KR100230880B1

KR100230880B1 - 사람 면역결핍 바이러스 그룹의 레트로바이러스로부터 유래된 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR100230880B1
Application number: KR1019950003516A
Authority: KR
Inventors: 브루스트 스테판; 크냅 스테판; 게르켄 만프레트; 귀르틀러 루츠게.
Original assignee: 부크, 파일; 베링베르케 아크티엔게젤샤프트
Priority date: 1994-02-23
Filing date: 1995-02-23
Publication date: 1999-11-15
Also published as: AU1353295A; JPH07278189A; DK0673948T3; BR9500732A; NO950668D0; US5830634A; US20010009667A1; US6335158B2; US7803524B2; NO315163B1; NO950668L; EP0673948A1; US20020123039A1; DE59504181D1; BR9500732B1; US6869608B2; US20050271678A1; DE4405810A1; KR950032278A; CA2143163C

Abstract

본 발명은, MVP5180/91로 명명되었고 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 기탁번호 V 920 92 318로 기탁된 신규한 면역결핍증 바이러스로부터 유래된 면역학적으로 활성인 펩타이드에 관한 것이다. 이들 펩타이드는, 특히, 면역결핍증 질환과 관련된 레트로바이러스에 대한 항체를 검출하는데 사용된다.

Description

사람 면역결핍 바이러스 그룹의 레트로바이러스로부터 유래된 펩타이드

제1도는 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 타입 레트로바이러스의 게놈 배열을 나타낸다.

제2도는 항원/항체 반응으로 수득한 역전사효소 활성과 항원 농도의 관계를 나타낸다.

제3도는 HIV-1 분리물 ARV-2의 서열과 재조합 플라스미드 pSEM 41/3-III에서 발현된 MVP5180 gp41의 서열을 나타낸다.

본 발명은 사람 면역결핍 바이러스 HIV 그룹의 신규한 레트로바이러스인 MVP5180/91로부터 유래된 합성 펩타이드 및 재조합 단백질에 관한 것이다. 또한 이들 펩타이드 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 방법도 기술하고 있다. 또한 본 발명은 의약 목적, 특히 진단용 및 백신 제조용으로서의 이들 펩타이드 및 재조합 단백질의 용도에 관한 것이다.

소위 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 그룹에 속하는 레트로바이러스는 이에 감염된 사람에게서, 총칭하여 면역결핍증 또는 AIDS (후천성 면역 결핍증)로 불리는 질환 증후군을 유발시킨다.

역학적 연구는 사람 면역결핍 바이러스(HIV)가 대다수의 AIDS (후천성면역 결핍증) 케이스에 대해 압도적인 병인학적 인자임을 입증하였다. 환자로부터 분리되고 1983년에 특성화된 레트로바이러스는 HIV-1으로 명명되었다[참조:Barre'-Sinoussi,F.et al.,Science 220,868-871(1983)]. HIV-1의 변에체는 W0 86/02383에 기술되어 있다.

1993년까지, 공지된 HIV-1 분리물은 서열비교와 역학적 관점을 근거로 하여 5개의 아형 A 내지 E로 분류되었다[참조:G.Myers et al.,1992,Human Retroviruses and AIDS 1992,A Compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences,Los Alamos Laboratory,Los Alamos,USA].

사람 면역결핍 바이러스의 제2그룹은 1985년 서부 아프리카에서 별견되었으며[참조:Clavel,F.et al.,Science 233,343-346 (1986)], 사람 면역결핍 바이러스 타입 2(HIV-2)로 명명되었다(EP-A-0 239 425 참조). 비록 HIV-2 레트로바이러스가 HIV-1과 분명히 상이하지만, 이들은 또한 원숭이 SIV 면역결핍 바이러스와 관련되어 있다. HIV-1과 마찬가지로 HIV-2 역시 AIDS 증후을 일으킨다.

EP-A 0 345 375는 면역결핍 레트로바이러스의 또 다른 변이체를 기술하고 있으며, 이 문헌에서는 이것을 HIV-3 레트로바이러스로 명명하고 있다(ANT 70).

추가의 면역결핍 바이러스 변이체의 분리가 또한 문헌[참조:Lancet Vol.340,Sept.1992,pp.681-682]에 기술되어 있다.

사람 면역결핍 바이러스는, 변이도가 매우 높아서 서로 다른 분리물을 비교하는 것을 몹시 어렵게 한다는데 특징이 있다. 예를 들어, 여러가지 HIV-1 분리물을 비교하는 경우, 게놈의 일부 영역에서는 고도의 변이성을 나타내는 반면 다른 게놈 영역은 비교적 잘 보존되어 있다[참조:Benn,S.et al.,Science 230,949-951(1985)]. 실질적으로 현저한 정도의 다형성(polymorphism)이 HIV-2에서도 관찰된 바 있다[참조:Clavel,F.et al.,Nature 324,691-695(1986)]. 가장 높은 정도의 유전적 안정성은 gag 및 pol 유전자 영역에 포함되어 있으며, 이것은 구조적으로 및 효소적으로 필수적인 단백질을 암호화하고 있으며; env 유전자의 일부영역 및 또한 조절 단백질을 암호화하는 유전자(vif, vpr, tat, rev 및 nef)들은 높은 정도의 변이성을 나타낸다. 또한, HIV-1에 대한 항혈청이, 비록 서열 상동성의 정도가 낮다고 해도, HIV-2로부터의 gag 및 pol 유전자 생성물과 교차-반응할 수 있다는 것이 입증되었다. 이들 2개의 바이러스는 또한 극히 낮은 제한조건(stringency)이 사용되지 않는 한 어떠한 유의한 정도로도 하이브리드화 되지 않는다[참조:Clavel,F.et al.,Nature 324,691-695 (1986)].

HIV 그룹의 레트로바이러스의 광범위한 확산, 및 감염과 병인학적 변화의 뚜렷한 증상들이 인지되는 시간 사이에서의 기간이 수년 내지 수십년(2년 내지 20년)간 지속된다는 사실로 인하여, HIV 그룹의 레트로바이러스로 인한 감염이 가능한한 빨리, 특히 신뢰할만한 방법에 의해 검출되어야 한다는 것이 역학적으로 매우 중요하다. 이것은 면역결핍 징후를 나타내는 환자를 진단하거나 또한 혈액 공여자를 스크리닝할 때도 중요하다. 비록 공여자로부터의 혈청이 면역결핍증의 징후를 나타낸다해도, HIV-1 또는 HIV-2 타입의 레트로바이러스 또는 이들 바이러스의 구성요소가 검출 시스템에서 사용될 때, 일부의 혈청에서는 항체가 검출될 수 없거나 또는 약하게만 검출된다는 문제점이 있다. 본 발명에 따른 항원을 사용하면, 특정 경우에도 이와 같은 검출이 가능하다.

