KR100341793B1

KR100341793B1 - 스핑고신 1-포스페이트를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진제

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Publication number: KR100341793B1
Application number: KR1019990026477A
Authority: KR
Inventors: 권영근; 김규원; 이옥희; 김영미; 이유미; 문은정
Original assignee: 권 영 근
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2002-06-24
Anticipated expiration: 2019-07-02
Also published as: KR20010008569A

Abstract

본 발명은 생체 내에 존재하는 지질대사물질인 스핑고신 1-포스페이트 (sphingosine 1-phosphate)를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진제에 관한 것이다. 본 발명자들은 S1P의 혈관신생에의 관여여부를 여러 가지 혈관신생 실험 모델을 통하여 확인한 결과, S1P가 생물활성지질로서 다른 구조 유사체와는 달리 실험실적 및 생체내 조건에서, 혈관내피세포에 존재하는 세포수용체와 결합하여, 이들의 혈관신생작용을 촉진할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 S1P를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 촉진제는 섬유아세포 성장인자, 표피 성장인자 및 혈소판 유도 내피 성장인자 등의 다른 혈관신생 촉진인자와는 달리, 좀더 효과적이고 부작용도 적으며, 경제적으로 제조될 수 있는 새로운 혈관신생 인자로서, 혈관신생이 요구되는 상처치유, 화상, 류마티스 관절염, 건선, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 질환 등의 다양한 생체질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

스핑고신 1-포스페이트를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진제{A Pharmaceutical Composition for Angiogenesis Stimulation which Comprises Sphingosine 1-Phosphate as an Active Ingredient}

본 발명은 스핑고신 1-포스페이트(sphingosine 1-phosphate: S1P)의 신규한 용도에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 생체 내에 존재하는 지질대사물질인 S1P를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진제에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 기존혈관의 내피세포가 세포외 기질을 분해하고, 이동, 분열 및 분화하여 새로운 모세혈관을 형성하는 현상으로, 혈관신생을 유도 혹은 억제하는 인자를 이용하여, 암, 류마티스 관절염, 건선, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 심근경색, 협심증, 뇌혈관성 질환 등, 혈관신생에 의존하는 질병을 치료하고자 하는 시도가 쥬다 포크만(Juda Folkman) 등을 선두로 하여 약 20년 전부터 활발히 이루어지고 있다(참조: Folkman J., Nat. Med 1: 27-31, 1995; Jackson J. R., et al., FASEB J., 11:457-465, 1997; Risau W., Nature, 386:671-674, 1997; Bussolino, F., et al., Trends Biochem. Sci. 22:251-256, 1997; Hanahan D. et al., Cell, 86:353-364, 1996).

정상 성인의 경우, 혈관을 이루고 있는 내피세포의 교체시간은 일반적으로 47일에서 20,000일로 다양하며 매우 엄격한 조절을 받고 있다. 일반적으로, 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1), 혈소판 인자-4(platelet factor-4), 엔지오스타틴 (angiostatin) 등의 혈관신생 억제인자와 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor), 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor) 등과 같은혈관신생 촉진인자가 평상시에는 양적 평형상태를 유지하여 혈관신생이 일어나지 않지만, 상처나 암이 발생한 경우, 상처난 조직의 재생 및 암의 성장을 위하여 혈관신생 억제인자와 촉진인자의 양적 평형상태가 깨어지고, 새로운 혈관이 형성되는데, 이때 혈관신생 촉진인자의 과다발현이 관여하게 된다.

일단, 혈관내피세포가 혈관신생 촉진인자에 의해 자극을 받으면, 기질 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease)와 같은 단백질 분해 효소의 발현과 분비가 증가하게 되며, 전기 효소에 의해 혈관내피세포를 둘러싸고 있는 기저막(basement membrane)이 분해되면, 혈관내피세포가 이를 뚫고 분열, 이동 및 분화를 거쳐 혈액이 흐를 수 있는 완전한 혈관을 형성하게 된다.

과다한 혈관형성은 질병악화에 있어 주 원인이 되기도 하지만, 혈관의 미형성 또한 심각한 질병의 원인이 되고 있다. 혈관신생은 상처치유나 조직재생에 필수적인 현상이라 할 수 있는데, 예를 들어, 혈관형성이 미발달된 태반은 유산의 아주 중요한 원인이 되며, 혈관의 미형성으로 인한 괴사, 궤양 및 허혈의 경우, 조직이나 기관의 기능이상을 유발하거나, 심지어는 사망의 원인이 될 수 있다. 또한, 동맥경화증, 심근경색 및 협심증과 같은 질병도 원활하지 못한 혈액 공급이 그의 원인이 되고 있다. 따라서, 혈관의 미형성으로 인한 저산소 상태 또는 저영양 상태의 유발로 인한 조직손상을 감소시키고, 원활한 조직재생을 위해 새로운 혈관형성을 유도하거나 촉진시키고자 하는 치료법 개발에 많은 관심이 모아지고 있다.

