KR100331608B1

KR100331608B1 - 동물 뼈를 이용한 골이식 대체재 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR100331608B1
Application number: KR1019990052810A
Authority: KR
Inventors: 김정근
Original assignee: 김정근; 주식회사 오스코텍; 임창준; 김세원; 김종여; 김형건; 신동령; 유영목; 임성빈; 고선일
Priority date: 1999-11-25
Filing date: 1999-11-25
Publication date: 2002-04-09
Anticipated expiration: 2019-11-25
Also published as: US7507254B2; AU1899001A; US20060014283A1; WO2001037891A1; KR20010048219A

Abstract

본 발명은 골이식 대체재의 제조방법에 관한 것으로, 뼈에서 해면골을 채취하고 뼈에 함유된 지방질 및 유기질을 제거해내고 방사선 멸균 과정을 거쳐 제조되어지는 것을 그 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 의한 골이식 대체재는 크리스탈의 구조가 변형되지 않고 그 형태가 잘 유지되며, 생체 적용시 거부반응을 유도하지 않고 생체적합성이 있어 신생골의 형성유도에 뛰어난 효과가 있는 것으로 판명되었다.

Description

동물 뼈를 이용한 골이식 대체재 및 그 제조 방법{Process for manufacturing of bone graft materials using animal bones}

본 발명은 동물 뼈를 이용한 골이식 대체재 및 그 제조방법에 관한 것이다.

뼈이식대체재란 여러 가지 치과질환 또는 정형외과적 질환으로 인하여 뼈조직의 결손부가 생긴 경우 이를 대체하고 신생골의 형성을 촉진시키기 위하여 사용하는 이식재이다. 일반적으로 가장 좋은 이식물은 본인의 뼈 중 다른 부위를 떼어내어서 이식하는 자가골로 알려져 있으나 이차적인 수술이 필요하고, 필요한 만큼의 양을 얻기가 힘들고, 일반 개인의원에서 시행하기가 어렵다는 단점을 가지고 있다. 따라서, 쉽게 사용할 수 있는 여러 가지 대체물을 이용하여 이식하는데, 예를 들면 기증에 의한 사람의 뼈나 인공적인 합성물을 사용하기도 한다. 그러나 이들도 각각 여러 가지 단점을 가지고 있으며 사용에 제약을 받고 있는 실정이다.

현재까지 국내에서 사용되는 뼈대체재는 전량 외국에서 수입한 것을 사용해 왔으며 현재 국내에 수입, 시판되고 있는 골 이식재로는 다음과 같은 것들이 있다.

(1)BIOOSS ^TM

① 제조 : 바이오메트리얼즈 가이스트리히(Biomaterials Geistlich),

(Switzerland), 수입원 : 정산 바이오메드

② 특성 : 소에서 채취한 골 분말을 암모니아(ammonia)로 처리한 후 200∼600'C에서 열처리한 재료로써 교원질 구조는 관찰되지 않으나 골조직의 기본 구조는 유지되고 있으며 방사선 멸균처리된 상태로 시판되고 있음.

(2)PYROST ^TM

① 제조회사 : 오스테오 에이지(Osteo AG),

(Switzerland), 수입원 : 남북의료기(대전)

② 특성 : 소의 해면골을 기계적 처리, pyrolitical treatment, 및 1200∼1300'C에서 열처리를 한 재료로써 골 결손부의 수복재로 사용되며 방사선 멸균 처리된 상태로 시판되고 있음.

본 발명자들은 상기와 같은 수입의존성 뼈대체재의 개발 및 기존제품 제조방법 및 특성상의 단점을 보완하기 위하여 연구 시험한 결과 사용기 편한 신규한 뼈대체재를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명 뼈대체재 제조방법은 뼈에서 해면골을 채취하여 특정한 기술을 이용하여 뼈에 함유된 지방질 및 유기질을 제거해내고 방사선 멸균 과정을 거쳐 제조되어지는 것을 특징으로 한다. 상기의 기존 뼈대체재 제품들은 유기질을 제거하는 과정과 고온처리 과정을 거쳐 생산되는데 반해 본 발명 골이식 대체재는 열처리를 하지 않아 크리스탈의 구조가 변형되지 않고 그 형태가 잘 유지되고 있다는 특성을 가지며, 또한 화학처리 과정을 달리함으로써 신생골의 형성 유도 능력을 극대화시킬 수 있다. 즉, 본 발명에 의한 지방 및 유기질이 제거된 뼈는 무기질만 남게 되는데 이것을 인체의 뼈속에 이식하면 면역반응을 일으키지 않으면서 주변에서 새로운 뼈조직이 쉽게 자라들어올 수 있는 뼈대 역할을 함으로써 신생골의 형성을 촉진시키는 효과가 있다.

