KR100230959B1 - 갈색거저리 유충에서 분리한 항진균 단백질 및재조합 미생물을 이용한 그의 제조방법 - Google Patents
갈색거저리 유충에서 분리한 항진균 단백질 및재조합 미생물을 이용한 그의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 갈색거저리 유충에서 분리한 항진균 단백질 및 재조합 미생물을 이용한 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 딱정벌레 목에 속하는 갈색거저리 유충으로부터 분리한 신규의 항진균 단백질(Tenecin 3), 그를 암호화하는 유전자, 전기 유전자를 포함하고 항진균 단백질(Tenecin 3)을 생산할 수 있는 발현벡터, 전기 발현벡터를 이용하여 재조합 항진균 단백질을 대량으로 제조하는 방법 및 전기 항진균 단백질(Tenecin 3)의 변종에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 갈색거저리 유충에서 분리한 신규의 항진균 단백질인 테테신 3 및 그의 변종은 유전공학적 방법으로 대량으로 제조된다. 이렇게 대량 생산된 테네신 3 및 그의 변종들은 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 항진균제의 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 갈색거저리 유층에서 분리한 항진균 단백질 및 재조합 미생물을 이용한 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 딱정벌레 목에 속하는 갈색거저리 유충으로부터 분리한 신규의 항진균 단백질(Tenecin 3), 그를 암호화하는 유전자, 전기 유전자를 포함하고 항진균 단백질(Tenecin 3)을 생산할 수 있는 발현벡터, 전기 발현벡터를 이용하여 재조합 항진균 단백질을 대량으로 제조하는 방법 및 전기 항진균 단백질(Tenecin 3)의 변종에 관한 것이다.
곤충은 성공적으로 진화해온 동물 중의 하나라는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 성공적인 진화의 중요한 요인은 곤충이 가지고 있는 면역방어체계의 개발을 들 수 있는데, 이 면역체계는 감염을 충분히 방어할 수 있을 뿐 아니라, 곤충이 다양한 생활범위를 갖는 것을 가능하게 하여준다. 그러므로, 곤충은 다양한 면역방어전략과 특이성을 가지고 있어야 한다. 이러한 가능성 때문에 오래 전부터 곤충은 면역방어 연구에 사용되어 왔다.
곤충에서 첫 번째 방어는 표피가 제공하는 물리적 장벽으로 이것은 수동적 방어이다. 두 번째 방어는 세포반응(cellualr response)과 체액반응(humoral response)를 포함하는 능동적 방어이다. 이러한 능동적 방어의 예는 표피가 상하게 되어 상피세포 또는 내부조직이 노출되고 이곳으로 세균이 감염되었을 때를 들 수 있다. 이러한 세균 감염에 대한 세포반응을 위해서, 곤충의 혈액(혈임파 : hemoly mph) 세포의 한 종류인 헤모사이트(hemocyte)가 동원된다. 이 헤모사이트는 세균을 식작용(phagocytosis)하거나 혹(nodule)에 가두는 작용을 한다. 한편, 체액반응을 위해서는 상처와 감염에 대응하여 다양한 혈임파 단백질의 생산이 유발되거나 증가된다. 이 혈임파 단백질의 상당수는 항세균 단백질(antibacterial protein)로 세균에 대하여 강력한 방어작용을 수행할 수 있다. 또한, 지혈작용이 활성화되어 상처를 수선하고 더 이상 세균이 유입되는 것을 막는다.
곤충의 혈임파에서 항세균 단백질이 많이 발견되었고 이에 대한 연구가 진행되었으나, 상대적으로 항진균 단백질에 대한 연구는 많이 진전되지 못하였다. 실제로 세크로핀(cecropin) 및 디펜신(defensin) 계열의 항세균 단백질이 항진균 활성을 가지는 것으로 보고되고 있지만, 항세균 활성없이 항진균 활성만을 갖는 단백질에 대한 보고는 전무한 상태이다.
이에, 본 발명자들은 항진균 활성만을 갖는 단백질을 곤충에서 찾아내고자 예의 연구노력한 결과, 최초로 딱정벌레 목에 속하는 갈색거저리 유충에서 신규의 항진균 단백질(Tenecin 3)을 분리하고 그의 특성을 밝혔을 뿐만 아니라, 나아가 갈색거저리 유충에서 전기 항진균 단백질(Tenecin 3)을 암호화하는 유전자를 분리하고, 그를 이용하여 재조합 항진균 단백질(Tenecin 3)을 대량으로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 전기 항진균 단백질(Tenecin 3)에 아미노산의 결실 또는 치환을 가하여도, 항진균 활성이 유지되는 변종이 제조됨을 발견하였다.
결국, 본 발명의 첫번째 목적은 갈색거저리 유충으로부터 분리한 항진균 단백질(Tenecin 3)의 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 전기 항진균 단백질(Tenecin 3)을 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 전기 항진균 단백질(Tenecin 3)의 유전자를 포함하고 항진균 단백질을 생산할 수 있는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 네번재 목적은 전기 발현벡터를 이용하여 재조합 항진균 단백질 (Tenecin 3)을 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯번째 목적은 전기 항진균 단백질(Tenecin 3)의 변종을 제공하는 것이다.
제1도는 항진균 단백질(Tenecin 3)의 일부 아미노산 서열을 나타낸다.
제2도는 항진균 단백질(Tenecin 3)의 전체 아미노산 서열 및 그의 암호화하는 염기서열을 나타낸다.
제3도는 말토스 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드의 유전자 지도를 나타낸다.
제4도는 완전형(intact)의 항진균 단백질(Tenecin 3)을 발현하는 플라스미드의 제조과정을 나타내는 모식도이다.
제5도는 His-tag 융합 항진균 단백질(Tenecin 3)을 이용한 N-말단 또는 C-말단 결실의 항진균 단백질(Tenecin 3) 변종을 나타내는 그림이다.
제6도는 항진균 단백질(Tenecin 3)의 C-말단 33개 아미노산 부분에 대한 특정자리 알라닌 돌연변이화 반응으로 얻어지는 항진균 단백질(Tenecin 3)의 변종을 나타내는 그림이다.
제7a도는 갈색거저리 유충에서 수득한 조 항진균 단백질(crude Tenecin 3)의 처리 농도에 따른 Saccharomyces cerevisiae의 성장 저해효과를 나타내는 그래프이다.
제7b도는 갈색거저리 유충에서 수득한 조 항진균 단백질(crude Tenecin 3)의 처리 농도에 따른 Candida albicans의 성장 저해효과를 나타내는 그래프이다.
제8도는 갈색거저리 유충에서 수득한 조 항진균 단백질(crude Tenecin 3)의 필라멘트형 진균들에 대한 성장 저해효과를 나타내는 그래프이다.
제9도는 갈색거저리 유충에서 수득한 조 항진균 단백질(crude Tenecin 3)의 Fusarium oxysporum에 대한 성장 저해효과를 나타내는 그래프이다.