특히, 혈관신생은 상처받은 피부조직이 재생되기 위한 필수적인 상처회복 (wound repair) 과정에 반드시 수반되어야 하는 요건이다. 상처의 초기 단계에는세포의 괴사와 혈관의 파괴로 인한 염증반응이 일어나게 되며, 이 염증반응 이후에 혈액성분의 탈혈관 현상, 혈소판의 활성화 및 혈액응고와 함께, 칼리크레인, 트롬빈 및 플라스민 등과 같은 생물학적 매개물질이 형성되는 일련의 과정을 거치게 된다. 결국, 상처 부위에서 새로운 조직이 형성되고, 세포외 기질의 합성 및 재구성이 일어나 재기능을 할 수 있도록 치유되는 것이다.

염증반응에 있어서, 내피세포나 면역에 관여하는 과립구, 비만세포 및 혈소판 등은 복잡한 폭상반응(cascade reaction)을 일으키며, 상처부위에의 이물질 침투를 억제하는 방어기작을 수행한다. 이러한 면역학적인 방어기작과 함께 표피세포, 대식세포, 내피세포 및 섬유아세포 등이 여러 종류의 성장인자를 분비하여 새로운 조직의 형성을 위한 세포분열을 촉진하고, 그와 동시에 표피세포, 내피세포 및 섬유아세포 등이 분비하는 여러 세포의 기질 단백질에 의한 세포 기질의 재구성이 일어남으로써, 상처의 치유가 완성되고 새로운 조직이 상처부위에 형성된다. 이러한 복잡한 상처치유의 반응과 함께 수반되는 중요한 현상이 혈관신생이며, 혈관신생은 상처치유 과정 중에 새로운 조직이 형성되면서 이러한 조직에 적당한 산소와 영양분을 공급해 주어, 그 조직이 정상적인 신체의 일부로서 재생이 되고 기능이 수행되도록 해 준다(참조: Majno G., et al., American J. Patol. 153:1035-1539,1998)

이와 같이 혈관신생을 이용한 생체 질환의 치료를 일컬어 혈관신생치료 (therapeutic angiogenesis)라 하고, 이미 혈관내피 성장인자와 같은 혈관신생 촉진인자는 중증의 국소빈혈(limb ischemia)를 위한 치료제로서 임상적용을 하는 단계에 있다. 혈관내피 성장인자 이외에 섬유아세포 성장인자, 표피 성장인자 (epidermal growth factor) 및 혈소판 유도 내피 성장인자(platelet-derived endothelial growth factor) 등의 혈관신생 촉진인자들도 임상적 치료를 위하여 다각적으로 연구되어 지고 있다(참조: Henry T. D., BMJ, 318:1536-1539, 1999). 그러나, 이들 인자들은 단백질로서, 분리정제에 어려움이 있고, 이에 따라 고가일 수밖에 없으므로, 임상적용에도 여러 가지 어려움이 따른다.

최근에는 혈관신생과정 중 혈소판의 역할이 중요하다는 가설이 입증되고 있다(참조: Tsopanoglou N. E., et al., American J. Physiol., 264:C1302-1307, 1993; Pipili-Synetos E., et al., Br. J. Pharmacol. 125:1252-1257, 1998). 물리적인 자극이나 세포화학적 자극에 의해 혈관내피세포의 물질투과성이 증가하면서, 혈관내피세포는 콜라겐과 같은 혈소판을 침착할 수 있는 인자를 많이 분비하게 된다. 이에 따라서, 혈관내벽에 혈소판의 결합이 증가하고 혈관내피세포 또는 주변세포에서 분비한 혈소판 응고인자에 의해 혈소판이 활성화되면, 활성화된 혈소판으로부터 여러 가지 다양한 인자가 분비되는데, 이들 인자들에 의해 혈관내피세포가 분열 및 이동하여 새로운 혈관의 형성이 이루어진다. 활성화된 혈소판에서 분비되는 인자 중 이미 알려진 혈관신생인자로는 혈관내피 성장인자, 혈관내피 성장인자-C 및 혈소판 유도 성장인자 등이 있다. 그 외에도 혈관 내피세포에 대한 영향은 검증되지 않았지만, 리소포스파티드 산(lysophosphatidic acid) 및 S1P와 같은 리소포스포리피드(lysophospholipid)들의 분비도 증가한다.