따라서, 본 발명은 부작용이 없으면서 생체적합성이 있는 골이식 대체재의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 설명한다.

도 1은 본 발명 골이식 대체재의 제조방법에 의해 제조된 골분말 사진을 나타내고,

도 2 및 3은 본 발명 골분말을 생리식염수를 추출용매로 하여 37℃ 항온수조에서 72시간동안 진탕함으로써 골조직분말 검액을 제조한 후 이식조직에 이식한 후의 조직절편 사진을 나타내는 것이고,

도 4는 골조직분말 검액을 기니-픽의 진피내 주사한 부위를 나타내는 그림이다.

본 발명은 특정한 기술을 이용하여 골분말을 제조하는 단계 및 상기 제조된 골분말의 안전성(급성독성시험, 세포성장저해시험, 이식시험, 감작시험, 무균시험)을 시험하는 단계들로 구성된다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 기술적 요지 및 권리범위내에서 당업자간에 변형이나 회피 실시 또는 균등적 실시가 가능할 수도 있으나 본 발명의 권리범위에 속한다는 것은 당업자에게 명백하게 이해될 것이다.

실시예 1 : 골분말 제조과정(Bone Powdering Procedure)

(1) 생후 1년된 젖소 송아지를 도축하여 얻은 다리뼈를 냉동보관(Deep freezer) 하였다.

(2) 상기 보관중인 다리뼈를 꺼내 골절단기(bone saw)로 치밀골을 제거하고해면골을 약 5mm×5mm×5mm 정도가 되도록 절단하였다.

(3) 골분쇄기(Bone mill)를 이용하여 분쇄하고, 미쇄골분쇄기(micromill)를 1분간 사용하여 미세하게 분쇄하여 골분말을 제조하였다.

(4) 상기 골분말을 1시간씩 3회에 걸쳐 2차 증류수로 세척하였다.

(5) 상기 세척된 골분말을 에테르(ether)로 4시간씩 2회에 걸쳐 지방을 제거하고, 다음 날 아침까지 에테르에 넣어두었다.

(6) 다음날 아침 에테르를 제거하고 후드(hood)내에서 증발 건조시킨 후 크기를 분류하기 위하여 망체로 1.4mm이상/1∼1.4mm/0.6∼1mm/0.425∼0.6mm/0.425이하로 구분하였다.

(7) 우선 0.6∼1mm과 0.425∼0.6mm의 크기로 분류된 골분말을 냉동 보관하고, 원하는 크기(0.6∼1mm/0.425∼0.6mm)이상인 골분말은 다시 미쇄골분쇄기 (micromill)를 1분간 사용하여 미세하게 분쇄하였다.

(8) 상기 (7) 단계에서 다시 분쇄된 골분말을 에테르로 4시간씩 2회에 걸쳐 지방을 제거하고, 다음 날 아침까지 에테르에 넣어두었다.

(9) 다음날 아침 에테르를 제거하고 후드내에서 증발 건조시킨 후 망체로 크기를 구분하였다.

(10) 크기별로 골분말을 모아 에탄올로 1시간씩 2회 세척하여 에테르를 제거하였다.

(11) 골분말을 1시간씩 3회 2차 증류수로 세척하였다.

(12) 골분말을 0.5% NaOCl로 1시간씩 2회 처리하였다.

(13) 골분말을 3.5% H₂O₂로 1시간씩 2회 처리하고 하룻밤 동안 3.5% H₂O₂에 넣어두었다.

(14) 처리가 끝난 골분말을 2차 증류수를 이용하여 3일 동안 세척하였다.

(15) 세척이 끝난 후 물기를 제거하고 초저온 냉동고에서 동결시킨 후 동결건조기(freeze drier)를 이용하여 동결건조시켰다.

