KR100235315B1 - 융합단백질을 이용한 인성장호르몬의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양괴사인자를 융합파트너로 하여 대장균에서 인성장호르몬 (human growth hormone, hGH)을 고수율로 생산하는 제조방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 종양괴사인자의 일부분과 인성장호르몬을 포함하는 융합단백질 유전자를 포함하는 발현 벡터, 그 발현 벡터로 형질전환된 미생물 그리고 발현된 융합단백질로부터 인성장호르몬을 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 발현 벡터는 종양괴사인자-α의 N-말단의 8번째에서 12번째에 해당하는 아미노산으로 구성된 펩타이드, 그의 C-말단에 10개의 히스티딘으로 된 폴리히스티딘 서열, 엔테로키나제 효소에 의해 특이적으로 절단되는 아스파라진산-아스파라진산-아스파라진산-아스파라진산-라이신(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) 서열 및 인성장호르몬 등을 코우딩하는 유전자를 포함한다.

본 발명의 제조방법에 의하면, N-말단에 메치오닌이 없는 천연형 인성장호르몬을 고수율로 용이하게 생산할 수 있다.

Description

융합단백질을 이용한 인성장호르몬의 제조방법

본 발명은 종양괴사인자를 융합파트너로 하여 인성장호르몬 (human growth hormone, hGH)을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 종양괴사인자의 일부분과 인성장호르몬의 융합 단백질 유전자를 포함하는 발현 벡터, 그 발현 벡터로 형질전환된 미생물 그리고 이로부터 발현된 융합단백질로부터 인성장호르몬을 정제하는 방법에 관한 것으로, 상기 발현 벡터는 폴리히스티딘 서열 및 엔테로키나제 절단 부위 등을 코우딩하는 유전자를 포함하여 이를 이용하면 N-말단에 메치오닌이 없는 천연형 인성장호르몬을 고수율로 용이하게 생산할 수 있다.

인성장호르몬(human growth hormone)은 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성되고 아미노 말단이 페닐알라닌-프롤린-트레오닌 (Phe-Pro-Thr)의 서열로 이루어져 있는 분자량 22,125 의 폴리펩티드 호르몬으로서, 단백질 합성, 세포증식 및 대사에 작용하여 인체의 정상적인 성장 및 유즙 분비 등에 중추적인 역할을 담당한다. hGH 는 이의 결핍으로 인한 어린이 왜소증 치료에 널리 사용되는 한편, hGH 결핍 성인 환자에게도 대체 투여하는 것으로 알려져 있다 (Raben, M. S. (1958)J. Clin. Endocr., 18, 901).

인성장호르몬은 종래에 죽은 사람의 뇌하수체에서 추출 및 정제하여 사용되어 왔으나 생산되는 양이 극히 제한되어 모든 환자에게 공급되는데 어려움이 있었다. 또한 뇌하수체에서 분리한 인성장호르몬을 접종받은 어린이 4명이 바이러스에 감염되어 사망했다고 밝혀져, 미국 식품 의약국에서 상기의 방법으로 생산된 인성장호르몬의 사용을 금지시켰다 (Science,234, 22, 1986). 따라서 최근에는 유전자 재조합 방법으로 대장균 및 효모 등에서 인성장호르몬을 발현시켜 정제하려는 많은 시도가 이루어졌으며, 이러한 인성장호르몬이 실제로도 임상에서 이용되고 있다 (대장균의 경우, 대한민국 특허공고 제 89-1244 호 및 제 87-701 호, 특허공개 제 87-2258 호 및 제 84-8695 호 참조; 효모의 경우, 대한민국 특허공고 제 92-99 호, 특허공개 제 90-9973 호 및 제 90-9976 호 참조).

유전자 재조합 방법으로 사람 또는 동물장기에서 어렵게 얻어지던 여러 중요한 단백질들을 미생물에서 생산하려면 목적 단백질의 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 재조합 발현 벡터를 얻고 이를 적당한 숙주세포에 형질전환시켜 배양함으로써 이를 생산한다. 그러나 목적 단백질을 대장균에서 직접 발현시키는 경우, 생산되는 단백질이 숙주세포에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 분해되는 현상이 나타나거나 (Gottesmann, S. (1989)Annu. Rev. Genet. 23, 163-198), N-말단에 메치오닌이 첨가된 형태로 만들어져 이를 천연형 단백질로 전환시키는 단계가 필요하다.

구체적으로 숙주세포로 대장균을 이용하는 경우, 만들고자 하는 단백질이 대장균내의 단백질 분해효소에 의해 분해되어 수율이 낮아지는 경우가 많으며, 특히 분자량 10,000 이하의 작은 크기의 폴리펩타이드의 발현에서 이러한 경향이 심한 것으로 알려져 있다 (Wetzel, R. & Goeddel, D. V.,Peptides5, 1-64, 1983; Gottesmann, S. (1989)Annu. Rev. Genet.23, 163-198). 이러한 현상을 줄이기 위해 목적 단백질을 세포 내에 불용성 응집체 (inclusion bodies) 형태로 발현하는 방법이 사용되는데, 이 때 단백질을 활성형으로 만들기 위해 구아니딘-하이드로클로라이드 (guanidine hydrochloride) 또는 우레아 (urea)와 같은 변성제 (denaturant) 등을 사용하여 희석 등을 통한 리폴딩 (refolding) 과정을 거치게 된다. 불용성 응집체로의 생산은 총불용성 단백질내에서 목적 단백질이 차지하는 비중이 상대적으로 높아 정제 목적으로 이용되기도 한다 (Pilanciski, W. P. et al. (1984)Bio/Technology2, 356-360; Cabradila, C. D. et al. (1986)Bio/Technology4, 128-133). 그러나 이후 거쳐야하는 리폴딩 과정은 아직까지 많은 문제점이 있어 생산 수율을 감소시키는 원인이 되기도 한다 (Marston, F. A. (1986)Biochem. J.240, 1-12; Mitraki, A. and King, J. (1989)Bio/Technology7, 690-697).

