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KR100344282B1 - 이소플라본 아글루콘 생산성을 갖는 로도투룰라 글루티니스를 이용한 이소플라본 아글루콘의 제조방법 - Google Patents

이소플라본 아글루콘 생산성을 갖는 로도투룰라 글루티니스를 이용한 이소플라본 아글루콘의 제조방법 Download PDF

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KR100344282B1
KR100344282B1 KR1019990047744A KR19990047744A KR100344282B1 KR 100344282 B1 KR100344282 B1 KR 100344282B1 KR 1019990047744 A KR1019990047744 A KR 1019990047744A KR 19990047744 A KR19990047744 A KR 19990047744A KR 100344282 B1 KR100344282 B1 KR 100344282B1
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Abstract

본 발명은 로도투룰라 글루티니스를 이용하여 이소플라본 아글루콘을 제조하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 특히, 메주로부터 분리한 이소플라본 아글루콘 전환능이 뛰어난 로도투룰라 글루티니스(KCCM-10172호)를 이용하여 대두 또는 대두배아로부터 추출한 추출액을 배지로 하여 4.0∼8.0 pH, 25∼35℃의 배양온도에서 30∼54시간동안 배양하며, 용존산소를 조절하여 순도 90%이상의 아글루콘이 함유된 이소플라본을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

이소플라본 아글루콘 생산성을 갖는 로도투룰라 글루티니스를 이용한 이소플라본 아글루콘의 제조방법{Method of making isoflavone aglucone using rhodotorula glutinis having ability to produce isoflavone aglucone}
본 발명은 이소플라본 아글루콘 생산성을 갖는 로도투룰라 글루티니스 (Rhodotorula glutinis)를 이용하여 이소플라본 아글루콘을 제조하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는, 특히, 메주로부터 분리한 이소플라본 아글루콘(isoflavone aglucone) 생산성을 지닌 로도투룰라 글루티니스 (기탁번호 KCCM-10172호로 기탁)를 이용하여 대두 또는 대두배아 추출액을 배지로 하여 고순도의 이소플라본 아글루콘을 제조하는 방법에 관한 것이다.
콩에 대한 연구는 1950년대부터 콩의 풍부한 영양 성분과 콩의 재배에 관한 연구가 활발히 진행되었으며, 최근 들어 대두 중의 이소플라본(isoflavone)이 기능성 성분으로 인식되면서 주목을 받고 있다.
대두 이소플라본은 여성호르몬인 에스트로겐(estrogen)과 같은 역할을 하기 때문에 식물성 에스트로겐이라 불리며 고혈압, 골다공증, 유방암, 전립선암, 갱년기 장애 등에 예방효과가 있다. 실제로, 대두 이소플라본은 섭취 여성의 뼈에서칼슘이 용출되는 것을 억제시켜, 골밀도의 감소를 억제하여 골다공증 예방 효과가 있다. 유방암 세포는 에스트로겐을 필요로 하는데. 대두에 함유된 제니스테인은 폐경전 여성에게 항 에스트로겐 활성을 지니며, 호르몬, 세포대사를 통해 유방암과 관련된 에스트로겐의 작용을 감소시켜 유방암 예방효과가 있다. 또한, 일본인의 전립선암 사망률이 서양인의 사망률에 비해 매우 낮은데, 이는 대두 식품의 섭취량에서 유래되었다는 연구가 있으며, 동물 실험을 통해 전립선암 증상의 진행과 전립선 종양의 성장을 방해한다는 연구 결과가 있다. 갱년기에는 여성 호르몬인 에스트로겐 생산이 중지되므로, 두통, 관절통, 체온의 불안정 등이 발생할 수 있는데, 상기 이소플라본은 약한 에스트로겐으로서의 역할을 수행하므로 갱년기 장애 증상을 감소시킨다.
대두는 제니스테인 (genistein), 글라이시테인 (glycitein), 다이드제인 (daidzein) 및 이들의 배당체와 유도체로 구성된 이소플라본을 함유하고 있으며, 대부분이 제니스틴 (genistin) 및 다이드진 (daidzin)과 같은 배당체 형태이지만, 미생물 발효나 효소반응의 β-글루코시다아제(β-glycosidase)에 의해 당 잔기가 가수분해되어 아글루콘인 제니스테인 및 다이드제인 형태로 존재하게 된다. 상기 이소플라본 배당체와 아글루콘은 모두 장내에서 흡수되는데, 배당체보다는 발효나 효소반응에 의해 전환된 아글루콘의 흡수속도가 현저히 빠르므로, 비발효식품에 존재하는 이소플라본보다는 발효식품에 존재하는 이소플라본 아글루콘이 이용성 측면에서는 매우 유리한 것으로 알려져 있다.