상기 과정에 의해 제조한 골분말 사진을 도 1에 나타내었다.

실시예 2 : 골분말의 안전성 검사

상기 실시예 1에서 제조된 골분말의 안전성을 검사하기 위하여 다음과 같은 시험을 실행하였다.

시험예 1 : 급성독성시험

제조한 골조직 분말(20%)을 마우스 꼬리 정맥에 0.15 ml씩 주사한 후 시간경과에 따른 치사률과 이상 행동 변화를 관찰하여 골분말의 급성 및 아급성독성을 확인하였다. 급성 독성실험은 ASTM F750, 아급성 독성실험은 OECD Guideline No. 409에 따라 마우스에 정맥 주사하였다.

시 료

제조한 골조직 분말을 분말 4 g 당 20 ml의 생리식염수를 추출용매로 하여37℃ 항온수조에서 72시간 동안 진탕함으로써 골조직 분말의 검액을 만들었다.

실험군

생리식염수를 비클(vehicle)로 하여 체중 약 30g의 균일계 수컷 마우스 5마리씩을 한군으로 하여 생리식염수(대조군) 또는 검액을 주사한 다음 주사직후, 주사후 1시간, 3시간, 24시간(급성), 48시간, 72시간, 및 7일(아급성)후 관찰하였다.

실험방법

마우스 꼬리 정맥을 통하여 생리식염수나 검액을 체중 1kg당 5ml의 비율로, 즉 0.15ml씩 주사한 후 각 시간별로 나타나는 치사률과 행동의 변화(자율운동성, 공격성, 비정형성 운동, 수면이상)와 같은 독성 작용이 나타나는지 대조군과 비교하였다.

주사직후와 주사 후 1, 3, 24, 48, 72시간 및 7일에 관찰한 결과 사망하거나 행동의 변화를 보인 마우스는 한 마리도 없는 것으로 관찰되었다.

주사결과(○ : 생존, X : 사망)

개 체실 험 군	1	2	3	4	5
대조군	○	○	○	○	○
주사직후	○	○	○	○	○
주사후 1시간	○	○	○	○	○
주사후 3시간	○	○	○	○	○
주사후 24시간	○	○	○	○	○
주사후 48시간	○	○	○	○	○
주사후 72시간	○	○	○	○	○
주사후 7일	○	○	○	○	○

이상의 실험결과 본 발명 골분말 추출액은 실험에 사용한 동물에 대해 급성 및 아급성 독성을 나타내지 않았다.

시험예 2 : 배양세포의 증식저해시험

골조직 분말의 추출용매가 포함된 세포배양액으로 세포를 배양하여 골조직 분말의 추출용매가 세포증식 및 억제에 미치는 영향을 관찰하여 본 발명 골분말의 안정성을 검사하고자 시험을 시행하였다.

시험재료

마우스의 결합조직으로부터 분리된 섬유모세포주인 ATCC 분류 CCL 1인 L929세포를 사용하였으며 통상적인 방법에 의해 10% FBS가 포함된 최소 필수 배지(MEM)에서 배양하였다. 세포는 75 ㎠ 배양 플라스크에서 배양하였으며 배양액은 일주일에 2회 교환하고 세포가 단층을 이룬 후 1 : 10으로 계대배양하였다. 배양시 온도는 37℃, 습도는 95%를 유지하였고 계속하여 5% CO₂와 95% 공기를 공급하였다.

시험방법

(1) 제조한 골조직 분말을 분말 4g당 20ml의 증류수를 추출용매로 하여 37'C 항온수조에서 72시간 동안 진탕함으로써 골조직 분말의 검액을 만들었다.

(2) 배양세포의 증식저해 시험을 위해 사용한 세포는 흰쥐의 섬유아세포로써 독성시험에 가장 적합한 L929세포를 사용하였으며 10% 우혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 최소필수배지(MEM)로 세포 배양을 수행하였다.

(3) 세포배양 플라스크에 단층배양중인 세포를 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)로 처리하여 세포를 수집 한 헤마토사이토메터(hemocytometer)로 세포수를 계측한 다음 배양액 ml당 10⁶개의 세포가 되도록 세포현탁액을 만들었다.

