 돌연변이체의 작제는 다음과 같이 이루어진다 : M41을 제공하기 위해 gp41(540-686)의 세포외도메인에 상응하는 DNA 서열을 발현벡터 pMal-p2 (New England Biolab)의 Xmn I 부위내로 클론된다. gp41 서열은 상류 프라이머 5'ATGACGCTGACGGTACAGGCC-3'(프라이머 A)와 하류 프라이머 5'-TGACTAAGCTTAATACCACAGCCAATTTGTTAT-3'(프라미어 B)와 함께 PCR 반응에 의해 pgtat(Malim et al., 1988, Nature 355:181-183)로부터 증폭될 수 있다. M41-P 는 USB 에서의 T7-Gen 돌연변이 키트를 이용하고 공급자의 지시에 따라 작제되었다. 돌연변이 프라이머(5'-GGAGCTGCTTGGGGCCCCAGAC-3')는 M41 의 578 위치에서 Ile 를 Pro 로 바꾸는 돌연변이를 도입시킨다. M41△107 은 결실 돌연변이성 프라이머 5'-CCAAATCCCCAGGAGCTGCTCGAGCTGCACTATACCAGAC-3'(프라이머 C)를 이용하여 USB T7-Gen 돌연변이 과정에 따라 만들어진다. M4I△l78 은 pMal-p2 의 Xnm I 위치에 gp41 아미노산 540-642 의 DNA 단편을 클론시킴으로써 만든다. 프라이머 A 와 5'-ATAGCTTCTAGATTAATTGTTAATTTCTCTGTCCC-3'(프라이머 D)는 삽입된 DNA 단편을 발생시키기 위해, 주형 pgtat 와 함께과 PCR에서 이용될 수 있다. M41-P 는 M41-P 178을 만들기 위해 PCR에서 프라이머 A 와 D 와 함께 주형으로 이용될 수 있다. 모든 삽입된 서열과 돌연변이된 잔기는 제한효소 분석에 의해 점검하고, DNA 서열화에 의해 확인한다.
8.1.2. 융합단백질의 정제와 특징화
융합단백질은 NEB사의 단백질 융합과 정제 시스템에 관한 제조업자 책자에 상술된 과정에 따라 정제할 수 있다. 융합단백질(10ng)은 8% SDS-폴리아크릴아미드겔에서 전기영동에 의해 분석하였다. 웨스턴 블랏분석은 Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Ch, 18,pp. 64-75 에서와 같이 실행하였다. 1000배 희석된 HIV-1 양성혈청 또는 레퍼토리 클로닝에서 유도된 사람 Fab 는 융합단백질과의 반응에 사용된다.
제 2 항체는 HRP-공액된 염소 항-사람 Fab 이다. ECL 웨스턴 블랏팅 감지 시스템(Amersham)은 결합된 항체를 감지하는데 사용되었다. 이들 감지 시스템에 대한 상세한 프로토콜 제조업자에 의해 제공되었다. 레인보우 분자량 마커(Amersham)는 융합단백질의 크기를 평가하는데 사용되었다.
8.1.3. 항-HIV 활성에 대한 세포 융합검사
세포 융합 검사는 이미 상술한 것과 같이 실행한다(Mattews et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5424-5481). CEM 세포(7×1O4)은 100㎍ 배양 배지에서 96-웰 편평한 l/2 면적 플레이트(Costar)에서 HIV-1mB만성 감염된 CEM 세포(104)와 함께 배양하였다. 10㎕ 배양 배지의 다양한 농도의 펩티드와 융합단백질은 37℃ 24 시간 세포배양물과 함께 배양시켰다. 다핵 합포체는 현미경 검사에 의해 평가하였다. M41 와 M41-P 는 모두 테스트된 농도에서 세포독성을 나타내지 않았고, 도 8에 나타내었다.
HIV-1 유도된 세포-세포 융합활성의 저해는 도면9에서 나타낸것과 같이, M41△l78 또는 M41-P△178 의 다양한 농도와 10nM DP178 존재하에 실행되었다. 10nM DP178 존재하에 눈에 띄는 합포체는 없었다. 펩티드 또는 융합 단백질은 콘트롤 시료에는 첨가 안된다.
8.1.4. GP41 의 루이신 지퍼 모티프에 DP178 결합의 ELISA 분석
사용된 DP178의 아미노산 서열은 YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF 이다. ELISA 를 위해, 0.1M NaHCOpH 8.6에서 M41△178 또는 M41-P△178(5㎍/㎖)은 96 웰 Linbro ELISA 플레이트(Flow Lab, Inc)상에 하룻밤동안 피복된다. 각 웰은 증류수로 3회 세척하고, 그 다음 2시간동안 3% BSA 로 차단한다. 차단후에 0.5 BSA/TBST(40mM 트리스-HC1, pH7.5, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20)와 함께 펩티드 즉 ELISA 플레이트에 첨가하고, 1시간동안 실온에서 배양시킨다. TBST 로 3회 세척후에, 0,5% BSA/TBST와 함께 Fab-d는 10 ng/㎖ 농도로 첨가하였다. 플레이트는 1시간동안 실온에서 배양한 후에 TBST 로 3회 세척하였다; 0.5% BSA로 TBST에서 200배 희석된 HRP 공액된 염소 항-사람 Fab 항혈청은 각 웰에 첨가되고, 45분간 실온에서 배양시켰다. 플레이트는 그다음 TBST 로 4회 세척한다. 퍼옥시다제 기질 o-페닐렌 디아민(2.5mg/㎖)와 0.15% H2O2를 첨갛여 색깔을 만든다. 반응은 10분간 실온에서 배양후에 4.5N H2SO4동용적으로 중단시킨다. 중단된 반응 혼합물의 OD 는 49Onm에서 마이크로 플레이트 리더(Molecular Design)로 측정되었다. 결과는 표 10 에 나타내었다.