제10도는 갈색거저리 유충에서 수득한 조 항진균 단백질(crude Tenecin 3)이 성장이 정지된 조건에서 효모형 진균의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
제11도는 말토스 결합 단백질-항진균 단백질(Tenecin 3)의 융합단백질이 Can dida albicans의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
제12도는 말토스 결합 단백질-항진균 단백질(Tenecin 3)의 융합단백질이 Cryptococcus neoformans의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
제13도는 말토스 결합 단백질-항진균 단백질(Tenecin 3)의 융합단백질이 Aspergillus nidulans의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
제14도는 말토스 결합 단백질-항진균 단백질(Tenecin 3)의 융합단백질 및 팩터 Xa에 의한 그의 절단산물이 Candida albicans의 성장에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
제15도는 항진균 단백질(Tenecin 3)의 N-말단 또는 C-말단 결실 변종들이 갖고 있는 항진균 활성을 나타내는 그래프이다.
제16도는 항진균 단백질(Tenecin 3)의 특정자리 돌연변이 변종들이 갖고 있는 항진균 활성을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
항진균 단백질은 신 기능 단백질이라는 점에서 단백질 자체의 성질, 생합성 과정, 항진균 작용메카니즘의 규명을 통하여, 생물현상 특히 면역작용을 이해할 수 있는 학문적 가치 뿐 아니라, 아직 효과적인 항진균성 항생제가 개발되어 있지 않다는 점에서 산업적으로도 매우 중요한 생물소재로 이용될 수 있는 실용적인 가치를 가진다. 신 기능 생물소재의 개발을 위해서 수행하여야 할 일은 이들을 분리, 정제, 특성을 밝히는 것은 물론, 생체 내에서 이들이 합성되는 과정, 이들의 유전자 발현기작, 이들이 작용하는 반응기작 등 여러 분야에서의 연구가 유기 보완적, 체계적으로 수행되어야 한다. 특히, 신 기능 생물소재가 자연에 미량으로 존재할 때, 이들의 공급을 유전자 재조합 방법을 이용하여 시도할 경우 생합성 과정, 유전자 발현기작에 관한 연구는 매우 필요하고 중요한 분야이다. 또한, 단백질의 성질 및 작용기작의 연구 결과로부터 약효가 뛰어난 신 기능 생물소재의 창출도 가능해 질 수 있다.
이러한 연구로부터 얻어지는 결과는 항진균 단백질을 직접 신 기능 생물소재로 이용할 수 있고, 또 이를 선도 물질로하여 새로운 생물소재를 창출할 수 있는 실용적 측면에서의 기대효과 뿐 아니라, 외부침입에 대한 세포의 방어기작인 면역작용 분야에서 새로운 생물 현상의 규명이라는 학술적인 측면에서의 기대효과도 크다. 그러므로, 본 발명을 통하여 얻은 결과는 학문적 발전은 물론, 항진균제의 신약 개발에 활용될 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명은 기초 연구와 실용화는 별개의 것이라는 종래의 선입관을 탈피하여 기초연구를 통한 신 기능 생물소재의 개발을 효율적으로 수행하는 좋은 예가 된다. 이와 같은 맥락에서 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명자들은 갈색거저리 유충에 존재하는 신규의 항진균 단백질(이하, '테네신 3(Tenecin 3)'라 함)에 대한 아미노산 서열과 그를 암호화하는 cDNA 서열을 알아내고자, 우선 갈색거저리 유충으로부터 테네신 3을 순수분리하였다. 즉, 갈색거저리 유충에 상처를 입히고 체액을 체취, 원심 분리하여 얻은 상등액을 100℃에서 열처리하여 고분자 단백질을 제거한 다음, 1차 및 2차에 걸친 C18역상(reverse phase open) 컬럼 크로마토그래피, 1차 및 2차에 걸친 C18역상 HPLC 및 젤 여과 HPLC하여, 테네신 3를 순수하게 정제하였다. 이렇게 분리된 테네신 3의 아미노산 서열을 결정하였다.
아울러, 갈색거저리 유충의 총세포 RNA로부터 mRNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 제조하고, PCR(polymerse chain reaction) 방법으로 테네신 3의 cDNA를 클로닝하고, 그의 염기서열을 결정하였다.
이렇게 클로닝된 테네신 3 cDNA 유전자를 단백질 발현기능의 플라스미드에 삽입하여 테네신 3를 생산하거나, 테네신 3의 정제를 용이하게 하고자 융합파트너가 연결된 벡터, 예를 들면 MBP(maltose binding protein) 유전자를 지니고 있는 벡터나 히스티딘이 표지된 테네신 3을 생산할 수 있는 벡터에 삽입한 다음, 그를 미생물에 도입하고 배양하여, 테네신 3의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 공정에 의해 융합파트너-테네신 3의 융합 단백질을 생산할 수 있다.
한편, 항진균 활성을 갖는 테네신 3의 변종을 찾아내고자, 신호펩타이드가 없는 성숙(mature) 테네신 3의 N-말단 또는 C-말단을 결실시키는 돌연변이, 혹은 알라닌으로의 치환을 유도하는 특정자리 돌연변이를 수행하여, 신호펩타이드를 포함하는 테네신 3의 아미노산 서열을 기준으로 한 94~96번 아미노산, 70~96번 아미노산, 61~96번 아미노산, 48~95번 아미노산, 19~28번 아미노산, 19~35번 아미노산, 19~47번 아미노산, 19~55번 아미노산, 19~63번 아미노산이 결실된 변종, 및 신호펩타이드를 포함하는 테네신 3의 아미노산 서열을 기준으로 한 67~70번 아미노산, 72~75번 아미노산, 77~80번 아미노산, 82~85번 아미노산, 86~89번 아미노산, 91~94번 아미노산이 알라닌으로 치환된 변종은 항진균 활성을 가지는 것을 확인하였다.
아울러, 상술한 테네신 3의 변종을 암호화하는 유전자를 제조하고 그를 발현벡터에 삽입한 다음, 미생물에 도입하여 배양하고, 테네신 3 변종의 발현을 유도하여, 이를 수득하는 공정에 의해 테네신 3의 변종을 대량 생산할 수 있다.
갈색거저리 유충에서 직접 분리하거나 재조합 미생물에서 제조한 테네신 3 및 그의 변종들은 변원성 진균들, 예를 들면 Candida albicans(구강 및 소화관에 병 유발)과 Cryptococcus neoformans(허파와 수막(髓膜)에 병 유발)의 성장을 억제시키는데 큰 효과가 있다. 따라서, 대량 생산된 테네신 3 및 그의 변종들은 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 항진균제의 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 아미노산 서열에 있어서, '기능적으로 동등한'이란 테네신 3의 아미노산 서열 중에서 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr과 같은 조합으로 치환된 모든 단백질을 의미한다. 또한, 본 발명의 염기서열에 있어서, '기능적 등가물'이라 함은 테네신 3 유전자의 염기서열 중에서 전기 조합의 아미노산을 제공할 수 있는 염기서열을 가지는 모든 유전자를 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
갈색거저리 유충으로부터 항진균 단백질의 순수분리 및 그의 아미노산 서열 결정
갈색거저리 유충에서의 항진균 단백질 분리 및 그 단백질의 아미노산 서열 결정은 다음에 기술된 상세한 방법에 의해 진행되었다.