(4) 추출액과 2배 농도의 배양액을 동량 혼합하여 추출액 처리 배양액으로 하였으며, 증류수와 2배 농도의 배양액을 동량 혼합하여 대조배양액으로 하였다.

(5) 세포현탁액 0.2ml(2 x 10⁵개 세포)씩을 15개의 시험관에 넣고 그 중 5개(처리군)에는 추출액 처리 배양액을 2ml 씩을 넣었으며 다른 10개(반응개시시의 대조군 및 72시간 대조군)의 시험관에는 대조배양액 2ml씩을 넣었다.

(6) 대조배양액을 넣은 시험관 중 5개를 원심분리하여 배양액을 제거한 후 세포를 pH 7.0의 인산완충 생리식염수로 재현탁시켰다.

(7) 이 현탁액을 다시 두 번 원심분리하여 세포를 씻은 다음 4'C에서 보존하여 반응개시시의 대조군으로 하였다.

(8) 처리군 및 72시간 대조군의 10개 시험관내의 세포들을 24-웰 배양 플라스크로 옮긴 후 5% 탄산가스 배양장치를 써서 72시간 동안 세포배양을 수행하였다.

(9) 배양후 세포를 수집하였고 pH 7.0 인산완충 생리식염수 2ml로 세포를 세 번 씻어낸 다음 처리군 및 72시간 대조군으로 하였다.

(10) 대조군 및 처리군의 세포를 파괴한 후 총 단백질 함량을 로우리(Lowry) 변법으로 측정하였다. 각 군의 총 단백질 양을 측정하고 각 군의 평균흡광도를 구한 후 세포 증식저해율을 다음 식에 의하여 계산하였다.

상기 방법에 의한 시험결과는 다음과 같았다.

· 72시간처리군의평균흡광도 ; 0.745

· 72시간대조군의평균흡광도 ; 0.675

· 반응개시시의평균흡광도 ; 0.301

또한, 상기 식에 의한 세포증식 저해율은 -18.7%로 나타나, 본 발명 뼈대체재는 L292 세포의 세포증식을 저해하지 않을 뿐만 아니라 오히려 약간의 세포증식 촉진 효과가 있는 것으로 추정되었다.

시험예 3 : 이식시험

이식 시험의 목적은 이식한 재료가 생체내에서 주위조직과 어떠한 국소적 반응을 나타내는지를 육안적, 현미경적으로 평가하는 것이었다.

실험동물

250g 내외의 스프라그-도울리(Sprague-Dawley)계의 흰쥐 8마리를 사용하였다. 통상적인 고형사료로 사육하였으며 식수는 무제한 공급하였다.

실험재료

상기 실시예 1의 골분말 처리방법과 동일하게 처리한 망상골 골편을 1mm X 3mm X 10mm 규격으로 제작하고 방사선 멸균소독을 하였다.

실험방법

(1) Ketamine HCl(Ketara 10mg/kg)과 2% Xylazine HCL(Rompun 0.15ml/kg)로 전신마취 시킨 후 등쪽 피부의 털을 제거하고 소독액으로 피부를 소독하였다.

(2) 5mm가량 피부를 절개하고 피하조직을 언더마이닝(undermining)하여 이식골편이 들어갈 위치를 확보한 후 준비해놓은 골편을 절개부위에서 1cm이상 떨어지도록 이식하고 봉합하였다.

(3) 이식 1주, 2주, 4주, 12주에 각각 2마리씩 경부염전으로 희생한 후 즉시 이식 골편을 포함한 주위조직을 채취하여 10% 중성완충 포르말린에 고정하였다.

(4) 2일간 동일 고정액에서 고정한 후 3일간 5%질산으로 탈회하고 이식편의 정중앙에서 2등분하여통법에 따라 ethyl alcohol로 탈수하고 xylene으로 명화한 후 파라핀(paraffin)에 포매하였다.

(5) 상기 포매된 조직은 박절기로 4μm두께의 절편을 얻어 H-E 염색과 고모리(Gomori)의 삼중염색을 시행하였다.

상기 방법에 의한 1주후의 시험결과는 다음과 같았다.