8.2. 결과
8.2.1. GP41의 엑토도메인 발현과 특징화
gp41 구조와 기능에서 두 개 나선부분의 역할을 이해하기 위한 단계로써, gp41의 엑토도메인은 말토즈 결합 융합 단백질(M41)(도면7)로써 발현되었다. 용해도를 개선시키기 위해 gp41의 N-단부에서 융합성 펩티드 서열이 이 재조합 단백질과 이의 유도체에서 생략되었다. 말토즈 결합 단백질은 상대적으로 유연한 비-변성 조건하에서 융합단백질의 정제를 실시하였다. M41 가용성 재조합 gp41은 글리코실화 되지 않았고, 막통과 단백질의 몇부분이 부족하고(예로, 융합펩티드, 막 스페닝, 세포질 도메인), gp120 없이 발현되기 때문에, HIV-1 비리온상에 고유 gp41 의 구조가 정확하게 반영된다는 것은 기대할 수 없었다. 그럼에도 불구하고, 정제된 M41 은 진핵세포에서 발현된 고유 gp41상에 구조적 에피토프에 결합하는 것으로 이미 확인된 특정 불연속 에피토프를 보존하는 방식으로 접히는데, 이는 사람 단클론항체, 98-6, 126-6, ,50-69 와 반응성이 있는 것으로 증명되었다(Xu et al., 1991, J. Virol. 65:4832-4838; Chen, 1994, J. Virol. 68:2002-2010). 따라서 이들 항체에 의해 정의되는 고유 gp41의 적어도 특정부위이 재조합 융합단백질 M41에서 재생산되는 것으로 보인다. 또한, M41 은 사람 재조합 Fab(Fab-d)와 반응하는데, 이는 FACS에 의해 분석한 것과 같이, gp41 상에 구조적 에피토르를 인지하고, HIV-1 감염된 세포 뿐만아니라 HIV-1 비리온에 결합하나 감염안된 세포에는 결합하지 않는다. 나선 모티프를 제거하면 즉, MI 융합 단백질의 DP107 또는 DP178이 제거되면 Fab-d 와의 반응성을 제거된다. 이 결과는 주요서열에서 60개 아미노산에 의해 분리된 두 개 나선부분은 Fab-d 에피토프를 유지하는데 요구된다는 것을 보여준다.
8.2.2. GP41의 재조합 엑토 도메인의 항-HIV 활성
야생형 M41 융합단백질은 항-HIV-1 활성에 대해 테스트하였다. 설명한 것과 같이, 합성 펩티드는 루이신 지퍼(DP107)에 상응하고 C-단부 추정 나선(DP178)은 강력한 항-HIV 활성을 나타낸다. 이들 두 부분이 포함됨에도 불구하고, 재조합 M41 단백질은 5OμM 과 같은 고농도에서 HIV-1 유도된 막 융합에 영향을 끼치지 않았다(표 12).
1. B. Friguet et al., 1985, J. Immunol. Method. 77:305-319 에 상술된 프로토콜을 사용하여 융합단백질에 Fab-d 결합의 친화력 상수를 결정하였다.
- = 융합단백질 에 Fab-d 의 결합을 감지할 수 없음.
항 바이러스 감염성 검사. 20㎕ 연속 희석시킨 바이러스 원액은 96-웰 미량적정판에 10% 태아 소혈청과 항생제를 포함한 RPMI 1640에서 정제된 재조합 융합단백질의 지시농도 20㎕와 실온에서 60분간 배양시켰다. 6×105세포/㎖에서 20㎕ CEM4세포를 각 웰에 넣고, 배양물은 습윤 CO2배양기에서 37℃ 배양시킨다. 세포는 매 2-30일마다 새로운 배지를 첨가하면서 9일간 배양시킨다. 5,7,9 일에 상층액 시료는 하기에서 설명하는 것과 같이, 바이러스 복제를 모니터하기 위해 역전사효소(RT)활성에 대해 검사한다. TCID50은 Reed & Muench, 1937, Am. J. Hyg. 27:493-497 식에 따라 각 조건에서 계산한다. RT 활성은 Goff et al., 1981, J. Virol. 38:293-248 and Willey et al., 1988, J. Virol. 62:139-147 as described in Chen et al., 1993, AIDS Res, Human Retroviruses 9:1079-1086의 공고된방법의 변형에 의해 결정할 수 있다.
놀라운 것은, 루이신 지퍼 모티프의 중간에 이소루이신 대신에 프로 틴으로 단일 아미노산 치환을 하면, 항바이러스 활성을 나타내는 융합단백질(M41-P)을 생산한다. 표12에서 볼 수 있는 것과 같이, M41-P는 약 85nM에서 합포체형성을 90% 저해시키고, 7OnM 농도에서 HIV-1mB감염을 90% 중화시켰다. M41-P로부터 이 부분을 제거하면 비활성 융합 단백질인 M41-P△178(표 12)를 생산하기 때문에, M41-P 의 항-HIV-1 활성은 C-단부 나선서열에 의해 중개되는 것으로 보인다. 이와 같은 해설은 DP178 서열이 부족한 절두형 융합단백질 M41△178은 농도의존성 방식으로 DP178 펩티드의 항-융합 활성을 제거한다는 것을 설명하는 실험에 의해 힘을 받았다(도면 9), 루이신 지퍼를 파괴하는 프로틴 돌연변이를 가지는 동일한 절두형 융합단백질인, M41-P△l78은 유사 경쟁 실험에서 활성이 없었다(도면 9). 결과는 DP178 펩티드는 gp41 의 상호활성 구조가 야생형 루이신 지퍼 서열에 따라 달라지는 gp41의제 2 부위와 연관있다는 것을 말한다. 유사한 상호작용은 야생형 융합단백질인 M41 내에 발생하고 이는 DP178 부분을 격리하는 세포내 클랩을 형성하도록 작용하여, DP178 부분이 항-바이러스 활성에 이용될 수 있도록 만든다.
