KR100244728B1

KR100244728B1 - 광학활성 1,4-디히드로피리딘 화합물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100244728B1
Application number: KR1019950700567A
Authority: KR
Inventors: 이시히키구니오; 나카시마다카시; 요시오카다케오; 츠네카와히로시; 아다치다카시; 오타토모미
Original assignee: 스즈키 타다오; 메루샹가부시키가이샤
Priority date: 1992-08-31
Filing date: 1993-08-31
Publication date: 2000-03-02
Anticipated expiration: 2013-08-31
Also published as: AU4981893A; US5635395A; EP0657429A4; WO1994005637A1; EP0657429B1; DE69330130D1; DE69330130T2; KR950702963A; CA2143106A1; EP0657429A1; ATE200484T1

Abstract

비스(치환 아미노알킬) 1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실레이트를 스트렙토마이세스속, 파애실로마이세스속, 보트리오디오플로디아속, 알터나리아속 또는 헬민트스포리움속에 속하는 부제 가수분해능을 갖는 미생물 또는 그의 처리물과 반응시킴으로써 (4R)-3-(치환 아미노알킬)옥시카르보닐-1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(니트로페닐)피리딘-5-카르복실산이 효율 좋게 얻어진다. 이 화합물은 협심증, 고혈압 등의 예방 또는 치료약으로서 유용한 의약품의 중요한 제조중간체로서 극히 유용하다.

Description

[발명의 명칭]

광학활성 1,4-디히드로피리딘 화합물 및 그의 제조방법

[기술분야]

본 발명은 허혈성 심질환이나 고혈압 등의 예방 및 치료약으로서 유용한 광학활성 1,4-디히드로피리딘유도체의 제조중간체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

[배경기술]

1,4-디히드로피리딘 계의 디히드로피리딘 환의 3위치와 5위치에 결합한 2개의 카르복실산 에스테르가 서로 다른 것은 그의 4위치에 부제탄소를 갖고 있어서 2종의 광학이성체가 존재한다. 최근, 이들 화합물의 생물학적 성질이 검토된 결과, 각각의 광학활성체 사이에 약리활성, 체내동태, 안정성 등에 차이가 있는 것이 보고되고 있다. [K. Tamazawa et al., J. Med. Chem. Vol. 29, 2504(1986)]. 이와 같은 부제탄소를 갖는 화합물을 의약품으로서 사용하는 경우, 생체에 대해 쓸데없는 부하를 부여하지 않는다는 의미에서 의약품으로서 바람직한 한쪽의 이성체만을 부여한다는 사고가 일반적으로 되고 있다. 이와 같은 관점에서 광학활성 1,4-디히드로피리딘 화합물을 제조하기 위한 방법이 검토되고 있다.

광학활성 1,4-디히드로피리딘유도체 합성의 일반적 방법으로서는 (4R)-1,4-디히드로피리딘 카르복실산 모노에스테르를 중간체로 하고, 여기에 바람직한 에스테르 잔기를 도입하는 방법이 알려지고 있다[A. Ashimori et al. , Chem. Pharm. Bull. Vol. 39, 108(1991)]. 이 광학활성 중간체의 (4R)-1,4-디히드로피리딘-3,5-디카르복실산 모노에스테르의 제조방법으로서는 시소(柴沼)등의 화학적 방법[Chem. Pharm. Bull. Vol. 28, 2809(1980)] 및 아지파(阿知波)등의 산소법[Tetrahedron Letters, Vol. 32, 5805(1991)] 및 Charles J. Sih 등의 효소법[Tetrahedron Letters, Vol. 32, 3465(1991)]이 알려져 있다. 그러나, 미생물적 수단에 의한 디에스테르의 직접 부제 가수분해 반응에 의한 방법은 개시되어 있지 않다.

상기 기재의 화학적 수단에 의한 광학활성(4R)-1,4-디히드로피리딘-3,5-디카르복실산 모노에스테르의 합성은 디히드로피리딘 환상의 아미노기에 보호기를 필요로 할 뿐 아니라, 가수분해 반응이 부제 가수분해하기 때문에 생성된 모노카르복실산이 라세미체이며, 라세미분할을 필요로 하는 등의 결점이 있다.

