KR100255526B1

KR100255526B1 - C-반응성 단백질 단편의 부분적으로 변형되고 역-전화된 테트라펩티드 유사체

Info

Publication number: KR100255526B1
Application number: KR1019940703644A
Authority: KR
Inventors: 안토니오 실비오 베르디니; 마시모 피노리; 실바나 카펠레티; 로마 가제로; 플라비오 레오니
Original assignee: 디에고 지. 브로체티; 이탈파마코 에스.피.에이.
Priority date: 1992-04-16
Filing date: 1993-04-02
Publication date: 2000-05-01
Anticipated expiration: 2013-04-02
Also published as: FI944224A7; NO943903D0; ZA932614B; DE69313842D1; ITMI920939A0; CA2118136C; TW242145B; JPH07505640A; US5521159A; EP0636140A1; US5578575A; NZ251697A; DE69313842T2; WO1993021208A1; HUT70179A; CA2118136A1; ATE157987T1; IT1254883B; AU667096B2; FI944224L

Abstract

면역 조절 활성이 부여된 C-반응성 단백질 단편의 역-전화된 테트라펩티드 유사체.

Description

C-반응성 단백질 단편의 부분적으로 변형되고 역-전화된 테트라펩티드 유사체

본 발명은 C-반응성 단백질 단편의 역-전화된 테트라펩티드 유사체(이하 CRP라 함)에 관한 것이다. CRP는 일반적으로 혈중 농도가 매우 낮은 단백질이며, 다음의 염증성 처리에 따라 그 농도가 2000배까지 올라간다[제이. 제이 몰리와 아이. 쿠쉬너, Am. N. Y. Acad. Sci., 389, 406-418(1989)]. 에프. 에이 로비 등, 생화학회지, 262, 15권, 7053-7057(1987)에는 터프트신의 서열과 매우 유사한 3가지의 CRP테트라펩티드 서열이 개시되어 있다. 이렇게 화학적으로 합성된 테트라펩티드가 질과 양에서 터프트신과 같은 방법으로 식세포인 백혈구를 자극하여 과산화물을 생성하며 또한 단핵세포를 유도하여 인터류킨을 생성하는 것을 보여준다. 터프트신처럼, 3가지의 CRP테트라펩티드는 프로테아제에 의해 빠르게 생체내에서 대사되어, 모펩티드의 생물학적 활성들을 경쟁적으로 저해할 수 있는 펩티드 대사산물을 생성할 수 있어야 한다. 상기 CRP 테트라펩티드 단편의 부분적으로 변형되고 N-말단 역-전화된 유사체는 터프트신에 대해 이미 알려진 바와 같은 면역조절 기능(EP-A-0 253 190)을 유지하면서 동시에 효소적 분해에 대해 상당한 안정성을 보일 뿐만 아니라, 특히 구조와 투여량에 따라서 특히 패혈 쇼크의 치료시에 다른 생물학적 효과를 나타낼 수도 있다는 것이 이제 놀랍게도 발견되었다. 그러므로 본 발명은 다음 일반식 Ⅰ과 같은 역-전화된 테트라 펩티드, 그 부분입체이성질체형태 및 약학적으로 허용될 수 있는 그 염, 에스테르 및 아미드에 관한 것이다.

여기에서 R은 수소 또는 트레오닌의 측쇄이고, R₁은 아르기닌, 류신, 또는 글루타민의 측쇄이고, R₂는 수소 또는 대사적으로 소실될 수 있는 아실 그룹이며, 단 R₁이 아르기닌의 측쇄라면 R은 트레오닌의 측쇄일 수 없다.

특히, 본 발명은 역-전화된 테트라펩티드 gGly-(R,S)mLys-Pro-Arg, gThr-(R,S)mLys-Pro-Leu, gThr-(R,S)mLys-Pro-Gln에 관한 것인데, 여기서 접두어 g와 m은 아미노산이 각각 겜-디아민(gem-diamine)과 말로닐 잔기 및 이들의 부분입체이성질체 형태임을 의미한다.

본 발명의 역-전화된 테트라펩티드는 공지된 방법에 따라 합성되며, 당업자들은 역전화하기 위한 아미노산의 종류에 따라서 그 방법을 선택할 수 있다.

예를 들면, 겜-디아민 잔기가 1,1-디아미노메탄 그룹(gGly)일 때, 역-전화된 테트라펩티드는 먼저 N,O-비스(트리메틸실일)아세트아미드(TSMAc), 트리메틸실일클로라이드(TMS-Cl) 또는 트리메틸실일시아나이드(TMSCN)와 같은 실란화제의 존재 하에서 멜드럼산 유도체 c-mLys(Z)(즉, 5-[4-벤질옥시카르보닐]-2,2-디메틸-1,3-디옥산-4,6-디온)을 H-Gly-NH₂와 반응시킴으로써 얻어질 수 있다(M. J. O. Anteunis ＆ Chr. Becu, Bull. Soc. Chim. Belg., 96m 119-139 1986). 상기와 같이 얻어진 가펩티드(pseudopeptide) OH-(R,S)-mLys(Z)-Gly-NH₂(Z=벤질옥시카르보닐)의 말로닐 잔기상의 제2그룹은 디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)와 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBT)의 존재 하에서 t-부틸 프롤리네이트와 축합하여 가펩타이드 [(R,S)mLys(Z)-Gly-NH₂]-Pro-H를 생성한다. 그것의 프롤린 카르복실기는 DCC와 N-히드록시숙신이미드(HOSu)로 활성화되어 비보호 아르기닌[고틀립, 피 등, Ann. N. Y Acad. Sci., 419, 12(1983)]과 반응하여 역-전화된 테트라펩티드 [(R,S)mLys(Z)-Gly-NH₂]-Pro-Arg-OH를 생성한다. 그런 다음 RP-DC 변위 크로마토그래피를 통하여 정제된다. 또한 필요하다면 이 방법으로 부분입체이성질체의 분리도 가능하다. 정제된 생성물을 팔라듐 촉매의 존재 하에서 포름산으로 수소첨가 반응시켜 잔존 보호기를 제거한 다음, 글리신 카르복시아미드를 gGly의 N-말단 잔기로 바꿔주기 위하여 [1,1-비스(트리플루오로아세톡시)-요도]벤젠(TIB)으로 처리한다. 이온교환 크로마토그래피에 의한 마지막 정제로 아세테이트로서 최종생성물을 얻을 수 있다.

