KR100294728B1 - 고순도의니임종자추출물의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아자디라크틴을 함유하는 니임 종자 추출물의 수용성 용액을 거대다공성 흡착제로 흡착시킨 다음, 용매를 사용하여 탈착시키는 고순도 니임 종자 추출물을 제조하는 새로운 방법을 개발한 것이다. 임의로 제형화한, 얻어진 추출물은 잎에 기생하는 해충의 박멸에 유용한 살충제가 된다.

Description

[발명의 명칭]

고순도의 니임종자 추출물의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 니임 나무(Azadirachta indica Juss.)의 종자로부터 살충성 물질을 추출하고 정제하는 신규한 방법과, 이러한 추출물을 함유하는 조성물 및 이들의 살충제로서의 사용용도에 관한 것이다.

식물 및 포유동물에 대해 바람직한 낮은 독성과 우수한 살충작용을 겸비한 조성물에 대한 연구가 계속되어 오고 있는데, 이는 해충이, 많은 공지된 살충제에 대해 내성을 갖고 있어, 더 높은 살충작용과, 더 우수한 선택성, 낮은 환경오염, 저렴한 생산비 및 효율성을 발휘하는 화합물이 요구되고 있기 때문이다.

유명한 의료적 또는 살충적 특성으로 인하여 인도에서는 니임(또는 님)나무의 여러부분이 이용되고 있다. 이 아열대 나무의 원산지는 인도, 파키스탄, 스리랑카와 동남아시아 및 아프리카 일부의 건조한 지역이다.

니임 나무의 모든 부분이 페스트와 각종 질병에 대한 천연적인 내성을 지니고 있는 것으로 알려져 있는데, 특히 종자가 가장 내성이 큰 것으로 알려져 있다. 상기한 종자의 제제 및 추출물은 작물해충, 예를들어 집시 모스(gypsy moths), 재패니스 비틀즈(Japanese beetles), 아피드(aphids), 토바코 머드웜(tobacco budworms) 및 볼 위빌(boll weevils)에 대해 살충효과가 있는 것으로 알려져 있다(참조. Chem. and Engineering News, May 27, 1985. pp.46 - 51 및 U.S. Dep. Agric., Agric. Rev. Man., ARM - NE - 4]. 니임 종자 추출물은 광범위 살충제로 인정되어 있다.

아자디라크틴 및 기타 살충적으로 활성을 갖는 니임종자 성분들은 물, 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성용매를 사용하여 분쇄한 니임 종자에서 추출할 수 있다. 상기한 추출물에는 아자디라크틴이, 전형적으로 건조중량기준, 5% 미만으로 함유되게 된다. 그러나, 활성 성분들의 분해로 인해, 상기한 추출물의 살충제로서의 효능은 급격히 감소된다. 따라서, 상기한 니임 종자 추출물의 유용한 식물 보호 물질로서의 실용성은 상당히 제한이 된다.

미국 특허 제4,556,562호에 기술된 바와 같이, 장기간 저장 안정성은 불순한 추출물을 전형적으로 약 0.3%의 아자디라크틴을 함유하는 묽은 알콜 용액으로 제제하고, 이 추출물의 pH를 약 3.5 내지 6으로 조정함으로써 성취할 수 있다. 이와달리, 미국 특허 제4,946,681호에 기술된 바와 같이, 알콜성 니임 종자 추출물에서 분자체로 물을 제거시켜 이 추출물을 안정화하는 방법도 공개되어 있다.