한편, 아지파 등의 방법은 디히드로피리딘 환의 3위치 및 5위치에 피바로일옥시메틸기 등이 결합한 디히드로피리딘 에스테르 유도체를 기질로서 한쪽 에스테르를 효소적으로 부제가수분해 하여 의약품의 합성중간체로서의 광학활성 디히드로피리딘 모노카르복실산 유도체로 유도되는 것이다. 그러나, 이 방법은 기질의 합성 및 피바로일옥시메틸기 등을 다른 치환기로 변환하여 의약품으로서 유용한 화합물로 유도하기까지 많은 공정을 필요로 하기 때문에 최종물까지의 수율이 그다지 양호하지 않다는 결점이 있다.

Sih등의 방법은 아지파 등의 방법에서 피바로일옥시 메틸에스테르가 아세톡시 메틸에스테르를 대체한 것뿐으로 본질적으로는 양자 다름없다.

그리하여 효율 좋은 광학활성체 (4R)-1,4-디히드로피리딘-3,5-디카르복실산 모노에스테르의 제조법의 개발이 요망되어 왔다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 미생물을 이용함으로서 (4R)-1,4-디히드로피리딘-3,5-디카르복실산 모노에스테르 유도체를 효율적으로 제조하는 방법을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 하기 식(I)

(식중, R은 저급알카노일기, 복소환카르복실기, 할로치환아세틸기, 알콕시아세틸기, 아릴옥시아세틸기, 치환 또는 비치환페닐 저급알카노일기, 페닐치환 또는 비치환저급 알케노일기, 알콕시 또는 알케닐옥시카르보닐기, 아르알킬옥시카르보닐기 또는 유기에스테르기를 나타내고, n은 2∼4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 스트렙토마이세스속, 파애실로마이세스속, 보트리오디오플로디아속, 알터나리아속 또는 헬민트스포리움속에 속하는 부제가수분해 기능을 갖는 미생물 또는 그의 처리물과 반응시킴으로서 생성하는 하기 식(Ⅱ)

(식중, R 및 n은 전술한 바와 같다)로 표시되는 광학활성 1,4-디히드로피리딘 화합물 또는 그의 염을 채취하는 것을 특징으로 하는 광학활성 (4R)-1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실산모노 에스테르 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 하기 일반식(Ⅲ)

(식중, R¹는 저급알카노일기를 나타내고, n은 2∼4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 1,4-디히드로피리딘 화합물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 하기 일반식(Ⅳ)

(식중, R¹는 저급알카노일기를 나타내고, n은 2∼4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 광학활성 1,4-디히드로피리딘 화합물 또는 그의 염을 제공하는 것이다.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

하기 일반식(I) 및 (Ⅱ)에서 R은 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 바레릴기, 이소바레릴기 등의 저급알카노일기 ; 피콜리노일기, 니코티노일기, 이소니코티노일기, 니페코티노일기, 퀴놀리노일기, 퀴녹사노일기, 페나티노일기 등의 복소환카르보닐기 ; 트리플루오로아세틸기, 클로로아세틸기, 디클로로아세틸기, 트리클로로아세틸기, 브로모아세틸기, 디브로모아세틸기 등의 할로치환아세틸기 ; 메톡시아세틸기, 에톡시아세틸기 등의 알콕시아세틸기 ; 페녹시아세틸기, 나프틸옥시아세틸기 등의 아릴옥시아세틸기 ; 페닐아세틸기, 메톡시페닐아세틸기, 페닐프로피오닐기 등의 치환 또는 비치환페닐저급알카노일기 ; 크로토노일기, 신나모일 등의 페닐치환 또는 비치환 저급알케노일기 ; 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, tert-부톡시카르보닐기, 아릴옥시카르보닐기 등의 알콕시 또는 알케닐옥시카르보닐기 ; 벤질옥시카르보닐기 등의 아르알킬옥시카르보닐기 ; 메탄술포닐기, 벤젠술포닐기, 벤질술포닐기, 톨루엔술포닐기 등의 유기술포닐기 등을 들 수 있다.

또한 4위치의 페닐기 상의 니트로기의 치환위치는 한정되지 않으며, 2위치, 3위치 및 4위치 어느 것이어도 좋다.

본 발명의 미생물 반응에 의한 제조방법에 사용되는 식(I)의 출발원료는 염으로서도 사용될 수 있다. 이와 같은 염으로서는 아세트산, 타르타르산, 벤젠술폰산 등의 유기산부가염 ; 염산, 황산 등의 무기산부가염 등을 사용할 수 있다.

식(I)로 표시되는 출발원료는 그 자체 공지의 방법에 따라 제조할 수 있다.