다른 실시예는 트레오닌이 겜-디아민 잔기인 경우이다. 역-전화된 테트라펩티드의 합성은 Z-Pro-OH와 H-Y-OtBu의 축합 및 이어서 촉매수소 첨가반응에 의한 벤질옥시카르보닐기의 제거로 얻어진 C-말단디펩티드로부터 출발하는데, 여기에서 Y는 상기 식 Ⅰ의 정의와 마찬가지의 아미노산 류신 또는 글루타민을 의미하며 때에 따라 적절히 보호된다. 이러한 디펩티드는 필요하다면, 예를 들어 이탈리아 특허 출원 제21349 A/90호에서 기재된 바와 같이 생성된 N-말단 역-전화된 디펩티드와 반응할 수 있다.

이전에 실란화된 H-Thr(tBu)-OH를 적절한 카르복시 활성화제의 존재 하에서 MNP-COOH로 아실화시킴으로써 얻어진 HNP-Thr(tBu)-OH를 비페닐포스포아지드(DPPA)로 처리하여 관련 아지드를 생성하고, 이를 가열하여 이소시아네이트를 생성한다. 이것을 촉매량의 아민, 바람직하게는 트리에틸 아민이나 디이소프로필 아민과 같은 3차 아민 존재 하에 티오페놀로 처리하여 페닐티오카르보닐 유도체 MNP-gThr(tBu)-PTC를 얻는다. 이어서 아민 잔기가 예를 들어 묽은 수산화나트륨 용액에 의해 처리됨으로써 탈보호되어 MNP-gThr(tBu)-H가 생성된다. 이 생성물을 C-mLys(Boc)과 축합 반응시켜 N-말단 가디펩티드 MNP-gThr(tBu)-(R,S)mLys(Boc)를 생성하고 이것을 다시 DCC/HOBT의 존재 하에서 H-Pro-Y-OtBu과 축합 반응시켜, R이 1-히드록시에틸인 식 Ⅰ의 보호된 역-전화된 테트라펩티드를 얻는데, 여기서 Y는 상기 정의된 바와 같다. 산으로 처리함으로써 하나의 겜-디아민 잔기를 제외한 모든 보호기가 제거된다. RP-DC를 통한 정제와 동시에, 필요하다면 두부분 입체이성질체를 분리하는 것이 가능하다. 예를 들어 해면 팔라듐 상에서 포름산 암모늄을 이용하여 촉매 수소첨가반응에 의해 MNP기를 제거할 수 있다. 적절한 크로마토그래피법에 의해 역-전화된 테트라펩티드를 최종 정제한다.

청구범위에 나타난 몇몇 역-전화된 테트라펩티드의 제조 실시예가 여기에서 제공되어 있는데, 이것이 본 발명을 어떠한 방법으로도 제한하려는 것은 아니다.

보호된 단편과 역-전화된 테트라펩티드의 아미노산 유도체의 HPLC분석은 다음 실험 조건 하에서 실행된다:

컬럼:리크로소브(Lichrosorb) RP-18;

유속:1.5ml/분;

검출기:머르크(Merck) L-4200 UV-VIS(230 또는 254nm);

용출 용매 A:물 90%, 메틸시아나이드 10%, 트리플루오로아세트산(TFA) 0.1%;

용출 용매 B:메틸시아나이드, 트리플루오로아세트산 0.1%;

용출 용매 C:물, 트리플루오로아세트산 0.1%;

농도 구배:(Ⅰ):B:A의 농도를 0:100%에서 40:60%로 변화(20′)시키고, 계속하여 20:80%로 변화시킴(10분)

(Ⅱ):B:A의 농도를 37:63%에서 80:20%로 변화시킴(20분)

(Ⅲ):A:C의 농도를 0:100%에서 50:50%로 변화시키고(20분), 다시 100:0%로 변화시키고(3분), 다시 B:A의 농도를 0:100%에서 40:60%로 변화시킴(20분)

(Ⅳ):A:C의 농도를 10:90%에서 40:60%로 변화시키고(8분), 다시 100:0%로 변화시키고(2분), 다시 B:A와 농도를 0:100%에서 40:60%로 변화시킴(20분)

이온 교환 정제에서 226nm 필터가 구비된 LKB UVICORD S Ⅱ 검출기, 파마시아 기록기(차트 속도=0.1cm/분)와 파마시아 FRAC 200 분액 수집기를 갖춘 파마시아의 FPLC 시스템이 이용된다.

110℃에서 6M 염산으로 22시간동안 가수분해한 후, 벡크만 시스템 골드(Bookman SYSTEM GOLD) 자동 아미노산 분석기로 여러 가지 역-전화된 펩티드의 아미노산과 암모니아 조성 및 비율(겜-디아미노 잔기의 특이 데이터로서)을 측정한다.

몇몇 화합물의 이름 뒤에 괄호 안의 문자와 숫자로 된 코드는 내부식별 코드이다.

H-gGly-(R,S)mLys-Pro-Arg-OH·2AcOH(ITF 1127)

A) THF(200ml)에 옥인 H-Gly-NH₂·HCl(3.32g, 30mmoles) 현탁액에 TMSAC(19.6ml, 80mmoles)와 TMS-Cl(2.54ml, 20mM)을 차례로 부가했다. 30분 후 C-mLys(Z)(6.98g, 20mmoles)을 부가하여, 반응 혼합물을 실온에서 추가로 3시간 동안 교반했다. 용매를 진공에서 증발시키고, 0.1N 염산으로 pH를 3으로 조절하면서 잔류물을 물로 취했다. 실온에서 1시간 교반 후, 형성된 고체를 여과하여 물로 세척하고 뜨거운 에탄올에 용해시켰다. 냉각 후 얻어진 고체를 여과하여 에틸에테르로 세척하고 건조하였다. 3.8g의 (R,S)mLys(Z)-Gly-NH₂를 얻었다(수율:51%).