(1) 항진균력 측정 방법
먼저, 사용하는 배지의 조성, 곤충 염수(insect saline) 및 PAGE시 사용되는 각종 완충용액(buffer)의 종류 및 조성은 다음과 같고, 단백질 정량은 마이크로-로우리(micro-Lowry)법으로 각 단계에서 분리, 정제된 단백질을 정량하였다.
Candida albicans 배양을 위한 고체 배지의 조성
효모 추출물 4g
포도당 3.4g
아가(agar) 5.2g
니트로푸라존(nitrofurazon) 0.2g
DDW(double distilled water) 400ml
HCl을 사용하여 pH 6.0으로 조정하여 밀봉한 후 4℃에 보관하였다(HCl은 물에 많이 희석하여 사용).
Candida albicans 배양을 위한 Sabouraud Broth의 조성
포도당 3g
펩론 2g
DDW 200ml
HCl로 pH 5.8로 조절한 후 멸균하여 사용하였다.
1X 곤충 염수(insect saline)의 조성
130 mM NaCl 0.759g
5 mM KCl 0.037g
1 mM CaCl2·2H2O 0.014g
DDW up to 100ml
pH 6.0으로 조절한 후 멸균하여 냉장보관하였다.
산-우레아(acid-urea)PAGE시 시료 주입용 완충용액(loading buffer)의 조성
1 M HCl 1ml
2-머캡토에탄올 0.5ml
우레아 5.4g
피로닌 Y(pyronin Y) 0.5ml
DDW up to 10ml
조제 후 -20℃에 보관하였다.
산-우레아(acid-urea)PAGE시 시료 전개용 완충용액(running buffer)의 조성
0.9 M acetic acid(pH 3) 51.5ml
DDW up to 1000ml
조제 후 갈색 병에 담아 4℃에 저장하였다.
SDS-PAGE시 시료 주입용 완충용액의 조성
0.5M Tris-HCl(pH 6.8) 3.75ml
20% SDS 1.5ml
2-머캡토에탄올 0.6ml
글리세롤 2.65ml
0.1% BPB 1.5ml
DDW up to 10ml
SDS-PAGE시 5X 시료 전개용 완충용액
Tris base 45g
글리신 140g
SDS 5g
DDW up to 1000ml
한편, 하기의 실시예에서 항진균 단백질의 활성은 다음과 같은 콜로니 계수법(colony count)과 분광광도법(spectroscopy)으로 측정하였다.
콜로니 계수법
Candida albicans(ATCC 36232)을 Sabouraud broth에 접종시킨 후 37℃에서 16시간 배양시킨 다음, 그 액 1ml를 취하여 8,000rpm(4℃)에서 5분간 원심 분리시켰다. 이어, 균을 곤충 염수이 현탁시키고, 그 액을 일부 취하여 650nm에서 흡광도를 측정하여 0.3 정도가 되도록(세포수는 2×106/ml) 조절한 다음, 이 액 50ul를 시험관에 넣고 곧이어 채취한 갈색거저리의 곤충체액 50ul가하였다. 그런 다음, 37℃에서 2시간 진탕 배양하고, 이 액을 곤충염수로 100배 희석한 액 50ul를 취하여 Candida albicans 배양용의 배지에 도말한 후, 37℃에서 48시간 배양하고 생성되는 콜로니수를 세어 원액에 대한 항진균력을 평가하였다.
분광광도법
Candida albicans(ATCC 36232)를 고체배지에서 24시간 배양하고, 한 개의 콜로니를 채취하여 액체배지 상에서 37℃로 16시간 배양한 후, 배양액을 8,000rpm에서 원심 분리하여 잔사를 곤충염수에 현탁시키고, 그 액을 일부 취하여 650nm에서의 흡광도가 0.3정도(세포수는 2×106세포/ml) 되도록 조절하였다. 이 액의 일정량을 취하여 액체배지로 10배 희석한 액 200ul를 취하고, 컬럼 크로마토그래피에 의하여 분리된 각 분획의 일정량의 단백질을 가한 후, 37℃에서 12시간 진탕 배양시켜 650nm에서의 흡광도를 측정하여 Candida albicans의 성장정도를 결정함으로써, 항진균력을 평가하였다.
(2) 갈색거저리 유충으로부터 체액 채취
갈색거저리(T.molitor)의 유충(4,000 내지 5,000 마리)을 주사바늘로 상처를 입히고 체액을 채취한 다음, 혈임파와 헤모사이트를 분리하기 위하여 20,000rpm, 4℃에서 원심 분리하고, 그 상등액만을 취하여 -80℃에 사용하기 전까지 보관하였다. 이 원액의 체액은 콜로니 계수법으로 항진균 활성을 측정하는데 이용하거나, 항진균 단백질을 분리 정제하는데 사용하였다.
(3) 항진균 단백질의 분리, 정제 및 특성 조사
항진균 활성이 있는 단백질을 단일 물질로 분리 정제하여 그 생화학적 특성을 조사하고자, 먼저 전기 단백질의 정제는 다음과 같은 순서에 따라 수행하였다.
① 열처리
상기 (2)에서 모은 곤충의 체액에 대하여 콜로니 계수법으로 항진균력을 측정한 곤충의 체액 중에 포함된 고분자 단백질을 제거할 목적으로, 열처리 조작을 다음과 같은 방법으로 하였다. 50ml의 프라스틱 튜브에 체액을 증류수로 10배 희석한 후 100℃의 끊은 물 속에서 15분간 열처리하고 4℃에서 24시간 방치하였다. 이어, 3,000rpm에서 원심 분리하고, 그 상등액만을 조심스럽게 취하여 다음 단계의 항진균 단백질의 분리, 정제에 이용하였다.
② 1차 C18역상 컬럼 크로마토그래피
상기 열처리하여 모은 액으로부터 항진균 단백질을 정제하기 위하여, 5% TFA을 포함하는 물로 평형화시킨 C18역상 컬럼(C18reverse phase open column, 0.7×30cm; Waters Co., USA)에 주입하고, 직선 농도구배(A: 5% CH3CN in 0.05% TFA, B: 45% CH3CN in 0.05% TFA)로 용출하면서 280nm에서의 흡광도를 측정하여, 흡광도가 있는 각 분획 부분(15ml)에 대하여 항진균력을 측정하였다.
항진균 활성이 있는 단백질을 단일 물질로 분리 정제하여 그 생화학적 특성을 조사하고자, 먼저 전기 단백질의 정제는 다음과 같은 순서에 따라 수행하였다.