전형적으로 10 내지 100%의 아자디라크틴을 함유하는, 고순도의 추출물을 얻는 여러가지 방법이 공지되어 있다. 이들 방법의 공통적인 특징은 메탄올과 같은, 극성 유기용매를 사용하여 불순한 추출물을 얻고, 이 추출물로부터 액체 - 액체 추출단계, 상분리단계, 용매 제거단계 및 때로는 실리카 겔상에서의 크로마토그래피를 포함하는 연속적인 공정단계로 아자디라크틴을 분리하는 것이다. 전형적으로, 트리글리세라이드와 같은 대부분의 소수성 불순물들은 50 내지 100% 수성 메탄올에 용해한 무수의 불순한 추출물 또는 불순한 추출물을 헥산과 같은 비극성 용매로 추출하여 제거한다[참조: Journal of Liquid Chromatography, 10(6), 1151(1987)]. 이 공정을 거친 다음, 추출물을 물과, 에틸 아세테이트와 같은 물과 혼화하지 않는 극성 유기용매로 처리하고, 유기 용매층을 제거하여, 전형적으로 아자디라크틴 15 내지 25% 미만을 함유하고, 제한된 저장안정성을 갖는, 반 - 순수 추출물을 얻는다. 높은 순도의 아자디라크틴의 조성물을 얻기 위해서는, 전형적으로 플로라실, 실리카겔 상에서의 크로마토그래피 등이 필요하다.

이러한 공지 방법은 규모를 크게 하는 경우, 회수되는 아자디라크틴의 양에 비해 다량의 가연성 용매를 취급해야 하므로 실용적이지 못하고 비용이 많이 든다. 또한 이러한 문제점들을 가중시키는 것은 상기한 추출물중에서 아자디라크틴이 신속하게 분해되는 것을 방지하기 위해 많은 불순물을 수반하는 메탄올 추출물과 같은 극성 유기용매를 연이어서 분리시켜야 한다는 것이다.

알콜 추출용매를 물로 대체할 경우, 많은 소수성 불순물이 추출될 가능성은 크게 감소될 수 있으며, 이밖에도 가연성 문제도 배제될 수 있다. 그러나, 물이 분쇄된 니임 종자로부터 아자디라크틴을 추출할 수 있는 능력을 갖고 있다는 것이 알려져 있음에도 불구하고, 이러한 사실의 잇점을 채택한 추출방법은 공개된 바가 없다. 이러한 이유는 추출된 니임 케이크로부터 청정한 수용성 추출물을 분리하는데 있어서 통상적으로 사용되는 여과법으로 수행할 경우, 분리가 매우 느리게 되기 때문이다. 또한, 에틸 아세테이트와 같은 극성 유기용매로 수용성 여액으로부터 아자디라크틴을 추출하기 위해 모든 시도를 하였으나, 분리가 어려운 안정한 에멀죤의 형성으로, 실패하였다.

따라서, 아자디라크틴이 15% 이상의 농도로 존재하는 용매 비함유 조성물을 얻을 수 있는 실용적이고, 대규모로 실시할 수 있으며 또한 경제적인 방법이 요청되었다. 그러한 조성물은 광범위한 살충성 적용분야에 사용될 수 있고, 필요시, 간단한 화학적 방법으로 더욱 안정화시킬 수 있을 정도의 충분한 안정성을 지녀야 한다.

본 발명자들은 수용성 또는 알콜성 니임 추출물을 거대다공성 중합체 흡착제로 흡착시킨 후, 이어서 용매로 탈착시키는 방법이 실용적이고도 대규모로 실시할 수 있으며 또한 경제적으로 아자디라크틴을 15% 이상의 농도로 함유하는 용매 비함유 조성물을 얻을 수 있는 방법이라는 것을 알게 되었다.