일반적으로 아글루콘은 비발효식품에서는 10%이하이나, 발효식품인 된장이나청국장 등에는 70∼80%정도가 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 현재까지 알려진 이소플라본 배당체를 가수분해하는 균은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 락토바실러스 불가리쿠스 (Lactobacillus bulgaricus), 아스페리질러스 니거 (Asperigilus niger), 사카로마이세스 (Saccharimyces) 등이 있으며, 이들은 모두 공통적으로 β-글리코시다아제를 생산하는 균들이다.
문헌(한국식품과학회지 제3권 제1호 185-195(1999))에 의하면, 이소플라본 글리코사이드(isoflavone glycoside)에서 배당체를 제거한 이소플라본 아글루콘 형태의 이소플라본은 락토바실러스 데브뤽키 (Lactobacillus debrueckii)를 이용, 발효를 통하여 가수분해됨을 보인다. 또한, 미국특허 제5,554,519호는 사카로폴리스포라 에리트라에아 (Saccharopolyspora erythraea, SE)를 발효시켜 유기용매 하에서 pH 8∼11에서 제니스테인 이소플라본을 추출하는 방법을 개시하고 있고, 일본특개소 60-199396에서는 스트렙토베르티실리움 종 K-251 (Streptoverticillium Sp.)을 배양시켜 이소플라본 유도체, 다이드제인 및 텍토리제닌 (tectorigenin)을 제조하는 발효방법을 개시하고 있으며, 일본특개소 50-160483호에서는 감자 전분, 글루코우즈, 대두 등을 함유한 배양액 상에서 27℃에서 5일간 호기성 배양시키면 아스페리질러스 니거가 배양되며, 이에 의해 생체 활성 이소플라본이 생성됨을 개시하고 있고, 일본특개소 50-35393호에서는 대두, 글루코우즈, 전분 등을 함유한 배양액 상에서 중성 조건에서 배양시키면, 악티노마이세스 로세올루스 (Actinomyces roseolus)에 의해 카테콜-O-메틸 트랜스퍼라제 (catechol-O-methyl transferase)를 억제시키는 이소플라본이 생성됨을 개시하고 있다. 효소를 이용한 공정에서는 β-글리코시다아제외에 에스터라제 (Easterase), 펙티나아제 (Pectinase) 및 세룰라아제 (Cellulase)와 같은 효소들에 의해 배당체를 가수분해하여 이소플라본 아글루콘을 전환시키는데 이용하고 있다. 예를 들면, 국제공개 제WO-9510512호는 상기와 같은 기능의 β-글루코시다아제, 에스터라제 또는 산을 이용하여 이소플라본에서 배당체를 가수분해하여 이소플라본 아글루콘이 풍부한 야채 유장 (vegetable whey)을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 상기 효소들은 기질에 따라 전환능이 다른 특성을 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 광범위한 연구를 수행한 결과, 상기 균들과 전혀 다른 균인 로도투룰라 글루티니스가 이소플라본 배당체를 효과적으로 가수분해하여 고수율 및 고생산성의 이소플라본 아글루콘을 생산할 수 있음을 발견하였으며, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 로도투룰라 글루티니스를 이용하여 대두 또는 대두배아로부터 고수율 및 고 생산성의 이소플라본 아글루콘을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 이소플라본 아글루콘 전환능을 갖는 로도투룰라 글루티니스(KCCM-10172호)를 제공하는데 있다
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 이소플라본 아글루콘을 제조하는 방법은 로도투룰라 글루티니스의 영양원 및 기질로 대두 또는 대두배아 추출액을 사용하고, 로도투룰라 글루티니스를 배양시키는 것으로 이루어진다.
