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KR100260335B1 - 빙핵활성 미생물 제제의 생산방법 - Google Patents

빙핵활성 미생물 제제의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 빙핵 형성 활성을 갖는 미생물을 pH 6.6~7.2 범위로 유지하면서 배양 온도 15~20℃ 범위로, 배양하고 회수하는 것으로 이루어지는, 빙핵 형성 미생물을 생산하는 방법을 제시한다. 본 발명에 의해 배양 중 온도 변화 또는 배양 후 온도 변화와 같이 특별한 공정 없이도 최대 빙핵형성능을 갖는 빙핵미생물을 생산할 수 있다.

Description

빙핵활성 미생물 제제의 생산방법
본 발명은 빙핵활성 미생물의 제조방법에 관한 것으로 빙핵활성 미생물의 최대 빙핵 형성능을 갖는 미생물을 배양하는 방법에 관한 것이다
생물학적 원인에 의한 서리 및 냉해 현상과 관련하여, 지난 20여년 동안 빙핵의 생물학적 근원에 대한 연구가 많은 과학자들에 의해 진행되어, 식물의 상해 원인이 기후적인 영향에 기인한 단순한 현상이 아니라 미생물에 의해 촉진되는 생화학적 현상이라는 것이 밝혀지게 되었다. 상해의 원인이 미생물의 빙핵형성 단백질(ice nucleation protein)로부터 기인한다는 사실이 밝혀진 이후, 빙핵형성 단백질에 관한 연구가 본격적으로 시작되어, 이 단백질이 빙핵(ice-nuclei)으로 작용한다는 것을 알게 되었고, 이러한 빙핵 형성 단백질을 생산하는 미생물들은 식물잎의 표면에 서식하는 엽면 미생물(ephiphytic microorganisms)로 밝혀졌다. 일반적으로 빙핵 형성 단백질은 3가지 타입으로 분류한다. 즉,-2℃~-5℃에서 빙핵을 형성시키는 단백질을 타입 1,-6℃~-8℃에서 빙핵을 형성시키는 단백질을 타입 II, -8℃~-10℃에서 빙핵을 형성시키는 단백질을 타입 III로 분류한다.(Ruggles et al. 1993 Journal of Bacteriology 175(22):7216-7221)
일반적으로 물은 0℃에서 어는 것으로 알려져 있으나, 실제로 순수한 물은 -39℃ 정도의 과냉각 상태(super cooling condition)를 거쳐서 얼음이 된다. 그런데, 빙핵활성 단백질이 존재하면 물의 어는점을 -2℃ 내지 -4℃ 정도로 상승시켜 물의 결빙을 촉진시킬 수 있다. 즉, 결빙 과정에서 물은 -39℃정도의 과냉각 상태가 필요하지만, 빙핵활성 단백질이 존재하면 -2℃ 내지 -4℃ 정도의 과냉각을 요구하므로 그 만큼의 에너지를 절약할 수 있다. 이와 같은 에너지 절약 효과를 위하여 빙핵활성 단백질은 여러 산업 분야에 응용되고 있는데, 예를 들어 빙핵형성 미생물(icenucleating microorganism)을 보다 높은 온도에서 인공적으로 눈을 제조하기 위한 빙핵으로 사용하는 것이 보고되었으며, 또 냉동식품의 동결촉진제로 이용하는 것이 보고 되었다.
빙핵형성 미생물은 인공제설의 촉진제로 널리 이용되고 있으며, 인공강우 촉진제로 이용하면 한발에 대비하여 인공강우를 유도할 수 있어서 현재 현장시험을 진행하고 있다. 결론적으로, 동결과정에 관련된 전 산업분야에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
한편, 이와 같은 산업적 이용을 위해서는 빙핵형성 미생물을, 원하는 빙핵활 성을 보유하는 상태로 얻는 것이 필수적이다. 즉, 배양 후 얻어지는 빙핵형성 미생물 모두가 빙핵 형성능을 발휘하는 것은 아니며, 따라서 특별한 조건에서 배양하거 나 또는 배양 후 별도의 처리를 통해 미생물의 빙핵형성능을 높이고자 하는 시도가 있었다
한국특허공고공보 96-10903(미국특허 5,137,815)에는 빙핵핵활성을 갖는 미생물의 생산방법으로 발효배지의 pH를 약 pH 5.5-6.7, 특히 pH6.6~5.6 범위 내에서 조절하고, 21℃에서 배양하는 방법이 기재되어 있다. 이 문헌에서는 빙핵 형성 미생물의 경우 배양 pH가 특허청구범위에 기재된 범위에서 벗어나는 경우, 예를 들어 pH 6.9과 같은 pH에서는 빙핵 형성능(INA,Ice nucleation protein)가 떨어진다고 보고 하였다.
미국특허 5,153,134에는 배지내의 질소함량을 세포중량으로 20g/L 되도록 성장시킬 수 있으며 성장말기에 빙핵형성을 저해하지 않는 양으로 한정하여 배양하면서 배양온도를 성장시기에 따라 29℃에서 24℃로 변환하면서 배양하는 생산방법이 기재되어 있다.