분쇄된 니임 종자 또는 오일을 제거한 니임 케이크를 물과 교반한 다음, 원심분리에 의해 액체층을 분리시켜 아자디라크틴을 함유하는 니임 종자로부터 청정한 수용성 추출물을 얻을 수 있다. 상기 청정한 수용성 추출물로부터, 청정한 수용성 니임 종자 추출물을 거대다공성 중합체 흡착제와 접촉반응시켜 아자디라크틴이 풍부한 획분을 얻을 수 있다. 본원에서 사용되는 거대다공성 중합체 흡착제는 마이쯔너(Meitzner)등의 미국특허 제4,256,840호에 기술되어 있는 바와 같은, 침전제 존재하에 공지방법으로 제조된 거대다공성 또는 거대망상 코폴리머 및 미국특허 제3,122,514호에 기술된 방법과 같은, 다른 방법으로 큰 기공을 도입시킨 코폴리머가 포함된다. 거대다공성 중합체 흡착제의 예로는 디비닐벤젠으로부터 얻는 폴리머, 디비닐벤젠/스티렌 코폴리머, 아크릴(에스테르) 폴리머, 페놀/ 포름알데히드 코폴리머등이 포함된다. 그후, 아자디라크틴 함유 추출물은, 알콜(예. 메탄올), 에스테르(예. 에틸 아세테이트), 케톤(예. 메틸 이소부틸 케톤), 기타 극성 유기 용매, 예를들어 N,N - 디메틸포름아미드(DMF) 및 디메틸술폭시드(DMSO), 방향족 탄화수소, 예를들어 톨루엔, 물 및 이의 혼합물과 같은 용매로 수지로부터 탈착시킨다. 이 방법에 의해 아자디라크틴 15% 이상을 함유하는 추출물이 얻어진다.

바람직한 탈착용매는 알콜, 에스테르 또는 케톤 및 이의 혼합물이다. 더욱 바람직한 용매는 에틸 아세테이트이다.

컬럼 방법을 사용할 경우, 컬럼은 물 약 20 내지 약 25컬럼 용적을 시간당 약 6컬럼 용적의 속도로 컬럼에 통과시켜 재생시킴으로써 탈착용매를 제거할 수 있다. 예컨데, 에틸 아세테이트를 탈착 용매로 사용할 경우, 이 재생 과정에 의해 물 세정액중 에틸 아세테이트 함량은 100ppm 미만이 되며, 이 함량은 공정을 새로 시작할 수 있을 정도의 충분히 낮은 양이다.

특히, 으깬 니임 종자로부터 오일을 기계적으로 추출하여 얻은 니임 케이크를 분쇄하고 물을, 중량/중량(w/w)기준으로, 약 1/6케이크/물의 비율로 첨가하여 함께 교반한 다음, 원심분리에 의해 무거운 고체층(습윤 케이크)으로부터 가벼운 액체층을 분리할 수 있다. 습윤 케이크는 약 1/3습윤 케이크/물(w/w)의 비율로 물을 추가하여 재슬러리화하고 가벼운 액체층은 상기에서와 같이 분리할 수 있다. 합한 청정 수(水) 추출물, 전형적으로 ℓ당 아자디라크틴 0.6g 미만을 함유하는 추출물을 거대다공성 중합체 흡착제, 예를들어 앰버라이트 XAD - 16 수지, 앰버라이트 XAD - 4 수지, 앰버크롬 CG - 161 수지 및 앰버크롬 CG - 162 수지와 같은 중합체 디비닐벤젠으로 구성된 수지, 앰버라이트 XAD - 2 수지 및 듀오라이트 XAD - 861 수지와 같은 디비닐벤젠/스티렌 코폴리머, 앰버라이트 XAD - 7 수지 및 앰버크롬 CG - 71 수지와 같은 아크릴(에스테르)폴리머, 듀오라이트 XAD - 761 수지와 같은 페놀/포름알데히드 코폴리머 등으로 충전한 컬럼을 시간당 약 10컬럼 용적의 속도로 수지가 아자디라크틴으로 포화되는데 필요로 하는 만큼, 통과시킬 수 있다. 예를들어, 앰버라이트 XAD - 16 수지 1ℓ은 아자디라크틴 약 20 내지 40g을 흡착할 수 있다. 수지를 포화시킨 다음, 에틸 아세테이트와 같은 용매 약 3 컬럼용적을 시간당 약 3컬럼 용적의 속도로 수지에 통과시킨다. 용매층은 필요시 건조하고, 감압하에 용매를 제거하여 아자디라크틴이 15% 이상의 농도로 존재하는 아자디라크틴 - 풍부 추출물을 얻는다.