최근 연구결과에 의하면, S1P는 폴리펩타이드 성장인자와 유사한 작용을 하는 것으로 조사되어, 생물활성 지질로서 정의되고 있으며, 세포의 증식효과, 항세포사멸효과, 세포분화유도 및 세포구조에 중요한 세포골격 (cytoskeleton)의 형성에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(참조: An S., et al., J. Cell. Biochem. Suppl., 30/31:147-157, 1998; Goetzl E. J., et al., FASEB J. 12:1589-1598, 1998). 또한, S1P에 대한, G 단백질과 상호작용을 하는 세포 수용체(G protein-coupled receptor)가 존재하는 것으로 알려져 있으며, 특히 S1P의 세포 수용체 중 하나인 EDG-1의 경우, 혈관내피세포가 혈관으로 분화할 때 발현이 증가하는 유전자임이 밝혀졌고, 최근에는, EDG-1이 S1P에 대한 세포수용체임이 보고되었다(참조: Lee M. J., et al., Science, 279:1552-1555, 1998). 그러나, S1P의 혈관신생 촉진기능에 대해서는 전혀 알려진 바가 없었다. 따라서, 좀더 효과적이고 부작용도 적으며 경제적으로 제조될 수 있는 새로운 혈관신생인자를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 혈액 및 혈소판에 다량 함유되어 있는 S1P가 혈관신생에 관여하는지의 여부를 다양한 혈관신생 실험모델을 통하여 조사한 결과, S1P가 다른 구조 유사체와는 달리 실험실적 및 생체내 조건에서 강한 혈관신생 작용을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 생체 내에 존재하는 지질대사물질인 S1P를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진제를 제공하는 것이다.

도 1은 혈관내피세포에서 스핑고신 1-포스페이트(sphingosine 1-phosphate: S1P)의 세포수용체의 발현양상을 RT-PCR에 의하여 분석한 아가로오즈 젤 전기영동 사진이다.

도 2는 혈관내피세포를 마트리젤 위에서 배양하고 스핑고신 1-포스페이트를 처리하여 혈관형성을 유도한 사진이다.

도 3a는 스핑고신 1-포스페이트 처리 후, 60mm 디쉬에 배양한 혈관내피세포에 상처를 낸 후, 상처낸 부위로부터 이동해 나온 혈관내피세포를 보여주는 사진이다.

도 3b는 스핑고신 1-포스페이트의 처리농도에 따라, 이동한 혈관내피세포를 계수하여 도식화한 그래프이다.

도 4는 트렌스웰을 이용한 혈관내피세포의 이동성 조사방법을 도식화한 그림이다.

도 5는 트렌스웰을 사용하여 기존에 알려져 있는 혈관신생인자인 혈관내피 성장인자(vFGF), 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 스핑고신 1-포스페이트의 혈관내피세포의 이동성 촉진효과를 비교한 그래프이다.

도 6은 트렌스웰을 사용하여 스핑고신 1-포스페이트와 구조가 유사한 지질 대사물질들인 스핑고신(sphingosine: Sph), C2-세라마이드(C2-ceraimde: C2-cer) 및 리소포스파티드 산(lysophosphatidic acid: LPA)의 혈관내피세포의 이동성 촉진작용을 비교 분석한 그래프이다.

도 7a는 마우스를 이용한 마트리젤 플러그(Matrigel plug) 실험에 있어서, 스핑고신 1-포스페이트의 혈관신생 촉진작용을 나타낸 사진이다.

도 7b는 마우스를 이용한 마트리젤 플러그(Matrigel plug) 실험에 있어서, 스핑고신 1-포스페이트 처리시 증가한 플러그 내의 헤모글로빈의 양을 정량한 그래프이다.

본 발명자들은 S1P의 혈관신생에의 관여여부를 하기 실험을 통하여 확인하고, 다른 구조 유사체와는 달리 S1P가 강한 혈관신생 촉진작용을 나타내는 것을 여러 가지 혈관신생 실험모델을 통하여 확인하였다.