Journal of Bacteriology, 1993년 7월호 p.4062-4070에는 32℃에서 배양하여 얻은 배양액을 배양이 끝난 후 짧은 시간 내에 16℃로 온도를 변환시켜 빙핵형성능이 높은 빙핵단백질을 유도하는 방법이 기재되어 있다. 그러나 이와 같이 배양 후 빠른 시간 내에 배양액의 온도를 낮추는 방법은 대략 배양 방법에서는 별개의 공정이 더 추가되므로 공정을 번거롭게 할 뿐 아니라, 실제로 대량 배양에서 다량의 배양액의 온도를 빠른 시간에 큰 폭으로 떨어뜨리는 것은 용이하지 않다.
본 발명의 목적은 빙핵형성능이 높은 미생물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 배양 중의 온도 변화 없이 빙핵형성능이 높은 미생물을 대량생산할 수 있는 생산공정을 제공하는 것이다.
제1도는 배양온도에 따른 빙핵형성 미생물의 빙핵형성능을 나타낸 그래프이다.
제2도는 배양 pH에 따른 빙핵형성 미생물의 빙핵형성능을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 빙핵 형성 미생물을 배양함에 있어, 세포 생육과 세포의 빙핵 형성능을 동시에 만족시킬 수 있는 온도 범위에서 배양하는 것으로 이루어진다. 따라서 배양 공정 중에 배양 온도를 변화시킬 필요 없이, 높은 빙핵활성능을 갖는 빙핵 미생물을 배양할 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 빙핵 형성 미생물을 배양 중 pH를 pH 6.6~7.2 바람직하게는 pH 6.8~7.0으로 유지하고 배양 온도를 15℃~20℃ 바람직하게는 17℃~20℃로 유지하면서 배양하는 것으로 이루어지는, 빙핵 형성 활성을 가지는 미생물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에서 pH를 조절하는 방법은 미생물 발효 분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 따른다. pH를 조절하기 위하여 통상적으로 사용되는 산 및 염기를 사용할 수 있으며, 예를 들어 황산, 수산화나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 빙핵활성능이 있다고 알려진 미생물, 예를 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae)와 같은 슈도모나스속 미생물, 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola)와 같은 어위니아속 미생물 등의 배양에 적용될 수 있으며, 특히 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 유용한 대표적인 미생물은 잔토모스나스(Xanthomons)속 미생물, 바람직하게는 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) 계열 미생물이다.
본 발명에서 빙핵 형성능은 발리의 동결 방울수 계측법으로 측정하였다 (Schnell, R. Cand G. Vali, Nature,236:163-165(1972)). 즉, 배지에서 배양한 배 양액을 pH7.0인 10mM 인산완충용액에 현탁시켜 세포수를 600nm에서의 OD가 1이 되도록 즉, 3×109ce11/ml이 되도록 현탁액을 만들고, pH 7.0인 10mM 인산완충액으로 연속 희석하여 일련의 10배 회석액을 제조하였다. 이 회석액들은 파라핀으로 코팅된 알루미늄 블럭에 5㎕씩 20방울을 분주하여 냉각 수조(Refrigerated batch circulater, JEIO TECH, 한국)에 올려 놓고, 0℃에서 -10℃까지 0.6℃/min의 일정한 속도로 냉각시키면서 과냉각 온도(Supercooling temperature)에 따른 동결 방울수를 계수하여 다음 식에 따라 계산한다. 특히 0℃에서 -5℃까지 냉각시키면서 생기는 동결 방울수를 계수하여 다음 식에 따라 계산하여 타입 I 빙핵수를 측정하였다.
CNI=-Ln(1-F)/(V x D)
CNI: 누적 빙핵수 f: 동결 방울의 분율
V: 방울의 부피 D: 희석 배율
총 배양액의 빙핵활성능은 0D600nm:1(3×109ce1l/ml)의 타입 1의 빙핵수에 배양액의 OD값을 곱하여 계산하였다