즉, 하기식(V)

HO - (CH₂)_n- NHR (V)

(식중, R은 저급알카노일기, 복소환카르보닐기, 할로치환아세틸기, 알콕시아세틸기, 아릴옥시아세틸기, 치환 또는 비치환페닐저급알카노일기, 페닐치환 또는 비치환저급알케노일기, 알콕시 또는 알케닐옥시카르보닐기, 아르알킬옥시카르보닐기 또는 유기술포닐기를 나타내고, n은 2∼4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 아미노기를 보호한 에탄올아민유도체, 3-아미노프로파노일 유도체 또는 4-아미노부탄올유도체를 디케텐과 반응하여 얻어진 하기식(Ⅵ)

(식중, R 및 n은 전술한 바와 같다)로 표시되는 아세토아세트산 에스테르체를 암모니아와 함께 니트로벤즈알데히드와 가열축합시킴으로서 제조할 수 있다. 또는 일반식(Ⅵ)로 표시되는 아세토아세트산 에스테르와 니트로벤즈알데히드를 미리 축합시켜 얻어지는 하기식(Ⅶ)

(식중, R 및 n은 전술한 바와 같다)로 표시되는 α-벤질리덴-β-케토에스테르체를 다시 일반식(Ⅵ)로 표시되는 아세토아세트산 에스테르와 암모니아 존재하에 축합시킴으로서 제조할 수 있다. 또는 일반식(Ⅵ)으로 표시되는 아세토아세트산 에스테르와 암모니아를 반응시켜 얻어진 하기식(VⅢ)

(식중, R 및 n은 전술한 바와 같다)

로 표시되는 β-아미노크로톤산 에스테르를 니트로벤즈알데히드와 함께 다시 일반식(Ⅵ)으로 표시되는 아세토아세트산 에스테르와 축합시킴으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 반응에 의한 제조방법의 원료화합물로서 바람직하게 사용될 수 있다. 일반식(I)에서 R이 저급알카노일기인 화합물, 즉 하기식(Ⅲ)

(식중, R¹은 저급알카노일기를 나타내고, n은 2∼4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 신규 1,4-디히드로피리딘 화합물을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 식(Ⅲ)의 화합물 또는 그의 염을 상기 미생물 반응에 의한 제조방법에 걸어 생성되는 하기식(Ⅳ)

(식중, R¹및 n은 전술한 바와 같다)로 표시되는 신규 광학활성 1,4-디히드로피리딘 화합물 또는 그의 염을 제공하는 것이다.

상기 미생물 반응에 사용되는 미생물로서는 스트렙토마이세스속, 파애실로마이세스속, 보트리오디오플로디아속, 알터나리아속 또는 헬민트스포리움속에 속하는 부제가수분해능을 갖는 미생물이 이용될 수 있다. 이와 같은 미생물로서는 예컨대 FI-4주, FI-741주, FI-1007주 및 A-914주를 들 수 있다. 이들 균의 형태학적 특징은 아래와 같다.

[FI-4주]

포테토 덱스트로우즈 한천배지상에 엷은 회백색의 면상(綿狀)의 균사층을 형성하고, 배양이 진행되면 흑회색으로 된다. 분생사(分生絲)는 분생사모양의 꼭대기의 작은 구멍에서 생기는 폴로형 분생사이며, 격벽에 의해 분단되어 벽돌을 쌓아놓은 형상을 나타낸다. 분생사의 저부는 둥글고, 꼭대기는 뾰족하며, 색은 갈색이다.

[FI-741주]

포테토 덱스트로우즈 한천배지상에 양호하게 발달한 백색면상의 균사층을 형성하고, 배양이 진행하면 갈색으로 된다. 분생자는 꼭대기가 개구한 분생자 껍질로 불리는 구형의 기관 내에 형성된다. 분생자는 상당히 길고, 평활하며, 점성을 나타내지 않는다. 성숙하면 갈색으로 되고, 세포벽이 두껍게 된다.

[FI-1007주]

포테토 덱스트로우즈 한천배지상에서 회백색의 균사층을 형성하고, 배양이 진행하면 기부는 약간 핑크 빛의 갈색으로 된다. 분생자는 분생자 모양의 최선단부의 가지(피아라이드)로부터 출현하는 피아로 형이다. 분생자 모양은 거의 분지하지 않으나, 피아라이드는 잘 분지하고, 가늘고 긴 구조를 취한다.

이상의 형태학적 특성을 기초로 하여 The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture(J. A. vonARX 저 1970)에서 검색한 결과, FI-4는 알터나리아 에스피(Alternaria sp.), FI-741은 보트리오디오플로디아 에스피(Botryodioplodia sp.), FI-1007은 파애실로마이세스 에스피(Paecilomyces sp.)로 동정되었다.