또한, 대장균내에서 발현되는 목적 단백질의 분해를 막고 안정성을 높여 수율을 향상시키기 위한 연구가 진행되어 목적 단백질을 대장균에서 융합단백질의 형태로 발현시키는 방법이 보고되었다 (Ulman, A. (1984)Gene29, 27-31; Nilsson, B. et al. (1985)EMBO J.4, 1075-1080; Di Guan et al. (1988)Gene67, 21-30; La Vallie, E. R. et al. (1993)Bio/Technology11, 187-193).

융합단백질은 보통 선택된 숙주에서 풍부하게 생산되는 것으로 알려진 단백질에 만들고자 하는 폴리펩타이드를 연결시킨 형태로 생산하는데, 지금까지 숙주에서 풍부하게 생성되는 것으로 알려진 단백질로는 베타-갈락토시다제 (β-galactosidase), 단백질 A (protein A), 글루타치온 에스-전달효소 (glutathione S-transferase) 등이 있다. 그러나 상기한 단백질을 융합파트너로 이용하는 경우 이들 융합단백질은 친화 크로마토그라피 등으로 용이하게 정제될 수 있는 장점이 있는 반면, 융합파트너가 제조하고자 하는 폴리펩타이드에 비해 상대적으로 크기가 커서 융합 부분의 크기에 따라 펩타이드의 수율이 현저히 떨어진다는 단점이 있다.

한편 인성장호르몬은 191개의 아미노산으로 이루어진 당화가 되어있지 않은 단백질로서, 진핵세포에서 번역된 다음 변형과정 없이도 활성을 나타낼 수 있어 대장균과 같은 원핵생물을 이용하여 대량 생산할 수 있고 실제로 메치오닐-hGH 가 대장균에서 생산됨이 보고되었다 (Goeddel, D. V. et al. (1979)Nature281, 544-548). 그러나 목적 단백질을 대장균에서 리더 펩타이드 없이 직접 발현시키는 경우 N-말단에 메치오닌이 첨가되어 인간이나 기타 동물에 적용되는 경우 면역 반응 (immunogenic)이 유발되거나 불안정하여 (unstable form) 본래의 단백질 기능을 수행하지 못하는 경우가 발생할 수 있다. 따라서 재조합 단백질을 천연형 단백질과 동일한 형태로 제조하는 방법을 개발하는 것은 매우 중요하다.

N-말단에 메치오닌이 제거된 천연형 인성장호르몬을 제조하기 위해 유전공학을 이용한 여러 방법들이 보고되었다 (Hsiung, H. M. et al. (1986)Bio/Technology4, 991-995; Chang, C. N. et al. (1987)Gene53, 189-196; Kato, C. et al. (1987)Gene54, 197-202). N-말단의 메치오닌이 제거된 천연형 인성장호르몬을 제조하는 방법은 크게 인성장호르몬을 세포밖 또는 페리플라즘 (periplasmic space)으로 분비시키는 방법 (Hsiung, H. M. et al. (1986)Bio/Technology4, 991-995; Nakayama, A. et al. (1987)J. Biotechnol.5, 171-179; Gray, G. L. et al. (1984)Bio/Technology2, 161-165) 또는 융합단백질의 형태로 세포내에 떨어뜨린후 리폴딩 과정 및 효소 처리 등으로 천연형 인성장호르몬을 생산하는 방법 (Franchi, E. et al. (1991)J. Biotechnol.18, 41-54) 등으로 나눌 수 있다. 그러나 이들 방법은 분비되는 양이 적거나, 발현율이 낮은 단점이 있다.

종양괴사인자 (tumor necrosis factor, TNF)는 대식세포 등에서 분비되는 사이토카인의 일종으로서 항암작용 (Aggarwal, B. B. (1987)Drugs of the Future891-898) 등을 포함한 여러 생물학적 활성을 지니고 있다. 종양괴사인자는 157개의 아미노산으로 구성되어 있는 베타-쉬이트 구조를 갖는 단백질로서 대장균내에서 높은 발현율을 가지고 안정적으로 생산되는 것으로 알려져 있다 (Pennica, D. et al. (1984)Nature312, 724-729; Pennica, D. et al. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82, 6060-6064).

본 발명자들은 종양괴사인자의 전체 또는 일부 서열을 융합파트너로 이용하면 융합 부분의 크기를 기존방법에 비해 현저히 감소시킴으로 수율이 증대되고, 융합단백질이 가용성 형태로 발현됨으로 정제 공정이 단순화되는 것을 발견하여, 종양괴사인자를 융합파트너로 하여 작은 펩타이드들을 융합단백질 형태로 고수율로 발현시키는 방법에 대하여 특허출원한 바 있다 (특허출원 제 94-7018 호). 또한 상기 방법을 이용하여 글루카곤을 제조하는 방법에 대하여 이미 특허출원 및 논문으로 발표한 바 있다 (특허출원 제 95-40452 호; Kim, D. Y. et al. (1996)Biotechnol. Tech.10, 669-672). 이외에 종양괴사인자와 아미노산 서열이 비슷하고 베타-쉬이트 구조를 갖는 림포톡신도 대장균내에서 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있어 상기 목적에 이용될 수 있다.