HPLC[농도 구배(Ⅰ)(254nm)]:r. t.(retention time) 13.5분; 순도 98%; 녹는점:161℃(dec.)

¹H-NMR로 생성물의 구조를 확인했다.

B) A)에서 얻은 생성물(3.65g, 10mmoles)의 DMF(15ml) 용액을 아이스배쓰에서 냉각시키고, 여기에 HOBT(1.43g, 10.5mmoles)와 DCC(1.96g, 9.5mmoles)를 차례로 부가했다. 30분간 교반 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 HCl·H-Pro-OtBu(2.49g, 12mmoles)과 TEA(1.67ml, 12mmoles)를 함유하는 DMF(10ml) 용액에 부가했다. 이 혼합물을 3시간 동안 교반한 다음 용매를 진공에서 증발시키고, 잔류물을 에틸아세테이트(50ml)로 취하여, 유기상을 2% 중탄산칼륨, 5% 탄산수소나트륨으로 세척하고 물로 중화한 다음, 황산나트륨 상에서 무수물화했다. 얻어진 4.2g의 라이트 오일(수율:82%)을 DMC와 TFA의 혼합액(1:1 V/V, 16ml)에 용해시키고 1시간 동안 교반했다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔류물을 에틸아세테이트와 에틸 에테르로 그라인드하여 3.6g의 [(R,S)mLys(Z)-Gly-NH₂]-Pro-OH를 백색 고체로서 얻었다(수율:79%).

HPLC[농도 구배(Ⅰ)(254nm)]:r. t. 14.6 및 15.7분(두 가지의 부분입체이성질체); 순도 97%.

¹H-NMR로 생성물의 구조를 확인하였다.

C) B)에서 얻은 생성물(3.36g, 7.5mmoles)의 THF(50ml) 용액에 HOSu(0.95g, 8.25mmoles)를 가하고, -10℃로 냉각한 후 DCC(1.54g, 7,5mmoles)를 가했다. 실온에서 4시간 동안 교반 후 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 H-Arg-OH(1.74g, 10mmles)과 KCl(1.74g, 10mmles)을 함유한 DMF/물 용액(7:3 v/v, 125ml)에 가했다. 반응 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반한 다음, 용매를 진공에서 증발시키고 잔류물을 에틸에테르로 여러번 세척하여 건조시켰다. 얻어진 고체를 TFA수용액(0.16% v/v, 30ml)에 용해시키고 RP-DC를 통하여 3부분으로 정제했다. 각각의 정제시에, 10ml의 용액을 TFA를 함유한 물(0.1%,v/v)로, 2.7ml/분의 유속으로 이 미리 균형이 잡혀진 다이나맥스(Dynamax) 300Å C₁₈(21.4×300mm) 컬럼에 주입했다. 주입 후 TFA(0.1% v/v)를 함유한 벤질디메틸헥사데실암모늄 클로라이드(BDHA-Cl) 50mM 수용액을 2.7ml/분의 유속으로 컬럼을 용출시켰다. 약 1시간의 용출 후 2.7ml단위로 분액을 수집했다. 각각의 분액을 HPLC[농도 구배(Ⅰ)]로 분석하여 불순물을 함유한 분액을 제거하고 나머지는 화합물 [mLys(Z)-Gly-NH₂]-Pro-Arg-OH의 이성질체 A, 두 이성질체의 혼합물, 및 이성질체 B를 각각 함유한 세 그룹으로 수집했다. 세 개의 크로마토그래피의 종료시, 세 그룹의 분액을 동결 건조하여 1.9g의 이성질체 A, 0.45g의 이성질체 혼합물 및 1.8g의 이성질체 B를 얻었다(총수율:89%).

HPLC[농도 구배(Ⅰ)(220nm)]:r. t. 13.6분(이성질체 A), 순도 96%; r. t. 14.7분(이성질체 B); 순도 93%+이성질체 A 4%.

FAB-MS:m/z=619 amu [M+H]⁺; m/z=485 amu [M-Z+H]⁺(두 이성질체에 대해 동일한 스펙트럼).

D) C)에서 얻은 이성질체 혼합물(0.31g, 0.5mmoles)의 포름산(85%, 5ml) 용액에 신선한 해면 팔라듐(약 0.1g)을 부가하고 이 혼합물을 실온에서 90분 동안 서서히 교반했다. 촉매를 여과하여 제거한 후, 용매를 진공에서 증발시키고, 잔류물을 물로 취하여 동결 건조시켰다. 얻어진 고체를 DMF/물의 혼합액(3:1 v/v, 5ml)에 용해시키고 TIB(0.43g, 1mmoles)를 부가했다. 이 반응 혼합물을 빛으로부터 차단시키고 실온에서 16시간 동안 교반했다. 용매를 진공에서 증발시키고 잔류물을 물에 용해시키고, 에틸 에테르로 세척하여 동결 건조시켰다. 얻어진 고체를 물에 용해시켜 pH 6이 되게 하여, CM-52 카르복시메틸셀를로즈로 충전되고 미리 15mM 암모늄 아세테이트 용액으로서 pH 6에 맞춰진 컬럼(6×200mm)상에 주입했다(유속=1ml/분). 주입 후, pH를 6으로 유지하면서 암모늄 아세테이트의 농도를 6시간 동안 0.15mM에서 150mM까지 선형으로 변화시켜 1ml/분의 유속으로 컬럼을 용출시켰다. 3ml 단위로 분액을 수집하여 HPLC [농도 구배(Ⅲ)]로 분석했다:H-gGly-(R,S)mLys-Pro-Arg-OH·2ACOH(ITF 1127)를 함유하는 분액을 수집하여 여러번 동결 건조했다. 얻어진 고체는 무수 에탄올에 용해시키고 에틸 에테르를 부가함으로써 침전된 0.085g의 생성물을 얻었다(수율:30%).