(1) 육안적 판단

특별한 염증소견이 관찰되지 않으며 이식편 주변으로 얇고 투명한 조직에 의해 둘러싸여 있었다.

(2) 광학현미경적 판단

이식된 조직편이 망상골이므로 그 다공성 조직안으로 육아조직성 주위조직들로 싸여져 있었다. 아직 섬유조직은 미약하였으며 혈관과 많은 수의 세포들로 이식체 주변과 내부를 채우고 있었다. 이식편에 근접해서는 일부 다핵거대세포들이 관찰되는 부분도 있었다. 대부분의 이식편들은 표면이 탈회되고 있었으며 조직표본 제작시 질산에 탈회되어 그 크기가 감소되어 있었다.

(3) 시험결과 이식 후 1주에는 육안적으로 염증반응이 없었으며, 조직학적으로 다수의 세포들과 삼출물, 육아조직과 부위에 따라서 섬유조직으로 피개되어 있었다(도 2 및 3).

시험예 4 : 감작시험

본 발명 골분말의 추출액(검액)을 기니-픽(guinea pigs)의 진피내 주사하여 감작시킨 후 패치(patch)를 적용하여 피부감작반응이 유발될 수 있는지 실험함으로서 감작 유발 가능성을 확인하였다.

시 료

제조한 골조직 분말을 분말 4 g 당 20 ml의 생리식염수를 추출용매로 하여 37℃ 항온수조에서 72시간 동안 진탕함으로써 골조직 분말의 검액을 만들었다.

실험동물

몸무게 350∼400 g의 건강한 수컷 기니-픽을 사용하였으며, 실험에 사용하기 1주일전 실험실의 동물장에서 적응시켰다.

실험준비

(1) 실험 전날 검액을 처치할 부분(몸통 또는 옆구리) 부위의 털을 동물용 면도기(animal clipper)로 깨끗이 탈모하였다.

(2) 진피내 주사(intradermal injection) 하는 경우, 각 부위마다 0.1 ml씩 주사하였다.

(3) 검액을 국소적용(topical application) 하는 경우, 여과지(filter paper)를 적당한 크기(2×4 cm)로 잘라 검액에 담가 완전히 적신 후 기니-픽 몸통(등 부위)의 면도한 부위에 붙이고 검액이 증발하지 않도록 그 위에 셀로판지를 덮고 접착테이프로 고정(occlusive dressing)하였다.

예비실험

본 발명에 사용될 검액의 농도를 결정하기 위하여 예비실험을 수행하였다.

(1) 추출된 20% 농도의 검액을 감작반응을 증가시킬 수 있는 물질, 즉 프로인드 아주번트(Freund's complete adjuvant)와 1：1 로 섞어 10% 농도의 검액을 만든 후 이를 각각 10 배씩 희석하여, 즉 10 %, 1 %, 0.1 % 의 검액을 만들어 실험에 이용하였다.

(2) 6 마리의 기니-픽을 2마리씩 3군으로 나누어 각 군에 10%, 1%, 0.1% 의 검액을 진피내 주사하였다.

(3) 상기 3 가지 농도의 검액을 각각 3 마리씩 3 군의 기니-픽의 등에 국소적용하고 24시간 후 접착테이프와 패치(patch)를 제거하였다.

(4) 상기 실험 (2) 및 (3)단계에서 주사 및 적용부위에 나타나는 홍반 (erythema) 및 부종(edema)을 하기 표 2에서와 같은 정도 판정방법에 따라 평가하였다.

(5) 예비실험에서 10%의 검액을 주사한 2 마리와 및 국소적용한 3 마리의 적용부위에 아무런 변화가 나타나지 않았으므로 즉, 그레이트(grade) 0 이었으므로 10% 검액을 본 시험에 이용하였다.

피부반응에 따른 판정기준

반 응	평가(numerical grading)
Erythema and eschar formationNo erythemaSlight erythemaWell-defined erythemaModerate erythemaSevere erythema to slight eschar formationOedema formationNo oedemaSlight oedemaWell-defined oedemaModerate oedemaSevere oedema	0123401234
중요사항1. 피부 부위에 다른 변화들도 기록하고 보고되어야 한다.