이에 본 발명자들은 인성장호르몬을 대량으로 생산하기 위하여, 종양괴사인자를 융합파트너로 이용하고 폴리히스티딘 서열 및 엔테로키나제 절단 부위를 인 성장호르몬 유전자의 5'-말단에 삽입한 발현 벡터를 제조하여 이를 대장균에 형질전환시키고 이로부터 융합단백질 형태의 인성장호르몬을 생산하여 정제한 다음 상기 N-말단 펩타이드를 엔테로키나제로 절단하여 공정이 단순하고 수율이 극대화된 천연형 인성장호르몬의 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 종양괴사인자를 융합파트너로 이용하여 인성장호르몬을 고수율로 제조하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

도 1및도 2는 발현 벡터 pT2GH 및 pT₇T2GH 의 제조 과정을 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명에서 생산한 단백질 T2GH 의 시간에 따른 총발현율 및 가용성 부분의 비율을 나타낸 것이고,

도 4는 상기 T2GH 의 DEAE-스트림라인 칼럼 크로마토그라피를 나타낸 것이고,

도 5는 엔테로키나제 절단으로 얻은 hGH 의 Q-세파로스 FF 음이온 교환 크로마토그라피를 나타낸 것이고,

도 6은 각 정제 단계에서의 T2GH 와 hGH 의 순도를 SDS-PAGE 로 분석한 결과를 나타낸 것이고,

레인 1 : 분자량 크기 마커; 레인 2 : 전체 대장균 파쇄액;

레인 3 : 수용성 단백질; 레인 4 : 불용성 침전;

레인 5 : 금속 친화 칼럼으로 정제된 T2GH;

레인 6 : 엔테로키나제를 처리한 단백질 산물;

레인 7 : Q-세파로스 음이온 교환 크로마토그라피를 거친 hGH

도 7은 정제된 hGH 의 HPLC 를 나타낸 것이고,

도 8은 표준 hGH 및 정제된 hGH 의 트립신 분석을 나타낸 것이고,

도 9는 정제된 hGH 의 수용체 결합능을 나타낸 것이고,

도 10은 정제된 hGH 의 원편광 이색분광 분석도를 나타낸 것이고,

도 11은 상기 hGH 의 정제 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 종양괴사인자 전체 또는 그의 일부가 치환된 형태의 종양괴사인자 뮤테인을 이용하여 인성장호르몬을 대장균에서 고수율로 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 인간 종양괴사인자-α의 8번째에서 12번째에 해당하는 아미노산으로 구성되고 그의 C-말단에 폴리히스티딘 서열을 포함하는 펩타이드를 융합 파트너로 이용하여 엔테로키나제 절단 부위 DDDDK (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, 이하 D4K)가 있는 인성장호르몬을 생산하고 이로부터 인성장호르몬만을 용이하게 정제한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 분자량이 비교적 작고 대장균 내에서 가용성 단백질로 발현되는 종양괴사인자를 이용하여 인성장호르몬을 융합단백질 형태로 생산한다.

종양괴사인자는 157개의 아미노산으로 구성된 베타-쉬이트 구조를 가지고 있는 단백질로서 대장균내에서 안정적으로 발현되므로 종양괴사인자의 전체 아미노산 서열 또는 일부 아미노산 서열은 융합파트너로 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명은 종양괴사인자의 아미노산 서열중 N-말단의 8번째에서 12번째에 해당하는 아미노산으로 구성된 펩타이드 및 그의 C-말단에 10개의 히스티딘으로 된 폴리히스티딘 서열을 첨가한 펩타이드 (T2 펩타이드)를 인성장호르몬의 융합파트너로 이용함으로써 융합파트너 부분을 현저히 줄여 전체적인 수율을 증가시킨다.

구체적으로 본 발명은 상기 T2 펩타이드를 코우딩하는 유전자를 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 증폭한 다음, 준비된 DNA 를 벡터에 삽입하여 상기 융합파트너를 생산할 수 있는 발현 벡터 pT2 및 pT₇T2 를 제조한다 (도 1참조).

또한, 본 발명은 인성장호르몬 유전자의 5'-말단에 엔테로키나제 절단 부위인 D4K 를 코우딩하는 염기 서열을 첨가한 DNA 를 PCR 로 증폭한 다음 이 유전자를 상기 발현 벡터에 적당히 삽입하여, 인성장호르몬이 상기 D4K 서열을 포함하는 융합단백질로 발현된 후 엔테로키나제에 의한 절단으로 천연형 인성장호르몬을 생산할 수 있는 발현 벡터를 제조한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 발현 벡터 pT2 또는 pT₇T2 의 제한효소Bam HI및Hind Ⅲ자리에 상기 D4K 서열과 결합한 인성장호르몬 유전자를 삽입하여 발현 벡터 pT2GH 또는 pT₇T2GH 를 얻는다 (도 2참조).

이외에도 상기 T2 펩타이드와 인성장호르몬의 융합단백질 (T2GH 단백질) 유전자를 코우딩하는 DNA 를 lac, trp, tac, pL, T3, T7, SP6, SV40, λ (pL/pR) 등의 적당한 프로모터를 갖는 발현 벡터에 직접 삽입하거나, 이들 프로모터와 리보좀 결합부위를 갖는 DNA 를 융합단백질 DNA 와 결합시킨 다음 다양한 플라스미드에 삽입하여 발현 벡터 시스템을 구축할 수 있다.

상기에서 N-말단의 인간 종양괴사인자-α의 올리고펩타이드 (PSDKP)는 대장균에서 T2GH 단백질을 가용성 단백질로 발현을 유도하는 리더 펩타이드로 작용하고, 폴리히스티딘 서열(H10)은 금속 킬레이트 수지 (metal-chelated resin) 친화성 및 낮은 pH 에서 히스티딘이 양전하를 띄는 성질을 이용하여 양이온 교환수지 등을 이용하여 T2GH 단백질이 용이하게 정제되도록 한다. 또한, 엔테로키나제 절단 부위인 D4K 는 T2GH 단백질이 엔테로키나제에 의해 절단되어 천연형 인성장호르몬을 생성하는데 유용하다.

상기 인성장호르몬 융합단백질을 생산하는 발현 벡터를 적당한 숙주에 하나한 (Hanahan, D. (1985)DNA Cloningvol. 1, 109-135, IRS press)의 방법으로 도입하여 형질전환체를 제조하였다.