HPLC:[농도 구배(Ⅲ)]:r. t. 8.8분(이성질체 A) 및 10.2분(이성질체 B); 순도 99%.

FAB-MS:m/z= 457 amu [M+H]⁺

유사한 방법에 따라 이성질체 A(ITF 1357)를 0.4259 얻었다(수율:30%).

이성질체 A와 같은 방법으로, 0.45g의 이성질체 B(ITF 1358)(수율:32%)와 0.1g의 혼합물(ITF 1127)을 얻었다.

[실시예 2]

H-gThr-(R,S)mLys-Pro-Leu-OH·AcOH(ITF 1192)

A) 0℃에서 메틸렌 클로라이드(125ml)에 비스(트리클로로메틸)카르보네이트(3.71g, 12.5mmoles)를 용해한 용액에 80ml의 메틸렌 클로라이드에 1-메틸이미다졸(5.96ml, 75mmoles)을 용해한 용액을 부가했다. 5분 후 메틸렌 클로라이드(80ml)에 용해되어 있는 MNP-OH(5.63g, 25mmoles)를 부가하고, 5분 후 미리 TMSCN(11.3ml, 90mmoles)으로 실란화된 H-Thr(tBu)-OH(5.26g, 30mmoles)를 부가하고 추가로 200ml의 메틸렌 클로라이드를 부가했다. 10분 후, 반응 혼합물을 pH 3.5로 산성화된 수용성 완충제로 세척하여 무수화한 다음 증발 건조하였다. 5%의 탄산나트륨(300ml)에 취해진 잔류물을 메틸렌클로라이드로 세척했다. 수성 상에 200ml의 에틸 아세테이트를 추가로 부가하여 pH를 5.7로 만들었다. 유기상을 분리하여 무수화하고, 용매를 증발시켜 MNP-Thr(tBu)-OH를 오일 형태(6.5g, 수율:68%)로서 얻었다.

HPLC [농도 구배(Ⅰ)(254nm)]:r. t. 25.1분; 순도:88%.

B) 0℃에서 A)에서 생성된 화합물(5.2g, 13.6mmoles)의 무수톨루엔(50ml) 용액에 DPPA(3.22ml, 14.9mmoles)와 TEA(2.09ml, 14.9mmoles)를 가했다. 4시간 후 반응 혼합물을 0℃로 미리 냉각된 소디움 히드로카보네이트 포화용액과 염화나트륨 포화용액으로 3번 세척한 다음, 무수화했다. 아지드 포함 용액을 80℃로 가열하여 이 온도에서 40분간 유지했다. 형성된 이소시아네이트에 티오 페놀(1.39ml, 13.6mmoles)과 촉매량의 TEA(191μl, 1.36mmoles)를 실온에서 부가했다. 하룻밤이 지난 후, 이 혼합물을 에틸 아세테이트와 물로 처리하고, 유기상을 2% 포테슘 비설페이트, 5% 소디움 히드로카보네이트로 세척하고 물로 중화한 다음, 황산 나트륨상에서 무수화하고, 증발 건조하여 얻어진 오일을 석유 에테르로 그라인드했다. 4.7g의 MMP-gThr(tBu)-PCT를 얻었다(수율:71.2%).

HPLC [농도 구배(Ⅱ)(254nm)]:r. t. 14.9분; 순도:95%.

C) 0℃로 유지된 수산화나트륨(1M, 26ml)과 물(877ml)의 혼합액에 B)에서 생성된 화합물(4.7g, 9.6mmoles)의 THF(64ml) 용액을 천천히 부가했다. 부가 종료 5분 후, 반응 혼합물을 염산(1M, 26ml)으로 중화했다. THF를 증발시키고 클로로포름(80ml)을 부가하고, 1M의 수산화나트륨으로 2상 혼합물의 pH를 9.0으로 만들었다. 유기상을 분리해 내고, pH를 매번 9.0으로 조절하면서 수용액상을 클로로포름으로 3번 처리하고, 유기상을 수집하여 증발 건조하였다. 에틸 에테르에 재현탁된 잔류물에 물(50ml)을 부가하고 혼합물을 11M의 염산을 이용해 일정한 pH가 될 때가지 pH 3.5로 적정했다. 수용액상을 분리하고 상기와 같은 처리를 두 번 반복했다. 수집된 수용액상을 동결 건조하여 2.8g의 MNP-gThr(tBu)-H·HCl을 얻었다(수율:85%).

HPLC [농도 구배(Ⅰ)(254nm)):r. t. 16.43분; 순도:99.9%.

D) C)에서 얻은 화합물(2.6g, 6.6mmoles)과 c-mLys(Boc)(2.4g, 8mmoles)의 THF(120ml) 용액에 TMSAC(4.6ml, 20mmoles)을 천천히 부가했다. 20시간 후 반응 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 물에 취하고 에틸 아세테이트 존재 하에 1M의 염산으로 pH를 3.5로 만들었다. 수용액상을 에틸 아세테이트로 3번 추출하고, 수집된 유기상을 무수화하여 작은 부피로 감소시키고 여기에 디이소프로필 에테르를 부가하여 3.4g의 MNP-gThr(tBu)-(R,S)mLys(Boc)-OH를 얻었다(수율:85%).

HPLC [농도 구배(Ⅱ)(230nm)]:r. t. 9.9분 및 10.2분(두 가지의 부분입체이성질체); 순도 93%.