DE 43 18 186은, 1991년 면역결핍증의 징후를 나타내는 34세의 카메룬 여성 환자의 말초 임파구로부터 분리되어 MVP5180/91로 명명된 신규한 면역결핍 바이러스의 분리 및 특성화를 기술하고 있다. 이 레트로바이러스는 지리적으로 HIV-1 및 HIV-2 바이러스가 만연된 서부 아프리카와 현재 독점적으로 거의 HIV-1만이 존재하는 동부 아프리카 사이에 위치한 아프리카 지역으로부터 기원한 것이다. 상기 출원은 또한 MVP5180/91의 바이러스성 게놈으로부터의 뉴클레오타이드 서열과 이로부터 추론된 아미노산 서열을 기술하고 있다. 이 레트로바이러스는, 부다페스트 조약에 따라, ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 기탁번호 제V920 92 318호로 기탁되었다.

HIV-1 및 HIV-2와 마찬가지로, 신규한 MVP5180/91을 다음의 세포주내에서 증식시킨다 : HUT 78, 쥬켓(Jurkat) 세포, C8166 세포 및 MT-2세포. 이 바이러스의 분리 및 복제는 문헌에 상세한 기술되어 있다[참조:Viral Quantitation in HIV Infection,Editor Jean-Marie Andrieu,John Libbey Eurotext,1991]. 이 문헌에 기술된 방법은 본원에서 참고로 인용되고 있다.

이 신규한 바이러스는 또한 마그네슘-의존성 역전사 효소를 갖고 있으나, 실제로는 망간 의존성이 아니다. 이것은 HIV-1 및 HIV-2 바이러스에 공통적으로 존재하는 또 다른 특징을 나타낸다.

신규한 MVP5180/91 바이러스와 HIV-1 및 HIV-2 레트로바이러스간의 차이를 더 이해하기 위해, 먼저 면역결핍증을 유발시키는 레트로바이러스의 구조를 간단히 언급하겠다. RNA는 바이러스의 내부에 원추형 코어로 위치하고 있으며 이는 p24(p는 단백질을 의미)를 지니는 단백질 소단위로 이루어져 있다. 이 내부 코어는 단백질 p17(외부 코어)로 구성된 단백질 외피로 둘러싸여 있다. 바이러스는 당단백질 외피로 둘러싸여 있고 이는 지질과 기타 구성성분 외에 트랜스막 단백질 gp41과 외막 단백질 gp120을 함유한다. 이 gp120은 숙주세포의 CD4 수용체에 결합할 수 있다.

알려진 바로는, HIV 바이러스의 RNA-간단한 용어로 기술-는 다음과 같은 유전자 영역을 지닌다 : 두 말단 부위에 소위 장말단 반복물(LTR: long terminal repeats) 및 gag, pol, env 및 nef와 같은 유전자 영역. 유전자 gag는, 특히, 코어 단백질 p24와 p17을, 유전자 pol은, 특히, 역전사효소인 RNAse H 및 인테그라제를, env 유전자는 바이러스 외피의 당단백질 gp41과 gp120을 암호화한다. nef 유전자는 조절 작용이 있는 단백질을 암호화한다. HIV 타입의 레트로바이러스의 게놈정렬을 제1도에 도식적으로 나타내었다.

레트로바이러스 HIV-1 및 HIV-2는, 특히, 애보트사에서 시험키트(HIVAG-1 모노클로날)로서 시판하고 있으며 (HIV-1) p24에 대해 지시되는 모노클로날 항체로 바이러스 항원을 시험함으로써 분별할 수 있다. 역전사효소의 함량은 대략적으로 HIV-1 및 HIV-2 바이러스 타입에서 동일한 것으로 공지되어 있다. 따라서, 만일, 파괴시킨 바이러스의 희석액에서, 항원/항체 반응으로 수득한 흡광도(E 490nm)를 역전사효소의 활성에 대해 플로팅하면, 대략적으로 제2도에 상응하는 그래프가 수득된다. 이것은 HIV-1의 경우, 사용된 모노클로날 항체가, 역전사효소의 함량과 관련하여, p24에 대해 대단히 높은 결합 친화도를 가짐을 나타낸다. 이와 달리, 모노클로날 항체는 HIV-2 p24에 대해 다시 말해서, 이들 바이러스에서의 역전사효소의 함량과 관련하여, 대단히 낮은 결합 친화도를 나타냄이 밝혀졌다. 이같은 측정을 MVP5180/91상에서 수행한다면, 곡선은 HIV-1과 HIV-2에 대한 곡선 사이의 중간지점에 거의 정확하게 위치하게 될 것이다. 즉, MVP5180/91 p24에 대한 모노클로날 항체의 결합 친화도는 HIV-1의 경우와 비교하여 떨어진다. 제2도는 이 같은 상황을 도식적으로 나타내고 있다. 여기에서, RT는 역전사 효소이고 단백질 P24는 애보트에서 시판하는 시험 키트내에 존재하는 모노클로날 항체가 지시되는, 항원(Ag)으로서 사용된다.

소위 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)은 유전공학에서 매우 광범위하게 적용되는 시스템이며, 이 방법을 수행하는데 필요한 성분들은 시판되고 있다. 이 방법을 이용하는 경우, 증폭시킬 DNA 서열의 영역이 공지되어 있기만 하면 DNA 서열을 증폭시키는 것은 가능하다. 증폭시킬 핵산서열의 짧은 영역에 어닐링하는, 짧은 상보성 DNA 단편(올리고뉴클레오타이드 = 프라이머)은 반드시 합성되어야만 한다. 이 시험을 수행하기 위해, 프라이머와 함께 HIV 핵산을 폴리머라제와 뉴클레오타이드 트리포페이트를 함유하는 반응 혼합물에 도입시킨다. 중합반응(DNA 합성)은 규정된 시간 동안 수행하고 그후 핵산 쇄를 가열시켜 분리한다. 냉각시킨 후, 다시 중합반응을 개시시킨다. 그러므로, 만일 신규한 레트로바이러스가 HIV-1 또는 HIV-2 바이러스라면, HIV-1와 HIV-2 바이러스의 공지된 서열내에서 보존된 프라이머를 사용하여 핵산을 증폭시키는 것이 가능하다. 이 같은 특성의 일부 프라이머가 이미 기술된 바 있다[참조:Laure',F.et al.,Lancet ii,(1988),538-541,pol 3 및 pol 4에 대해;및 0u C.Y et al.,Science 239 (1988) 295-297,sk 38/39 및 sk 68/69에 대해].

그후, 앞서 기술된 프라이머 쌍이 사용될 경우 MVP5180/91 DNA가 증폭되지 않거나 증폭이 매우 낮게 일어난다는 것이 밝혀졌다[참조: DE 43 18 186].