구체적으로 상기 발현 벡터 pT2GH 를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환시켜 얻은 대장균 형질전환체를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 2월 25일에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8786 P).

상기 대장균 형질전환체를 적당한 배양조건에서 배양하여 인성장호르몬을 포함하는 융합단백질을 생산할 수 있다. 배양된 세포들은 라이소자임 소화, 동결융해, 초음파 파쇄, 또는 프렌치 프레스 등으로 처리한 후, 원심분리나 여과를 통해 상기 융합단백질을 함유하는 추출물을 얻는다. 상기 융합단백질은 추출물을 용해, 초여과, 투석, 이온 교환 크로마토그라피, 겔 여과, 전기영동 그리고 친화성 크로마토그라피 등의 일반적인 정제방법을 통해 분리해 낼 수 있다. 분리된 융합단백질을 적당량의 엔테로키나제로 처리하면 이로부터 인성장호르몬만을 얻을 수 있다. 정제된 인성장호르몬은 브래드포드 단백질 정량방법 (Bradford, M. (1976)Anal. Biochem.72, 248-254) 등에 의해 정량할 수 있으며, 아미노산 분석, N-말단 아미노산 서열 분석, 질량 분석, 펩타이드 맵핑, 수용체 결합 분석 등을 통해 천연형 인성장호르몬임을 확인한다.

본 발명의 T2GH 단백질은 대장균에서 가용성으로 발현된 후 세포내에서 서서히 침전되는 특징이 있어 원심분리 등의 방법으로 손쉽게 분리해 낸 다음 알칼리성 용액에 녹여 위와 같은 방법으로 정제될 수 있다.

이 때 T2GH 가 초기에 가용성으로 발현된 후 세포내에서 불용성으로 침전하는 현상은 본 발명의 특이적인 것으로서 단백질 발현시 나타나는 불용성 응집체 (inclusion bodies)와는 달리 알칼리성 용액에 쉽게 용해되므로 유용하다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 좀 더 상세히 설명하고자 한다.

그러나 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞ 종양괴사인자 유전자를 융합파트너로 이용한 발현 벡터의 제조

인간 종양괴사인자-α (human tumor necrosis factor-alpha, 이하 hTNF-α라고 한다)를 주형으로 하여 N-말단 8번째에서 12번째에 해당하는 아미노산으로 구성된 펩타이드와 이 펩타이드의 C-말단에 10개의 히스티딘으로 된 폴리히스티딘 서열을 첨가한 T2 폴리펩타이드를 코우딩하는 유전자를 다음과 같은 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 증폭하였다.

T2-I (센스 프라이머): 5'-TATACATATGCCGAGTGACAAGCCT-3'

T2-Ⅱ (센스프라이머): 5'-AGTGACAAGCCTCATCATCATCATCATCATCATCATCAT CATCACAGCAG-3'

T2-Ⅲ (안티센스프라이머): 3'-TAGTAGTGTCGTCGCCTAGGTACA-5'

이 때 프라이머 T2-I, T2-Ⅱ 그리고 T2-Ⅲ 를 10 : 1 : 10 의 비율로 섞어 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 증폭된 DNA 절편을 제한효소NdeI과BamHI으로 각각 처리하여 5′말단에NdeI제한효소 부위와 3′말단에BamHI제한 효소 부위를 갖도록 하여 벡터 pET-3a (Novagen, 미국)의 제한효소NdeI과BamHI자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pT2 이라고 명명하였다 (도 1참조).

같은 방법으로 T2 폴리펩타이드를 코우딩하는 유전자를 제한효소NdeI과BamHI으로 각각 처리하여 5′말단에NdeI제한효소 부위와 3′말단에BamHI제한 효소 부위를 갖도록 한 다음 벡터 pT7-7 (Tabor, S. and Richardson, C.C. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82, 1074-1078, 하바드의과대학 생물화학과에서 입수가능함)의 제한효소NdeI과BamHI자리에 삽입하였다.

이렇게 만들어진 발현 벡터를 pT₇T2 이라고 명명하였다 (도 2참조).

＜실시예 2＞ 인성장호르몬을 융합단백질 형태로 생산하는 발현 벡터의 제조

인성장호르몬 유전자는 인간의 뇌하수체 (pituitary gland) cDNA 라이브러리(Clontech, 미국)를 주형으로 하고, 다음과 같은 프라이머를 이용하여 PCR 방법으로 제조하였다.

GH-I (센스프라이머):

5' -GCAGGATCCGACGACGACGACAAATTCCCAACCATTTCCCTTATC- 3′

D D D D K[→→→ hGH

GH-Ⅱ (안티센스프라이머):

5' -TGCAAGCTTTTACTAGAAGCCACAGCTGCCCTCCACAG- 3′

프라이머 GH-I 은 인성장호르몬 서열의 5′말단에 엔테로키나제 절단 부위인 D4K 를 코우딩하는 DNA 서열을 추가하여 인성장호르몬이 D4K 를 포함하는 융합단백질로 발현된 후 엔테로키나제 절단에 의해 메치오닌이 없는 천연형 인성장호르몬이 생성되도록 고안되었다.

증폭된 DNA 를 제한효소Bam HI및Hind Ⅲ로 절단한 뒤 상기 플라스미드 pT2 의 제한효소Bam HI과Hind Ⅲ자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 발현 벡터를 pT2GH 라고 명명하였다 (도 2참조).

같은 방법으로, 증폭된 DNA를 제한효소BamHI과HindⅢ로 절단한 뒤 상기 플라스미드 pT₇T2 의Bam HI과Hind Ⅲ자리에 삽입하였다. 이렇게 만들어진 발현 벡터를 pT₇T2GH 라고 명명하였다 (도 2참조).