E) 메틸렌 클로라이드(50ml)에 녹인 Z-Pro-OH(2.4g, 10mmoles)과 H-Leu-OtBu·HCl(2.7g, 12mmoles) 용액에 TEA(3ml, 22mmoles)을 부가하고 이어 BOP(4.4g, 10mmoles)과 HOBT(1.35g, 10mmoles)를 부가했다. 5시간 후 반응 혼합물을 염화나트륨 포화 용액으로 한번 처리한 다음, 증발 건조했다. 잔류물을 에틸 아세테이트와 물에 분할시켰다. 유기상을 2% 포테이슘 비설페이트, 5% 소디움 히드로카보네이트로 세척하고 물로 중화시키고, 황산나트륨 상에서 무수화한 다음, 건조시키고 석유 에테르를 부가하여 디이소프로필 에테르에 용해된 잔류물로부터 3.8g의 Z-pro-Leu-OtBu를 얻었다.

HPLC [농도 구배(Ⅰ)(230nm)]:r. t. 28.6분; 순도 100%.

F) E)에서 생성된 디펩티드(1.5g, 3.5mmoles)를 메탄올(70ml)에 용해시키고, 질소 분위기에서 이 용액에 Pd/C 촉매(100mg)를 부가한 다음, 매우 천천히 트리에틸 실란(2.9g, 18mmoles)을 부가했다. 3시간 후 반응 혼합물을 여과하고 용매를 증발시켜 1g의 H-Pro-Leu-OtBu를 얻었다(수율:100%).

HPLC [농도 구배(Ⅰ)(230nm)]:r. t. 15.9분; 순도 93%.

G) D)에서 생성된 가디펩티드(1.1g, 1.9mmoles)의 메틸렌클로라이드(15ml) 용액에 200ml의 DMF에 용해되어 있는 HOBT(320mg, 2.3mmoles)를 부가했다. 온도를 0℃로 낮추고 DCCI(392mg, 1.9mmoles)을 부가했다. 15분 후, 반응 혼합물을 E)에서 생성된 C-말단 디펩티드(540mg, 1.9mmoles)가 들어 있는 플라스크에 여과시키고 하룻밤동안 반응시켰다. 용매를 증발시킨 후 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분할시키고 유기상을 2% 포테이슘 비설페이트, 5% 소디움 히드로카보네이트로 세척하고 물로 중화시킨 다음, 황산나트륨 상에서 무수화시켰다. 디이소프로필 에테르로 잔류물을 그라인딩함으로써 건조된 유기상으로부터 12.3g의 MNP-gThr(tBu)-(R,S)mLys(Boc)-Pro-Leu-OtB를 얻었다(수율:77%).

HPLC: 65% B(230 및 254nm)의 등농도 구배; r. t. 8.2분과 8.6분; 순도:100%.

H) G)에서 생성된 화합물의 일부(1.4g, 1.3mmoles)를 아이스베쓰에서 진한 염산(5ml)으로 8분 동안 처리했다. 반응 혼합물을 증발 건조시킨 다음, 물로 취해서 동결 건조했다. 910mg의 조생성물(crude)을 얻어서 이것을 벤질디메틸도데실암모늄 브로마이드(BDDA-Br, 90%의 물, 10%의 아세토니트릴 및 0.1%의 TFA에 용해된 50mM 용액)를 변위제로서 이용하는 다이나맥스 컬럼(300Å C18, 12μm, 21×250mm)상에서 RP-DC를 통하여 2.7ml/분의 유속으로 정제하였다. 이렇게 하여 MNP-gThr-mLys-Pro-Leu-OH의 세 종류 분액을 얻었다:320mg의 이성질체 A, 320mg의 이성질체 B, 160mg의 부분입체이성질체 혼합물.

HPLC [농도 구배(Ⅰ)(230nm)]:r. t. 16.1 및 18분; 순도 99.9%.

I) H)에서 생성된 이성질체 A(315mg, 0.4mmoles)를 메탄올(15ml)에 용해시키고 여기에 포름산으로 활성화된 해면 팔라듐과 포름산(5ml)에 녹인 포름산 암모늄(120mg) 용액을 부가했다. 2시간 후 촉매를 여과하여 분리하고, 용매를 증발시킨 후 잔류물을 물로 취했다. 수용액 상을 에틸에테르로 세척하고 동결 건조하여 200mg의 조생성물을 얻은 다음 이것을 이온 교환법에 의해 정제했다. 이온 교환은, 용출 용매로서 0.015M 암모늄 아세테이트, pH 6.0(A)와 0.3M 암모늄 아세테이트, pH6.0(B)을 30분간 A에서의 B의 농도를 0에서 25%까지 선형으로 변화시키고 다음 40분간 등농도 구배로 하고 유속을 3ml/분으로 하여 S-세파로즈 패스트 플로우(S-Sepharose Fast Flow)의 파마시아 XK16 컬럼(Pharmacia XK16 column)(16×200mm)상에서 이루어졌다. 분액을 매 2분마다 수집 하여 HPLC로 분석하여 H-gThr-(R,S)mLys-Pro-Leu-GH·AcOH(ITF 1192)를 포함하는 분액을 동결 건조했다.

HPLC [농도 구배(Ⅲ)(230nm)]:r. t. 12.8분; 순도 97%.

아미노산 조성:프롤린(1) 1.0; 류신(1) 1.0; NH₃(2) 1.9; 펩티드 함량 77μmoles(40mg; 수율; 20%).

상기와 동일한 방법을 이용하여 이성질체 B(ITF 1443)를 얻었다:

[실시예 3]

H-gThr-(R,S)mLys-Pro-Gln-OH·AcOH(ITF 1193)

A) Z-Gln-OH(5.6g, 20mmoles)을 빙초산(60ml)에 용해시키고 여기에 Trt-OH(Trt=trityl)(10.4g, 40mmoles), Ac₂O(3.77ml, 40mmoles) 및 황산을 부가했다. 반응 혼합물을 50℃까지 가열하여 이 온도에서 90분 동안 유지한 다음, 실온으로 냉각하여 물로 처리했다. 얻어진 침전물을 여과하고, 물에 현탁시켜 에틸 아세테이트로 3번 추출했다. n-헥산의 농축 및 부가 반응에 의해 수집되고 무수화된 유기상으로부터 8.12g의 Z-Gln(Trt)-OH를 얻었다(수율:77%).