이들 두 도메인 사이에 특이적 상호작용은 다른 사람 단클론 Fab-d 연구에서 지적되었다. 가령, Fab-d 는 DP178 펩티드 또는 융합단백질 M41△178에 결합하지 못하나 이의 에피토프는 이들 두 물질을 함께 혼합하여 재 구성될 수 있다(도면10). 다시 융합단백질 M41-P△178 의 루이신 지퍼 도메인의 프롤린 돌연변이는 유사 혼합실험에서 에피토프를 재구성하는데 실패 하였다.
9. 실시예 : DP-107-유사와 DP-178 유사 서열의 컴퓨터를 이용한 확인방법
많은 공지의 코일드-코일 서열이 문헌에서 상세히 설명되어 있고, 각 아미노산에는 헵타드 반복체를 포함하고 있다. 코일드 코일의 명명은 헵타드 반복체의 7개 아미노산 각각에 A~G로 라벨을 하고, 아미노산 A와 D는 소수성 위치가 될 수 있다. 아미노산 E 와 G 는 하전을 띈다. 이들 4 개 위치(A,D,E,G)는 단량체 α-나선의 양쪽성 기본 구조를 형성한다. 두 개 이상의 양쪽성 나선 기본 구조는 디-, 트리-, 테트라-, 코일드-코일 구조 등을 형성하기 위해 서로 상호작용하게 된다. 컴퓨터 조사 모티프의 고안을 시작하기 위해, 일련의 잘 특징화된 코일드 코일을 선택하는데, 여기에는 이스트 전사인자 GCN4, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 루프 36 과 사람 프로토-온코겐 c-Myc, c-Fos, c-Jun을 포함한다. 각 펩티드 서열에서 A 와 D 위치의 엄격한 유사성과, B, C, E, F 와 G 위치(이들 위치에서는 관측되지 않기 때문에)을 제외한 아미노산 리스트를 결정한다. 코일드 코일 구조를 가지는 것으로 알려진 HIV-1 Bru DP-107 와 구조적으로 아직 정의되지 않은 HIV-1 Bru DP-178의 아미노산의 헵타드 위치에 대한 가능성을 유추함으로써 모티프를 DP-107 및 DP 178 서열에 맞게 만들었다. 각 서열은 분석은 제 12 도에 포함하고 있다. 예로써 GCN4의 모티프는 다음과 같이 디자인한다:
1. GCN4 의 A 또는 D위치에서만 발견되는 아미노산(표준 한 문자 아미노산 코드를 사용)은 [LMNV]이다.
2. {CFGIPTW}을 제외한 B,C,E,F와 G 위치에서 모든 아미노산이 발견 되었다;
3. 따라서, PESEARCH 모티프는 다음과 같이 쓸 수 있다;
이 모티프를 "A 위치에서는 L, M, N, V가 중 하나이어야 하고; B 와 C (그다음 2개 위치)에서는 C,F,G,I,M,P,T,W를 제외한 모든 것이 수용되고; D 위치에서는 L,M,N,V 중 하나이어야 하고, E,F,G(그다음 3개 위치)에서는 C,F,G,I,M,P,T,W를 제외한 모든 것이 수용된다"라고 해석해야 한다. 이말은 28-mer 모티프에서는 4번 반복되고, 35-mer 모티프에서는 5번 반복된다. 기본 모티프는 [LMNV]-{CGGIMPTW}이다. 나머지 잘 설명된 코일드-코일 서열에 대한 모티프 키는 표12에 요약하였다.
DP-107과 DP-178에 대한 모티프 디자인은 헵타드 반복위치가 정의되지 않았고, 펩티드가 28 잔기보다 더 길기때문에 전술한 28-mer 모델서열과는 약간 다르다. 도면 13 에서는 DP-107과 DP-178에 대한 몇 가지 가능한 서열 배열을 설명하고 28-mer, 35-mer, 전체길이에 기초한 모티프 디자인을 포함한다. 펩티드 길이가 길어졌기 때문에 모티프에만 약간의 차이가 발생한다. 일반적으로, 염기 펩티드의 길이를 늘이면 덜 엄격한 모티프가 된다. 이는 이 문헌에서 "hit"라 불리는 DP-107 또는 DP-178 유사 주요 아미노산 서열을 확인하기 위한 가능성을 확장시키는데 매우 유용하다.