상기 방법에 따라 본 실험에 사용될 검액의 농도를 결정하기 위하여 예비실험을 수행한 결과, 예비실험에서 10%, 1%, 및 0.1%의 검액을 주사한 2 마리씩의 각 군과 국소적용한 3 마리씩의 각 군의 적용부위에 아무런 변화가 나타나지 않았으므로 즉, 홍반(erythema) 및 부종(edema)을 표 2에서와 같은 정도 판정방법에 따라 평가하였을 때 그레이트(grade) 0 이었으므로 가장 높은 농도인 10% 검액을 본 실험에 이용하는 것으로 결정하였다.

본 실험

실험군으로 10마리의 기니-픽을 대조군으로 5마리의 기니-픽을 사용하였다.

(1) Intradermal induction phase

도 4와 같이 면도한 각각의 기니-픽의 양쪽 견갑골 사이에 위치한 주사부위(a, b, c)에 다음 각각의 약물들을 0.1 ml씩 진피내 주사하였다.

A. Freund's complete adjuvant와 주사용 증류수를 50:50(v/v)으로 혼합한 용액을 주사.

B. 실험군에는 10%의 검액만을 주사하고, 대조군에는 생리적 식염수만을 주사.

C. 실험군에는 10%의 검액과 Freund's complete adjuvant를 50:50(v/v)으로 혼합한 용액들을 주사하고, 대조군에는 생리적 식염수와 Freund's complete adjuvant를 50:50(v/v)으로 섞은 용액들을 주사.

상기 방법에 따라 도 1과 같이 면도한 각각의 기니-픽의 견갑골 사이에 순서대로(a, b, c)에 상기 각각의 약물들(A, B, C)을 0.1 ml씩 양쪽에 대칭으로 진피내 주사한 결과, 주사 후 15마리 모두에서 어떠한 염증반응도 보이지 않았다.

(2) Topical induction phase

상기 intradermal induction phase 반응 검사가 끝난지 7일 후, 각각의 동물의 견갑골에 진피내 주사 부위가 모두 포함되도록 20 mm X 40 mm크기의 여과지에 10% 검액을 흠뻑 적신 다음 적용하고 증발하지 않도록 드레싱 (occlusive dressing)을 한다. 48 ± 2 시간에 드레싱(dressing) 및 패치(patches)를 제거하고 반응을 관찰하였다. 대조군에서는 검액 대신 생리적 식염수 만을 사용하며 다른 처치과정은 동일하였다.

상기 과정에 따라 반응을 관찰한 결과 A에서는 20 부위 중 2, B에서는 20 부위 중 2, C에서는 20 부위 중 3군데에서 grade 1의 부종이 보였으며 홍반을 보인 부위는 없었다. 대조군에서는 검액 대신 생리적 식염수를 사용하였으며 드레싱 및 패치를 제거하고 반응을 관찰한 결과 A에서는 10 부위 중 2, B에서는 10 부위 중 1, C에서는 10 부위 중 2군데에서 그레이드 1의 부종이 관찰되었으나 홍반을 보인 부위는 없었다. 상기 결과는 본 검체에 의하여 topical induction phase에서 감작반응이 유발되지 않았음을 의미하는 것으로 판단되었다.

(3) Challenge phase

상기 topical induction phase 반응 검사가 끝난지 14일 후 실험에 사용한 모든 실험군과 대조군에 대하여 본 검사를 실시하였다. 10% 검액을 각각의 동물의 옆구리에 0.1 ml씩 주사한 후 10% 검액을 적신 패치를 붙이고 드레싱(occlusive dressings)을 시행하였다. 24 ± 2 시간 경과한 다음 드레싱 및 패치를 떼어내고 결과를 관찰하였다.

상기 과정에 따라 관찰한 결과 15마리의 동물 모두에서 어떠한 홍반이나 부종도 유도되지 않았다. 따라서 실험에 사용된 검액에 의하여 challenge phase에서도 아무런 감작반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.