＜실시예 3＞ 대장균 형질전환체의 제조

하나한(Hanahan)이 기술한 방법에 의해 발현 벡터 pT2GH 로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환 (Hanahan, D. (1985)DNA Cloningvol.1 109-135, IRS press)시킨 다음 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하였다.

상기 발현 벡터 pT2GH 로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 균주를 선택하여 1997년 2월 25일에 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호 KCTC 8786P).

＜실시예 4＞ 대장균 형질전환체의 배양 및 T2GH 단백질의 생산

가) 균주 및 배지

재조합 발현 벡터 pT2GH 로 형질전환된 대장균 형질전환체를 이용하여 유가식 배양으로 T2GH 를 발현시킴으로 대량 생산하였다. 종균 배지의 조성은 1L당 트립톤 10g, 효모 추출물 10g, NaCl 5g 의 LB 배지이며 회분 및 유가식 배양을 위해 이용된 배지의 조성은 아래와 같다.

(1) 회분 배양 (batch cultivation)(1L 당)

① KH₂PO₄13.3 g

(NH₄)₂HPO₄4 g

시트르산 1.7 g

티아민 HCl 0.1 g

소량 금속 용액 20.0 mL

② MgSO₄.7H₂O 1.2 g

③ 포도당 20 g

이 때 상기 성분 ①, ②, ③ 을 분리하여 각각 121℃ 에서 15분간 멸균한 후 혼합하였고, 배지를 혼합한 다음 200mg/L 농도가 되도록 필터 주사기(syringe filter , 0.2μm)로 앰피실린을 첨가하였다. 상기 소량 금속 용액 (trace metal solution , 50X)은 1L 중에 FeCl₃.6H₂O2.2 g, ZnSO₄.7H₂O 1.05 g, CuSO₄.5H₂O 0.18 g, Na₂MoO₄.2H₂O 0.2 g, CoCl₂.6H₂O 0.2 g, MnCl₂.4H₂O1.17 g, H₃BO₃0.25 g, EDTA 0.65 g 을 포함한다.

(2) 유가식 배양 (fed-batch cultivation)

1) 세포 성장기 (growth phase) (1L 당)

① 소량 금속 용액 20 mL

MgSO₄.7H₂O 20 g

② 포도당 800g

이 때 상기 성분 ①, ② 를 분리하여 각각 121℃에서 15분간 멸균한 후 혼합하였고, 배지를 혼합한 다음 1g/L 농도가 되도록 필터 주사기 (0.2μm)로 앰피실린을 첨가하였다. 또한, NH₄OH 를 질소원 및 pH 조절자로 동시에 이용하였다.

2) 재조합 유전자의 발현기 (induction phase or product formation phase)에서 사용한 배지 (1L 당)

① (NH₄)₂SO₄1.5 g

이스트 추출물 다양한 양

MgSO₄.7H₂O 1 g

② 포도당 다양한 양

상기 성분 ①, ②를 분리하여 각각 121℃ 에서 15분간 멸균한 후 섞어 혼합하였다. 배지를 혼합한 다음 100mg/L 의 농도가 되도록 필터 주사기 (0.2μm)로 앰피실린을 첨가하였다.

나) 대장균 형질전환체의 배양 및 T2GH 발효

재조합 대장균은 종균 배지와 동일한 성분의 아가 플레이트에서 배양한 다음 생성된 콜로니를 15% 글리세롤 용액에 현탁시켜 -70℃에 보관하였다. 배양시에는 -70℃에 보관중인 재조합 대장균을 상기와 동일한 아가 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양한 다음 생성된 콜로니를 종균 배지에 다시 접종하여 37℃, 200 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 16시간이 경과한 다음 이 종균 배지를 10% 농도가 되도록 회분 배양 배지가 들어있는 5 L 발효조에 접종하여 37℃, pH 6.75 조건에서 배양을 시작하였다. 배지 중의 포도당이 모두 소모되면 유가식 배양의 세포 성장기 배지를 발효조의 조절 장치(control module)에 연결된 펌프를 이용하여 주입하는데, 아래식에 따라 배양액 중의 포도당 농도를 100 mg/L 이하로 유지하며 주입속도가 세포성장에 따라 점차 지수적으로 증가하도록 조절하며 주입하였다. 동시에 암모니아수를 질소원 및 pH 조절자로 이용하였다.

V_i+1=V_i+F_i(Δt)

X_i+1V_i+1=X_iV_iexp(μΔt)

S₀: 주입 배지 중의 포도당 농도 (g/L)

X : 배지 중의 대장균 농도 (g/L)

μ : 비성장속도 (hr^-1)

V : 배지 부피 (L)

F : 배지 주입속도 (L/hr)

Δt : 30초

세포 성장기 중 대장균이 70-80 g/L 의 농도까지 성장하였을 때 주입배지를 상기 단백질 생산기의 배지로 바꾸어 주면서 재조합 대장균 g 당 5mmol 양으로 IPTG 를 첨가하여 T7 프로모터의 발현을 유도하였다. 또한 재조합 대장균 g 당, 단위시간(h) 당 0.3mL 을 유지하도록 배지의 주입 속도를 조절하였다. 발효조에서의 배양은 모두 용존산소가 40% 이상이 되도록 교반속도를 조절하면서 수행하였고 2-4시간 간격으로 시료를 취하여 세포 농도, 아세트산 농도, T2GH 농도, 단백질 용해도 등을 분석하였다. 결과적으로 아세트산 축적을 억제하면서 발효배지 내에서 T2GH 를 약 9 g/L 까지 생산하였다. 초기에 T2GH 는 대장균 세포내에서 가용성으로 발현되었으나 점차 침전되어 배양 말기에는 80% 이상이 불용성 침전체의 형태로 존재하였다.