혈관내피세포에 대한 직접적인 S1P의 혈관신생 촉진 활성을 조사하기 위하여, 사람의 탯줄에 콜라게네이즈(collagenase)를 처리하여 혈관내피세포를 분리하고, 현재까지 S1P에 대한 수용체로 알려진 EDG-1, EDG-3 및 EDG-5의 존재 여부를 RT-PCR을 통하여 확인한 결과, 혈관내피세포에서는 EDG-3와 EDG-5에 비해, EDG-1이 우세하게 발현하고 있음을 확인하였다. 이는 혈관내피세포가 S1P에 반응할 수 있다는 것을 의미한다.

또한, 혈관내피세포의 세포외 기질로의 침윤 및 분화에 대한 S1P의 효과를 조사하였다. 혈관내피세포를 분리하여, 생체내의 세포외 기질과 유사한 마트리젤 (Matrigel) 위에 배양하면, 젤 내로 혈관내피세포가 침윤 및 분화하여 실제 사람 몸에서 생성되는 혈관과 유사한 관을 형성하는데, 이것은 다른 타세포와는 구별되는 혈관 내피세포만의 특징적인 현상으로 이를 이용하여, S1P 처리가 관형성을 현저하게 촉진함을 확인하였다.

S1P가 혈관내피세포의 이동성에 미치는 영향에 있어서는, 혈관내피세포를 세포간 접촉이 일어날 수 있는 밀도로 배양한 다음, 면도날로 세포를 긁어내어 상처를 주고, 상처를 낸 가장자리에서 이동하여 나온 혈관내피세포를 계수하여 이동성을 측정하였으며, 그 결과, SIP의 농도가 증가할수록 혈관 내피세포의 이동성도 증가함을 관찰하였다. 또한, 트렌스웰을 사용한 이동성 조사에 있어서도, 상기와 동일한 결과를 나타내었다. S1P와 구조가 유사한 스핑고신(sphingosine), C2-세라마이드 (C2-ceramide), 리소포스파티드 산을 처리하였을 경우에 있어서는(참조: 화학식 1), 혈관 내피세포의 이동성에 아무런 영향을 주지 않는 것으로 나타났는데, 이러한 S1P 특유의 혈관내피세포에 대한 이동성 촉진 효과는 기존에 잘 알려진 혈관신생 촉진인자인 혈관내피 성장인자나 섬유아세포 성장인자에 비해서도 현저하게 월등한 것으로 나타났다.

S1P의 혈관신생 촉진활성에 대한 생체내 실험은 마우스 마트리젤 플러그 분석법(mouse Matrigel plug assay)를 이용하였다. 무균상태의 마우스의 복부에 마트리젤을 피하 주사하고, 이의 고분자화에 의한 플러그 형성을 유도한 후, 마우스의 피부를 벗겨내고 마트리젤을 꺼내어 얇게 절편하여, 현미경 사진으로 플러그내로의 혈관형성 정도를 정량적으로 분석한 결과, S1P의 처리가 현저하게 혈관형성을 유도함을 확인하였으며, 헤모글로빈 양 또한 증가시킴을 확인하였다. 상기 결과는 S1P가 생체내에서 강력하게 혈관신생을 촉진함을 보여주고 있다.

따라서, S1P는 혈관신생이 요구되는 상처치유, 화상, 류마티스 관절염, 건선, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 질환 등의 다양한 생체질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 실험실적(in vitro) 혈관신생 분석

혈관신생은 매우 복잡한 단계를 거쳐 이루어지는데, 혈관내피세포가 혈관신생 촉진인자에 자극되면, 혈관내피세포 주변에 위치하고 있는 세포외 기질의 분해를 위해 혈관내피세포로부터 단백질 분해 효소의 분비가 증가하고, 이에 의해 세포외 기질이 분해되면 혈관내피세포의 증식과 이동이 일어난다. 마지막 단계에서는혈관내피세포의 완전한 관을 형성하기 위한 분화가 일어난다.