HPLC [농도 구배(Ⅱ)(230nm)]:r. t. 11.3분; 순도:100%.

B) A)에서 얻어진 생성물(4g, 7.6mmoles)의 메틸렌 클로라이드(50ml) 용액에 보론 트리플로라이드 에틸 에테르(153μl)와 t-부틸-,2,2,2-트리클로로아세트이미데이트(TBTA; 4.2g, 15.3mmoles)를 부가했다. 10분 후 반응 혼합물을 소디움 히드로카보네이트로 포화된 용액과 물로 한번 세척한 다음, 무수화하고 증발 건조시켰다. 얻어진 잔류물을 메탄올(60ml)에 용해시키고 물을 부가하여 Z-Gln(Trt)-OtBu를 침전시켰다(수율:81%).

HPLC [농도 구배(Ⅱ)(230nm)]:r. t. 17.7분; 순도 100%.

C) 질소로 포화된 200ml의 메탄올에 녹인 B)에서 생성된 화합물(2.5g, 4.3mmoles) 용액에 포름산으로 활성화된 해면 팔라듐과 포름산(5ml)에 녹인 포름산 암모늄(200mg) 용액을 부가했다. 3시간 후 촉매를 여과하여 분리해내고 메탄을 용액을 증발 건조시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트로 취하고 5% 소디움 히드로카보네이트로 한번 세척한 다음 물로 중화시켰다. 유기상을 무수화하여 소량으로 농축한 다음, 0℃로 냉각시키고 에틸 아세테이트(4M, 1.08ml)에서 1당량의 염산으로 처리했다. 석유 에테르를 추가로 부가하여 2g의 HCl·H-Gln(Trt)-OtBu를 침전시켰다(수율:100%) .

HPLC [농도 구배(Ⅱ)(230nm)]:r. t. 7.4분; 순도:100%.

D) Z-Pro-OH(1.15g, 4.6mmoles)을 메틸렌 클로라이드(15ml)에 용해시키고 DMF(250μl)에 녹인 HOBT(0.7g, 5.5mmoles)를 부가했다. 아이스 배쓰에서 이 용액에 DCCI(0.95g, 4.6mmoles)을 부가했다. 15분 후 반응 혼합물을 C)에서 생성된 화합물(2g, 4.1mmoles)이 들어 있는 플라스크에 여과시키고 TEA(587μl, 4.1mmoles)로 중화시켰다. 18시간 후 용매를 증발시키고 잔류물을 에틸아세테이트와 물 사이에 분리시켰으며, 유기상을 2% 포테슘 비설페이트, 5% 소디움 히드로카보네이트로 세척하고 물로 중화시킨 다음, 황산나트륨 상에서 무수화시켰다. n-헥산을 부가함으로써 작은 부피로 농축된 유기 용액으로부터 2.6g의 Z-Pro-Gln(Trt)-OtBu를 얻었다(수율:93%).

HPLC [농도 구배(Ⅱ)(230nm)]:r. t. 16.8분; 순도:100%.

E) D)에서 생성된 보호된 디펩티드에 C)에서와 같이 100ml의 메탄올에서 해면 팔라듐과 포름산으로 수소 첨가 반응시켰다. 촉매를 여과해 분리해내고 메탄올을 증발시킨 후, 잔류물을 에틸 아세테이트로 취하고, 5% 소디움 히드로카보네이트로 한번 세척하고 무수화시켰다. 농축된 유기상을 0℃에서 염산의 에틸 아세테이트(4M, 875μl) 용액으로 처리하고, 석유 에테르를 부가하여 2g의 HCl·H-Pro-Gln(Trt)-OtBu를 얻었다(수율:100%).

HPLC [농도 구배(Ⅱ)(230nm)]:r. t. 7.8분; 순도:100%.

F) 실시예 2의 D)에서 얻어진 가디펩티드(1.38g, 2.26ml)의 메틸렌클로라이드(15ml) 용액에 200μl의 DMF에 용해되어 있는 HOBT(382mg, 2.82mmoles)를 부가했다. 온도를 0℃로 하고 DCCI(466mg, 2.26mmoles)를 부가했다. 15분 후 이 혼합물을 E)에서 생성된 디펩티드(1.31g, 2.26mmoles)가 들어있는 플라스크에 여과시키고, TEA(318μl, 2.26mmoles)로 중화시키고 반응하도록 하룻밤을 방치했다. 용매를 증발시킨 후 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분리시키고, 유기상을 2% 포테슘 비설페이트, 5% 소디움 히드로카보네이트로 세척한 다음 황산나트륨 상에서 무수화했다. 유기상을 증발 건조시킨 다음 에틸아세테이트/n-헥산(1:1 v/v, 15ml)용액에 취하고, n-헥산을 부가하여 2.3g의 MPN-gThr(tBu)-(R,S)mLys(Boc)-Pro-Gln(Trt)-OtBu를 얻었다(수율:92%).

HPLC[농도 구배(Ⅱ)(230nm)]:r. t. 21.5 및 22.0분(두 가지의 부분입체이성질체); 순도:92.5%.

G) F)에서 생성된 역-전화된 테트라펩티드(2.13g, 1.87mmoles)를 실온에서 메틸렌 클로라이드/TFA(1:1 v/v, 40ml)에 용해시켰다. 90분 후 용매를 증발시키고, 에틸 에테르를 부가하여 조생성물을 침전시켰다. 이렇게 하여 1.416g의 MPN-gThr-(R,S)mLys-Pro-Gln-OH를 얻었다(수율:95%).

HPLC[농도 구배(Ⅰ)(230nm)]:r. t. 12.4분; 순도:91.5%.