〈실시예 5〉 인성장호르몬의 정제

1) 세포 파쇄 (cell disruption)

고농도 배양에서 얻는 세포 배양액을 6000 Xg 에서 20분간 원심분리하여 펠렛을 회수하였다. 회수된 대장균은 완충액 A (20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 0.5% 트리톤 X-100)로 4배 희석하여 4℃에서 저어주어 세포 현탁액을 만들어 주었다. 세포 현탁액을 프렌치 프레스 (Niro-Soavi, Italy)를 이용하여 1000바에서 2회 파쇄하였다. 이후 각 단계들의 단백질 정량은 브래드포드 방법 (Bradford method)을 사용하였으며, 상기 단백질 파쇄액은 14% SDS-PAGE 를 수행하여 분석하였다 (도 6참조).

2) 불용성 침전체의 분리

상기 세포 파쇄액을 8000 Xg에서 20분간 원심분리하여 펠렛을 회수하고, 이 펠렛을 완충액 B (1mM EDTA 가 없는 완충액 A)로 4배 희석하여 현탁액을 만들고 다시 원심분리하여 펠렛을 취하는 방법을 2회 반복하였다. 이렇게 얻어진 펠렛을 완충액 C (0.5% 트리톤 X-100 이 없는 완충액 B)로 4배 희석하여 현탁액을 만들어 원심분리한 다음 펠렛을 취하였다 (도 3참조).

3) 용해

위에서 얻어진 침전체 펠렛을 20mM 트리스 완충액에 2g/L가 되게 현탁하고, NaOH 를 가하여 pH 를 12 로 만들어 침전체를 용해시켰다. 이 용액을 천천히 저어주면서 20mM 트리스-HCl, pH 8.0 을 가하여 4배 희석시켰다.

4) 니켈-킬레이팅 스트림라인 친화 컬럼 크로마토그라피 (Nickel-chelating Streamline affinity chromatography)

상기 T2GH 용액을 정제하기 위하여 니켈-킬레이팅 스트림라인(Nickel-chelating Streamline)을 이용하였다. 먼저 A50 칼럼 (0.6L, Pharmacia, Sweden)에 칼럼 부피의 5배인 50mM NiCl₂을 통과시켜 니켈을 결합시키고 (nickel charging), 결합 완충액 (20mM 트리스-HCl, 0.5M NaCl, pH 8.0)으로 칼럼을 평형화 시켰다. 평형화된 칼럼에 NaCl 을 0.5M 되게 가한 T2GH 용액을 로딩한 다음 세척 완충액(0.05M 이미다졸을 가한 결합 완충액)으로 칼럼을 세척하여 불순물을 제거하고 용출 완충액 (0.5M 이미다졸을 가한 결합 완충액)으로 T2GH 를 용출하였다 (도 4참조).

5) 엔테로키나제 절단 (Enterokinase cleavage)

니켈-킬레이팅 스트림라인 (Nickel-chelating Streamline)을 통하여 정제된 T2GH 는 20mM 트리스-HCl, pH 8.0 에서 투석 (dialysis)을 수행하여 NaCl 을 제거한 후 정제된 엔테로키나제를 이용하여 T2GH 로부터 hGH 폴리펩타이드를 절단해내는 반응을 수행하였다. 반응은 0.4g/L 농도의 T2GH 에 1/500 (T2GH/엔테로키나제, w/w)의 엔테로키나제를 가하고 37℃에서 16-24시간 동안 수행시켰다.

6) Q-세파로스 FF 음이온 교환 크로마토그라피 (Q-Sepharose FF anion exchange chromatography)

엔테로키나제 절단에 의하여 생성된 hGH 를 순수하게 정제하기 위하여 음이온교환 크로마토그라피를 수행하였다. 먼저 엔테로키나제에 의한 반응이 끝난 반응액을 10mM 인산나트륨, pH 7.0 으로 4배 희석하고 같은 완충액으로 미리 평형화된 Q-세파로즈 FF 칼럼 (50/50, 250mL, Pharmacia, Sweden)에 로딩하고 세척을 수행한 후, 5-0.5M NaCl의 선형 농도구배를 형성시켜서 hGH 를 용출하였다. 용출된 hGH 분획들을 취합하여 10mM 글라이신에서 투석 (dialysis)한 후, 동결건조하였다 (도 5참조).

7) 세파크릴 S-100 겔 여과 크로마토그라피 (Sephacryl S-100 gel filtration chromatography)

Q-세파로즈 FF 음이온 교환 크로마토그라피를 통하여 순수하게 정제된 hGH 에서 극미량으로 잔존이 가능한 내독소 등의 불순물 및 hGH 다이머 (dimer)를 제거하기 위하여 겔 여과를 수행하였다. 동결건조된 hGH 에 증류수를 가하여 만든 20mL 미만 부피의 hGH 용액을 20mM 글라이신으로 미리 평형화된 세파크릴 S-100 칼럼 (26/100, Pharmacia, Sweden)에 로딩하고 유속 4mL/분으로 용출을 수행하였다.

발현 벡터 pT2GH 를 이용한 대장균에서의 hGH 의 생산은 LB 배지를 이용한 배치 배양 및 고농도 배양 각각에서 발현 양상에 차이가 있는데, 배치 배양에서는 T2GH가 가용성과 불용성 (soluble/insoluble)의 비율이 거의 50/50으로 발현되는 반면 고농도 배양에서는 초기에는 가용성으로 발현되나 점차 세포내에 침전되어 주로 불용성으로 생산되었다.

일반적으로 대장균 내에서의 목적 단백질의 발현은 LB 배지를 이용한 회분배양 및 고농도 배양에서 거의 비슷한 경향을 보이는 이유로 해서 본 발명자는 먼저 회분배양을 통하여 가용성 T2GH 로부터 hGH 를 정제하는 과정을 확립하고, 이를 그대로 고농도 배양을 통한 대량 정제에 응용하고자 하였다. 그러나 고농도 배양에서 T2GH 가 주로 불용성으로 생산되고, 이 불용성 침전체는 알칼리용액에서 쉽게 용해되는 특징을 보여 알칼리용해 단계를 이용하였다.