[A-914주]

ISP-2 한천배지상에서 담갈색의 견고한 콜로니를 형성한다. 배양이 진행하면 콜로니 표면은 약간 회색을 띤 녹색으로 된다. 멜라닌 색소나 기타 확산성 색소를 만들지 않는다. 기중균사는 분단되지 않으며 양호하게 발달하고, 기균사가 존재한다. 기균사상에 나선상으로 연쇄한 분생자를 다량 착색한다. 분생자의 표면은 평활하다.

세포벽 성분에 L-히드록시프롤린을 이용할 수 없다. 100㎍/㎖의 올레안드마이신에 감수성이다.

이상의 특징을 기초로 하여 Bergey's Mannual of Systematic Bacteology Volume 4에서 검색한 결과, A-914는 스트렙토마이세스 비리도스포루스(Streptomyces viridosporus)로 동정되었다.

FI-4주는 1993년 3월 18일 일본공업 기술원 생명공학기술연구소에 기탁되어 수탁번호로서 FERM P-13535가 부여되었다. 그후, 1993년 6월 14일에 부타페스트조약에 의한 기탁으로 이관되어 기탁번호로서 FERM BP-4335가 부여되었다. FI-741주, FI-1007주 및 A-914주는 각각 1992년 7월 29일에 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되고, 수탁번호로서 FERM P-13097, FERM P-13096 및 FERM P-13098이 부여되었다. 그후, 1993년 6월 14일에 각각 부타페스트조약에 의한 기탁으로 이관되어 기탁번호로서 각각 FERM BP-4333, FERM BP-4332, FERM BP-4334가 부여되었다.

또한, 본 발명에 이용할 수 있는 미생물로서 스트렙토마이세스 에스피-ATCC 11862 및 헬민트스포리움 조나담 IFO 6678을 들 수 있다. 이들 미생물은 각각 아메리칸 타잎 컬처 콜렉션 및 (재)발효연구소에 보관되어 있으며 용이하게 입수할 수 있다.

상기 미생물을 배양하는 배지는 특별히 한정되지 않으며, 통상의 미생물의 배양에 사용할 수 있는 것이면 좋다. 예를들면 탄소원으로서는 상기 미생물의 이용가능한 것이면, 어느 것이라도 사용될 수 있고, 구체적으로는 글루코오즈, 푸락토오즈, 슈크로오즈, 덱스트린 등의 당류 ; 글리세롤, 소르비톨 등의 당알코올 ; 푸말산, 시트르산 등의 유기산을 사용할 수 있다. 이들 탄소원의 배지에의 첨가량은 통상 0.1 내지 10% 정도로 하는 것이 바람직하다. 질소원으로서는 예를 들면 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 암모늄염 ; 푸말산암모늄, 시트르산 암모늄 등의 유기암모늄염 ; 육즙, 효모엑기스, 콘스팁 리커, 카제인 가수분해물 등의 천연 유기질소원 등을 사용할 수 있다. 그중, 유기질소원은 많은 경우, 탄소원으로서도 겸용될 수 있다. 질소원의 첨가량은 통상 0.1 내지 10%가 적당하다. 유기염류로서는 예를 들면 인산칼륨, 인산나트륨 등의 인산알칼리 금속염 ; 염화칼륨, 염화나트륨 등의 염화알칼리 금속염 ; 황산마그네슘, 황산 제 1 철 등의 황산금속염 등을 사용할 수 있다. 그의 사용량은 0.001내지 1%의 범위가 적당하다.

미생물의 배양은 상기 배양에서 20내지 40℃, 바람직하기로는 28내지 37℃, pH는 5내지 9, 바람직하기로는 6∼8에서 호기적 조건하에서 실시되면 좋다.

미생물 반응은 미생물 또는 그의 처리물과 반응시킴으로서 수행된다. 미생물과의 반응은 통상 미생물의 배양물과의 반응이며, 미생물 배양물로서는 배양된 미생물균체, 배양여액 및 배양액을 들 수 있다. 미생물처리물이란 배양된 미생물 균체의 처리물, 배양여액 및 배양액 등의 처리물이며, 이 미생물 균체의 처리물로서는 건조균체, 예를 들면, 동결건조균체, 분무건조균체 또는 유기용매, 예를 들면 아세톤, 톨루엔, 메탄올, 부탄올 등으로 처리한 균체, 균체추출물, 고정화처리물을 들 수 있다. 또한, 배양여액 및 배양액의 처리물로서는 배양액의 농축물, 건조분말, 분무 건조분말을 들 수 있다. 또한, 배양균체 및 배양여액에서 효소를 분리, 정제하여 이 화합물의 처리물로서 사용할 수 있다.