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
[배양온도에 따른 빙핵 형성능]
대한민국 대전광역시 유성구 구성동에 위치한 생명공학연구소 유전자은행 (KCTC)에 1996년 6월 21일에 기탁된 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris) KCTC0251BP와 기존의 빙핵활성 미생물로 알려진 슈도모나스 시린제(Pseudomonas syringae)KCTC1832 그리고 생명공학연구소 생물공정그룹에서 입수한 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola)를 표 1의 액체 배지 2L에서 배양온도를 각각 15℃, 18℃, 20℃, 22℃, 25℃,30℃로 달리하여 48시간 배양하였다. 배양 pH가 pH6.8~pH7.0의 범위에서 유지되도록 3N NaOH와 3N H2S04를 이용하여 조절하였고, 용존산소량은 20%이상을 유지하면서 48시간동안 회분배양하였다. 배양 발효조는 5리터 발효조(Korean Fermentor Co.,Ltd.Korea)를 이용, 배양액을 2리터로 하였다.
앞에 기재된 방법에 따라 타입 I 빙핵 형성능을 측정하였으며 그 결과를 표 2 및 제1도에 나타낸다.
제1도에서 확인되는 바와 같이, 볼 수 있듯이, 배양온도 15~20℃에서 타입I(-5℃ 이상에서 빙핵 형성)의 빙핵 형성능을 갖는 빙핵 미생물을 다량 생산할 수 있었다.
[실시예 2]
[배양 pH에 따른 빙핵 형성능]
배양온도를 18℃로 하고 배양 pH를 각각 pH5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0까지 달리하는 것을 제외하고는 실시예 1과 같이 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)KCTC0251BP, 슈도모나스 시린제(Pseudomonas syringae)KCTC1832와 어위니아 허비콜라(Erwinia herbicola)를 회분식배양하였다. 앞에 기재된 방법에 따라 각도별 타입 I 빙핵 형성능을 측정하였으며 그 결과를 표 3 과 제2도에 나타냈다. 제2도 확인되는 바와 같이, pH7.0에서 가장 높은 역가를 보였다.
[실시예 3]
[대량배양]
빙핵활성미생물을 대량생산하는 경우에도 빙핵 형성능이 높은 미생물을 생산할 수 있음을 확인하기 위하여, 표 1의 배지조건으로 배양온도를 18℃, 배양 pH를 pH6.8~7.0으로, 용존산소량을 20% 이상으로 유지하면서 450리터 발효조(Korean Fermentor Co., Ltd. Korea)와 (주)동아바이오텍사의 25m3발효조(Komatsugawa, Co., ltd, Japan)를 이용하여 대량 배양하였으며 결과를 표 4에 나타낸다. 발효조 크기에 별다른 영향없이 5L 발효조와 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
본 발명에 의해 배양 중 온도 변화 또는 배양 후 온도 변화와 같은 특별한 공정 없이도 최대 빙핵형성능을 갖는 빙핵미생물을 생산할 수 있으며, 본 발명을 이용하여 종래의 빙핵활성 미생물보다 빙핵활성이 뛰어난 빙핵활성 미생물 제제를 생산할 수 있다.

Claims (4)

  1. 빙핵 형성 활성을 갖는 미생물을 pH 6.8~7.2 범위, 배양 온도 15~2O℃ 범위로 유지하면서 배양하고, 회수하는 것으로 이루어지는, 빙핵 형성 미생물을 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 잔토모나스 속 미생물, 어위니아 속 미생물 또는 슈도모나스 속 미생물인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 배양 온도 16~19℃ 범위로 배양하는 것을 특징으로 하는 방법,
  4. 제1항에 있어서, 배양 pH를 6.8~7.0 범위로 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US5153134A (en) * 1987-03-05 1992-10-06 Genencor International, Inc. Fermentation of microorganisms having ice nucleation activity using a temperature change

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