소위 웨스턴 블롯(면역블롯) 방법은 HIV 항체를 검출하기 위한 일반적인 방법이다. 이 방법에서는, 바이러스성 단백질을 겔 전기영동으로 분획화시킨 후 막으로 이전시킨다. 그후 이전된 단백질을 지니는 막을 조사하고자 하는 환자로부터의 혈청과 접촉시킨다. 존재하는 바이러스성 단백질에 대한 어떠한 항체라도 이들 단백질에 결합할 것이다. 세척한 후, 잔류하고 있는 항체만이 바이러스성 단백질에 특이적인 항체가 된다. 그후 이 항체를, 일반적으로 발색반응을 촉매하는 효소에 커플링시킨 항-항체를 사용하여 가시화시킨다. 이러한 방법으로 바이러스 단백질의 밴드를 가시화시킬 수 있다.

웨스턴 블롯에서, HIV 분리물 MVP5180/91, HIV-1 및 HIV-2 바이러스와 비교하여 두 가지 중요하고 의미있는 차이점을 나타낸다. HIV-1은 일반적으로 단백질 p24에서 기인한 것으로 보이는 하나의 강한 밴드와, 단백질 p23에서 기인한 것으로 보이는 대단히 약하거나 종종 거의 보이지 않는 하나의 밴드를 나타낸다. HIV-2는 단백질 p25에 기인한 것으로 보이는 하나의 강한 밴드와 종종 단백질 p23에 기인한 것으로 보이는 하나의 약한 밴드를 나타낸다. 이와 달리, MVP5180/91바이러스는, 각각 p24 및 p25 단백질에 상응하는 거의 동일한 강도의 2가지 밴드를 나타낸다.

밴드에는 역전사효소에 기인한 것으로 보이는 추가의 중요한 차이점이 있다. HIV-1은 역전사효소에 상응하는 밴드(p53)와 RNAse H와 결합한 역전사 효소에 상응하는 밴드(p66)을 나타낸다. HIV-2의 경우, 역전사 효소는 p55 단백질에 상응하며 이것이 RNAse H에 결합했을 때는 p68 단백질에 상응한다. 이와 달리, HIV 분리물 MVP5180/91은 역전사효소에 상응하는 단백질 p48에서 밴드를 나타내고, RNAse H와 함께 역전사효소에 상응하는 단백질 p60에서 밴드를 나타낸다.

이같은 데이타로부터 MVP5180/91 역전사 효소는 HIV-1 또는 HIV-2의 역전사효소 분자량보다 약 3kD 및 약 7kD이 작은 분자량을 갖는다고 결론지을 수 있다.

면역결핍증의 징후를 나타내는 독일 환자로부터의 혈청 중 항-env 항체는 바이러스 MVP5180/91을 사용하는 경우 매우 약하게만 검출되는 반면, 이들 혈청은 HIV-1 바이러스가 MVP5180/91 대신에 사용될 때 강하게 반응한다는 것이 밝혀졌다(참조:DE 43 18 186). 이러한 보다 강한 검출 반응은 주로 gp41 단백질에 위치한다. 실험에서는, 면역결핍증의 징후를 나타내는 독일환자로부터의 것과 아프리카 환자로부터의 것을 비교한다.

MVP5180/91 게놈의 클로닝과 서열분석은 이미 기술된 바 있다(참조: DE 43 18 186).

상이한 바이러스 분리물 간의 유사성은 핵산서열 또는 단백질 서열간의 상동성 정도로 나타낼 수 있다. 예를 들어, 50% 상동성이란 100개의 뉴클레오타이드 위치 또는 아미노산 위치 중 50개가 서열내에서 상응한다는 것을 나타낸다.

단백질간의 상동성은 서열분석으로 측정한다. 상동성 DNA 서열은 문헌[참조: Southern E. M . ,J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975]에 따른 하이브리드화 방법에 의해 확인할 수 있다.

표 1은 MVP5180/91과, HIV-1 및 HIV-2의 컨센서스 서열(consensus sequience), 및 또한 분리된 ANT70(HIV-3로 명명됨; 참조: W0/89/12094 및 EP-A-0 345 375)의 컨센서스 서열사이의 서열비교를 요약한 것이다. 이 같은 서열 비교는, 진단학적으로 중요한 env 유전자 영역에서, 예를 들어, MVP5180/91이 HIV-1과는 단지 53%만이 상동성이고 HIV-2와는 단지 49%만이 상동성인 서열을 보유하고 있음을 분명히 해주고 있다. 이와 달리, 예를 들어, 아형 A 내지 E의 HIV-1 분리물은, 이들의 게놈성 뉴클레오타이드 서열을 비교할 때 분명히 보다 큰 상동성(%)을 나타낸다. 이런 경우 이 값은 예외없이 75% 이상이다.

[표 1]

이 같은 서열상의 분명한 차이에 근거하고, 이의 게놈성 구조가 HIV-1 바이러스의 것에 상응한다는 사실로 인하여, 분리물 MVP5180/91은 HIV-1 아형인 아형 0로 명명된다[참조:Myers et al.,1993 Human Retrovirus and AIDS 1993, A compilation and analysis of nucleic acid and aminoacid sequences. Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, USA]. 지금까지 알려진 이 같은 아형의 유일한 대표적인 것은 상기 언급한 분리물 ANT70이다.

HIV 감염에 대한 신뢰할만한 검출은 오늘날에는 특히 혈액공여와 관련하여 대단히 중요하다. 혈액 및 혈액제품의 바이러스적 안전성 보장과 관련하여, 혈액 은행에서의 개인적 헌혈자에 대한 HIV-1 항체의 면역화학적 시험은 1985년에 특이적 항-HIV-1 시험이 활용되기 시작된 후 필수적인 것이 되었다. HIV-2가 1986년에 발견된 후, 상응하는 HIV-1 항체 시험을 이용하여 항- HIV-1을 검출하는, 확립된 HIV-1 시험을 이용할 때 높은 신뢰도로써 HIV-2-특이적 항체를 검출해 내는 것은 가능하지 못함이 밝혀졌다. 1989년 이후, 소위 복합 시험이 활용되어 왔는데, 이는 동시적이고, 비-차별적인 항-HIV-1 및 항-HIV-2의 검출을 허용한다. 대부분의 시판 양태의 항-HIV-1/항-HIV-2 복합 시험은 재조합적으로 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된 HIV 항원에 기초한 것이다.

이들 진단적 시험에서는, 검사할 사람으로부터의 혈청 샘플을 바이러스 또는 이의 일부로부터의 하나 이상의 단백질의 단백질 쇄, 펩타이드 또는 당단백질(이는 진핵세포주에서 발현될 수 있다)과 혼합시킨다. 바람직한 시험방법에는 면역형광 시험 방법 또는 면역효소적 시험방법(예 ELISA 또는 면역블롯)이 있다.