본 발명을 실시하기 위하여는 배지에 미생물을 접종한 후, 예를 들면 20내지 40℃에서 12내지 120시간 배양함으로써 미생물을 1㎖중에 10⁶내지 10¹⁰개를 함유하는 균주배양액을 얻는다. 이 배양액에 완료화합물인 식(I)의 화합물을 통상 최종농도가 0.5mg/㎖ 내지 5mg/㎖ 되도록 물 또는 용해보조제에 용해하여 가하고, 통상 28℃에서 18시간 내지 72시간 반응시킨다. 이어서 pH를 5로 조정후, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 부탄올 등의 유기용매 등으로 추출하고, 결정화하던가 또는 전용, 침전화 등의 수단에 의해 목적하는 광학활성인 식(Ⅱ)의 화합물을 얻을 수 있다.

여기서 사용되는 용해 보조제로서는 각종 유기용매를 사용할 수 있다. 이러한 유기용매로서는 아세톤, 메틸에틸케톤, 디메틸술폭시드, 디옥산, N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴 등을 들 수 있으며, 이들은 단독, 또는 2종류 이상을 사용하여도 좋다. 그의 첨가량은 배지에 대하여 3내지 5% 범위가 바람직하다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명하나, 본 발명은 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

(4R)-1,4-디히드로-2,6-디메틸-3-(2-니코티노일아미노에틸)옥시카르보닐-4-(3-니트로페닐)피리딘-5-카르복실산의 제조

1-1) 스트렙토마이세스 비리도스포루스 A-914에 의한 제조.

스트렙토마이세스 비리도스포루스 A-914를 30 ㎖의 C배지(포테토 스타치 2%, 에스산미이트 2%, 효모엑기스 0.5%, NaCl 0.25%, CaCO₃0.32%, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.0005%, MnSO₄ㆍ4H₂O 0.0005%, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.0005%, pH 7.4)를 함유하는 250 ㎖플라스크에 식균하고, 28℃에서 3일간 배양했다. 얻어진 배양액에 1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(3-니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실산 비스(2-니코티노일아미노에틸)에스테르ㆍ2염산염 60 mg을 증류수 0.75 ㎖에 용해하여 가하고, 다시 2일간, 28℃에서 진탕을 계속했다. 이 반응 혼합물에 1N 염산을 가하고, pH 5.0으로 한 후, 에틸아세테이트 30 ㎖로 추출했다. 유기층을 0.1N 수산화나트륨수용액(20 ㎖×3)으로 분액역추출했다. 이 수층에 1N 염산을 가하고, pH 5.0으로 한 후, 에틸아세테이트 30 ㎖로 분액 추출했다. 이 유기층을 포화식염수로 세정후, 무수 황산나트륨으로 건조했다. 유기층을 감압 농축후, 이 농축액을 분취용 TLC 플레이트에 흡착시키고, 클로로포름 : 메탄올 : 아세트산(50 : 5 : 1)로 전개하고, Rf 치 0.22에서 UV 흡수를 나타내는 용출 획분을 농축 건고하면 목적하는 표제 화합물이 18.0 mg 얻어진다.

이 물질의 광학 순도는 다이셀 공업사 광학 분할용 컬럼, 키랄 AGP(4 mm×100 mm)를 사용한 HPLC[이동상 ; 0.6% 이소프로판올 - 0.01 M 인산 완충액(pH 7.1), 유속 ; 0.7 ㎖/min]에 의해 분석했다. 그 결과, 광학순도는 100%이며, 유지시간은 4.7분을 나타냈다.

NMR(CDCl₃) δ;

2.37(3H, s), 2.39(3H, s), 3.6-3.8(2H, m), 4.2-4.4(2H, m), 5.18(1H, s), 6.74(1H, br), 7.30(1H, t, J=8.0Hz), 7.43(1H, dd, J=5.0＆8.0Hz), 7.62(1H, d, J=8.0Hz), 7.94(1H, dd, J=2.0＆8.0Hz), 8.10(1H, t, J=2.0Hz), 8.17(1H, dt, J=8.0＆1.5Hz), 8.68(1H, dd, J=1.5＆5.0Hz), 8.91(1H, d, J=1.5Hz)

FAB-MS(m/z) ; 467(M+H)⁺

1-2) 스트렙토마이세스 에스피-ATCC 11862에 의한 제조.