이상의 시험과정의 결과로부터 Intradermal induction phase에서 실험군 및 대조군 15 마리 모두에서 홍반과 부종같은 어떠한 종류의 염증반응도 보이지 않았으며, topical induction phase에서는 일부에서 grade 1의 부종이 보였으나 대조군들과 비교할 때 검액에 의한 감작 반응이라고 할 수 없었으며, Challenge phase에서도 15마리의 동물 모두에서 어떠한 홍반이나 부종도 유도되지 않았다. 따라서 본 실험과 같은 maximization sensitization test에서도 사용된 검액에 의하여 intradermal induction phase, topical induction phase, 및 challenge phase에서 감작반응이 나타나지 않으므로 이 물질에 의한 감작반응의 유발 가능성은 거의 없다고 할 수 있다.

시험예 5 : 무균시험

제품의 생물학적 안정성, 유효성 확인을 위한 시험으로 다음의 배양법으로 증식되는 미생물(세균, 진균)의 유무를 확인하기 위해 본 시험을 실시하였다. 본 시험은 대한약전(제 6 개정) 일반 시험법의 무균 시험법에 따라 세균 및 진균시험을 직전법으로 수행하였다.

사용균주

본 시험에 사용한 세균은 대장균(E. coliDH5α)을 사용하였고 진균은 글루코-펩톤(Glu-peptone) 배지를 공기중에 직접 방치하여 여러 곰팡이들을 직접 배양하여 사용하였다(표 3).

사용 미생물 균주

Strain Description Source

E. coliDH5αsupE44 supF58 hsdS3(r ^- _B m ^- _B )(Φ80lacZ△M15)StratagenehsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1

사용 배지 및 시약

본 시험에 사용한 배지 및 그 조성은 표 4와 같았다. 세균을 검출하기 위한 무균 시험용 치오글리콜산 배지(Brewe Thioglycollate Medium)는 물 200 m에 Beef. Infusion, Sodium Chloride, Dipotassium Phosphate, Protease Peptone, Bacto Dextrose, Bacto Agar, Bacto Methlene Blue를 넣고 수욕상에서 가온하여 녹인 다음 Sodium Thioglycollate을 넣어 녹인 후 Test tube ( 25×200mm )에 각각 40 ml 씩 나누어 넣고 고압증기멸균기를 써서 121℃에서 20 분간 가열하여 멸균한 다음 곧 상온에서 식힌 다음 본 시험에 사용하였다. 진균 검출을 위한 무균시험용 포도당·펩톤배지는 물 200 ml에 KH₂PO₄, MgSO₄,, Peptone, Yeast extract 및 포도당을 넣고 수욕상에서 가온하여 녹인 후에 Test tube( 25×200mm )에 각각 15 ml 씩 나누어 넣고 고압증기멸균기를 써서 121℃에서 20분간 가열하여 멸균한 다음 곧 상온에서 식힌 다음 본 시험에 사용하였다.

배지의 화학적 조성

무균시험용 치오글리콜산배지 (Brewe Thioglycollate Medium)Beef. Infusion 500gSodium Chloride, 5.0gDipotassium Phosphate 2.0gProtease Peptone, 10gBacto Dextrose 3.0gBacto Agar 0.5gBacto Methlene Blue 0.002gSodium Thioglycollate 0.5gD.W 1L무균시험용 포도당·펩톤배지KH₂PO₄1.0gMgSO₄0.5gPeptone, 5.0gYeast extract 2.0gGlucose 20.0gD.W 1L

배지의 성능시험

본 시험에 사용한 무균시험용 치오글리콜산배지(Brewe Thioglycollate Medium)는 30℃에서 5일간, 무균시험용 포도당·펩톤배지는 25℃에서 13일간 보존 한 뒤 혼탁, 침전물의 생성 또는 기타의 이상이 나타나지 않았음을 확인 후 사용하였고, 또 배지가 미생물의 발육에 만족할 만한 상태에 있는가를 시험하기 위하여 본 시험에 사용한 배지의 일부를 취하여 무균시험용 치오글리콜산배지(Brewe Thioglycollate Medium)에는 대장균(E. coliDH5α)을 접종하여 뚜렷하게 발육하는 것을 확인하였고, 포도당·펩톤배지는 직접 공기중에 방치하여 여러 곰팡이들이 발육하는 것을 확인하였다.