이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
일반적으로 로도투룰라 균은 사과, 배 등에서 과실의 변패의 원인균으로, 문헌 (대한신장학지 11(1) 85-87, 1992)에 의하면, 외래복막투석 환자에 있어 복막염을 일으키는 매우 드문 원인균으로서, 비경제적인 균으로 알려져 왔다. 그러나, 본 발명에서는 발효식품인 메주에서 분리한 로도투룰라 글루티니스 균을 이용하여, 이소플라본 아글루콘의 생산능을 실험한 결과, 기존의 이소플라본 아글루콘 전환능을 지닌 다른 균과 비교하여 성능이 결코 뒤지지 않음을 발견하였고, 이에 기초하여 종래에 기탁된 로도투룰라 글루티니스를 실험한 결과, 이소플라본 아글루콘 전환능이 우수한 장점을 갖고 있음을 발견하였다.
균의 선발은 경기도 일원에서 수집한 각각의 메주를 분쇄하여 시료를 멸균증류수로 10, 100배 희석한 후 희석액을 감자 덱스트로우즈(Potato dextrose agar)배지에 도말하여 30℃에서 배양하여 성장속도가 빠르고, 형태학적 특성이 다른 균주를 1차 선발하였고, 이들 선별된 균주들을 대두 및 대두배아 추출액이 포함된 평판배지(추출액85%, agar15%)에서 배양시켜 2차 선발하였다. 2차 선발에서 선별된 균주들을 이소플라본 전환능이 우수하고, 생산성이 높은 균주를 3차 선발하였다.
이렇게 선발된 균주의 동정은 형태학적 및 생리학적 특성을 조사하였고, 바넷 (Barnett)등 (Yeast:Characteristics and identification. 캠브리지 대학 출판부, 런던, 1983)의 분류방법에 따라 동정하여 본 균주를 로도투룰라 글루티니스로 동정하여 1999. 10. 13.자에 한국종균협회에 국제 기탁하였다(기탁번호 KCCM-10172호).
성장배지로는 감자 덱스트로우즈(Potato dextrose) 배지를 사용하였고, 플라스크의 발효배지로는 대두 또는 대두배아 추출액을 사용하였다. 본 발명에서 사용된 대두 및 대두배아 추출액은 β-글리코시다아제, α-글리코시다아제, 펙티나아제 등을 사용시 이소플라본 아글루콘으로 전환됨을 보여주었으며, 이로부터 본 발명의 로도투룰라 글루티니스는 상기 효소들을 생산하는 것으로 판단된다. 상기 추출액의 고형분 농도는 8∼20g/l이 바람직하며, 상기 농도가 8g/l미만이면 전환율은 높으나 산업화시 설비용량이 커져 비경제적인 문제가 발생하고, 20g/l를 초과하면 설비용량은 낮아지지만 발효에 의한 전환율이 낮아지는 문제가 있다.
종배양은 냉동 보관된 균주를 감자 덱스트로우즈 배지에 접종하여, 진탕배양기에서 성장시켰다. 발효조 배양에서는 발효초기에 대두 및 대두배아 추출액을 배지로 사용하였다. 발효과정중 교반속도는 300∼600rpm으로 조절하였고, 통기량은 0.5∼2.5vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전과정 동안 4.0∼8.0으로 조절하였으며, 만일 상기 pH가 4.0이하로 떨어질 경우 균체의 성장이 늦어지면서 생산성이 낮아지는 문제가 발생하며, 8.0을 초과하면 균의 성장은 가능하나 효소활성이 떨어져 전환능이 낮아지는 문제가 발생한다. 배양온도는 25∼35℃로 조절하였으며, 만일 상기온도 범위를 벗어날 경우, 균체성장에 영향을 주어 전환능이 낮아지는 문제가 발생한다. 배양시간은 바람직하게는 30∼54시간이다.
발효과정동안 용존산소는 인골드(Ingold)(Swiss, polarographic type)의 용존산소전극을 사용하여 측정하였으며, 발효시점에서는 350∼400rpm으로 하고, 발효진행시 감소하는 용존산소를 발효 초기 용존산소 100%에 대하여 적어도 20%이상으로 높여주기 위해 회전수를 400∼600rpm으로 조절하였으며, 주입공기량도 이에 맞추어 조절하였다. 만일, 용존산소가 상기 20%이하로 낮아질 경우 균체량이 감소하는 문제가 발생할 수 있다.