스트렙토마이세스 에스티-ATCC 11862를 사용하여 실시예 1-1)과 동일하게 반응처리하여 4 mg의 원료로부터 목적 광학 활성 모노카르복실산 0.7 mg을 얻었다.

1-3) 보트리오디오플로디아 에스티-FI-741에 의한 제조.

보트리오디오플로디아 에스티-FI-741을 30 ㎖의 FI 배지(포테토 스타치 2%, 에스산미이트 2%, KH₂PO₄0.1%, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.05%, 글루코오즈 1%, 아데카놀 LG 109 0.05%)를 함유하는 250 ㎖의 삼각 플라스크에 식균하고, 28℃에서 3일간 배양했다. 얻어진 배양액제, 1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(3-니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실산 비스(2-니코티노일아미노에틸)에스테르ㆍ2염산염 60 mg을 증류수 0.75 ㎖에 용해하여 가하고, 다시 2일간, 28℃에서 계속 진탕했다. 이하, 실시예 1-1)과 동일하게 처리하면 광학순도 100%의 표제화합물이 8 mg 얻어졌다.

1-4) 파애실로마이세스 에스피-FI-1007에 의한 제조.

파애실로마이세스 에스피-FI-1007을 30 ㎖의 FI 배지(포테토 스타치 2%, 에스산미이트 2%, KH₂PO₄0.1%, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.05%, 글루코오즈 1%, 아데카놀 LG 109 0.05%)를 함유하는 250 ㎖의 삼각플라스크에 식균하고, 28℃에서 3일간 배양했다. 얻어진 배양액에 1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(3-니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실산 비스(2-니코티노일아미노에틸)에스테르ㆍ2염산염 60 mg을 증류수 0.75 ㎖에 용해하여 가하고, 다시 2일간, 28℃에서 계속 진탕했다. 이하 실시예 1-1)과 동일하게 처리하면 광학 순도 100%의 표제화합물이 10 mg 얻어졌다.

1-5) 기타 균에 의한 제조

알터나리아 에스피-FI-4 및 헬민트스포리움 조나담 IFO 6678주를 사용하여 실시예 1-3)과 동일하게 반응처리하고 TLC에 의해 분석하여 목적하는 모노카르복실산을 확인했다.

[실시예 2]

1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(3-니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실산 비스(2-아세트아미드에틸)에스테르의 제조

N-아세틸에탄올아민 25 g의 디옥산 100 ㎖ 용액에 트리에틸아민 0.34 ㎖를 가하고, 디케텐 18.7 ㎖를 천천히 적하했다. 발열반응이 종료한 후, 농암모니아수 8.1 ㎖ 및 m-니트로벤즈알데히드 18.3g을 가하고, 80℃의 오일용액중 17시간 가열 교반했다.

감압하에 용매를 증류하고, 얻어진 잔사를 700 g의 실리카겔을 충진한 컬럼에 전개제로서 톨루엔-아세톤 혼합용매(혼합비 2:1)를 사용하여 정제하여 목적물 24 g을 얻었다.

NMR(CDCl₃) δ;

1.98(6H, s), 2.36(6H, s), 3.48(2H, m), 3.60(2H, m), 3.95(2H, m), 4.20(2H, m), 5.11(1H, s), 6.67(1H, s), 6.85(2H, t, J=6Hz), 7.40(1H, t, J=8Hz), 7.70(1H, td, 1.2＆8Hz), 8.00(1H, td, J=1.2＆8Hz), 8.23(1H, t, J=2Hz)

FAB-MS(m/z) ; 489(M+H)⁺

[실시예 3]

(4R)-3-(2-아세트아미드에틸)옥시카르보닐-1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(3-니트로페닐)피리딘-5-카르복실산의 제조

3-1) 파애실로마이세스 에스피-FI-1007에 의한 제조

파애실로마이세스 에스피-FI-1007을 300 ㎖의 FI 배지(포테토 스타치 2%, 에스산미이트 2%, KH₂PO₄0.1%, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.05%, 글루코오즈 1%, 아데카놀 LG 109 0.05%)를 함유하는 250 ㎖의 삼각 플라스크에 식균하고, 28℃에서 3일간 배양했다. 얻어진 배양액에 1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(3-니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복산비스(2-아세트아미드에틸)에스테르 60 mg을 디메틸술폭시드 0.75 ㎖에 용해하여 가하고, 다시 28℃에서 2일간 계속 진탕했다. 이 반응혼합물에 1N 염산을 가하고, pH 3.0으로 조정후, 에틸아세테이트 30 ㎖로 추출했다.