필요에 따라, 얻어진 아자디라크틴 - 풍부 추출물의 안정성은 과산화수소의 알칼리용액, 알킬 퍼옥시드, 예를 들면 디 - n - 부틸 퍼옥시드, 산 퍼옥시드, 예를 들면 과벤조산, 나트륨 퍼카보네이트 등과 같은 온화한 산화제로 더욱 처리하여 향상시킬 수 있다. 이 반응에 바람직한 용매는 에틸 아세테이트 또는 부틸 아세테이트와 같은 극성 유기용매이다. 바람직한 산화제는 과산화수소이다. 과산화수소와 함께 사용되는 바람직한 염기는 포화 중탄산나트륨 용액이다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 이 기술분야에서 공지된 바와 같이 니임 종자로부터 얻는 불순한 메탄올성 추출물을 최종비율이 용적/용적(v/v)기준으로 약 55/45 물/메탄올 내지 약 95/5 물/메탄올(v/v), 바람직하기는 약 65/35 물/메탄올(v/v)기준이 되도록 물로 희석한다. 청정한 액체층은 중합체 수지, 예를들어 앰버라이트 XAD - 16 수지와 같은 중합체 디비닐벤젠으로 이루어지는 수지로 충전한 컬럼에 통과시키고 상기에서와 같이 컬럼으로 추출물을 탈착시킨다. 필요한 경우, 얻어진 아자디라크틴 - 풍부 추출물의 안정성은 상기한 바와 같은 완화한 산화제로 더욱 처리하여 향상시킬 수 있다.

얻어진 추출물은 아자디라크틴 약 1% 내지 약 80%, 일반적으로 약 15% 내지 45%를 함유한다.

얻어진 본 발명의 추출물은 또한 제형 및 조성물의 제조시에 유리하게 사용된다. 조성물 및 제형의 제법에 대한 예는 문헌[American Chemical Society Publication “살충성 제제에 대한 연구”(1969), Advances in Chemistry Series, 86 및 “살충제 제형”(1973), Wade Van Valkenburg editor]에서 찾아볼 수 있다. 이들 조성물 및 제형에 있어서, 활성 물질을 통상의 농경학적으로 허용되는(즉, 식물과 양립할 수 있는 및/또는 살충적으로 불활성인) 불활성 희석제 또는 이 기술분야에서 공지되어 있는 것과 같은, 통상의 조성물 또는 제형에 사용가능한 고체 형태의 중량제와 혼합한다. 필요시, 계면활성제, 안정화제, 소포제 및 편류방지제와 같은 보조제를 첨가할 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물 및 제형의 예로는 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있는 것으로, 수용성용액 및 분산액, 오일성 용액 및 오일분산액, 페이스트, 분진성 분말, 습윤성 분말, 유화가능한 농축물, 유동물, 과립, 유인제, 전화(invert)에멀젼, 에어로졸 조성물 및 훈증용 캔들(candles)이 포함된다.

본 조성물 및 제형은 이 기술분야에서 공지된 방법으로 제조한다. 예를들면, 활성 화합물은 통상의 분산가능한 액체 희석제 담체 및/또는 분산가능한 고체 담체로 증량시킬 수 있다. 필요시, 유화제 및/또는 분산제를 포함하여 통상의 계면활성제와 같은 담체 비히클 보조제를 사용할 수 있으며, 물을 희석제로서 사용하는 경우, 유기용매를 보조용매로서 첨가할 수 있다.

카복시메틸 셀룰로스 및 천연 및 합성 폴리머, 예를 들면 아라비아검, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 셀룰로스 및 폴리비닐 아세테이트와 같은 접착제를 분말, 과립 또는 격자형태로 제형에 사용하여 살충제의 부착성을 향상시킬 수 있다. 또한 칼슘 스테아레이트 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제를 습윤가능한 분말 또는 과립으로 만든 혼합물에 가할 수 있다.