이소플라본 아글루콘의 주성분인 다이드제인, 글라이시테인 및 제니스테인의 농도는 SUPELCOSIL LC-18 (SUPELCO, USA)칼럼이 장착된 HPLC (Water, USA)에 UV 검출기를 이용하여 260nm에서 측정하였다. 이때, 용매는 아세트나이트릴, 물, 초산을 70:30:0.1로 혼합한 액을 사용하였고, 상온에서 유속은 1.0ml/min이였다. 균체 농도는 탁도계를 이용하여 600nm에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 건조 중량으로 환산하였다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
종 배양 : 균주 로도투룰라 글루티니스 (한국종균협회 KCCM-10172호)를 감자 덱스트로우즈 배지 50ml가 들어있는 250ml 플라스크에 접종하여 240rpm 30℃로 24시간 배양하였다.
본 배양 : 종 배양액을 추출액 50ml가 들어있는 250ml 플라스크에 접종한 후, 진탕배양기로 220rpm에서 30℃로 배양하였고, 배지의 pH는 발효 초기에 5.0로 조절한 후 유지시켰다. 시간 경과에 따른 이소플라본 아글루콘의 생산을 살펴본 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 배양시간 6일째에서 최대의 이소플라본 아글루콘이 생산되었다.
250ml 플라스크에서 분리균주의 시간에 따른 이소플라본 아글루콘 생성량
배양일 배당체농도(ppm/l) 아글루콘 농도(ppm/l) 전환율(%) 생산성(ppm/l-일) 순도(%)
0 100 0.50 0 0 9
2 73 15 30 7.5 17
4 42 27 54 6.75 39
5 25 38 76 7.6 60
6 0 48.0 96 8.0 100
전환율(%) :((이소플라본 아글루콘X2)/이소플라본 배당체) X100.
생산성(ppm/L-일) :이소플라본 아글루콘 (ppm/l) / 일(day).
순도(%): (이소플라본 아글루콘/(이소플라본 아글루콘+이소플라본 배당체)) X 100.
실시예 2
배양 방법은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 추출액의 농도를 변화시켜 6일 (144시간) 동안 배양한 결과를 하기 표 2에 표시하였다.
250ml 플라스크에서 추출액 농도별 이소플라본 아글루콘의 생성량
추출액 고형분(g/l) 초기배당체농도(ppm/l) 아글루콘(ppm/l) 전환율(%) 생산성(ppm/l-시) 순도(%)
5 1150 525 91.3 3.65 84.0
10 1980 912 92 6.3 85.4
20 4050 1850 91.3 12.85 84.1
25 4550 1550 68.1 10.76 51.6
전환율(%) :((이소플라본 아글루콘 X2)/이소플라본 배당체) X100.
생산성(ppm/L-시) :이소플라본 아글루콘 (ppm/l) / 시간.
순도(%): (이소플라본 아글루콘/(이소플라본 아글루콘+이소플라본 배당체)) X 100.
실시예 3
종 배양은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 고형분 농도가 10%인 추출액을 배지로 하고 발효액이 10 l인 15 l발효조를 사용하여 배양하였다. 배양온도 30℃에서 pH를 변화시켜 실험을 수행하였다. 통기량은 1.0vvm이었고, 교반속도는 350rpm으로 조절하여 pH를 변화시켜 48시간 배양한 결과를 하기 표 3에 표시하였다.
15 l 발효조에서 pH 별 이소플라본 아글루콘의 생성량
pH 초기 배당체농도(ppm/l) 아글루콘(ppm/l) 전환율(%) 생산성(ppm/l-시) 순도(%)
3.0 1980 300 30 6.25 17.9
5.0 470 47 9.79 31.1
7.0 430 43 8.96 27.7
9.0 310 31.3 8.33 18.6
전환율(%) :((이소플라본 아글루콘X2)/이소플라본 배당체) X100.
생산성(ppm/L-시) :이소플라본 아글루콘 (ppm/l) / 시간.
순도(%): (이소플라본 아글루콘/(이소플라본 아글루콘+이소플라본 배당체)) X 100.
실시예 4
배양방법과 발효배지는 실시예 3과 같고, 배양 pH는 최적 배양 pH인 5.0으로 하고, 통기량은 1.0vvm이었고, 교반속도는 350rpm으로 조절하여 하기와 같이 배양온도를변화시키면서 48시간 발효를 수행하였고, 배양한 결과를 표 4에 표시하였다.