조사할 각 타입 펩티드 서열의 매우 특이적 모티프를 만드는데 추가하여 "하이브리드" 모티프를 만드는 것 또한 가능하다. 이들 모티프는 새로운 조사 알고리즘을 만들기 위해, 두 개 이상의 매우 엄격한 모티프를 "교차"하여 만들 수 있는데, 새로운 조사 알고리즘ㅇㄴ"부모"모티프 서열 뿐만 아니라 부모서열에 유사성을 가지는 임의 다른 펩티드 서열도 발견할 것이다. 가령, 표 3에서 GCN4 의 "부모"서열은 DP-107의 가능한 "부모" 서열 각각과 교차하였다. 하이브리드 모티프는 두 개 부모의 A 와 D 위치에서 발견되는 모든 아미노산을 포함하나 다른 위치에서 모체에 발견되지 않는 모든 아미노산들은 배제된다. GCN4 또는 [LMNV] {CFGIMPTW}의 교차 또는 DP-107(D 위치에 처음 L과 함께 28-mer) 또는 [ILQT] {CDFIMPST}의 교차하여 생성된 하이브리드는 [ILMNQTV]{CFIMPT}이다. 단지 두 개 기본 하이브리드 모티프는 두가지 구조의 가능성 및 부모 DP-107 분자의 모든 펩티드 길이를 포함하도록 존재한다. 도면15는 DP-178과 GNC4의 하이브리드를 나타낸다. 도면 16은 DP-107와DP-178의 하이브리드를 나타낸다. 대표적인 모티프 즉 부모 모티프와 하이브리드 모티프는 모티프 키이고, 실제 컴퓨터 조사에 필요한 전체 길이 모티프를 묘사하는 것은 아니라는 것을 명심하는 것이 중요하다.
하이브리드화는 두 개 이상 모티프가 임의 복합됨으로써 이루어진다. 표 5 는 GCN4, DP-107(both frames)와 DP-178(both frames)을 포함한 몇가지 세 개-모티프 하이브리드화를 요약하였다. 생성 모티프는 서로 매우 유사하게 된다는 것을 주목하였다. 사실 제 1 및 제 3 하이브리드 모티프는 각각 제 2 및 제 4 하이브리드 모티프의 부분집합이다. 이는 제 1 및 제 3 하이브리드 모티프와 제 2 및 제 4 하이브리드 모티프보다 좀더 엄격하다는 것을 의미한다. 이들 4개 모티프중 사소한 작은 변화만으로 또는 이들을 하이브리드화 시킴으로써 모든 서열을 찾을 수 있는 하나의 모티프를 얻을 수 있다. 그러나, 엄격성이 감소되었다는 것을 명심해야 한다. 마지막으로, 도면18에는 가장 광범위한 그리고 최저의-엄격성 하이브리드 모티프에 대해 상술하고 있는데, GCN4, DP-107(both frames), DP-178(both frames), c-Fos, c-Jun, c-Myc, Flu loop 36의 하이브리드에 대해 요약하고 있다.
특별 모티프는 DP-178이 gp41 의 막통과 부분의 상류 약 10개 아미노산과 DP-107 와 DP-178을 분리하는 프롤린의 C-단부에 위치한다는 사실에 기초하여 고안되었다. DP-178 은 막이 연합할 때 양쪽성 나선이 되어, 아마도 프롤린은 나선형성의 개시에 도움이 될 것으로 추정하고 있다. 동일한 배열이 호흡기 합포체 바이러스에서 볼 수 있으나; 그러나, 이 바이러스에서 DP-178-유사부분은 또한 프롤린의 C-단부에 바로 루이신 지퍼를 가진다. 따라서, 고안된 N-단부 프롤린-루이신 지퍼모티프는 다른 바이러스들도 이와 같은 동일한 모양을 가지는지를 분석하기 위해 고안된다. 모티프는 도면 19에 요약하였다.
PC/Gene 단백질 데이터 베이스에는 5879 바이러스성 아미노산 서열(library file PVIRUSES; CD-ROM release 11.0)을 포함한다. 이중 1092 는 바이러스 외피 또는 당단백질 서열(library file PVIRUSE1)이다. 표 5-10은 단백질 서열을 포함하고 조사된 모든 모티프에 대해 모티프 hit 위치를 나타낸다.
10. 실시예 : HIV에서 DP-107와 DP-178 유사서열의 컴퓨터를 이용한 확인
도면 20 에서는 HIV-1 BRU 분리체 gp41 (PC/Gene 단백질 서열 PENV_HVIBR)의 조사결과를 나타낸다. DP-107와 DP-178의 교차하여 하이브리드 모티프(즉 107×178×4)가 되고; 도면 l6에서 발견되는 동일 모티프는 아미노산 550-599, 636-688, 796-823를 포함하는 세 개 히트를 포함한다. 이들 부위에는 DP-107 와 8개 N-단부 아미노산과 4 개 C-단부 아미노산; DP-178와 7개 N-단부 아미노산과 10개 C-단부 아미노산; 그리고 막통과 내부부분(세포질)을 포함한다. 도면 20 에서는 모티프 이름이 ALLMOTI5 인 조사에서 수득한 결과를 포함하는데, 이 모티프의 키는 도면17에서 볼 수 있는 ({CDGHP}{CFP}×5)이다. 이 모티프 또한 DP-107(아미노산 510-599), DP-178(아미노산 615-717)와 세포질부분(아미노산 772-841)을 포함한 세 개 히트를 포함한다. 이들 히트는 아미노단부와 C-단부 모두에 상당한 추가서열과 함께, 모티프 107×178×4 에 발견되는 히트와 겹친다. 이는 107×178×4 이 ALLMOTI5 하이브리드 모티프의 부분집합이라는 것이 놀라운 것은 아니다. 중요한 것은 ALLMOTI5 의 엄격성이 107×178×4 보다 상당힐 적다하더라도 HIV-1 의 저해성 펩티드의 서열을포함하는 것으로 나타난 gp41 의 DP-107 와 DP-178 부분을 선택적으로 확인할 수 있다. 이들 두 개 모티프 조사결과는 PC/Gene 단백질 서열이름 PENV HVIBR으로 표5에 요약하였다. 프롤린-루이신 지퍼 모티프는 절단부위의 상류(P7LZIPC 및 P12LZIPC)인 gp120의 바로 C-말단에 있는 503-525와; gp41의 세포질도메인 (P23LZIPC)에 있는 735-768을 포함하는 몇 가지 히트를 HIV-1 BRU 에 제공하였다. 이 결과는 전술한 것과 동일한 서열이름하에 표 8,9,10에서 볼 수 있다. Lupas 알고리즘에 의해 예측된 코일드-코일 부분을 포함하는 HIV-1 BRU 의 유일한 부분은 아미노산 635-670 이라는 것이다. 이는 N 단부에서 8개 아미노산으로 시작하고 DP-178 의 단부에서 8개 아미노산 N 단부로 끝난다. DP-107은 공지의 코일드 코일이라는 사실에도 불구하고, DP-107 가 Lupas 방법을 이용하였을 경우에 코일드-코일 부분을 포함하는 것으로 예측되지는 않았다.