③ 2차 C18역상 컬럼(open column) 크로마토그래피
상기 1차 C18역상 컬럼 크로마토그래피에서 항진균 활성을 나타내는 분획을 모아 2차 역상 컬럼 크로마토그래피하였다. 이때, 사용된 컬럼 및 용출 용매는 1차시와 동일하였다.
④ 1차 C18역상 HPLC
상기 2차 C18역상 컬럼 크로마토그래피에서 항진균 활성을 나타내는 분획을 모아 C18역상 HPLC 컬럼(Toyosoda, JAPAN, ODS 12OT, 0.5×30cm)에 주입하고, 직선 농도구배(유속: 1ml/min, A:5% CHCN3in0.05% TFA, B: 90% CHCN3in 0.05% TFA)으로 분리하여, 각 분획에 대하여 항진균력을 측정하여 활성이 있는 분획만을 분취하였다.
⑤ 2차 C18역상 HPLC
상기 1차 C18역상 HPLC에서 항진균 활성을 나타내는 분획을 모아 2차 C18역상 HPLC 하였다. 이때, 사용된 칼럼은 C18역상 HPLC(Synchropack, 0.5×30cm, Synchrion Co., USA)이고, 사용된 직선 농도구배는 용출 시간을 길게 한다는 점을 제외하고는 상기 1차 C18역상 HPLC에서와 동일하게 하였다. 용출시켜 얻은 각 분획에 대하여 항진균력을 측정하고, 활성이 있는 분획만을 분취하여 단백질 정량하고, SDS-PAGE 및 산-우레아 PAGE로서 그 순도를 조사하였다.
⑥ 젤 여과 HPLC
항진균 단백질의 아미노산 서열 및 그 특성을 조사하기 위한 단일 물질로 정제하기 위하여, 상기 2차 C18역상 HPLC 에서 항진균 활성을 나타내는 분획을 모아 젤여과 HPLC 컬럼(Toyosoda, JAPAN, TSK gel G3000SW, 1×30cm)에 주입하고, 이소크래틱시스템(isocratic system, 유속: 0.5ml/min, 30% CH3CN in 0.05% TFA)으로 분리하여, 각 분획에 대한 항진균력 측정 및 단백질 정량을 실시하였다.
⑦ SDS-PAGE 및 산-우레아 PAGE 에 의한 항진균 단백질의 분자량 및 그 순도의 측정
상기 ⑤, ⑥ HPLC에서 각각 분취한 항진균 단백질의 아미노산 서열을 결정하기 위해서는 단백질이 순수하게 단일 물질로 정제되었는지를 확인할 필요가 있고, 어느 정도의 분자량을 가진 단백질인가를 확인하기 위하여, SDS-PAGE 및 산-우레아 PAGE 를 실시하였다. SDS-PAGE는 20% 분리 젤(separating gel)과 3.75% 스태킹 젤(stackin gel)를 이용하여 전기영동하고, 쿠마시에 블리리언트 블루(Commassie Brilliant Blue) G-250으로 염색한 다음, 표준품 단백질의 밴드와 비교하여 항균 단백질의 크기 및 순도를 확인하였다.
(4) 분리된 항진균 단백질의 아미노산 서열의 결정
① 아미노산 서열 결정을 위한 단백질의 환원 및 알킬화 반응
시스테인 잔기에 의한 이황화결합이 항진균 단백질에 존재하는 경우, 엔도펩티다아제 처리에 의한 단백질의 단편화가 용이하지 않으므로, 이황화결합을 환원시키고 알킬화 반응시킨 다음, 엔도펩티다아제 처리하였다. 즉, 분리 정제된 항진균 단백질 30ug을 150ul의 용액(6M guanidine-HCl in 0.25M Tris buffer, pH 8.5)에 용해시킨 후, 7.5ul의 2-머캡토에탄올을 가하고 질소나 아르곤 가스를 주입하였다. 이어, 차광의 조건하에서 2시간 반응시키고, 6ul의 4-비닐피리딘(4-vinylpyridine)을 가한 다음, 다시 실온에서 2시간 방치하여, HPLC로 알킬화된 단백질을 분리·정제하고, 엔도펩티다아제를 처리하였다. 이때, 사용된 컬럼은 ABI사의 Aquapore RP-300 컬럼이었다.
② 리실엔도펩티다아제(Lysylendopeptidase)로 항진균 단백질의 단편화
(3)-⑦에서 단일 물질로 동정된항진균 단백질 및 상기 ①에서 단편화된 항진균 단백질의 부분 아미노산 서열을 결정하기 위하여, 리신 특이적 엔도펩티다아제를 50mM Tris-HCl(pH 9.0) 용액 중에 1nmol의 항진균 단백질과 0.025ug/ul 농도가 되도록 가하고, 30℃에서 19시간 배양한 후, 그 반응액을 C18역상 컬럼(Synchrion, INC., Synchropack, 0.5×30cm)에 주입하고, 직선 농도구배(A: 0% CH3CN in 0.05% TFA, B: 100% CH3CN in 0.05% TFA)로 단편화된 펩타이드를 분취하였다. 이렇게 얻어진 펩타이드 단편은 Speed-Vac 건조시킨 후, 자동 아미노산 서열분석기로 부분 아미노산 서열을 결정하였다(참조 : 제1도).
③ 트립신, Asp-N 및 V8 엔도펩티다아제 처리
상기 ②에서 리신 엔도펩티다아제로 항진균 단백질을 단편화한 후 아미노산 서열을 결정하면서 전체의 아미노산 서열을 결정하기 위해서는 다른 엔도펩티다아제 처리도 필요하였다. 이러한 얻어진 단편의 아미노산 서열을 비교하여 상호 겹치는 (overlapping) 아미노산으로, N-말단부터의 아미노산 서열 전체를 결정할 수 있었다(참조 : 제2도)
먼저, 트립신 처리는 단백질 1nmol을 0.2M NH4HCO340ul에 녹인 후, 트립신 0.33ug을 가하고 37℃에서 14시간 배양한 다음, 100℃에서 2분간 열처리하여 HPLC로 단백질 단편을 분리, 정제하였다. Asp-N 엔도펩티다아제 처리는 역시 1nmol의 단백질을 50ul의 50mM 인산 완충용액(pH 8.0)에 녹인 후, 0.5ug의 단백질가수분해효소를 가하고 37℃에서 18시간 배양한 다음, HPLC로 분리, 정제하였으며, V8 엔도펩티다아제 처리는 1nmol 을 단백질을 200ul의 0.1M 암모늄 아세테이트(pH 4.0)에 녹인 후, 0.3ug의 단백질가수분해효소를 가하고 37℃에서 18시간 배양한 다음, HPLC로 분리, 정제하였다. 상기에서, 사용된 HPLC의 컬럼 및 용출용매는 상기 ②에서 사용된 것과 동일하였다.