이 유기상을 0.1 M 수산화나트륨 20 ㎖로 역추출했다. 이 추축액의 pH를 3.0으로 조정후, 에틸아세테이트 20 ㎖로 추출, 포화식염수로 세정, 무수황산나트륨으로 건조했다. 유기산을 농축후, 조제용 TLC 플레이트에 흡착시키고, Rf 치가 0.22로 UV 흡수를 나타내는 획분을 감압 건고하면 목적하는 표제화합물이 10 mg 얻어진다.

이 물질의 광학 순도는 다이셀 공업사제 광학 분할용 컬럼 키랄 AGP(4 mm×100 mm)를 사용한 HPLC[이동상 ; 0.35% 이소프로판올 - 0.01M 인산완충액(pH 4.4), 유속 ; 0.8 ㎖/min]로 분석했다. 그 결과, 광학 순도는 100%이며, 유지시간은 14.3분을 나타냈다.

NMR(CDCl₃) δ;

1.91(3H, s), 2.34(6H, s), 3.40(2H, t, J=5.5Hz), 4.0-4.2(2H, m), 5.10(1H, s), 7.44(1H, t, J=8.0Hz), 7.66(1H, td, J=1.0, 2.0＆8.0Hz), 7.99(1H, td, J=1.0, 2.0＆8.0Hz), 8.11(1H, t, J=2.0Hz)

FAB-MS(m/z) ; 404(M+H)⁺

또한, 이 물질을 디아조메탄으로 처리하여 얻어진 메틸 에스테르체는 아래의 NMR 스펙트럼을 나타냈다.

NMR(CD₃OD) δ;

1.90(3H, s), 2.30(3H, s), 2.33(3H, s), 3.40(2H, t, J=5.9Hz), 3.63(3H, s), 4.04(1H, dd, J=11.4＆5.9Hz), 4.13(1H, dd, J=11.4＆5.9Hz), 5.08(1H, s), 7.45(1H, t, J=8Hz), 7.65(1H, d, J=8Hz), 8.00(1H, d, J=8Hz), 8.09(1H, s)

표제 화합물의 (R)-체 표품을 아래와 같이 제조했다. 즉, 시소(柴沼)등의 보고[Chem. Pharm. Bull., Vol. 28(9), 2809∼1812(1980)]기재의 방법에 의해 조제한 (S)-(+)-1,4-디히드로-2,6-디메틸-5-메톡시카르보닐-4-(3-니트로페닐)-3-피리딘카르복실산 5 mg을 테트라히드로푸란 0.5 ㎖에 용해후, 클로로포름산 이소부틸 2 ㎕를 가하고, 10분간 교반한 후, 트리에틸아민 6 ㎕ 및 N-아세틸에탄올아민 30 ㎕를 가하고, 다시 2시간 교반했다. 반응 혼합물에 트리아세테이트 5 ㎖를 가하고, 수세하여 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조후, 용매를 증류했다. 얻어진 잔사를 분취용 실리카겔 TLC(전개계 ; 톨루엔-아세톤=1:1)로 정제하여 3 mg의 (R)-체 표품을 얻었다. 상기 광학 분할용 컬럼에서 동일한 유지시간(14.0분 ; 이동상 2.5% 이소프로판올/0.01 M 인산완충액(pH 7.1), 유속 ; 0.8 ㎖/min)을 나타냈다. 또, (S)-체에서는 동일조건에서 8.4분의 유지시간을 나타냈다.

또한, 이 물질 10.0 mg을 1N 나트륨메톡시드의 메탄올 용액 1 ㎖에 용해하고, 40℃의 유욕중, 5시간 가열했다. 반응 혼합물에 냉각하, 1N 염산을 가하여 pH 2로 한 후, 증류수 5 ㎖ 및 에틸아세테이트 5 ㎖를 가하여 분액했다. 유기상을 수세후 망초로 탈수건조하고, 용매는 감압 증류했다. 잔류물을 분취용 TLC로 정제하여 얻은 메틸에스테르체 8.0 mg의 이화학적 성상은 하기에 나타난 바와 같이 상기 시소(柴沼)등의 방법에 의해 얻어진 (R)-(-)-1,4-디히드로-2,6-디메틸-5-메톡시카르보닐-4-(3-니트로페닐)-3-피리딘 카르복실산과 일치했다.