11. 실시예 : 사람 호흡기 합포체 바이러스에서 DP-107-유사 서열과 DP-178 유사 서열을 컴퓨터를 이용한 확인
도면 21 은 사람 호흡기 합포체 바이러스(RSV;균주 A2)융합 당단백질 Fl(PVGLF_HRSVA 이름의 PC/Gene 단백질 서열)에 대한 조사결과를 나타낸다. 모티프 107×178×4로 아미노산 152-202, 213-243, 488-515을 포함한 세 개 히트를 발견할 수 있다. 이들 히트의 배열은 HIV-1에서 발견되는 것과 유사한데 단, 모티프는 DP-178 과 유사성이 있는 두부분을 발견하는데, 이중 하나는 DP-107 이라 불리는 또는 아미노산 213-243의 하류와 다른 하나는 막 통과부분(DP-178과 유사) 또는 아미노산 488-515의 상류이다. 모티프 ALLMOTI5 는 아미노산 116-202, 267-302, 506-549을 포함한 세 개 부분을 발견할 수 있다. 프롤린-루이신 지퍼 모티프는 아미노산 205-221; 265-287(P1LZIPC 265-280, P12LZIPC); 484-513(P7LZIPC 와 P12LZIPC 484-506, P23LZIPC)을 포함한 몇 개 히트를 제공한다. PLZIP 모티프는 HIV-1 의 DP-178과 위치 유사성을 공유하는 부분을 확인할 수 있다.
12. 실시예 : 원숭이 면역결핍 바이러스에서 DP-107-유사 서열과 DP-178 유사 서열을 컴퓨터를 이용한 확인
도면 22 에서는 원숭이 면역결핍 바이러스 gp41(AGM3 분리체 ; PENV_SIVAG 이름의 PC/Gene 단백질 서열)의 모티프 히트를 나타낸다. 모티프 107×178×4 에는 아미노산 566-593, 597-624, 703-730을 포함한 세 개 히트를 발견한다. 처음 두 개 히트는 이들 사이에 세 개 아미노산만을 가지고, 이는 DP-107-유사 히트인 566-624 에서의 하나의 히트와 복합한 것으로 보인다. 아미노산 703-730 은 DP-178-유사 히트를 나타낸다. ALLMOTI5는 아미노산 556-628 (DP-107-like), 651-699 (DP-178-like)와 막통과 부분이 되는 808-852를 포함한 세 개 히트를 찾을 수 있다. SIV 는 또한 Lupas 알고리즘으로 예측하였을때 코일드-코일을 형성하는 높은 성향과 함께 655-692에서온 한 부분을 찾는다. 107×178×4 와 ALLMOTI5 모티프도 동일부분을 가진다. SIV 는 gp41 에서 어떠한 PLZIP모티프 히트를 가지지는 않는다.
13. 실시예 : 개 디스펨퍼 바이러스에서 DP-107-유사-서열과 DP-178 유사 서열을 컴퓨터를 이용한 확인
개 디스펨퍼 바이러스(균주 Onderstepoort) 융합 당단백질 Fl(PVGLF_CDV0 이름의 PC/Gene 단백질 서열)은 DP-107-유사하므로 DP-178-유사 히트로 예측되는 사람 RSV 와 유사한 부분을 가진다(도면 23). 모티프 107×178×4 는 아미노산 252-293에서 융합 펩티드의 C-단부에 한부분을 강조한다. 아미노산 252-286 또한 Lupas 알고리즘을 이용하면코이드-코일이 될 것으로 예상할 수 있다. 제 1 부분의 C 말단 100개 아미노산은 아미노산 잔기 340-367에서 DP-178-유사 부위이다. ALLMOTI5 은 관심이 가는 세 부분을 강조하는데 : Lupas 예측 및 DP-107-유사 107×178×4 히트와 모두 완전하게 겹치는 아미노산 228-297; 제 2 107×178×4 히트와 겹치는 아미노산 340-381; 막통과 부분의 바로 N-단부에 위치하는 DP 178-유사 서열이 되는 아미노산 568-602 이다. 또한 Lupas 방법으로 예측하면 코일드 코일을 형성하기 위한 높은 성향을 가지는 또다른 부분 (아미노산 잔기 570-602)와도 겹친다. 몇 개 PLZIP 모티프는 성공적으로 다음의 소요 부분을 확인하였는데; P6 과 P12LZIPC는 각각 아미노산 336-357 와 아미노산 336-361을 강조하고 ; P1과 P12LZIPC는 아미노산 398-414을 발견하고 P12 와 P23LZIPC는 아미노산 562-589 와 아미노산 562-592을 각각 발견하였다.