아미노산 조성:프롤린(1) 1.0; 글루타민(1) 1.0; NH₃(3) 2.9; 펩티드 함량:92.7%. BDDA-Br(물, 0.1% TFA에서 50mM)를 변위제로서 이용하고 유속을 2.7ml/분으로 하여 다이나맥스(300Å C18, 12μm, 21.4×300mm) 컬럼 상에서 RP-DC에 의해 보호된 역-전화된 테트라펩티드를 정제했다. 이렇게 하여 1.04g의 생성물이 얻어졌다(수율:81%).

HPLC [농도 구배(Ⅰ)(230nm)]:r. t. 12.4분; 순도:100%. A에서의 농도를 0에서 20%까지로 변화시키는 농도 구배에서(20분):r. t. 17.5 및 17.8분(두 가지의 부분입체이성질체); 순도:100%.

H) G)에서 생성된 보호된 역-전화된 테트라펩티드(875mg, 1.1mmoles)를 15ml의 포름산 암모늄 수용액(0.25M, pH 3.0)에 용해시키고, 여기에 포름산 암모늄(0.5M, pH 3.0)으로 활성화된 해면팔라듐을 부가하여 반응하도록 60℃에서 15분 동안 방치했다. HPLC로 출발 화합물이 사라진 것이 확인될 때가지 반응 온도를 70℃로 올리면서 이 처리를 4번 반복했다. 그런 다음, 촉매를 여과하여 분리해내고, 수용액상을 에틸에테르로 세척하고 동결 건조시켰다. 용출 용매로서 0.015M 암모늄 아세테이트, pH 6.0(A)과 0.3M 암모늄 아세테이트, pH6.0(B)를 360분간 B의 농도를 0부터 100%까지 선형으로 변화시키고 유속을 4ml/분으로 하여 CM-세파덱스(Sephadex) C-25의 파마시아 XK26 컬럼 상에서 이온 교환법에 의해 조생성물을 정제했다. 3.7ml 단위로 분액을 수집하였다. H-gThr-(R,S)mLys-Pro-Gln-OH·AcOH(ITF 1193)을 함유하는 것으로 나타난 분액을 동결 건조하였다.

HPLC [농도 구배(Ⅳ)(230nm)]:r. t. 6.5 및 7.7분(두 가지의 부분입체이성질체를 1:1비율로 하여); 순도:99%.

아미노산 조성:프롤린(1) 1.0; 글루타민(1) 1.0; NH₃(3) 2.9; 펩티드 함량:966μmoles(515mg); 수율 88%.

본 발명의 몇몇 화합물의 생물학적 활성을 테스트했다.

쥐의 비세포에 의한 생체외 IFN-τ 생성의 자극

쥐의 비장으로부터 단일 세포의 현탁액으로서 비장 세포를 얻었다. 이와 같이 얻어진 비세포를 5%의 송아지 태아혈청(FCS)(하이클론, ST, 유타, 미국)을 함유하는 RPMI 1640 배양배지에서 최종 농도 107세포/ml로 재현탁시키고, 표시된 농도로 시험되는 화합물의 존재 하 37℃에서 24시간 동안 96-웰 플레이트(96-well plate:96개의 웰이 있는 플레이트)에 배양했다. 배양의 종료시 상등액을 수집하여 22μm 필터로 여과하고, 엘리사(ELISA) 상용 키트(젠자임, 보스톤, MA, 미국)에 의해 테스트할 때까지 -80℃로 동결시켰다.

그 결과는 표 1에 나타나 있다.

[표 1]

대조군(미처리 세포)에 대한 U/ml 및 자극 지수(IS)로서 얻어진 결과는, 본 발명의 화합물이 그 투여량에 따라 쥐의 비세포에 의한 ITF-T생성을 자극할 수 있다는 것을 보여준다. 특히, 실시예 1의 화합물은 현재의 부류 중에서 가장 강력한 화합물임을 보여줬다. 실제로 그것은 1.0μg/ml의 투여시 시토킨을 두 배로 증가시켰다.

쥐의 복막의 대식세포에 의한 IL-1 생성의 자극

가수분해된 전분(BDH 케미컬스, 풀, 도르세트, 영국) 용액을 BALB/C쥐의 복막 구멍으로, 이 쥐를 죽이기 3일전에 주입함으로써 쥐의 복막의 대식세포를 얻었다. 그런 다음 10%의 FCS를 함유하는 RPMI 1640 용액으로 복막 구멍을 세척하여 복막세포를 수집하고 10⁶세포/ml의 농도로 동일한 용액에 재현탁하여 96-웰 플레이트에 배양했다. 문제의 화합물의 존재 하에 37℃에서 96시간 동안 배양했다. 배양의 말기에 상등액을 수집하여 적절한 엘리사 상용 키트(젠자임, 보스톤, MA, 키국)로 시토킨을 투여하는데 이용했다.

그 결과는 표 2에 나타나 있다.

[표 2]

대조군에 대한 U/ml과 자극 지수로서 얻어진 결과는, 시험 화합물이 현저한 자극 효과가 있음을 나타낸다. 특히, 실시예 3의 화합물은 사용된 어떠한 투여량에서도 IL-1 생성을 약 10배(9.3<자극지수<10.7) 증가시켰다.

쥐의 복막 세포에 의한 산화질소의 자극

이전 테스트에서 기술된 바와 같이 복막 세포를 얻어 문제의 화합물과 30μg/ml 농도의 지다당류의 존재 하 37℃에서 96시간 동안 배양했다. 배양의 말기에 상등액을 수집하여 팔머 알. 엡. 제이 등, 자연, 327, 524, 1987에 기재된 화학발광 시험법으로 산화질소 농도를 측정했다.

결과는 표 3에 나타나 있다.

[표 3]

대조군에 대한 nmol/ml과 자극 지수로서 얻어진 결과는 본 발명의 화합물이, 사용된 어떠한 투여량에서도 산화질소 생성을 자극함을 보여준다. 특히, 실시예 2의 화합물은 0.01μg/ml(자극 지수=4.3)에서 이미 자극 피크를 나타냈다.