면역효소적 시험에서, 예를 들어 MVP5180/91 또는 이의 변이체로부터 유래된 항원은 미세역가 플레이트의 웰에 결합될 수 있다. 이에 사용되는 용량은 시험시스템 및 미세역가 플레이트의 처리에 상당한 정도로 영향을 받는다. 조사할 사람으로부터 유래된 혈청 또는 혈청 희석물을 미세역가 플레이트의 웰에 가한다. 규정된 항온처리 시간후 플레이트를 세척한다. 특이적 면역 복합체는 사람 면역글로불린에 특이적으로 결합하고, 이미 마커 성분, 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제 등에 커플링시킨 항원에 대한 항체 결합으로 검출해낸다. 이들 특이적 면역 복합체는 또한 당해분야의 숙련가에게 널리 공지된 샌드위치법을 이용하여 표지시킨 항원에 의해 검출할 수도 있다. 이들 효소는 무색 기질을 강하게 착색된 생성물로 전환시킬 수 있으며, 그후 특이적 항-HIV 항체의 존재는 발색강도로부터의 판독할 수 있다.

MVP5180/91이 아형 0에 속하지 않은 기타 HIV-1 분리물 및 또한 HIV-2 분리물과 상대적으로 낮은 상동성을 나타내기 때문에, 시판되는 항-HIV-1/항-HIV-2 테스트에서 사용되는 항원이, MVP 5180/91 또는 MVP5180/91과 아주 밀접하게 관련되어 있는 바이러스에 감염되어 생성된 항체를 검출하는데도 적합한지에 대한 의문이 생긴다.

놀랍게도, 상업적으로 시판되는, 효과적인 항-HIV-1/2 스크리닝 시험에 의해 만족할만하게 검출되지 않는, 면역결핍증 환자로부터의 혈청중 HIV 항체가 MVP5180/91 항원에 기초한 면역분석을 이용하는 경우 신뢰할만하게 검출된다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에서, 미세역가 플레이트를 HIV-1 및 MVP5180으로부터 유래한 펩타이드로 동시에 피복시키게 되면, 이들 바이러스에 대해 지시되는 항체를 동시적으로 검출하게 된다는 것도 입증되었다. 본 발명은 또한, MVP5180-특이적 및 혈청형 0-특이적 항체를 검출하도록 해주는 MVP5180-기원한 재조합 항원에 관한 것이다. 또한 이것외에도, 특이적이고 선택적인 방법으로 혈청형 0-특이적 및 "비"-혈청형 0-특이적 HIV 항체사이를 구분해 낼 수 있는 펩타이드가 기술되고 있다.

HIV 감염의 진단에 있어, HIV 감염의 존재 또는 부재에 관한 진단적 테스트에 의해 가능한 한 정확도를 높게 하는 것이 절대적으로 요구된다. 특히, 혈액은 행과 관련하여, 가능하다면, HIV 바이러스 감염을 100% 신뢰도로 예방하는 것이 필수적이다. 신뢰도에 있어서 약간의 개선도 중요한데, 이것은 저장혈액 중에서 단지 하나의 HIV-양성 샘플을 동정해내는 것이라도 수혈을 통해 HIV 바이러스 감염으로부터 환자를 보호할 수 있기 때문이다.

따라서 본 발명은, 특히, HIV 타입의 레트로바이러스를 진단적으로 검출하기에 적합한 하기와 같은 펩타이드에 관한 것이다. 이와 같은 펩타이드는 약 15개 내지 약 50개, 바람직하게는 약 15개 내지 약 35개의 연속적인 아미노 서열을 가지며, 이 아미노산은 다음의 아미노산 서열로부터 선택된다 :

VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR,

상기 서열식에서,

X 는 C 또는 S의 의미를 갖는다.

바람직한 양태에서, 펩타이드는 다음 서열로부터 선택된다 :

RLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWN.

상기 언급한 아미노산 서열은 단일 문자 코드로 나타내었으며, 여기에서 각각의 문자는 다음의 의미를 갖는다; A = 알라닌, R = 아르기닌, N = 아스파라긴, D = 아스파르트산, C = 시스테인, Q =글루타민, E = 글루탐산, G = 글라이신, H = 하스티딘, I = 이소루이신, L = 루이신, K = 라이신, M = 메티오닌, F =페닐알라닌, P = 프롤린, S = 세린, T = 트레오닌, W = 트립토판, Y = 티로신 및 V = 발린.

아미노산 서열이 소위 3 문자 코드로 나타내지는 경우, 다음의 서열이 수득된다 : Val Trp Gly Ile Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Trp Gly X Lys Gly Lys Leu Ile X Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Ser Trp Thr Ser Gly Arg,

상기 서열식에서,

X는 Cys 또는 Ser의 의미를 갖는다.

특히 바람직한 양태에서, 하나의 펩타이드내에서의 X의 의미는 동일하다. 즉, 시스테인이 2회 존재하거나 세린이 2회 존재한다.

면역학적으로 활성인 펩타이드는, 환자의 혈액 또는 혈액 공여자의 혈액중에 존재할 수 있는 HIV 바이러스에 대한 항체와 반응할 수 있는 펩타이드를 말한다. 따라서, 통상적으로, 면역학적으로 활성인 펩타이드는 항체의 형성을 유발시키는 하나 이상의 에피토프를 포함한다.

진단에 대해 주된 관련성을 갖는 에피토프는 영역 XKGKLIX 내에 위치해 있는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따른 펩타이드는, 이 에피토프의 좌 및/또는 우에 대한 추가의 영역을 갖고 있으며, 이것은 바이러스 MVP 5180의 상응하는 서열과 상동성이다. 이 영역은 펩타이드가 진단적 시험에서 사용될 때 무엇보다도 중요하다. 이 펩타이드가, 예를 들어, ELISA 시험에서, 고체상에 결합된다면, 펩타이드가 에피토프의 좌측에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 경우 유리하다. 접합을 수행하고자 한다면, 펩타이드가 주요 에피토프의 우측에 MVP5180과 상동성인 서열을 갖는 것이 유리하다.

바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 약 20개 내지 약 30개의 아미노산 길이를 갖는다. 본 발명의 범주 내에서 다음의 펩타이드가 특히 바람직하다;

MVP601-623 : NQQRLNLWGCKGKLICYTSVKWN

MVP591-616C : RLQALETLIQNQQRLNLWGCKGKLIC 및

MVP591-616S : RLQALETLIQNQQRLNLWGSKGKLIS.

MVP5180과 상동성인 아미노산 서열 외에, 본 발명에 따른 펩타이드는, 펩타이드의 한쪽 또는 양쪽 끝 모두에, 특정 작용에 중요한 추가의 아미노산을 갖는다. 이와 관련하여, 이들 후자의 아미노산은 예를 들어 펩타이드가 고체상에 결합되는 것을 용이하게 하는 아미노산일 수 있다. 이들 펩타이드가 재조합적으로 제조되었다면, 이 펩타이드는 또한 재조합적 제조의 특성으로 인해 생겨날 수 있는 아미노산을 포함할 수 있다.