¹H-NMR(CD₃OD) δ;

8.09(1H, t, J=2.2Hz), 7.99(1H, td, J=8.1, 2.2＆1.1Hz), 7.64(1H, d, J=1.1Hz), 7.44(1H, t, J=8.1Hz), 5.09(1H, s), 8.62(3H, s), 2.34(3H, s), 2.88(8H, s) ;

[α]²⁷D : -32.0° (c0.30, 메탄올) ;

[α]²⁷D : -22.3°(c0.30, 아세톤) ;

MS : FAB(neg.) 331(M-H)

3-2) 기타 균에 의한 제조

스트렙토마이세스 에스피-A-914 및 스트렙토마이세스 에스피-ATCC 11862를 각각 C 배지(포테토스타지 2%, 에스산미이트 2%, 효모엑기스 0.5%, NaCl 0.25%, CaCO₃0.32%, FeSO₄ㆍ7H₂O 0.0005%, MnSO₄ㆍ4H₂O 0.0005%, ZnSO₄ㆍ7H₂O 0.0005%, pH 7.4)를 함유하는 250 ㎖ 플라스크에 식균하고, 28℃에서 3일간 배양했다. 얻어진 배양액 각 2 ㎖에 1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(3-니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실산 비스(2-아세트아미드에틸)에스테르 4 mg의 디메틸술폭시드 용액 50 ㎕를 가하고, 다시 28℃에서 2일간 계속 진탕했다. 반응 혼합물에 1N 염산을 가하여, pH 3.0으로 조정한 후, 에틸아세테이트로 추출했다. 얻어진 유기층으로부터 목적하는 광학활성 모노카르복실산을 각각 0.5 mg을 얻었다.

헬민트스포리움 조나담 IFO 6678 및 보트리오디오플로디아 에스피-FI-741을 각각 FI 배지(포테토 스팁 2%, 에스산미이트 2%, KH₂PO₄0.1%, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.05%, 글루코오즈 1%, 아데카놀 LG 109 0.05%)로 식균하고, 28℃에서 3일간 배양했다. 얻어진 배양액에 1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(3-니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실산 비스(2-아세트아미드에틸)에스테르의 디메틸술폭시드 용액을 가하고, 다시 28℃에서 2일간 계속 진탕했다. 실시예 3-1)과 동일하게 처리하고 TLC에 의해 분석하여 목적하는 모노카르복실산을 확인했다.

[산업상이용가능성]

본 발명의 미생물 반응에 의한 제조방법에 의해 간편하고, 고광학 순도의 일반식(Ⅱ)로 표시되는 화합물 또는 그의 염이 제공된다. 이들로부터 허혈성 질환이나 고혈압 등의 질환에 유효한 광학활성 1,4-디히드로피리딘유도체, 예를 들면 (4R)-(2-니코티노일)에틸(3-니트로옥시)프로필 1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(3-니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실레이트["다카하시 등, Jpn. J. Pharmacol., vol 58, Suppl, I, p399(1992)"]등의 제조의 효율화가 달성된다.

Claims

하기 일반식(I)

(식중, R은 저급알카노일기, 복소환카르복실기, 할로치환아세틸기, 알콕시아세틸기, 아릴옥시아세틸기, 치환 또는 비치환페닐 저급알카노일기, 페닐치환 또는 비치환저급 알케노일기, 알콕시 또는 알케닐옥시카르보닐기, 아르알킬옥시카르보닐기 또는 유기에스테르기를 나타내고, n은 2∼4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 스트렙토마이세스속, 파애실로마이세스속, 보트리오디오플로디아속, 알터나리아속 또는 헬민트스포리움속에 속하는 부제가수분해 기능을 갖는 미생물 또는 그의 처리물과 반응시킴으로서 생성하는 하기 식(Ⅱ)

(식중, R 및 n은 전술한 바와 같다)로 표시되는 광학활성 1,4-디히드로피리딘 화합물 또는 그의 염을 채취하는 것을 특징으로 하는 광학활성 (4R)-1,4-디히드로-2,6-디메틸-4-(니트로페닐)피리딘-3,5-디카르복실산모노 에스테르 유도체의 제조방법.
하기 일반식 (Ⅲ)

(식중, R¹는 저급알카노일기를 나타내고, n은 2∼4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 1,4-디히드로피리딘 화합물.
하기 일반식(Ⅳ)

(식중, R¹은 저급알카노일기를 나타내고, n은 2∼4의 정수를 나타낸다)로 표시되는 광학활성 1,4-디히드로피리딘 화합물.