본 발명의 추출물은 단독으로 및/또는 상기한 고체 및/또는 액체 분산가능한 담체 비히클과 및/또는 다른 공지된 양립성 활성제, 특히 살충제, 살 절지동물제, 살선충제, 살진균제, 살균제, 살서제, 제초제, 비료, 생장 - 조절제, 상승제등과, 필요에 따라 특수 용도에 적합하게 만든 각 투여제제의 형태, 즉 즉시 사용할 수 있는 용액, 유탁액, 현탁액, 분말, 페이스트 및 과립형태로 사용할 수 있다.

시판용 제제에 있어서, 이들은 일반적으로 안정화된 추출물이 혼합물중 0.1중량% 내지 99중량%로, 바람직하기는 약 1중량% 내지 75중량%의 양으로 함유되는 담체 조성물 혼합물이다.

제형중 어떤 것은 제형된 형태중의 아자디라크틴에 안정화 효과를 부여할 수 있는데, 그것은 아마도 분산성과 습도, 햇빛 등으로부터의 보호에 기인하는 것으로 보인다.

추출물의 제형은 통상의 대용량 유압식 스프레이, 저용량 스프레이, 초 저용량 스프레이, 공기분사식 스프레이, 공중살포 및 산포와 같은 통상적으로 사용되는 방법으로 스프레이하여 살포할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 안정화된 추출물 단독으로 상응하는 박멸 또는 독성의 양(즉, 해충 구제 또는 살충적으로 유효한 양)과, 또는 상기한 담체 비히클(조성물 또는 제형)과 함께 해충에 접촉시키는 것을 특징으로 하여 해충을 선택적으로 죽이거나, 박멸하거나 또는 구제하는 방법도 포함한다. 본원에서 사용되는 “접촉”이란 용어는 (a) 상기한 해충 및 (b) 이러한 해충의 서식처(즉, 보호시킬 장소, 예를 들면 자라고 있는 작물 또는 작물이 자라고 있는 지역)중 적어도 하나에 본 발명의 활성 화합물을 단독으로, 조성물 또는 제형의 한 성분으로서 또는 다른 살충제 또는 살진균제를 함유하는 조성물 또는 제형의 한 성분으로서 살포하는 것으로 이해하여야 한다.

담체 비히클에 혼합하여 사용되는 각 추출물의 농도는 사용되는 장치의 형태, 적용방법, 처리할 지역, 박멸할 해충의 종류 및 감염정도와 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 것은 잘 알 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 제제는 상기한 성분들 이외에, 이러한 종류의 제제에 통상적으로 사용되는 다른 물질도 함유할 수 있다.

다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다. 모든 부 및 퍼센트는 달리 언급하지 않는한, 중량부 및 중량 퍼센트이다.

[실시예 1]

[추출물 1(40% 아자디라크틴)]

니임 종자, 1282kg을 부분적으로 껍질을 벗기고, 기계적 오일 추출을 포함하는 표준 방법으로 오일을 제거하였다. 오일을 제거한 니임 케이크 586kg을 물 3150kg중에서 분쇄하고 습윤케이크를 원심분리에 의한 침강에 의해 분리시켰다. 습윤케이크를 물 2100kg으로 재슬러리하고 분리과정을 반복하였다. 합한 액체층 3618kg을 여과하여 더욱 청정화시키고, 앰버라이트 XAD - 16 60ℓ를 함유하는 스테인레스 강제 컬럼을 통해 600kg/시간의 속도로 통과시켰다. 이어서 컬럼내의 수지를 에틸 아세테이트 180ℓ로 세정하고 생성된 에틸 아세테이트 층을 감압하에 농축하여 25kg을 얻었다. 에틸 아세테이트 농축물을 포화 중탄산 나트륨 수용액 10kg 및 30% 과산화수소수 300㎖와 55℃에서 20분간 교반하였다. 상부 유기층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조하고 여과한 후, 에틸 아세테이트를 제거하여 아자디라크틴 40%를 함유하는 추출물 1 4.25kg을 얻었다.