이들 펩타이드는 재조합 기술외에 합성 방법으로도 제조할 수 있다. 메리필드(Merrifeld) 타입의 고체상 합성은 적절한 제조경로를 나타낸다. 이 기술에 대한 추가의 설명 및 당해 분야에 공지된 다른 방법은 문헌을 참조한다[참조:M.Bodansky et al.,Peptide Synthesis,John Wiley ＆ Sons,2nd Edition 1976).

본 발명은 또한, 상기 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 상보적인 분리된 DNA 단편에 관한 것이다. 이 같은 특성의 분리된 DNA 단편은, 자체가 공지된 폴리 머라제 연쇄 반응(PCR)에 사용할 수 있다.

다음의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드는 특히 면역 결핍증을 유발시키는 바이러스에 대한 항체를 검출하기 위한 시험키트에서 사용될 수 있다. 이런 경우, 하나 이상의 본 발명에 따른 펩타이드가 사용된다.

시험키트는 소위 웨스턴 블롯을 포함할 수 있으며, 또한 특히 바람직한 양태에서 소위 ELISA 시험 또는 형광 항체 검출시험을 포함할 수도 있다. 이것외에도, 본 발명에 따른 펩타이드는 또한 백신제조, 특히는 아형 0의 HIV 바이러스 감염에 대한 백신 제조에 적합하다.

다음의 실시예는 본 발명의 양태를 나타내며, 이에 제한되지 않는다.

[실시예 1]

혈청형 0-특이적 항체의 HIV 검출을 위한 간접적 면역분석

[실시예 1a ]

본 발명에 따른 MVP 601-623 펩타이드 및 HIV-1 펩타이드 HIV 601-623의 합성

MVP5180의 트랜스막 단백질 gp41로부터의 MVP 601-623(제3도 참조) NQQRLNLWGCKGKLICYTSVKWN의 합성은 문헌에 따라 실시한다[참조:Barant,G. and Merrifield,R.B.,"The Peptides,Analysis,Synthesis and Biology",Vol.2,Academic Press Ed.Erhard Gross,Johannes Meyerhofer]. HPLC에 따른 분석적 순도는 81%이다.

참조용 펩타이드 HIV 601-623(제3도참조) DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWN도 마찬가지로 메리필드 방법으로 합성한다. 조 펩타이드를 HPLC로 정제한다. 순도는 87%이다.

제3도는 HIV-1 분리물 ARV-2의 상응하는 서열과 비교하여, 재조합 플라스미드 pSEM 41/3-III에서 발현된 MVP5180 gp41로부터의 서열영역을 나타낸다. HIV로 나타낸 펩타이드는 HIV-1 분리물-유래된 서열을 나타낸다. MVP로 나타낸 펩타이드는 MVP5180-유래된 서열을 나타낸다. 서열의 번호부여는 문헌[참조:Rattner et al.,Nature,313:277-284]에서 HIV-1 BH10 env 서열에 관한 데이터와 관련되어 있다.

[실시예 1b]

펩타이드 용액의 제조 및 이 펩타이드를 사용한 미세역가 플레이트의 피복

실시예 1a로부터의 펩타이드 MVP 601-623 및 HIV 601-623을 6mg/m1의 농도로 50%(v/v) 아세트산에 용해시킨다.

스톡 용액을 중탄산나트륨(pH 9.6) 0.10M 중에 희석시켜 폴리펩타이드의 농도가 1μg/m1가 되도록 한다.

희석 용액 100μ1를 Nunc(Roskilde,Denmark)로부터의 타입 b 미세역가 플레이트의 웰 각각에 가한다. 충전된 시험 플레이트를 18시간 동안 20℃에서 항온처리하고, 용액을 흡입 제거시키고 웰을 인산염-완충시킨 생리학적 염화나트륨 용액(PBS)중에서 300μ1의 소혈청 알부민 용액 10g/1 용액으로 3 내지 4회 세정시킨 다음, 시험 플레이트를 20℃에서 실리카 겔로 건조시킨다.

[실시예 1c]

사람 면역 글로불린 IgG 부류(h-IgG)에 대한 퍼옥시다제-표지시킨 항체 및 검출용 TMB 기질의 제조

h-IgG에 대한 모노클로날 항체를, 문헌[참조:Sthli et al.,J.of Immunological Methods 32,297-304,1980]에 기술한 방법으로 동정된 동일한 항원 특이성을 갖는 상이한 모노클로날 항체를 사용하여, 문헌[참조: Koehler and Milstein, Nature 256, 495, 1975]의 방법에 따라 제조한다.

겔 크로마토그래피 정제 및 PBS 완충액(pH 7.4)에 대한 투석에 이어, 모노클로날 항제 분획(4mg의 단백질/ml)을 문헌[참조:Tanamori et al.,J.Immunol.Meth.62,123-131,1983]에 따라 N-γ-말레이미도 부틸옥시석신이미드(GMBS)와 반응시킨다. 이와 병행하여, 2-이미티올란 하이드로클로라이드(Sigma 주문 번호 I 6256)를 문헌[참조:King et al.,Biochem.17,1499-1506,1978]에 따라 서양고추 냉이 퍼옥시다제(POD, Boehringer Mannheim 주문번호 413470)와 반응시킨다. 항체/POD 접합체를 GMBS/항체 접합체 및 이미노티올란/POD 접합체로부터 문헌[참조:Tanamori et al.,상기 참조]에 기술된 바와 같이 제조한다.

생성된 IgG/POD 접합체 용액은 360μ1/ml의 단백질 함량을 갖는다. IgG에 대한 POD의 비율은 2.8이다. 이어서 용액을 PBS 중의 50ml/1 태아송아지 혈청(ECS; Biochrom KG(Berlin) 및 5g/1 폴리옥시에틸린(20) 솔비탄 모노라우레트(트윈 20)을 써서 500ng/ml IgG/POD로 희석시키고, 이를 항-IgG/POD 접합체로 명명한다. ELISA에서 사용하기 위해, 항-IgG/POD 접합체를 트리스 완충액(pH 7.4, 0.5%의 트윈 20 함유)으로 1:100 내지 1:20,000으로 희석시키고, 접합체 완충액[0.1M1-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올(트리스), 0.1M 염화나트륨(NaC1) 및 0.1% 트윈 20(pH 8.4)] 중의 일련의 1:26 최종 희석물을 제조한다.

항-사람 IgG/POD를 검출하기 위해, 다음과 같은 2개의 스톡 용액으로부터 제조한 과산화수소 및 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 구성된 기질시스템 또는 기질 제제를 사용한다.