알칼리용해후 크로마토그라피로 정제한 후 엔테로키나제 절단을 행하여 융합단백질로부터 인성장호르몬을 분리시켰다. 반응이 끝난 후 이온교환 수지 및 겔 여과 크로마토그라피를 이용하여 인성장호르몬을 정제하였다.

〈실시예 6〉 정제된 인성장호르몬의 특성

1) SDS-PAGE 분석

먼저 14% 노벡스 프리캐스트(Novex precast) SDS-PAGE 겔 (1.5mm×15웰)을 전기영동 키트에 장착하고 완충액 (0.05M 트리스-HCl, pH 8.4, 0.38M 글리신, 0.1% SDS)을 키트의 챔버에 채운 다음 시료를 2X SDS 완충액 (0.0625M 트리스-HCl, pH6.8, 1% SDS, 15% 글리세롤, 15mM DTT)과 1 : 1 로 섞어 100℃에서 1분간 끓였다. 끓인 시료는 겔의 웰에 로딩하고 125V 에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색하였다. 쿠마시 염색방법은 겔을 염색 용액 (0.025% Coomassie blue R-250, 40% 메탄올, 7% 아세트산)에서 30분간 염색한 다음 탈색용액 I (50% 메탄올, 10% 아세트산)에서 1시간, 탈색용액 Ⅱ (5% 메탄올, 7% 아세트산)에서 4시간 이상 탈색하였다.

정제된 hGH 는 약 21.5kDa 의 분자량을 가지며 국내시판품 (유트로핀, Lucky Co., 재조합 단백질) 및 시그마사 제품 (인간 뇌하수체 유래)과 비교하였을 때에 동일한 위치에서 단일띠로 나타났다 (도 6참조).

2) HPLC 분석

먼저 용매 A (10% 아세토니트릴)와 용매 B (80% 아세토니트릴)를 각각 준비한 다음 나일론막 (0.2μm)을 이용하여 진공펌프로 여과하며 가스를 빼내고 용매 A 와 용매 B 에 각각 트리플루오르아세트산 (trifluoroacetic acid, TFA)을 0.05% 되게 가하였다. HPLC (Hitatch HPLC system)에 칼럼 (Vydac C18 reverse phase column, 4.6×250mm)을 연결하고 용매 A로 평형화시켰다. 평형화된 칼럼에 시료를 주입하여 유속 1mL/분, 10-100% 용매 B의 선형 농도구배로 30분동안 시료를 용출하고 215nm에서 흡광도를 측정하여 용출되는 양상을 분석하였다.

hGH 는 C18 역상 컬럼에서 약 82% 아세토니트릴 농도에서 용출되었으며, 국내시판품 (유트로핀, Lucky Co.) 및 시그마사 제품과 비교하였을 때에 동일한 위치에서 단일 피크로 나타났다 (도 7참조).

3) 펩타이드 맵핑: 트립신, Glu-C (Peptide mapping : trypsin, Glu-C)

hGH 를 40μg 을 포함하는 반응 완충용액 (40mM CHES, pH 9.2)에 원료의 1/20(w/w)에 해당하는 트립신 (TPCK treated, Sigma)을 가한 후 37℃에서 48시간 동안 방치하였다. 반응이 완료된 반응액은 다음과 같은 방법으로 HPLC 를 수행하여 분석하였다.

먼저 용매 A (10% 아세토니트릴)와 용매 B (80% 아세토니트릴)를 각각 준비한 다음 나일론막 (0.2μm)을 이용하여 진공펌프로 여과하며 가스를 빼내고 용매 A와 용매 B에 각각 트리플루오르아세트산 (TFA)를 0.05% 되도록 가하였다. HPLC (Hitatch HPLC system)에 칼럼 (Vydac C18 reverse phase column, 4.6×250mm)을 연결하고 용매 A로 평형화하였다. 평형화된 칼럼에 시료를 주입하여 유속 1mL/분, 0-90% 용매 B의 선형 농도구배로 30분동안 시료를 용출하며 215nm 에서 흡광도를 측정하여 용출되는 양상이 표준품과 동일한지를 확인하였다.

Glu-C (Sigma, U.S.A)를 이용한 펩타이드 맵핑은 50mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate, pH 7.8)을 반응액으로 하여 반응 및 HPLC 를 동일한 방법으로 수행하였다.

hGH 를 트립신으로 처리하였을 때에 HPLC 양상이 표준품으로 사용한 유트로핀과 동일함을 보였다 (도 7참조).

4) 면역화학 측정법 (Radioimmunoassay, RIA)

hGH 의 면역화학 측정은 GH 키트 (Daiichi, Japan)를 이용하였다.

먼저 표준품 (standard hGH, Daiichi, Japan)과 국내에 시판되는 재조합 hGH (Lucky Co., 한국) 및 정제된 hGH 를 각각 0-50ng/mL 의 농도로 0.1mL 씩 준비하고, 여기에 표지된¹²⁵I-hGH 항체용액 (8.1 μCi/10.5mL)을 0.1mL 가하여 준 후, 각각의 반응액에 GH 항체비드를 넣고 15-30℃에서 3시간 동안 200rpm으로 흔들어주었다. 반응이 끝난 후, GH 항체비드를 정제수로 3회 세척하고 방사능을 측정하였다. 그 결과 유트로핀 및 시그마사 제품에 비해 5-10% 범위내에서 더 높게 나타나 순도와 구조적 동질성이 더 우수한 것으로 나타났다.

5) 수용체 결합분석 (Receptor binding assay)

hGH 의 인간 림프구 세포주인 IM9 에 존재하는 hGH 수용체에 대한 결합분석은 국내에 시판되는 재조합 hGH (Lucky Co., 한국)에 방사성 동위원소를 표지하여 수행하였다.