[실시예 2]

[추출물 2(27% 아자디라크틴)]

오일이 제거된 니임 케이크 200kg을 메탄올 200㎖씩을 새로 가하여 연속적으로 3회 추출하여 아자디라크틴을 함유하는, 불순한 메탄올 추출물 144kg을 제조하였다. 메탄올 추출물을 합하고 일부는 제거하였다. 얻어진 이 농축물에, 물 280kg을 가하고, 생성된 침전물을 제거한 후, 수성 메탄올 추출물을 앰버라이트 XAD - 16 수지 30ℓ을 함유하는 컬럼을 통해 분당 2ℓ의 속도로 통과시켰다. 그후 수지를 메탄올 90ℓ로 세정하고, 메탄올을 제거시킨 후, 얻어진 잔류물을 에틸 아세테이트에 녹이고 실시예 1에서와 같은 방법으로 과산화수소를 함유하는 중탄산나트륨 포화 수용액으로 처리하여 아자디라크틴 27%를 함유하는 추출물 21.66kg을 얻었다.

[실시예 3]

[생물학적 활성도]

아자디라크틴 40%를 함유하는, 실시예 1에서 얻은 추출물 1을 사용하여 생물학적 활성도에 대해 시험하였다.

시험하기 위해, 2 내지 3주 정도 자란, 리마 콩(Phaseolus limensis var. Woods′ Prolific)식물에 시험용액을 흐를때까지 살포하였다. 건조후, 처리한 잎들을 떼어내고, 20, 10, 5 및 2.5ppm의 용량에서 멕시칸 콩 벌레(Mexican Bean Beetles, MBB; Epilachna varivestis) 및 거염벌레(Southern Armyworms, SAW; Spodoptera eridania)의 제2기 유충을 5마리/용량 사용하여 감염시켰다. 치사율은 3일째 및 6일째에 측정하였다. 얻어진 결과는 다음 표와 같다.

본 명세서 및 실시예들은 본 발명을 이들로써 한정하려는 것이 아니라 설명하기 위한 방안으로 기재된 것이며, 여기에 첨부된 청구범위로써 한정시킨 본 발명의 범위와 사상을 벗어나지 않는한, 다양한 변경 및 변화를 시킬 수 있다는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (17)

15% 이상의 아자디라크틴을 함유하는 추출물을 제조하는 방법에 있어서, a) 청정된 수용성 니임 종자 추출물을, 아자디라크틴을 흡착하는 거대다공성 중합체 흡착제와 접촉시키는 단계와, b) 이 거대다공성 중합체 흡착제에서 용매를 사용하여 아자디라크틴을 분리하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기한 거대다공성 중합체 흡착제가 디비닐벤젠 폴리머, 디비닐벤젠/스티렌의 코폴리머, 아크릴 폴리머, 페놀/포름알데히드 코폴리머 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제2항에 있어서, 상기한 거대다공성 중합체 흡착제가 디비닐벤젠 폴리머인 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기한 청정된 수용성 추출물이 5용적% 내지 45용적%의 메탄올을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제4항에 있어서, 상기한 메탄올 함량이 35용적%인 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 용매가 알콜, 에스테르 또는 케톤인 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제6항에 있어서, 상기 용매가 에틸 아세테이트, 메탄올, 또는 메틸 이소부틸 케톤인 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제7항에 있어서, 상기한 극성 유기용매가 에틸 아세테이트인 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제1항에 있어서, c) 추출물을 산화제로 처리하는 단계를 더욱 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제9항에 있어서, 상기 산화제가 과산화수소의 알칼리 용액인 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제10항에 있어서, 중탄산나트륨 용액이 사용되는 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제9항에 있어서, 상기 c)단계에서 용매가 사용되는 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제12항에 있어서, 상기 용매가 에틸 아세테이트인 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.

제1항의 방법에 따라 제조된 니임 종자 추출물.

제14항에 있어서, 상기 추출물이 아자디라크틴을 1% 내지 80% 함유하는 것을 특징으로 하는 추출물.

제15항에 있어서, 상기 추출물이 아자디라크틴을 15% 내지 45% 함유하는 것을 특징으로 하는 추출물.

농경학적으로 허용되는 담체와, 0.1% 내지 99%의 제1항의 추출물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 살충제조성물.