S1P의 혈관내피세포에 대한 직접적인 혈관신생 촉진활성을 조사하기 위하여, 사람의 탯줄에 콜라게네이즈(collagenase)를 처리하여 혈관내피세포를 분리하였다. 그런 다음, 혈관내피세포로부터 RNA를 분리하고, RT-PCR방법을 이용하여 현재까지 S1P에 대한 수용체로 알려진 EDG-1, EDG-3 및 EDG-5의 존재 여부를 확인하였다(참조: 도 1). EDG-1을 위해 5'-CCATGGGGCCCACCAGCGTC-3'(sense)(참조: 서열번호 1)와 5'-CCCTTCCCGCAGAAACC-3'(antisense)(참조: 서열번호 2)를, EDG-3을 위해 5'-ATGGCAACTGCCCTCCCG-3'(sense)(참조: 서열번호 3)와 5'-GCTGCTGGACTTCACCA-3'(antisense)(참조: 서열번호 4)를, EDG-5를 위해서는 5'-ATGGGCAGCTTGTACTCGGAG-3'(sense)(참조: 서열번호 5)와 5'-CTTGAGCAGGGCTAGCG-3'(antisense)(참조: 서열번호 6)를 프라이머로 사용하였다. 도 1에서 보듯이, RT-PCR 결과 혈관내피세포에서는 EDG-3와 EDG-5에 비해, EDG-1이 우세하게 발현하고 있음을 확인하였다. 도 1에서, SM은 DNA 크기 마커; 1열은 EDG-1; 2열은 EDG-3; 및, 3열은 EDG-5를 나타낸다. 이상의 결과로부터, 혈관내피세포는 S1P에 반응할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이어, S1P가 혈관내피세포의 세포외 기질로의 침윤 및 분화에 어떠한 영향을 미치는 지에 대하여 조사하였다(참조: 도 2). 분리한 혈관내피세포를 생체내 세포외 기질 과 유사한 마트리젤(Matrigel, Becton Dickinson, U.S.A.) 위에 배양하면, 혈관내피세포가 침윤 및 분화하여 실제 사람 몸에서 생성되는 혈관과 유사한 관을 형성한다. 이것은 다른 타세포와는 구별되는 혈관내피세포만의 특징적인 현상으로, 이러한 혈관내피세포의 특징을 이용하여 마트리젤에서 혈관내피세포를 3차원적으로 배양하고, 5μM의 S1P를 처리한 결과, 도 2에서 보듯이, S1P를 처리하지 않은 대조군에 비해서 관형성이 현저하게 촉진됨을 확인하였다. 도 2에서, 좌측은 음성대조군을, 우측은 SIP처리군을 나타낸다.

또한, 혈관 내피세포의 이동성에 대한 S1P의 영향을 확인하기 위하여, 혈관내피세포를 60mm 디쉬(dish)에 세포간 접촉이 일어날 수 있는 밀도로 배양한 다음, 면도날로 세포를 긁어내어 상처를 주고, 상처를 낸 가장자리에서 이동하여 나온 혈관내피세포를 계수하여 이동성을 측정하였다(참조: 도 3a 및 도 3b). 도 3a의 사진에서 보듯이, S1P 미처리 음성대조군에 비하여, S1P 처리후에 혈관내피세포의 이동성이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 도 3a 에서, 좌측은 음성대조군을, 우측은 SIP 처리군을 나타낸다. 또한, 도 3b에서 보듯이, 0.05μM 내지 10μM의 농도로 처리한 결과, 0.1μM과 같은 낮은 농도에서부터 혈관내피세포의 이동성이 증가하였고, 농도가 증가하면 할수록 혈관내피세포의 이동성도 같이 증가하였다.

혈관내피세포의 이동성을 재검증하기 위하여 트렌스웰(Transwell)을 사용하여 조사하였는데(참조: 도 4), 트렌스웰을 사용한 이동성 결과 역시 상기와 동일한 결과를 나타내었다(참조: 도 5). 도 5에서 보듯이, 5μM의 S1P를 처리하였을 경우, 대조군에 비하여 이동성이 2.5배 내지 3배 증가하였다. 또한, 이러한 S1P의 혈관내피세포의 이동성 촉진 효과는 기존에 잘 알려진 혈관신생 촉진인자인 혈관내피 성장인자나 섬유아세포 성장인자를 각각 10ng/ml로 처리하였을 때에 비해 현저히 월등한 것으로 나타났다. S1P와 구조가 유사한 스핑고신(sphingosine), C2-세라마이드(C2-ceramide), 리소포스파티드 산의 경우에는 혈관 내피세포의 이동성에 아무런 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(참조: 도 6). 도 6에서, ▒는 1μM, ■는 5μM 의 S1P 처리농도를 나타낸다.