[실시예 2]
항진균 단백질의 cDNA 염기서열 결정
갈색거저리(T. molitor)의 유충(애벌레)로부터 총세포 RNA를 추출하여 5X 역전사 반응 완충용액 5ul, 20mM dNTP 1ul, RNase 억제제 1ul, 25mM MgCl22ul, 합성한 50mM 올리고(dT)18프라이머 1ul와 M-MuLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사 효소(NEB) 1ul를 넣고, 3차 증류수로 전체 부피를 20ul를 조정한 다음, 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켜 첫번째 사슬 cDNA를 제조하였다. 또한, 전기 총세포 RNA로부터 mRNA를 분리하여 cDNA를 만들고, 람다(lambda)gtll 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다.
상기에서 제조된 첫번째 사슬 cDNA 및 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로, 항진균 단백질(Tenecin 3)의 cDNA를 클로닝하였다. 이때. PCR 조건은 변성(deanturing) 온도 94℃, 연장(extension) 온도 72℃로 하였으며, 결합(annealing) 온도는 각 PCR에 사용한 프라이머의 Tm값에 따라 적절하게 조절하였다. 총 35회(cycle)를 수행하였으며 처음에 72℃에 10초간 방치하고 2회(cycle) 동안 94℃에서 120초, 결합 온도에서 120초, 72℃에서 120초간 방치하였으며, 그 이후의 횟수동안에는 94℃에서 45초, 결합 온도에서 60초, 72℃에서 60초간 두었다. 마지막 연장시간은 300초로 하였다. PCR 반응은 총 100ul로 하였으며 주행 DNA 1ul와 50μM의 5'과 3' 프라이머 각 1ul, 10X Taq 중합효소 완충용액(100mM Tris-Cl(pH 8.3), 500mM KCl, 0.1% 젤라틴) 10ul, 20mM dNTP 1ul, 25mM MgCl28ul, 그리고 Taq DNA 중합효소((주)바이오니아, 대한민국)1ul를 넣은 후, 물을 첨가하여 100ul가 되게 하였다.
이렇게 얻은 cDNA를 파아지미드(phagemid)에 서브클로닝하여 생거(Sanger)의 방법으로 Sequenase Version 2.0 키트(United States Biochemical, USA)를 사용하여 항진균 단백질(Tenecin 3)의 염기서열을 결정하였다(참조: 제2도). 제2도에서, 진한 이탤릭체는 신호펩티드를 나타낸다.
[실시예 3]
말토오스 결합 단백질(MBP)-테네신 3 융합단백질을 이용한 테네신 3의 대량 생산
말토오스 결합단백질의 유전자를 지니고 있는 벡터 pMAL-p2와 pMAL-c2에 상기 실시예 2에서 제조한 테네신 3 유전자를 삽입하여, MBP(maltose binding protein)- 테네신 3의 융합 단백질을 생산할 수 있는 플라스미드 pMP-35와 pMC-35를 제조하였다(참조: 제3도). 이 중 pMC-35 플라스미드를 가지고 있는 대장균 JM109 세포를 밤새 키운 후, 그 중 10ml을 1L의 LB 배지에 가하고 37℃에서 3시간 키웠다. 여기에 최종농도가 0.3mM이 되게 IPTG를 넣고 다시 2시간 동안 흔들면 배양하였다. 배양이 끝난 후 4℃에서 5000rpm으로 20분간 원심분리하여 세포를 수확하고, 이를 컬럼용 완충용액(10mM Tris-Cl(pH 7.4), 20mM NaCl) 200mM에 용해시켰다. 이를 얼음에 둔채로 Ultrasonics W-385를 사용하여 초음파로 파괴시키고, 10000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취하고, 5배의 상기 컬럼용 완충용액을 더하여 희석하였다. 이 중 50ul를 램리(Laemmli)의 방법으로 15% SDS-PAGE 젤에서 전기영동시켜 융합 단백질의 발현 여부를 확인하였다.
이 융합단백질을 분리정제하기 위하여, 아밀로스 수지를 컬럼에 잘 채운 후 컬럼부피의 8배에 해당하는 양의 상기 컬럼용 완충용액으로 세척한 다음, 상기에서 얻은 초음파 파쇄액을 적절한 유속으로 주입하였다. 시료 주입이 끝난 후, 다시 8배 부피의 상기 컬럼용 완충용액으로 세척하고, 10mM 말토오스가 포함된 컬럼용 완충용액으로 수지에 결합한 융합단백질을 탈리시키면서 분획으로 나누어 받았다. 각 분획을 SDS-PAGE겔로 조사하여 원하는 융합단백질이 존재하는 분획들만을 모두 모았다. 이를 2ml로 농축하고, 이 농축액 중의 1ml에 1ul의 팩터 Xa를 첨가하고 실온에서 밤새 두어, MBP와 테네신 3와의 절단이 일어나게 하였다.
[실시예 4]
대장균 내에서의 대량 발현을 위한 새로운 재조합 DNA의 제조
대장균 내에서 완전형(intact)의 테네신 3를 대량발현하기 위한 재조합 DNA를 다음과 같은 방법으로 제조하였다(참조: 제4도).
벡터는 E.coli 발현벡터인 pET-3a를 사용하였고, 삽입체는 테네신 3의 코딩 염기서열이며, 이 유전자는 갈색거저리의 총세포 RNA로부터 얻은 cDNA를 주형으로 하고 결합온도 48℃에서 PCR반응을 통해 얻었다. 사용한 5'- 및 3'-PCR 프라이머는 다음과 같았다.
PCR 반응을 통해 얻은 산물은 NdeI-BamHI 링커를 가지고 있고, 이를 Ndel-BamHI으로 절단하고 pET-3a에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pAFT-1을 제조하였다(참조: 제4도).
한편, 테네신 3는 신호펩티드를 가지고 있으며 이것이 잘려나가면서 성숙 (mature) 단백질이 되는데, 이러한 진핵세포의 신호펩티드를 이용하여 대장균에서 페리플라즘(periplasmic space)으로 생성된 단백질을 수송하는 예가 많으므로, 테네신 3의 신호펩티드도 박테리아에서 작용한다면 쉽게 완전형의 테네신 3를 정제할 수 있을 것이다. 이를 위해 하기와 같은 새로운 5' 프라이머를 제조하여 신호펩티드를 포함하는 cDNA를 PCR반응을 통해 얻은 다음, pET-3a 벡터에 클로닝하고 이를 pAFT-2로 명령하였다(참조: 제4도).
아울러, 테네신 3의 His-taq 융합 단백질을 Ni2+친화컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하기 위해, pRSET B 벡터에 테네신 3 cDNA를 클로닝하여, His-taq이 테네신 3의 N-말단에 융합된 융합단백질을 생산할 수 있는 플라스미드 pRSAF-1를 제조하였다.