검액의 조제 및 조작

본 시험에 사용된 검체는 입자의 크기가 0.425∼0.524 mm인 고형 물질로 일부는 멸균된 증류수에 1%가 되도록 현탁하여 표 5과 같이 배지에 넣어 검액으로 사용하였고(시험관 번호 3∼5번, 9번), 일부는 시험용 배지에 검체를 0.4 g씩 직접 넣어서 시험을 수행하였다(시험관 번호 6, 7, 10번). 본 시험의 전 과정은 무균조작으로 수행하였다.

시험물질의 사용부피

표시량	채취량	세 균 시 험	진 균 시 험
		1 시험관당	시험관의갯 수	1 시험관당	시험관의갯 수
		검체의채취량	시험관의갯 수	배지의 양	시험관의갯 수	검체의채치량	배지의 양
1g 이상	약 1 g	5 ml	40 ml	2	2 ml	15 ml	5

배 양

검액은 배지와 잘 섞고 세균시험은 30℃에서 10 일간, 진균시험은 25℃에서 13일간 배양하였다. 그리고 진균시험에서 25mm X 200mm 시험관을 사용하였기 때문에 수평면에 대하여 각도 20∼30°의 경사를 유지한 상태로 배양하였다.

검액을 배양한 후 배지성능시험용 시험관(2번과 8번)을 제외한 모든 시험관에서 균이 발육되지 않았다(표 6).

시험결과

	진 균 시 험	세 균 시 험
시험관 번호	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
판 정	X	0	X	X	X	X	X	0	X	X

1번 시험관: 배지 성능시험용

2번 시험관: 배지 성능시험용(공기 중에 방치)

3 - 7번 시험관: 시험용

8번 시험관: 배지 성능시험용(E.coli를 접종한 배지)

9 - 10번 시험관: 시험용

제품의 생물학적 안정성, 유효성 확인을 위한 시험으로 미생물(세균, 진균)의 유무의 확인을 위하여 수행한 본 실험에서 다음과 같은 결론을 얻었다.

a. 검체에서 세균이 발육하지 않았다.

b. 검체에서 진균이 발육하지 않았다.

따라서 무균 시험방법에 따라 시험할 때 이에 적합하다는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 처리방법에 의해 제조된 골이식 대체재는 지방 및 유기질이 제거되고 무기질만 남게 되고, 생체적합성이 있어 생체의 뼈속에 이식하면 면역반응을 일으키지 않으면서 주변에서 새로운 뼈조직이 쉽게 자라들어올 수 있는 뼈대 역할을 함으로써 신생골의 형성을 촉진시키는 효과가 있다

Claims

골이식 대체재의 제조방법에 있어서,

(a) 동물 뼈의 치밀골을 제거하고 해면골을 절단하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 해면골을 미세하게 분쇄하여 골분말을 제조하는 단계;

(c) 상기 (b)단계에 의해 제조된 골분말을 증류수로 세척하는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 세척된 골분말을 에테르로 지방을 제거하는 단계;

(e) 상기 (d)단계의 골분말로부터 에테르를 증발 건조시킨 후 망체로 1.4mm이상/1∼1.4mm/0.6∼1mm/0.425∼0.6mm/0.425이하로 크기별로 분류하는 단계;

(f) 크기(0.6∼1mm/0.425∼0.6mm)이상인 골분말은 미세분쇄하는 단계;

(g) 상기 (f) 단계의 분쇄된 골분말을 에테르로 지방을 제거하는 단계;

(h) 상기 (g)단계의 에테르를 증발 건조시킨 후 망체로 크기별로 분류하는 단계;

(i) 상기 (h)단계의 크기별로 분류한 골분말을 모아 에탄올로 세척하여 에테르를 제거하는 단계;

(j) 상기 (i)단계의 골분말을 증류수로 세척하는 단계;

(k) 상기 (j)단계의 골분말을 0.5% NaOCl로 처리하는 단계;

(l) 상기 (k)단계의 골분말을 3.5% H₂O₂로 처리하고 12∼16 시간동안 3.5% H₂O₂에 침지시켜두는 단계;

(m) 상기 (l)단계의 처리가 끝난 골분말을 증류수를 이용하여 세척하는 단계; 및

(n) 상기 (m)단계의 세척이 끝난 후 물기를 제거하고 동결건조시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 골이식 대체재의 제조방법.
상기 제2항의 제조방법에 의해 제조된 골이식 대체재.