14. 실시예 : 닭 질병 바이러스에서 DP-107 유사 서열과 DP-178 유사 서열을 컴퓨터를 이용하여 확인
도면 24 는 닭 질병 바이러스(균주 오스트리아-빅토리아/32; PVGLF_NDVA 이름의 PC/Gene 단백질 서열)에서 발견된 모티프 히트를 나타낸다. 모티프 107×178×4는 아미노산 151-178에서 DF-107-유사 히트와 426-512 에서 DP-178-유사 히트를 포함한 두 부분을 발견하였다. ALLMOTI5은 117-182, 231-272, 426-512 부분을 포함한 세 지역을 발견하였다. 426-512 에서의 히트는 (460-503) Lupas 방법에 의해 예측된 코일드-코일 성향이 높은 부분을 포함한다. PLZIP 모티프는 아미노산 273-289 (P1 와 12LZIPC)에서 소요의 한 부분만을 확인하였다.
15. 실시예 : 사람 파라인플루엔자 바이러스에서 DP-107-유사 서열과 DP-178 유사 서열을 컴퓨터를 이용한 확인
모티프 107×178×4 와 ALLMOTI5 은 사람 파라인플루엔자 바이러스(균주 NIH 47885; PVGLF_p13H4 이름의 PC/Gene 서열)의 동일부분 115-182 와 117-182 에 DP-107 유사 히트를 나타내었다(도면 25). 또한 두 개 모티프는 아미노산 207-241에서 C 단부에 DP-178-유사 히트를 가진다. 두 모티프는 또한 아미노산 457-497와 462-512를 포함하는 막통과 부분 부근에 DP-178-유사히트를 가진다. 283-303 (P5LZIPC), 283-310(P12LZIPC), 453-474(P6LZIPC) 와 453-481(P23LZIPC)를 포함한 몇 개 PLZIP 모티프 히트가 관찰되었다. Lupas 알고리즘은 아미노산 122-176 이 코일드-코일을 형성하는 성향이 있음을 예측하였다.
16. 실시예 : 인플루엔자 A 바이러스의 DP-107-유사 서열과 DP-178 유사 서열을 컴퓨터를 이용하여 확인
도면 26 에서는 아미노산 잔기 380-456에서 ALLMOTI5용 모티프 히트 아미노산 387-453에서 107×178×4용 모티프 히트 뿐만 아니라 잔기 379-436에서 인플루엔자 A 바이러스(균주 A/Aichi/2/68)의 코일드 코일 성향에 대한 Lupas 예측과 설명한다. 잔기 383-471 (HA2 의 38-125)는 산성 pH 조건 (Carr and Kim, 1993, Cell 73:823-832)하에서 연장된 코일드 코일이 됨을 Carr 와 Kim 에 의해 밝혀진바 있다. Lupas 알고리즘은 379-436 잔기에서 코일드-코일을 예측하였다. 모든 세 가지방법은 코일드 코일구조를 실제 가지는 부분을 성공적으로 예측하였으나; 그러나 ALLMOTI5 은 88 잔기의 최대부분을 예측하였다.
17. 실시예 : RSV 항바이러스성 화합물
이 실시예에서, 실시예 9에서 상술한 컴퓨터 지원을 받은 코일드-코일 펩티드 서열조사를 이용하여 확인된 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 펩티드 서열이 공지의 코일드-코일 펩티드에 실제 구조적으로 유사한 펩티드 도메인을 인코드하고 있음을 보여주고, 항바이러스 활성을 가진다는 것이 추가로 발견되었다.
17.1. 재료와 방법
구조분석은 서클라 디크로니즘(CD) 연구로 구성되는데 이는 출원인의 미국출원 O8/O73,028에서 설명된 방법에 따라 실시할 수 있다.
항-RSV 항바이러스성 활성은 Pringle, C.R. et al., 1985, J. Medical Vir 17:377-386에서 상술한 것과 같이 검사한다.
48개 아미노산 RSV F2 펩티드와 53개 아미노산 RSV T67 펩티드는 실시예 9에서 상술한 컴퓨터를 이용한 펩티드 서열 연구 전략을 통하여 확인된 서열들을 연결하는데 이용된다. 도면 21 에서는 이들 서열의 정확한 위치와 이용된 모티프에 대해 상술하고 있다.
17.2. 결과
35-mer 올리고펩티드는 48 아미노산 RSV F2 펩티드 서열의 일부 (도면27)와 53 아미노산 RSV T67 펩티드 서열의 일부(도면 28)를 구성하도록 합성되었다. 올리고 펩티드는 공지의 코일드-코일 구조에 구조적 유사성과 항-RSV 활성에 대해 CD분석을 통하여 검사하였다. 도면 27과 28에서 볼 수 있는 것과 같이, 상당수 이들 올리고 펩티드는 실제 코일드-코일 구조적 유사성과 항바이러스 활성을 나타낸다.
따라서, 실시예9에서 상술하는 컴퓨터 지원을 받은 서치는 상당히 유망한 항-RSV 항바이러스 화합물을 나타내는 바이러스 펩티드 도메인을 성공적으로 확인하였다.
18. 실시예: HPF3 항바이러스 화합물
여기에서는, 상기 실시예9에서 상술한 컴퓨터로 코일드-코일 펩티드 서열조사를 이용하여 확인된 사람 파라인플루엔자 바이러스 3(HPF3) 펩티드 서열은 공지의 코일드 코일 펩티드와 실제 구조적 유사성을 나타내는 펩티드 도메인을 인코드하고 또한 이는 항바이러스 활성을 가지는 것으로 보인다.
18.1. 재료와 방법
구조분석은 서큘라 디크로니즘 (CD) 연구로 구성되는데 이는 출원인의 미국출원 O8/O73,028 에 설명된 방법에 따라 실시할 수 있다.
항-HPF3 항바이러스성 활성은 Pringle, C.R. et al., 1985, J. Medical Vir, 17:377-386에서 상술한 것과 같이 검사한다.