[실시에 5]
대장균 내에서 발현된 테네신 3의 고순도 정제
MBP-테네신 3 융합단백질은 자체적으로는 활성도가 낮고, 이를 Xa로 잘라 사용하는 것은 높은 농도의 테네신 3 단백질을 얻기가 어려워, 상기 실시예 4에서 제조한 pRSAF-1을 이용하였다.
균 배양
멸균한 LB배지 10ml에 앰피실린을 가하여 최종 농도가 1mM되게 한 다음, 이 배지에 pRSAF-1을 지닌 대장균 2-3 콜로니 정도를 취하여 접종시킨 후 37℃에서 밤새 전배양(preculture)하였다. 600nm에서의 흡광도를 측정시 OD 값이 0.6-1 정도되었을 때, 위의 용액을 전배양시와 동일한 조성을 가진 LB/amp 배지 1L에 혼합하여, 이것을 37℃에서 3-4시간 정도 배양하였다. 600nm에서 흡광도가 1 정도 되었을 때, 1M IPTG를 1ml 정도 가하여 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이후에 8,000g, 4℃에서 10분 정도 원심분리하여 배양된 균주를 모아, 소량의 1X 결합 완충용액에 현탁시킨 다음, -20℃에서의 동력 및 융해 조작을 3회 정도 실시하였다. 이후 얼음 상에서 열과 거품이 나지 않게 주의하며, 시료가 약간 흑색으로 변색할 때까지 간헐적으로 세포를 초음파 파쇄하였다. 이것을 4℃에서 약 20,900g 정도로 20분간 원심분리한 후, 상등액을 조심스럽게 취하여 이것을 다음 단계인 His-tag 친화성 컬럼에 주입하였다.
His-tag 친화성 컬럼을 통한 재조합 테네신 3 유도체의 분리
2ml 정도의 수지를 잘 현탁시켜 공기 방울이 들어가지 않게 주의하며 자유낙하 시키는 방법으로 컬럼을 충진시키고, 수지에 대하여 약 5배 부피의 2차 증류수로 수지를 세척하였다. 이때의 유속은 4초당 1방울(17ul)정도로 하며, 다음 과정에서도 이 정도의 유출 속도를 유지시켰다. 이후, Ni를 함유한 1X 완충용액(charge buffer)을 가하여 수지에 전하를 부여하고, 다시 결합 완충용액으로 평형화시킨 다음, 상기에서 얻은 상등액을 주입하였다. 이어, 1X 결합 완충용액을 가하여 다시 평형화시키고, 이후 10% 및 16% 용출 완충용액을 평형화될 때까지 차례로 가한 다음, 최종적으로 100%의 용출 완충용액을 가해 컬럼에 결합했던 모든 것을 유출시켰다(컬럼은 재사용을 위하여 6배 부피의 스트립 완충용액(strip buffer)으로 용출시켜 4℃에서 보관하였다) 위의 과정에서 분취한 액의 함유된 염(salt)과 과량의 아미다졸을 제거하기 위하여, 제한 분자량 1000의 막을 사용한 한외여과 (ultra filtration)를 실시하였는데, 여과하여 농축한 후 다시 적량의 2차 증류수로 희석하는 과정을 수회 반복하였다.
HPLC에 의한 재조합 테네신 3 유도체의 분리
상기 His-tag 컬럼으로 분리된 시료를 상온에서 Speed-Vac을 이용하여 건조시키고, 소량의 HPLC용 정제수에 용해시켜 TSK-gel 3000SW 컬럼에 주입하였다. 이 때, 유속은 0.3ml/min, UV 흡광도는 220nm에서 측정하고, 용매는 0.05%의 TFA를 함유한 25% CH3CN 용액을 사용하였다. 이 과정을 통하여 분리된 각 피크(peak)별로 용출액을 분취하여 SDS-PAGE하고 순도 및 분자량 등을 결정하고, 또 각각에 대해 항균력 시험을 하였다.
[실시예 6]
돌연변이 테네신 3 단백질을 생산하기 위한 재조합 DNA의 제조
His-tag 테네신 3의 결실 실험을 위한 플라스미드의 제조
(1) N-말단 결실을 위한 플라스미드의 제조
테네신 3의 cDNA 부분을 포함하는 pAFT-2 벡터의 SacI/BamHI 제한효소자리를 절단하고 클레노우 단편(klenow fragment)으로 처리하여 염기를 채운 다음 (fill ing), 시로 연결하여 SacI 자리가 제거된 플라스미드를 얻어 "pAFT-22"라 명명하였다. pAFT-22의 EcoRI, HindIII 단면을 pRSET B벡터에 클로닝하여 얻어진 플라스미드의 BamHI, HindIII 단편을 SacI 자리가 제거된 pGEM-3zf(+)에 다시 클로닝하여 "pJLAF5d"라고 명명하였다.
(2) N-말단 결실
pJLAF5d 벡터의 SacI 제한효소자리를 절단하여 엑소뉴클레아제(exonuclease)에 저항성을 갖는 3' overhang을 만들어주고, BalII 제한효소로 5' overhang을 만든 다음, 일렬화된 벡터를 진클린(geneclean)방법을 이용하여 정제하였다. 얻어진 DNA 단편에 대하여 Exo III 엑소뉴클레아제를 처리하여 시간별로 분획화하였다. 각 분획에 대해서 SI 뉴클레아제를 처리하여 단일가닥 부분을 제거한 다음, 70℃로 가열하여 뉴클레아제들을 불활성화시키고 평활말단화 연결(blunt-end ligation)을 시행하여 N-말단 결실의 돌연변이 재조합 DNA를 얻었다(참조: 제5도)
(3) C-말단 결실
pRSAF3d(=pRSAF-1) 벡터의 SphI 제한효소자리를 절단하여 3' overhang를 만들어 주고, Sa1I 제한 효소로 5' overhang을 만든 다음, 일렬화된 벡터를 진클린 방법으로 정제하였다. N-말단 결실실험에서와 마찬가지로 얻어진 DNA 단편에 대하여 Exo III 엑소뉴클레아제를 처리하여 시간별로 분획하였다. 각 분획에 대하여 S1 뉴클레아제를 처리하여 단일가닥 부분을 제거한 다음, 70℃로 가열하여 뉴클레아제들을 불활성화 시키고 평활말단화 연결을 시행하여 C-말단 결실의 돌연변이 재조합 DNA를 얻었다(참조: 제5도).
결실 재조합 단백질의 발현 및 분리
(1) 결실 재조합 단백질을 합성하는 균주의 제조
C 말단이 결실된 플라스미드의 경우에는 결실실험에 사용된 플라스미드가 직접 재조합 단백질을 발현할 수 있는 플라스미드이었기 때문에 다시 클로닝해야 할 필요가 없었지만, N 말단이 결실된 플라스미드의 경우에는 결실점의 결정 이후에 발현을 위한 pRSET 벡터로 옮겨야 하였다. 결실점이 무작위적으로 결정되기 때문에 번역시의 코돈을 고려하여 결실된 테네신 3부분이 His-tag에 융합되어 발현될 수 있도록 클로닝하였다. 이후 모든 플라스미드는 발현을 위해 T7 RNA 중합요소 유전자를 가지는 대장균 BL21(DE3) 균주에 도입하였다.