Na¹²⁵I를 재조합 hGH 에 표지하기 위하여는 산화제로서 이오도젠 (Iodogen , PIERCE, U.S.A)을 사용하였는데, 표지된¹²⁵I-hGH 의 방사능은 9.8 μCi/μg이었다.

수용체 결합실험은 기본적으로 밴 오버겐 등 (Van Obberghen, E. et al. (1976)J. Biol. Chem.251, 6844-6851)이 보고한 hGH 수용체 결합 분석방법에 따라 수행하였다. 먼저 0.02nM 의 표지된 hGH 를 0.1-50000nM 농도의 표지되지 않은 hGH와 섞어 mL 당 2×10⁷세포수의 배양된 IM9 림프구와 함께 30℃에서 90분동안 반응시켰다. 반응후 IM9 림프구를 4℃의 신선한 배지로 4회 반복하여 세척하여 결합하지 않은¹²⁵I-hGH를 제거하였다. IM9 림프구를 세포용출 완충액 (1% 트리톤 X-100, 10% 글리세롤, 20mM HEPES, pH 7.4)으로 파쇄한 후, 세포에 결합한¹²⁵I-hGH 의 방사능을 측정하였다.

IM9 림프구 세포를 이용한 수용체 결합분석에서도 다른 분석방법에서와 마찬가지로 표준품과 동일한 수용체 결합력을 보였다 (도 9참조).

6) 질량 분석

hGH 의 계산에 의한 이론적 분자량은 22130.23 이며 ESI 질량분석에 의한 측정값이 22132.67±1.65 으로 나타나 계산치와 측정치가 일치하였다.

7) 원편광 이색성 분광법 (circular dichroism, CD) 분석

hGH 와 이의 전구체인 T2GH 의 원편광 이색성 분광법 분석은 Jasco J-700 CD 분광기를 이용하였다. 분광기는 사용전 d-캄포술폰산 (d-camphorsulfonic acid)로 보정하였으며 실온에서 측정하였다. hGH 의 CD 스펙트럼은 표준품으로 사용한 유트로핀과 같은 패턴을 보여주어 동일한 2차 구조를 가짐을 알 수 있었다 (도 10참조). 또한 전구체인 T2GH 도 hGH 와 거의 비슷한 CD 스펙트럼을 보여 동일한 2차 구조를 가짐을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 인간 종양괴사인자-α의 올리고펩타이드 (PSDKP)를 융합파트너로 이용하여 융합된 인성장호르몬을 대장균 내에서 가용성 단백질로서 고수율로 발현시킬 수 있고, 이에 포함된 폴리히스티딘 서열(H10)은 금속 킬레이트 수지 (metal-chelated resin) 및 S-세파로스와 같은 양이온 교환수지 등을 이용하여 상기 융합단백질이 용이하게 정제되게 한다.

이외에도 본 발명의 T2GH 단백질은 대장균에서 가용성으로 발현된 다음 세포내에서 서서히 침전되는 특징이 있는데, 이는 본 발명의 특이적인 현상으로 대장균에서 단백질을 발현시킬 때 나타나는 불용성 응집체 (inclusion bodies)와는 달리 T2GH 단백질은 알칼리성 용액에 쉽게 용해된다. 따라서 불용성 응집체는 변성제에 녹인 다음 리폴딩 과정을 거쳐야 되나 본 발명의 T2GH 는 알칼리 용해만으로 공정이 끝나기 때문에 리폴딩의 난점을 극복할 수 있다.

또한, 상기 융합단백질에 포함된 엔테로키나제 절단 부위인 D4K 는 T2GH 단백질이 엔테로키나제에 의해 절단되어 천연형 인성장호르몬을 생성하는데 유용하다. 이것은 리더펩타이드 없이 대장균에서 직접 발현시 N-말단에 메치오닌이 첨가되어 천연형 인성장호르몬의 제조가 어려운 점을 극복할 수 있도록 해준다.

Claims (11)

1. 종양괴사인자를 융합파트너로 이용하여 미생물에서 인성장호르몬을 얻는 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 융합파트너는 종양괴사인자 전체 아미노산 서열 또는 그의 서열중 일부가 치환된 종양괴사인자 뮤테인인 것을 특징으로 하는 제조방법.
3. 제 2항에 있어서, 융합파트너는 종양괴사인자-α의 N-말단의 8번째에서 12번째에 해당하는 아미노산으로 구성되고 그의 C-말단에 폴리히스티딘 서열을 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제 3항에 있어서, 융합파트너와 결합한 인성장호르몬을 생산하는 대장균 형질전환체를 배양하여 세포를 파쇄하고 단백질 침전체를 얻어 알칼리 용액으로 용해한 다음 칼럼 크로마토그라피를 이용하여 융합단백질을 분리하고 이로부터 인성장호르몬을 정제하는 제조방법.
5. 제 4항에 있어서, 분리한 융합단백질을 엔테로키나제로 절단하여 인성장호르몬을 정제하는 제조방법.
6. 종양괴사인자-α의 N-말단의 8번째에서 12번째에 해당하는 아미노산으로 구성되고 그의 C-말단에 폴리히스티딘 서열이 첨가된 유전자 서열을 포함하는 발현 벡터.
7. 제 6항의 발현 벡터에 엔테로키나제 절단 부위 DDDDK 및 인성장호르몬을 코우딩하는 유전자가 삽입된 발현 벡터.
8. 제 7항에 있어서, 발현 벡터 pT₇T2GH.
9. 제 7항에 있어서, 발현 벡터 pT2GH.
10. 제 7항의 발현 벡터로 대장균을 형질전환시켜 얻은 형질전환체.
11. 제 10항에 있어서, 발현 벡터 pT2GH 로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켜 얻은 형질전환체 (수탁번호 : KCTC 8786P)

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