56개 아미노산 및 70개 아미노산 HPF3 T67 펩티드는 실시예 9에서 상술한 컴퓨터 조사 펩티드 서열을 통하여 확인된 서열을 연결하는데 이용된다. 도면 25 에서는 이들 서열의 정확한 위치와 이용된 모티프에 대해 상술하고 있다.
18.2. 결과
35-mer 올리고펩티드는 56개 아미노산 HPF3 F2 펩티드 서열의 일부(도면 29)와 70개 아미노산 RSV T67 펩티드 서열의 일부(도면 30)를 구성하도록 합성되었다. 올리고 펩티드는 공지의 코일드-코일 구조에 구조적 유사성과 항-RSV 활성에 대해 CD 분석을 통하여 검사할 수 있다. 도면 29 와 30에서 볼 수 있는 것과 같이, 상당수 이들 올리고펩티드는 실제 코일드-코일 구조적 유사성과 항바이러스 활성을 나타낸다.
따라서, 실시예 9에서 상술하는 컴퓨터 지원을 받은 서치는 상당히 유망한 항-RSV 항바이러스 화합물을 나타내는 바이러스 펩티드 도메인을 성공적으로 확인하였다.
본 발명은 본 발명의 개별특징을 설명하는 특이적 구체예에 한정시키지 아니하고 본 발명의 영역에는 이의 기능적 등가의 방법과 성분이 포함된다. 또한 여기에 상술한 것에 추가하여 본 발명의 다양한 수정은 본 명세서와 도면의 기술분야에 숙지된 자에게는 명백할 것이다. 이와 같은 수정 또한 본 발명의 영역내에 속한다.

Claims (40)

  1. 다음의 아미노산 서열로 구성된 펩티드군에서 선택된 펩티드.
    이때, 상기 펩티드군은 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 및 카르복시 말단이 절두된 아미노산 서열로 이루어진 집합이며;
    아미노산 잔기는 1 문자 코드로 나타내었고;
    X는 아미노기, 아세틸기, 9-플로렌메톡시-카르보닐기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성되고; 그리고
    Z는 카르복실기, 아미도기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성된다.
  2. 다음의 아미노산 서열로 구성된 펩티드군에서 선택된 펩티드.
    이때, 상기 펩티드군은 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 및 카르복시 말단이 절두된 아미노산 서열로 이루어진 집합이며;
    아미노산 잔기는 1 문자 코드로 나타내었고;
    X는 아미노기, 아세틸기, 9-플로렌메톡시-카르보닐기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성되고; 그리고
    Z는 카르복실기, 아미도기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성된다.
  3. 다음의 아미노산 서열로 구성된 펩티드군에서 선택된 펩티드.
    이때, 상기 펩티드군은 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 및 카르복시 말단이 절두된 아미노산 서열로 이루어진 집합이며;
    아미노산 잔기는 1 문자 코드로 나타내었고;
    X는 아미노기, 아세틸기, 9-플로렌메톡시-카르보닐기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성되고; 그리고
    Z는 카르복실기, 아미도기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성된다.
  4. 다음의 아미노산 서열로 구성된 펩티드군에서 선택된 펩티드.
    이때, 상기 펩티드군은 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 및 카르복시 말단이 절두된 아미노산 서열로 이루어진 집합이며;
    아미노산 잔기는 1 문자 코드로 나타내었고;
    X는 아미노기, 아세틸기, 9-플로렌메톡시-카르보닐기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성되고; 그리고
    Z는 카르복실기, 아미도기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성된다.
  5. 다음의 아미노산 서열로 구성된 펩티드군에서 선택된 펩티드.
    이때, 상기 펩티드군은 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 및 카르복시 말단이 절두된 아미노산 서열로 이루어진 집합이며;
    아미노산 잔기는 1 문자 코드로 나타내었고;
    X는 아미노기, 아세틸기, 9-플로렌메톡시-카르보닐기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성되고; 그리고
    Z는 카르복실기, 아미도기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성된다.
  6. 다음의 아미노산 서열로 구성된 펩티드군에서 선택된 펩티드.
    이때, 상기 펩티드군은 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 및 카르복시 말단이 절두된 아미노산 서열로 이루어진 집합이며;
    아미노산 잔기는 1 문자 코드로 나타내었고;
    X는 아미노기, 아세틸기, 9-플로렌메톡시-카르보닐기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성되고; 그리고
    Z는 카르복실기, 아미도기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성된다.
  7. 다음의 아미노산 서열로 구성된 펩티드군에서 선택된 펩티드.
    이때, 상기 펩티드군은 기준 아미노산 서열의 아미노 말단 및 카르복시 말단이 절두된 아미노산 서열로 이루어진 집합이며;
    아미노산 잔기는 1 문자 코드로 나타내었고,
    X는 아미노기, 아세틸기, 9-플로렌메톡시-카르보닐기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성되고; 그리고
    Z는 카르복실기, 아미도기, 소수성기 또는 거대 캐리어기로 구성된다.
  8. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, X는 소수성기인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  9. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, 소수성기 X는 카르보벤조옥실, 단실 또는 t-부틸옥시카르보닐인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  10. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, Z는 소수성기인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  11. 제 10 항에 있어서, 소수성기 Z는 t-부틸옥시카르보닐인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  12. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, X는 거대분자 캐리어인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  13. 제 12 항에 있어서, 거대분자 캐리어기는 지질-지방산 공액체, 폴리에틸렌글리콜, 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  14. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, Z는 거대분자 캐리어기인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  15. 제 14항에 있어서, 거대분자 캐리어기 Z는 지질-지방산 공액체, 폴리에틸렌글리콜, 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  16. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, 적어도 하나의 결합 연결하는 인전 아미노산 잔기는 비-펩티드 결합인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  17. 제 16항에 있어서, 비-펩티드 결합은 이미노결합, 에스테르 결합, 하이드라진결합, 세미카르바지드결합 또는 아조결합인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  18. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 잔기는 D-이성체 모양에 있는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  19. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산이 삽입된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  20. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, 아미노산 삽입 위치는 아미노산 잔기 1 내지 15사이가 되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
  21. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, 아미노산 잔기가 결손되어 최소한 한 개의 아미노산 잔기가 없으며, 이때 펩티드는 최소 3개 아미노산 잔기로 구성된것을 특징으로 하는 펩티드.