(2) 결실 재조합 단백질의 발현
결실 재조합 단백질의 대량 생산을 위하여, 먼저 각 플라스미드를 가지는 단일 콜로니들의 BL21(DE3) 각각을 12시간 정도 액체 배지에서 배양한 다음, 이를 500ml LB 배양액에 1/100로 희석시켜 다시 3시간 정도 배양하였다. OD600값이 약 1.3정도 되었을 때 IPTG를 최종 농도 1mM 정도가 되도록 첨가하고 약 3시간 정도 더 배양하였다.
(3) 결실 재조합 단백질의 분리와 정제
단백질 생산후에 원심분리로 균체를 수확한 다음, 급히 동결하였다가 10ml 정도의 결합 완충용액(5mM imidazole, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl pH 7.9)에 재현탁하고, 초음파 파괴하였다. 이어, 21,000xg로 원심분리하여 얻은 상층액을 Ni2+가 결합된 His 결합의 수지가 충진된 친화성 컬럼에 가하고, 결합 완충용액과 용출 완충용액(1M imidazole, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl pH 7.9)의 농도구배 컬럼 크로마토그래피 방법으로 His-tag이 융합된 결실 테네신 3만 용출하였다. 이때, 보다 편리하고 정확한 농도구배 컬럼 크로마토그래피를 위해 자동화된 액체 컬럼 크로마토그래피 기기를 이용하여 실험하였다. 용출된 단백질들은 SDS-PAGE으로 발현여부를 확인한 다음, 투석튜브(dialysis tube, MWCO 1000)를 이용하여 염을 제거하고 동결건조(lyophilization)하여 농축하였다.
특정자리 돌연변이화 반응을 위한 플라스미드의 제조
N-말단 결심 실험으로 얻어진 재조합 단백질 중에서 활성을 보이는 것 중 테네신 3의 가장 작은 DNA 단편을 갖는 p5212에 대하여 특정자리 돌연변이화 반응을 도입하였다. 특정자리 돌연변이화를 위해서, pHT△N45의 BamHI, HindIII 단편을 pALTER-1벡터에 클로닝하고 "pSelHT△N45"라고 명명하였다. pSelHT△N45를 PstI 제한효소로 절단하여 클레노우 단편을 처리하고, 재결합하여 PstI자리를 제거함으로써 얻은 콜론을 "pSe1HT△N45△"라 명명하였다.
(1) 특정자리 돌연변이와 프라이머의 디자인
pHT△N45의 아미노산들을 6개의 블록(block)으로 나누어 각 블록을 4개의 알라닌으로 블럭 돌연변이화시킬 수 있도록 프라이머를 디자인하였다. 이때, 축퇴 (degenerate) 코돈중에서 알라닌 블록 중에 새로운 PstI 제한 효소자리가 만들어지도록 디자인하여 돌연변이 코돈을 얻는데 편리하도록 하였다.
(2) 특정자리 돌연변이화반응
pSelHT△N45△를 포함하고 있는 대장균에 보조 파아지 R405을 감염시켜 단일 가닥 DNA를 얻은 후에, Amp 수선 올리고머(repair oligomer)와 각각의 돌연변이화 프라이머를 넣고, T4 DNA 중합효소로 처리하여 단일가닥 DNA를 주형으로 양쪽가닥을 만들어 준 다음, 연결효소로 처리하여 닉(nick)을 이어주었다. 반응 후 DNA 를 수선 기능에 결손을 가진 균주인 대장균 BMH 71-18mutS에 도입하고, 그 형질전환체를 앰피실린 포함의 배지용액에서 배양하여 돌연변이화된 DNA를 얻었다(참조: 제6도).
[실시예 7]
갈색거저리에서 추출한 테네신 3, MBP-테네신 3 융합 단백질, 결실 재조합 단백질 및 특정자리 돌연변이화 결실 재조합 단백질의 항진균력 조사
1. 갈색거저리에서 추출한 테네신 3의 항진균력 조사
(1) 각종 균류의 배양조건
본 실험에 사용한 진균류의 배지 및 배양 조건을 하기 표에 나타내었다.
[표 1]
(2) 각종 균류의 성장측정
효모 종류는 액체 배양액을 희석하여 생존균수를 헤아리고(viable counting) , 필라멘트 형(filamentous type)은 분생포자가 발아하는 것을 현미경으로 관찰하여 균사가 자라는 길이를 시간별로 측정하였다.
(3) 조 테네신 3(crude Tenecin 3)의 각종 진균류에 대한 항균력
3종의 효모형 진균류와 4종의 필라멘트형 진균에 대한 c-테네신 3의 항균효과를 조사하였다. 조사한 7종의 진균류 중 필라멘트형 진균과 Trimorphomyces papilionaceus에 대해서는 치사효과를 나타내지 않았으며, 주로 성장의 저해효과만을 나타내었다(참조; 제7a도 및 제7b도,제8도,제9도). Saccharomyces cerevisiae와 Candida albicans의 효모형 진균은 5㎎/ml의 c-테네신 3 농도에서 거의 완벽하게 성장이 저해되었으며(참조: 제7a도 및 제7b도), 약하게나마 치사효과가 나타났다. 이들 효모형 진균은 배지에서 배양하면서 c-테네신 3을 처리하였을 경우, 5㎎ 이상의 농도에서 균체수가 감소하는 것을 보였다. 그러나, 이들도 성장이 일어나지 않는 조건, 즉, 구연산 나트륨 완충용액(0.05M,pH 6.5)에서 배양하였을 경우에는 전혀 c-테네신 3의 치사효과가가 관찰되지 않았다(참조; 제10도). 따라서, c-테네신 3의 치사효과는 적어도 성장한느 세포에만 작용함을 알 수 있었다.
(4) c-테네신 3에 의한 각종 균류의 성장 및 형태발생상의 이상
앞에소 본 바와 같이 c-테네신 3는 각종 균류에 대해 치사효과는 크지 않고, 주로 정상적인 성장을 억제하였다. c-테네신 처리한 Candida albicans와 Saccharomyces cerevisiae는 처리하지 않은 균주보다 커지며, 달걀모양에서 구형으로 변하였다. 필라멘트형 진균은 포자의 발아관 생성이 늦거나 발아율이 떨어지며, 발아한 포자의 균사성장이 저해받거나 극히 비정상적으로 진행되었다.