스톡용액 1 : TMB 디하이드로클로라이드를 5g/1(16mmol/l)의 농도로 2차 증류수에 교반하여 용해시키고, 이 용액의 pH를 5N 염산을 사용하여 pH 1.5로 조정한다. 페니실린 G를 200mg/l(0.56mmol/1)의 최종농도로 이 용액에 교반하면서 가한다.

스톡 용액 2 : 1.4ml의 빙초산, 1.5ml의 1N NaOH 및 250mg(3mmol)의 H₂0₂, 우레아/과산화수소 부가물을 900ml의 2차 증류수에 가한다. 이들 물질이 완전히 용해된 후, 용액을 2차 증류수로 1ℓ로 만든다.

TMB 기질 제조 : 1 용적부의 스톡용액 1과 10 용적부의 스톡용액 2를 서로 혼합시킨다.

[실시예 1d]

본 발명에 따른 펩타이드를 사용한 ELISA에서 MVP5180에 대한 면역글로불린 G 부류의 사람 항체의 검출

실시예 1b에 따라 제조한, 피복시킨 미세역가 플레이트의 웰내에서 50μ1의 혈청 또는 혈장을, 0.3M 트리스, 0.3M NaCl, 20% 소혈청 및 0.1% 트윈 20을 함유하는, 50μ1의 샘플 완충액에 가한다. 플레이트를 37℃에서 30분간 항온처리한 후, 시험 용액을 흡입 제거시키고 각 경우의 웰을 PBS 중에 1g/ℓ의 트윈을 함유하는 세척 완충액으로 5회 세척한다. 그후, 각각의 웰에 100μ1의 접합체(실시예 1c에 따라 제조)를 가하고 트리스 완충액(pH7.4, 0.5% 트윈 20) 중의 1 : 3000의 예비 희석액 및 바람직하게는 접합체 완충액중 1 : 26의 최종 희석액을 선택한다. 플레이트를 37℃에서 30분간 항온처리한 후, 내용물을 흡입시키고 웰을 각각의 경우 다시 한번 5회씩 세척한다. 이어서 100μ1의 TMB 기질 제제를 각각의 웰에 가하고 플레이트를 20 내지 22℃에서 30분간 배양한 후; 반응은 100μ1의 1N 황산을 가하여 정지시킨다. 발색된 용액의 흡광도는 PBS의 블랭크 값에 대해 450nm(E450)의 파장에서 측정한다.

표 2에서, 웨스턴-블럿 항-HIV-1 네가티브와 웨스턴-블럿 항-HIV-1 포지티브 샘플(모든 혈액은 카메룬인의 헌혈자의 혈액임)의 반응성을, 한편으로는 합성 펩타이드 MVP 601-623으로 피복시키고 다른 한편으로는 합성 펩타이드 HIV 601-623으로 피복시킨 미세역가 플레이트상에서 비교한다.

[표 2]

표 2로부터, 일부의 샘플(16717과 16748)이 두가지 분석 모두에서 분명히 양성적으로 반응하며, 다른 것(17038)은 단지 본 발명에 따른 MVP 펩타이드와 반응한다는 것을 알 수 있다.

[실시예 2]

혈청형 0-특이적 HIV 항체를 검출하기 위한 면역측정 면역분석

[실시예 2a]

MVP 601-623 펩타이드/POD 접합체의 제조

본 발명에 따른(실시예 1a) 10mg의 MVP 601-623을 1ml의 빙초산/물(50:50 v/v) 중에 용해시킨다. 용액을 5N 수산화나트륨 용액으로 중화시킨후, 여기에 10-배 몰 과량의 GMBS를 가하고 이 혼합물을 실온에서 1시간 항온처리한다. 반응하지 않은 GMBS를, 0.1M 인산나트륨/5mmo1/1 니트릴로트리아세트산(pH 6.0)을 사용하여 겔여과(세파덱스 G-25)로 분리 제거시킨다. 10mg의 서양고추냉이 퍼옥시다제(POD)를 실온에서 1시간 동안, 5ml의 10mmo1/1 인산나트륨, 100mmo1/1 NaCl, pH 8.0중에서 100-배 몰과량의 2-이미노티올란과 함께 항온처리한다. 그후 유리 변형화제를, 0.1M 인산나트륨/5mmo1/1 NTA(pH 6.0) ,를 이용하여 겔 크로마토그래피(세파덱스 G-25)로 제거한다. 2개의 용출액(SH-활성화된 퍼옥시다제 및 말레이미드-변형된 HIV-1 펩타이드)을 혼합하고 실온에서 밤새 항온처리한다. 1/19 용적의 0.1M N-에틸말레이미드를 사용하여 반응이 정지되면 반응하지 않은 HIV-1 펩타이드를 겔 크로마토그래피(세파덱스 G-25)에 의해 접합제로부터 제거시킨다. 용액을 농축시킨후(2mg/ml), 펩타이드/퍼옥시다제 접합체를 -20℃에서 저장한다.

[실시예 2b]

항-MVP 항체를 검출하기 위한 면역측정 면역분석

항-HIV 항체를 검출하기 위한 면역분석은 다음과 같이 실시한다 : 25μ1의 샘플 완충액(0.3M 트리스/HCl, 1% 알부민, 2% 트윈 20, pH 7.2)을 37℃에서 30분간, 100μ1의 사람혈청과 함께 HIV 펩타이드로 피복시킨 시험 플레이트 웰내에서 항온 처리한다. 웰을 50mmo1/1 PBS로 4회 세척한 후, 0.1% 트윈 20, 100μ1의 HIV 펩타이드/퍼옥시다제 접합체(실시예 1b에 따라 제조:0.1M 트리스/Hcl, 1% 알부민, 2% 플루론 F 64, pH 8.1 중 1:1000)를 여기에 피펫팅한다.

4회의 추가 세척 단계로 30분간의 항온처리(+37℃)를 종료시킨다. 결합된 HIV-1-특이적 항체분자의 수와 직접적으로 관련이 있는, 결합된 퍼옥시다제 활성은 H₂0₂/테트라메틸 벤지딘(Behringwerke AG, Marburg, FRG)을 가하여 측정한다.

[실시예 2c]

본 발명에 따른 제제의 사용

웨스턴-블롯 특성화된 항-HIV 네가티브 및 항-HIV 포지티브 샘플(실시예 1도 참조)을 실시예 2b에 따른 면역분석으로 시험한다.

이 조사의 결과(시그날/컷오프)는 제3세대의 상용 항-HIV 분석(면역측정 시험원리)과 비교하여 표 3에 나타내었다.

[표 3]

이 비교에서, 동일한 분석 시험 원리가 적용된다해도, 상이한 항원은, 특히 샘플 17038과 17041의 경우, 상이하게 인지된다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 항원은 샘플 17038 중에서 HIV 항체의 존재를 매우 명확하게 입증한 반면, 시판되는 참조용 분석은 부적절하게 반응하였다.