쥐의 복막의 대식세포의 레슈마니아박멸성의 활성에 대한 효과

상술된 바와 같이 수집된 복막 세포를 96-웰 편평 바닥플레이트(Nunc, Roskilled, DK)에 10⁵/100μl의 농도로 접종하고 37℃에서 24시간 배양했다. 처리의 말기에, 웰에 부착하지 않은 세포를 분리하여 제거하고, 부착된 세포는 배양 배지로 3번 세척하여 문제의 화합물과 함께 24시간 동안 배양한 다음, 레슈마니아 메이져(레슈마이아 메이져, 닐 알. 에이. 박사에 의해 공급된 PVL49 변이주, 위생과 열대약의 런던 스쿨, 런던, 영국)의 전편모충과 24시간 배양시켜 그 세포를 감염시켰다. 감염 처리의 말기에 각 웰에 RPMI 1640에 소디움도데실설페이트를 용해한 용액(0.01%) 100μl를 부가하고 플레이트를 37℃에서 30분 동안 배양했다. 30%의 FCS를 포함하는 쉬나이더의 배양배지(쉬나이더 드로소필라 배지, 깁코 실험실, 브랜드 아릴랜드, 뉴욕, 미국)를 부가했다. 각 웰에 1μCi의³H-티미딘을 부가하고 37℃에서 72시간 동안 배양했다. 세포-회수기로 세포를 수집하고 액체 신틸레이션 β-카운터로 방사성을 측정함으로써, 감염 정도와 상관 관계가 있고 결과적으로 세포의 레슈마니아박멸성의 활성과 관계있는, 복막세포 내의 살아있는 기생충에 의한 방사성의 도입을 측정했다.

그 결과는 표 4에 나타나 있다.

[표 4]

얻어진 결과는 본 발명의 화합물이 감염 정도를 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 특히, 실시예 1의 화합물이 가장 효과적임을 보여주는데, 그것은 시험에서 사용된 최소의 투여량에서 감염을 이미 70% 이상 감소시켰다.

패혈 쇼크에 대하여 생체 내 보호의 평가

체중이 20 내지 25g인 BALB/C 쥐(6마리 쥐/그룹)의 복막조직 내에 50mg/kg LPS(지다당류-시그마)를 접종했다. 대조군을 제외한 실험군에, LPS 접종 후 바로(즉, LPS와 동시에) 또는 30분 후에 0.5ml의 최종부피를 갖는 생리 용액에 용해된 본 발명의 화합물의 하나를 그 투여량을 증가시키면서 접종했다. 생존율을 측정하기 위하여 8일 동안 쥐를 체크했다. 실시예 1의 화합물은 6.2μg/쥐 내지 0.62μg/쥐의 투여시에 약 65%의 생존율을 나타내었고, 그것의 이성질체 B는 6.25μg/쥐의 투여시에 약 80% 및 62.5μg/쥐의 투여시에 약 75%의 생존율을 나타냈다.

위와 같은 측면에서, 본 발명의 화합물은 치료와 예방에서 모두 면역반응을 강화하거나 복원을 필요로 하는 모든 병리학적 및 비병리학적상황에서 유용하다. 그러므로, 본 발명의 화합물 사용의 실시예로서, 주로 패혈 쇼크의 경우에서와 같은 세균 감염, 바이러스 감염(허피스), 기생충증, 및 후천적인 면역 결핍 증후군, 노소년의 예방, 중화상, 투석, 종양 및 이식으로 인한 감염이 언급될 수 있다. 게다가 본 발명의 화합물은 백신의 보조제로서 이용될 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 본 발명의 화합물을 함유하는 약학적 조성물을 포함하여 새로운 화합물을 면역-자극제로서 사용하는 방법으로서의 용도를 제공하는 것뿐만 아니라 이 용도와 관련된 모든 산업적 측면에서의 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 목적하는 치료적 용도를 위해서, 식 Ⅰ의 화합물은, 예를 들어 “레밍스톤의 제약 과학 핸드북”(맥 출판사, ⅩⅦ판, 뉴욕, 미국)에 기술된 방법에 따라서 약제학적 조성물로서 적절하게 제형화되어 투여될 수 있다. 명백히 약량학은 치료되는 질병의 종류와 중상의 정도 및 환자의 조건(체중, 나이, 성별 등)과 같은 몇 가지 측면에 의존할 것이다.

Claims

다음 일반식 Ⅰ과 같은 역전화된 테트라펩티드 및 부분입체이성질체 형태 및 약학적으로 허용될 수 있는 그 염, 에스테르 및 아미드.

여기서 R은 수소 원자 또는 트레오닌의 측쇄이며; R₁은 아르기닌, 류신 또는 글루타민의 측쇄이고, R₂는 수소 원자 또는 대사적으로 소실될 수 있는 아실 그룹이며, 단 R₁이 아르기닌의 측쇄이면 R은 트레오닌의 측쇄일 수 없다.
제1항에 있어서, gGly-(R,S)mLys-Pro-Arg 및 하나의 부분입체이성질체임을 특징으로 하는 테트라펩티드.
제1항에 있어서, gThr-(R,S)mLys-Pro-Leu 및 하나의 부분입체이성질체임을 특징으로 하는 테트라펩티드.
제1항에 있어서, gThr-(R,S)mLys-Pro-Gln 및 하나의 부분입체이성질체임을 특징으로 하는 테트라펩티드.
면역조정 물질 및 패혈 쇼크의 예방과 치료에 유용한 제제로서 제1항에 따른 역-전화된 테트라펩티드를 사용하는 방법.
면역조절 및 패혈 쇼크의 예방과 치료에 효과적인 양의, 제1항에 따른 적어도 하나의 테트라펩티드를 단독으로 또는 약학적으로 허용될 수 있는 부형제와 복합하여 포함하는 약학적 조성물.