2. MBP-테네신 3 융합 단백질의 항진균력 조사
MBP-테네신 3융합 단백질의 항균력을 조사하기 위하여, SD(Sabouraud Dextrose)아가에서 배양한 Candida albicans의 단일 콜로니를 SD 브로쓰(broth)에서 2시간 배양하였다. 배양된 103세포를 MBP-테네신 3융합 단백질 또는 동일부피의 증류수(대조군)와 함께 400ul의 2x SD 브로쓰에서 진탕배양한 다음, 일정 시간 간격으로 일정량을 취하여 SD 아가에 도말하고, 콜로니의 수를 계산하여 세포 성장의 지료로 하였다. 그 결과, 약 200ug 농도의 MBP-테네신 3융합 단밸질은 Candida albicans(참조; 제11도)와 Cryptococcus neoformans(참조; 제12도) 병원성 균류의 성장을 저해하였으나, Aspergillus nidulans와 Saccharomyces cerevisiae의 성장은 눈에 띄게 저해하지 못하였다(참조; 제13도).
융합 단백질의 항균력이 MPB와 관련이 있을 수도 있어, pMAL-c2와 pMC-35로부터 얻어진 단백질을 Xa로 자른 후 Candida에 대한 항진균력을 조사하였다(참조; 제14도). 제14도에서 보듯이, pMAL-c2로부터 얻어진 단백질과 이를 Xa로 자른 단백질 모두 비교적 낮은 정도로 Candida의 성장을 저해하였으나, MBP-테네신 3 융합 단백질을 Xa로 잘랐을 경우에는 현저한 성장저해를 보임으로써, 융합 단백질의 항진균 효과는 MBP보다는 테네신 3 단백질 때문임을 명백히 알 수 있었다. 융합 단백질의 활성도가 떨어지는 것은 거대한 단백질의 MBP와 융합되었기 때문일 것으로 생각되며, 특히 다른 곤충에서 분리된 항진균성 단밸질과 비교하여 보존된 (conserved) 것으로 보이는 C말단 부분이 MBP와 결합되어 활성을 상실하였기 때문일 것으로 추정된다. 약 50ug의 융합 단백질을 Xa로 잘랐을 때, 테네신 3 농도는 약 7ug 정도되는 것으로 추정되는데, 이 농도에서 103세포의 Canadida는 거의 성장치 못하였다(참조; 제14도)
3. 결실 재조합 단밸질의 항진균력 조사
정제된 결실 단백질들을 C. albicans에 대하여 항진균 활성을 조사해 보았다. 활성실험시에 처리해 준 단백질들의 양은 결실된 단백질들의 예상되는 분자량을 계산하여 결실되지 않은 테네신 3의 50ug과 같은 물수의 양이 처리될 수 있도록 하여 실험하였다. 실험 결과의 예상으로, 중요부위가 결실된 단백질의 경우에는 항진균 활성을 가지지 않을 것이라고 예측되었지만, 실제 활성 조사결과로는 예상과 달리 결실된 단백질들 모두가 항진균 활성을 가지는 것으로 나타났다(참조; 제15도). 특히, HT△C49와 HT△N45의 경우에는 각각 N 말단과 C말단의 절반에 해당하는 부분만으로 이루어져 서로 공유하는 부분이 없음에도 불구하고 똑같이 항진균 활성을 나타내었다. 이런 결과를 해석해 볼 때, 테네신 3는 항진균 활성에 적용하는 두 개의 영역(domain)을 가지며, 이들은 각각 N말단과 C말단에 위치한다는 것을 알 수 있었다.
4. 특정자리 돌연변이화 결실 재조합 단백질의 항진균력 조사
정제된 알라닌 돌연변이화 단백질들을 곰팡이 C. albicans에 대하여 항진균 활성을 조사해 보았다. 활성 실험시에 처리해 준 단백질들의 양은 결실된 단백질들의 예상되는 분자량을 계산하여 결실되지 않은 테네신 3의 20ug과 같은 몰수의 양이 처리될 수 있도록 하여 OD 계수법을 이용하여 실험하였다. 실험 결과, 테네신 3의 49번째 아미노산에서 약 8개의 아미노산 부분과 테네신 3계열의 항진균 단백질들간에 커다란 유사성을 나타내는 c-블록의 GHQG부분이 항진균 활성에 영향을 미치는 중요한 아미노산이라는 결과를 얻을 수 있었다(참조; 제16도).
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명에 의하면, 갈색거저리 유충에서 분리한 신규의 항진균 단백질인 테네신 3 및 그의 변종은 유전공학적 방법으로 대량으로 제조된다. 이렇게 대량 생산된 테네신 3 및 그의 변종들은 약학적으로 허용되는 성분들과 함께 항진균제의 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
Claims (12)
- 갈색거저리(T.molitor)의 유충으로부터 분리한 하기와 같은 아미노산 서열 또는 이와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 가지는 항진균 단백질(Tenecin 3) :
- 제1항의 항진균 단백질(Tenecin 3)을 암호화하는 하기와 같은 염기서열을 가지는 항진균 단백질의 유전자 및 그의 기능적 등가물;
- 제2항의 항진균 단백질(Tenecin 3) 유전자를 포함하고 있는 발현벡터.
- 제3항에 있어서, 단백질 발현가능의 플라스미드인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제3항에 있어서, 말토스 결합 단백질(maltose binding protein)을 융합파트너로 이용하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제3항에 있어서, 히스티딘이 표지된 항진균 단백질(Tenecin 3)을 생산할 수 있는 벡터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제3항의 발현벡터로 형질전환된 숙주 미생물을 배양하여 항진균 단백질 (Tenecin 3)의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 공정을 포함하는 재조합 항진균 단백질(Tenecin 3)의 제조방법.
- 제7항에 있어서, 숙주 미생물을 대장균인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항의 항진균 단백질(Tenecin 3)에서 신호펩타이드가 결실되고 남은 성숙 항진균 단백질(mature Tenecin 3)의 아미노산 서열이 일부 결실되거나 치환된 변종.
- 제9항에 있어서, 신호펩타이드를 포함하는 항진균 단백질(Tenecin 3)의 아미노산 서열을 기준으로 한 94∼96번 아미노산, 70∼96번 아미노산, 61∼96번 아미노산, 48∼96번 아미노산, 19∼28번 아미노산, 19∼35번 아미노산, 19∼47번 아미노산, 19∼55번 아미노산 및 19∼63번 아미노산으로 구성된 구릅으로부터 선택되는 1종의 아미노산 그룹이 결실된 것을 특징으로 하는 변종.
- 제9항에 있어서, 신호펩타이드를 포함하는 항진균 단백질(Tenecin 3)의 아미노산 서열을 기준으로 한 67∼70번 아미노산, 72∼75번 아미노산, 77∼80번 아미노산, 82∼85번 아미노산, 86∼89번 아미노산 및 91∼94번 아미노산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종의 아미노산 그룹이 알라닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종.
- 제9항의 변종을 암호화하고 있는 유전자를 단백질 발현가능의 벡터에 삽입하고, 그를 숙주 미생물에 도입한 다음, 형질전환체를 배양하여 변종 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 공정을 포함하는 재조합 변종 단백질의 제조방법.
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