실시예 2: 마우스를 이용한 마트리젤 플러그(Matrigel plug) 실험

생체내에서의 S1P의 혈관신생 촉진활성을 확인하기 위하여, 포유류에서 그 효능을 검증할 수 있는 실험모델인 마우스 마트리젤 플러그 분석법(mouse Matrigel plug assay)를 이용하였다(참조: Passaniti A., et al., Lab. Invest., 67:519-528, 1998). 무균상태의 마우스(specific pathogen free mouse: SPF)인 C57BL/6 (6∼7주령)의 수컷에 500㎕의 마트리젤을 굳지 않도록 4℃에서 혼합하여, 마우스의 복부에 피하 주사하고, 마트리젤의 고분자화(polymerization)에 의한 플러그 형성을 유도하였다. 5일 후, 마우스의 피부를 벗겨내고 마트리젤을 꺼내어 얇게 절편한 후, 현미경 사진을 이용하여 플러그내로의 혈관형성 정도를 관찰하였으며, 또한 플러그내 헤모글로빈(hemoglobin) 양을 키트(Drabkin reagent kit 525, Sigma, U.S.A.)를 이용하여 측정하고, 혈관신생 정도를 정량적으로 분석하였다(참조: 도 7a 및 도 7b). 도 7a에서 보듯이, S1P가 처리된 실험군은 음성대조군에 비하여 현저하게 혈관형성이 유도되는 것을 확인할 수 있었는 바, 도 7b의 좌측은 아무것도 처리되지 않은 대조군, 우측은 S1P가 처리된 실험군의 마트리젤을 절편하여 찍은 현미경사진이다. 또한, 도 7b는 플러그내에 존재하는 헤모글로빈 양을 측정한 그래프로서, 대조군에는 헤모글로빈이 거의 존재하지 않은데 반하여, S1P 처리군에는 다량의 헤모글로빈이 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 S1P가 생체내에서 강력하게 혈관신생을 촉진함을 보여주었다.

상기 결과로서, 혈관내피세포를 사용한 실험실적 모델과 마우스를 사용한 생체내 모델에서 S1P가 강력한 혈관신생 촉진 효과가 있음을 확인하였다.

투여방법 및 효과량

S1P를 임상적으로 이용하고자 하는 경우, 전기 성분은 약제학적 분야에서의 통상적인 방법에 따라 약제학적 제제로 제형화시켜 이용할 수 있다. 이러한 목적으로서 바람직한 약제학적 제제에는 주사용 용액, 연고제, 크림제, 겔제, 로숀 등의 국소투여용 외용제가 있다. 이들 약제학적 제재는 약제학적으로 허용되는 통상의 담체, 즉 주사제의 경우에는 안정제, 보존제, 용해보조제, 완충제, 또는 등장화제, 외용제의 경우에는 수성 또는 유성 연고기제, 산화방지제, 방부제, 또는 증량제 등을 이용하여 제조할 수 있다.

생체 내에 존재하는 지질대사물질인 S1P를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진제의 투여량은 투여 대상의 무게 및 질환의 정도에 따라 차이가 있으나, 통상 성인(체중 60kg 기준)의 경우, 비경구로서 1일 1회 5mg 내지 20mg 으로 투여하는 것이 바람직하며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 경험에 의하여 적절히 결정될 수도 있다.

급성독성 시험

본 발명에서 생체 내에 존재하는 지질대사물질인 S1P를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진제의 급성독성을 알아보기 위하여, 전기 촉진제를 C57BL/6 (6∼7주령)의 수컷 마우스에 유효량 범위의 약 1,000배인 1mg을 피하 주사하고, 투여후 7일간에 걸쳐 마우스의 사망수를 관찰하여 LD₅₀값을 결정한 바, 사상예는 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명의 유효량의 범위에서, S1P를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진제는 충분히 안전한 제제임을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 생체 내에 존재하는 지질대사물질인 S1P를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 촉진제를 제공한다. 본 발명에 의하면, S1P가 생물활성지질로서 다른 구조 유사체와는 달리 실험실적 및 생체내 조건에서, 혈관내피세포에 존재하는 세포수용체와 결합하여, 이들의 혈관신생작용을 촉진할 뿐만 아니라, 섬유아세포 성장인자, 표피 성장인자 및 혈소판 유도 내피 성장인자 등의 다른 혈관신생 촉진인자와는 달리, 좀 더 효과적이고 부작용도 적으며 경제적으로 제조될 수 있는 새로운 혈관신생 인자이므로, 혈관신생이 요구되는 상처치유, 화상, 류마티스 관절염, 건선, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 심근경색, 협심증 및 뇌혈관성 질환 등의 다양한 생체질환의 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

스핑고신 1-포스페이트(sphingosine 1-phosphate)를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생 촉진제.
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