[실시예 3]

혈청형 0-특이적 HIV 항체를 선택적으로 검출하기 위한 면역분석

[실시예 3a]

본 발명에 따른 펩타이드 및 이의 참조용 펩타이드의 합성

다음의 4가지 펩타이드가 실시예 1a의 방법으로 합성된다 :

RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC HIV 591-616 C 참조용 펩타이드

RILAVERYLKDQQLLGIWGSSGKLIS HIV 591-616 S

RLQALETLIQNQQRLNLWGCKGKLIC MVP 591-616 C 본 발명에 따른

RLQALETLIQNQQRLNLWGSKGKLIS MVP 591-616 S 펩타이드

(제3도 참조)

HPLC로 정제후 4가지 조펩타이드에 대한 순도는 81% 내지 89%이다.

[실시예 3b]

피복 및 실시

실시예 3a에 따라 제조 및 정제한 4개의 펩타이드를 실시예1b에 따라 용해 시키고 미세역가 플레이트상에 피복시킨다. 실시예 1d에 따라 분석을 실시한다.

[실시예 3c]

본 발명에 따른 제제의 사용

실시예 3b에 따라, 실시예 1및 실시예 2로부터의 샘플을, 본 발명에 따른 MVP 591-616C 및 MVP 591-616S와 참조용 펩타이드 모두에 대해 간접적인 항체 시험으로 시험한다. 이 조사의 결과는 표 4에 나타내었다.

[표 4]

표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 선택적 및 특이적 방법으로, MVP 591-616S분석의 시그날/컷오프 값을 HIV 591-616S 분석의 값과 비교하는 경우, 혈청형 0-특이적 및 "비"-혈청형 0-특이적 HIV 항체를 구분하는 것이 가능하다.

[실시예 4]

혈청형 A 내지 E 및 혈청형 0-특이적 HIV 항체의 동시검출을 위한 면역분석

[실시예 4a]

펩타이드 용액 제조 및 미세역가 플레이트의 피복

실시예 1a에 따라 제조한, 펩타이드 MVP 601-623 및 HIV 601-623을 6mg/ml의 농도로 50%(v/v)의 아세트산 중에 용해시킨다.

스톡 용액을 용적 기준으로 서로 다른 비율로써 혼합하고 0.01M 탄산나트륨(pH 9.6) 중에 희석시켜 펩타이드의 총 농도가 0.125 내지 2μg/ml가 되도록 한다. 실시예 1b에서와 같이 이들 용액을 미세역가 플레이트에 가하고 항원을 피복시킨다.

[실시예 4b]

면역분석 실시 및 결과

실시예 1c 및 1d에 따라 면역분석을 실시한다. 결과는 표 5와 같다.

[표 5]

[실시예 5]

재조합 항원을 사용한 혈청형 0-특이적 HIV 항체의 검출을 위한 면역분석

[실시예 5a]

플라스미드 pSEM 41/3-III의 작제

본 실시예는 MVP5180/91 gp41 영역의 혈청진단적 중요성을 조사하고자 하는 것이다. 이를 위해, MVP518 gp41의 구성적 영역을 함유하는 재조합 발현 클론을 작제한다. 이 같은 플라스미드의 작제를 위한 방법론은 공지되어 있다[참조:Sambrook,Fritsch,Maniatis,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989].

gp41로부터의 적절한 DNA 단편은 PCR 방법으로 수득한다[참조:폴리머라제 연쇄 반응,US-A-4,683,195 및 4,683,202 참조]. 이 목적을 위해 다음의 프라이머가 사용된다 :

1. A: 5' TGTGTGGTACCGCAGCGGCAACAGCGCTGACG 3' 및

1. B: 5' GTGTGTCTAGTTTAGTTATGTCAAACCAATTC 3'

주형으로서 0.1μg의 플라스미드 pSP4 DNA가 사용된다(DE 4318184). PCR 조건은 다음과 같다(30사이클):

1. 초기 변성 : 94℃, 3분

2. 증폭 : 94℃에서 1.5분; 56℃에서 1분 및 72℃에서 1분

뉴클레오타이드 및 완충 농축액이 사용되며, Taq 폴리머라제가 제조업자(Perkin Elmer) 교시에 따라 사용된다.

이어서 증폭된 DNA를 37℃에서 1시간 동안 제한 엔도뉴클레아제 Asp 718 및 XbaI으로 분해시키고, DNA를 1% 아가로스 겔 중에서 분획화시킨다. 길이가 440bp 인 DNA 밴드를 겔에서 잘라내어 DNA를 전기 용출시키며, 페놀-추출하고, 에탄올로 침전시키며 건조시킨 후 5μ1의 H₂0 중에 재현탁시킨다.

0.5μg의 용해시킨, 증폭한 DNA를 0.5μg의 Asp 718/XbaI-분해시킨 발현 벡터 pSEM3[참조:Knapp et al.,Biotechniques 8,280-281,1990;2 Weiss 단위의 λT4 리가제, 15℃에서 12시간]에 연결시키고 이. 콜라이 XL Blue(Stratagen 제공)내에 형질전환시킨다. 이 방법으로부터 수득된 클론은 재조합 플라스미드 pSEM41/3-III를 지니며 이. 콜라이 β-갈락토시다제의 단편과 함께 융합 단백질로서 MVP 5180/gp41-특이적 펩타이드를 발현시킨다.

[실시예 5b]

MVP 41/3-III 융합 단백질의 발현 및 정제

플라스미드 pSEM 41/3-III(실시예 5a에 따라 작제)로 형질전환시킨 에스케리키아 콜라이 XL1 Blue를 루리아(Luria) 브로쓰 배지 중에서 배양하고 1mM 이소프로필 티오갈락토시드로 흡광도를 0.5까지 유도시킨다. 3 시간 후 세포를 원심분리시켜 가라 앉히고, 100mM 인산나트륨 완충액, 10mM MgCl₂, pH 7.5로 세척한 후, 5000x g에서 10분간 원심분리시키고 동일 완충액 내에 재현탁시킨다. RNAse와 DNAse를 가한후, 세포 현탁액을 1000bar에서의 고압 균질화기로 파괴시키고 균질물을 원심 분리(4℃에서 80,000x g로 20분간)시킨다. 봉입체(inclusion body)를 함유하는 침전물을 50mM 트리스 -HCl, pH8.0 및 0.5% 데옥시콜레이트중에 재현탁시키고 다시 한 번 원심분리시킨다(4℃ 100,000x g에서 20분간). 수득된 침전물을 3M 우레아, 20mM 트리스-HCl, 0.5mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 중에 재현탁시키고 다시 원심분리시킨다(4℃, 100,000x g에서 20분).