15 l 발효조에서 온도별 이소플라본 아글루콘의 생성량
온도(℃) 초기 배당체(ppm/l) 아글루콘(ppm/l) 전환율(%) 생산성(ppm/l-시) 순도(%)
20 1980 350 35.4 7.29 21.4
25 480 48.5 10.0 32
30 500 50.5 10.41 33.8
35 320 32.3 6.67 19.3
40 200 20.2 4.16 11.2
실시예 5
선정된 최적조건에서 이소플라본 아글루콘의 생산량을 경과시간에 따라 전환율이 최고점에 이르는 실험을 실시하였다. 추출액 10 l를 15 l 발효조에서 고형분 농도(10%), 용존산소는 교반속도를 300∼600rpm으로 조절하여 20%이상 유지되도록 조절하였다. pH는 발효 전과정 동안 5.0으로 조절하였고, 배양온도는 30℃이었다. 시간에 따른 이소플라본 아글루콘의 생산은 표 5에 나타내었다. 이러한 방법으로 추출액 내에 배당체 형태로 존재하는 이소플라본으로부터 발효를 이용하여 배당체가 제거된 아글루콘 형태의 이소플라본(아글루콘 순도 90%이상)을 얻었다.
15 l 발효조에서 추출액 10 l로부터 시간별 아글루콘의 생성량
시간 배당체 농도(g/l) 아글루콘 농도(ppm/l) 전환율(%) 생산성(ppm/l-시) 순도(%)
0 2000 0 - - -
6 2000 0 - - -
12 1800 50 5 4.16 0.02
18 1150 500 50.2 27.8 30.4
24 900 550 55 22.9 37.9
30 500 700 70 23.3 58.3
36 240 850 85 23.61 78.0
42 50 970 97 23.10 95.1
48 0 900 90 18.75 100
54 0 760 76 14.07 100
실시예 6
종래의 로도투룰라 글루티니스와 본원 발명의 로도투룰라 글루티니스의 이소플라본 아글루콘 전환율을 비교하여 보았다. 초기 배당체의 농도는 1980ppm/l로 동일한 추출액을 사용하였다. 발효조건은 본원 발명의 조건으로 하였으며, 40시간 발효한 결과를 표 6에 나타내었다.
15 l 발효조에서 추출액 10 l로부터 시간별 아글루콘의 생성량
균주명 아글루콘 농도(ppm/l) 전환율(%) 생산성(ppm/l-시) 순도(%)
KCCM-50262(ATCC-2527) 810 81 20.25 69.2
KCCM50531(IFO1501) 780 78 19.5 65.0
KCCM50528(IFO 1099) 790 79 19.75 66.4
KCCM-10172 970 97 24.5 96.0
상기에서 살펴본 바와 같이, 본원 발명은 이소플라본 글리코사이드에서 배당체를 제거하여 이소플라본 아글루콘 형태의 이소플라본을 제조하는데 있어서, 기존에 사용하지 않았던 새로운 균주인 메주에서 추출한 로도투룰라 글루티니스를 이용하여 종래의 아스페리질러스, 락토바실러스 계통의 균을 이용한 발효를 통한 전환율 및 생산성에 있어서, 동등한 결과를 산출할 수 있었고, 종래의 로도투룰라 글루티니스와 비교한 결과 전환능이 우수한 결과를 산출할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 대두 또는 대두배아 추출액을로도투룰라 글루티니스( Rhodotorula glutinis) 의 영양원 및 기질로 사용하여 이소플라본 아글루콘을 생산하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글루콘의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기로도투룰라 글루티니스( Rhodotorula glutinis) 는 메주로부터 분리하여 한국종균협회에 기탁한로도투룰라 글루티니스( Rhodotorula glutinis) KCCM-10172호인 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글루콘의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배양 pH는 4.0∼8.0인 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글루콘의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 배양온도는 25∼35℃인 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글루콘의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양은 30∼54시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글루콘의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 배양시 용존산소를 발효초기 용존산소량에 대하여 적어도 20%이상을 계속적으로 유지하도록 하는 것을 특징으로 하는 순도 90%이상의 이소플라본 아글루콘의 제조방법.
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