  22. 제 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 잔기가 치환된 것으로 구성되고, 이때 제1아미노산 잔기는 제2의 아미노산 잔기로 치환된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  23. 제 22 항에 있어서, 아미노산 치환은 보존형 치환인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  24. 제 22 항에 있어서, 아미노산 치환은 비-보존형 치환인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  25. 세포에 HIV 레트로 바이러스의 전달을 저해시키는 방법에 있어서, 이 방법은 레트로바이러스에 의한 세포감염을 저해시키기에 충분한 시간동안 제1, 2, 3항의 펩티드 효과량을 세포에 접촉시키는 것으로 구성되고, 이때 세포는 사람의 세포가 아닌 방법.
  26. 숙주에서 HIV 레트로 바이러스를 중화시키는 방법에 있어서, 이 방법은 제1항, 2항 또는 3항에 따른 펩티드 효과량을 투여하여, 숙주에서 HIV 페트로 바이러스를 중화시킬 수 있는 충분한 면역반응이 일어나고, 숙주내 감염안된 세포로의HIV 바이러스 감염이 저해되는 것으로 구성되고, 이때 세포는 사람의 세포가 아닌 방법.
  27. 숙주에서 HIV 레트로 바이러스를 중화시키는 방법에 있어서, 이 방법은 제1항, 2항 또는 3항의 펩티드를 바이러스 분리체와 접촉시키고; 그리고
    레트로 바이러스의 효소활성에 대해 바이러스 분리체를 검사하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  28. HIV를 감지하는 방법에 있어서:
    HIV 바이러스 감염을 저해시키기 위해 충분한 시간동안 제1항, 2항 또는 3항의 펩티드를 바이러스 분리체와 접촉시키고; 그리고
    레트로 바이러스 효소활성에 대해 바이러스 분리체를 검사하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 세포로 호흡기 합포체 바이러스의 전달을 저해시키는 방법에 있어서, 바이러스에 의해 세포감염이 일어나지 않도록 충분한 시간동안 제4 또는 5항에 따른 효과농도의 펩티드를 세포에 접촉시키는 것으로 구성되고, 이때 세포는 사람의 세포가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 숙주에서 호흡기 합포체 바이러스를 중화시키는 방법에 있어서, 제 4 또는 5항에 따른 펩티드의 효과량을 투여하여 숙주에서 바이러스를 중화시킬 수 있는 충분한 면역반응이 일어나고, 숙주내 감염안된 세포의 바이러스 감염이 저해되는 것으로 구성되며, 이때 세포는 사람의 세포가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 숙주에서 호흡기 합포체 바이러스를 중화시키는 방법에 있어서, 제 4 또는 5항의 펩티드에 대해 발생된 항체의 효과량을 숙주에 투여하여 숙주에서 감염안된 세포로의 호흡기 합체 바이러스 감염이 저해되는 것으로 구성되고, 이때 세포는 사람의 세포가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 파라인플루엔자 바이러스의 감지방법에 있어서:
    바이러스에 의한 세포 감염을 저해시키기 위해 충분한 시간동안 제 6 또는 7항의 펩티드를 바이러스 분리체와 접촉시키고; 그리고
    파라인플루엔자 바이러스 효소 활성에 대한 바이러스 분리체를 검사하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 세포로 파라인플루엔자 바이러스 전염을 저해시키는 방법에 있어서, 바이러스에 의한 세포감염이 일어나지 않도록 충분한 시간동안 제15 또는 16항에 따른 효과농도의 펩티드를 세포에 접촉하는 것으로 구성되고, 이때 세포는 사람의 세포가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스를 중화시키는 방법에 있어서, 제 6 또는 제 7항에 따른 펩티드의 효과량을 투여하여, 숙주에서 바이러스를 중화시킬 수 있는 충분한 면역반응이 일어나고, 숙주내 감염안된 세포로의 파라인플루엔자 바이러스 감염이 저해되는 것으로 구성되고, 이때 세포는 사람의 세포가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스를 중화시키는 방법에 있어서, 제 6 또는 7항의 펩티드에 대해 생생된 항체의 효과량을 숙주에 투여하여, 숙주에서 감염안된 세포의 파라인플루엔자 바이러스 감염이 저해되는 것으로 구성되고, 이때 세포는 사람의 세포가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 파라인플루엔자 바이러스의 감지방법에 있어서:
    파라인플루엔자 바이러스 감염을 저해시키기 위해 충분한 시간동안 제 6 또는 제 7항의 펩티드를 바이러스 분리체에 접촉시키고; 그리고
    파라인플루엔자 바이러스 효소활성에 대한 바이러스 분리체를 검사하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 25항 내지 제 28항의 방법에 있어서, HIV 레트로바이러스는 HIV-1 레트로바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, HIV-1 레트로바이러스는 HIV-1SF-2인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 37항에 있어서, HIV-1 레트로바이러스는 HIV-1RF인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 37항에 있어서, HIV-1 레트로바이러스는 HIV-1MN인 것을 특징으로 하는 방법.
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