이제까지 2회 세척시킨 침전물을, 이어서 5M 구아니딘 HCl, 10mM 트리스-HCl, 5mM 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 0.5mM PMSF 및 100mM 디티오트레이톨 중에서 1시간 동안 항온처리한다. 원심분리(4℃, 100,000x g에서 20분)시킨후, 가용화된 MVP 41/3-III 단백질을 함유하는 상등액을, 5M 구아니딘 HCl, 10mM 트리스-HCl, 5mM EDTA, pH 8.0 중에서, TSK-HW-55 S(다름슈타트 소재의 머크 제조) 상에서의 겔 여과에 의해 크로마토그래피로 정제한다. 생성물-함유 분획을 전기영동으로 확인하고 합한 후, 재완충시켜 5M 우레아, 10mM 트리스- HCl, 5mM EDTA(pH 8.0)로 옮긴다.

[실시예 5c]

혈청형 0-특이적 HIV 항체 검출용 면역분석

본 발명의 실시예 5b에 따라 정제한, 본 발명에 따른 재조합 항원 MVP 41/3-III을 0.1M 탄산나트륨(pH 9.6)에 단백질 농도 0.5μg/ml로 희석시킨다.

항원을 실시예 1b에 기술한 바와 같이 피복시키고, 이러한 방식으로 준비된 분석을 실시예 1d와 같이 수행한다.

[실시예 5d]

면역분석에서 재조합 항원을 사용한 결과

실시예 5c에 따라 조사한 샘플로부터의 결과는 표 6에 요약하였다.

[표 6]

이들 결과는, 본 발명에 따른 영역을 포함하는 MVP 5180/gp41로부터의 재조합 단백질이 또한 혈청형 0-특이적 "비"-혈청형 0-특이적 HIV 항혈청을 모두 검출해내는데 있어 매우 적합함을 나타내고 있다.

서열 리스트

(1) 일반정보 :

출원인:

(A) 성명: 베링베르케 아크티엔게젤샤프트

(B) 가:

(C) 시: 마르부르크

(E) 국가: 독일연방공화국

(F) 우편번호(ZIP): 35001

발명의 명칭:

MVP5180로부터 유래된 펩타이드

서열수: 10개

컴퓨터 판독형태:

(A) 매체타입: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 운용시스템 PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트 웨어: PADAT 스퀀즈모둘, 버젼 1.0

(2) 서열확인번호 1에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 48개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형: 미확인

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 펩타이드

(v) 단편유형: 내부형

(xi) 서열확인번호 1에 대한 기술:

VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR

(2) 서열확인번호 2에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 32개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형: 미확인

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 펩타이드

(v) 단편유형: 내부형

(xi) 서열확인번호 2에 대한 기술:

RLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWN

(2) 서열확인번호 3에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 23개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형: 미확인

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 펩타이드

(v) 단편유형: 내부형

(xi) 서열확인번호 3에 대한 기술:

NQQRLNLWGCKGKLICYTSVKWN

(2) 서열확인번호 4에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 26개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C ) 본쇄형: 미확인

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 펩타이드

(v) 단편유형: 내부형

(xi) 서열확인번호 4에 대한 기술:

RLQALETLIQNQQRLNLWGCKGKLIC

(2) 서열확인번호 5에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 26개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형: 미확인

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 펩타이드

(v) 단편유형: 내부형

(xi) 서열확인번호 5에 대한 기술:

RLQALETLIQNQQRLNLWGSKGKLIS

(2) 서열확인번호 6에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 23개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형: 미확인

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 펩타이드

(v) 단편유형: 내부형

(xi) 서열확인번호 6에 대한 기술 :

DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWN

(2) 서열확인번호 7에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 26개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형: 미확인

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 펩타이드

(v) 단편유형: 내부형

(xi) 서열확인번호 7에 대한 기술:

RILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLIC

(2) 서열확인번호 8에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 26개 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 본쇄형: 미확인

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 펩타이드

(v) 단편유형: 내부형

(xi) 서열확인번호 8에 대한 기술:

RILAVERYLKDQQLLGIWGSSGKLIS

(2) 서열확인번호 9에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 32개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 프라이머

(xi) 서열확인번호 9에 대한 기술 :

TGTGTGGTAC CGCAGCGGCA ACAGCGCTGA CG

(2) 서열확인번호 10에 대한 정보:

(i) 서열특징

(A) 길이: 32개 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 본쇄형: 일본쇄

(D) 형태: 미확인

(ii) 분자유형: 프라이머

(xi) 서열확인번호 10에 대한 기술:

GTGTGTCTAG TTTAGTTATG TCAAACCAAT TC

Claims

다음의 아미노산 서열로부터 선택된 약 15개 내지 약 50개의 연속한 아미노산 서열을 갖는 면역학적으로 활성인 펩타이드.

Val Trp Gly Ile Arg Gln Leu Arg Ala Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Trp Gly X Lys Gly Lys Leu Ile X Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Ser Trp Ser Gly Arg, 상기 서열식에서. X는 Cys 또는 Ser를 의미한다.
제1항에 있어서, 다음의 아미노산 서열로부터 선택된 약 15개 내지 약 35개의 연속한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.

Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Trp Gly X Lys Gly Lys Leu Ile X Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn

상기 서열식에서, X는 Cys 또는 Ser를 의미한다.
제1항 또는 제2항에 있어서, 사람면역결핍바이러스(HIV) 타입의 레트로바이러스 검출에 적합한 펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약 20개 내지 약 30개의 연속한 아미노산을 갖는 펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 펩타이드의 한쪽 또는 양쪽 말단에 바이러스 MVP5180의 서열로부터 유래되지 않은 추가의 아미노산을 갖는 펩타이드.
제1항에 있어서, X가 Cys의 의미를 갖는 펩타이드.
제6항에 있어서, 잔기 Cys에 상응하는 시스테인 잔기가 산화된 상태로 존재하는 펩타이드.
제6항 또는 제7항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.

Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Ile Cys
제6항 또는 제7항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.

Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Trp Gly Cys Lys Gly Lys Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn
제1항 또는 제2항에 있어서, 다음의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.

Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Trp Gly Ser Lys Gly Lys Leu Ile Ser
제1항 또는 제2항에 있어서, 합성적으로 제조된 펩타이드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합적으로 제조된 펩타이드.
제1항 내지 제6항 또는 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 암호화하는, 분리된 DNA 단편.
면역 결핍증을 일으키는 레트로바이러스를 검출하기 위한, 제13항에 따른 분리된 DNA 단편을 포함하는 진단 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 사용함을 특징으로 하여 백신을 제조하는 방법.
면역 결핍증을 일으키는 바이러스에 대한 항체를 검출하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩타이드 및 검출성 표지를 포함하는 진단 조성물.
제16항에 있어서, 웨스턴 블롯용 진단 조성물.
제17항에 있어서, ELISA 테스트용 진단 조성물.