KR100227240B1

KR100227240B1 - 섬모형 신경성인자 수용체

Info

Publication number: KR100227240B1
Application number: KR1019920703067A
Authority: KR
Inventors: 데이비스싸무엘; 스퀸토스테판피.; 펄스마크이.; 얀코폴로스죠지디.
Original assignee: 파울 루베트킨; 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1991-06-03
Publication date: 1999-12-01
Anticipated expiration: 2011-06-03
Also published as: KR930701624A; US5648334A; CN1061623A; US5892003A

Abstract

본 발명은 CNTFR에 관계되며 CNTF수용체의 아미노산 서열과 핵산 서열을 제공한다. 또한 i) CNTF활성을 감지할 수 있는 검사시스템, ii) CNTF의 생리적 역할을 연구하는 모델 시스템, iii) CNTF관련 신경질환을 확인하는 진단기술, iv) CNTF관련 신경과 근육질환에서의 치료용 요법적 기술과, v) CNTF와 CNTFR에 유사한 분자를 확인하는 방법에 관계한다.

Description

[발명의 명칭]

섬모형 신경성인자 수용체

[도면의 간단한 설명]

제1(a)도는 태그 리간드 결합을 이용한 발현 클로닝의 다이아그램이다. (b)도는 제2차 이오딘 항체검사를 한 것이 된다. (c)도는 (b)와 같은 실험이다. (d)도는 FACS의 결과를 나타낸 것이다.

제2도는 CNTER-인코딩 cDNA 와 유도한 아미노산서열(SEQ IDNO:2)의 핵산서열(SEQ ID NO:1)이다.

제3도는 이뮤노글로블린 유사 도메인과 사이토킨 수용체-유사 도메인 에서의 사람 CNTER 과의 유사성을 나타낸다.

제4도는 CNTER 과 다른 연관성 수용체 사이의 구조적 연관성이다.

제5도는 CNTER 메세지의 조직 분포도이다.

제6도는 hCNTF-R 유전자가 삽입된 pCMX 이다.

제7도는 골근육에서 CNTF수용체 발현을 노던 블랏 분석한 것이다.

제8도는 신경지배 제거 수술된 우측 후지의 해부학적 다이아그램이다.

제9도는 동물의 수술안한 슬와근을 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

[개요]

본 발명은 섬모형 향신경성 인자 수용체(CNTFR)에 관계하고, CNTF수용체를 코드하는 핵산과 아미노산 서열을 제공한다. 또한(i) CNTF활성을 감지하는 검사시스템; (ii) CNTF의 생리적 역할을 연구하는 실험적인 모델시스템; (iii) CNTF-관련된 신경증상을 확인한는 진단기술; (iv) CNTF-관련된 신경증상을 치료하는 요법기술과; (v) CNTF와 분자구조상 유사한 물질을 확인하는 방법에도 관계한다.

[발명의 배경]

[섬모형 향신경성인자]

섬모형 향신경성인자(CNTF)는 시험관내에서 병아리 배의 모양신경절 뉴우런의 생존에 특별히 요구되는 단백질이다.(Manthorpe et al., 1980, J, Neurochem, 34 : 69-75), 해부학적으로 모양신경절은 측면 직근과 시신경 사이의 오비탈 공동에 위치하며 섬모형 근육과 괄약근 동근의 신경을 분포시키는 시신경에서 부교감 신경을 수용한다.

모양 신경절 뉴우런은 죽은세포의 일정기간동안 나타나는 뉴우런 집단에서 발견된다. 병아리 모양 신경절에서 8일된 배(E8)에 있는 뉴우런의 절반이 E14 이전에 죽었을 때 관찰되었다(Landmesser and Pilar, 1974, J, Physiol, 241 : 737-749)같은 기간동안에 모양 신경절 뉴우런은 이들의 표식세포, 즉 섬모몸체와 눈의 융모막 코트와 서로 연결되어 있다. Landmesser 와 Pilar (1974, J, Physiol, 241 : 751-736)은 세포가 죽기전에 눈을 제거할 경우 동측의 신경절에서 모양 신경절 뉴우런이 완전히 상실되는 것을 관찰하였다. 역으로 Narayanan 은 (1978, J, Embryol, Ex, Morphol, 44 : 53-70)은 원기에 눈을 추가로 이식할 경우 이용할수 있는 표식세포의 수가 증가되고 모양 신경절뉴우런 세포의 치사가 감소되었다. 이러한 결과는 모양 신경절 뉴유런에 작용하는 신경성 인자 유도된 표식이 존재하는 것과 일치한다.

배양시에, 모양 신경절(CG) 뉴우런은 생존인자에 요구되는 것으로 밝혀졌다. 섬모성 향신경성인자(CNTF) 활성은 병아리 근육세포 조건화 배지와(Helfand et al., 1976, Dev, Biol, 50-541-547; Hefand et al., 1978, Exp, Cell Res, 113-39-45;Bennett and Nurwme, 1979, Brain Res. 173:543-548; Nishi and Berg, 1979, Nature 277-232-234; Varon et al., 1979, Brain Res. 179:29-45). 근육 추출물에서(McLennen and Hendry, 1978, Neurosci. Lett. 10 : 269-273); 병아리 배 추출물에서 (Varon et al., 1979, Brain Res. 173 : 29-45; Tuttle et al., 1980, Brain Res. 183 : 161-180)그리고 심장 세포 조건화 배지에서(Adler et al., 1979, Science 204 : 1434-1436; Barbin et al., 1984, J. Neurochem. 43 : 1468-1478).

Adler et al (1979, Science 204 : 1434-1436)은 CG 뉴우런의 마이크로웰 배양의 엣세이 시스템에서 풍부한 CNTF는 눈의 표식세포에서 CG 뉴우런이 시신경을 분포한다는 것을 설명하였다. 12일된 배에는 8000개 이상의 영양단위(TU)가 있으며, 눈조직에는 2500TU 가 있고 섬모체와 융모막 코트에는 활성이 있는 부분이 위치하는 것으로 보인다.

Barbin et al., (1984, J. Neurochem 43 : 1468-1478)은 병아리배눈조직에 CNTF가 번성하는 과정을 설명하였다. CNTF가 번성하는 과정을 설명하였다. CNTF활성은 쥐의 좌골 신경을 포함한 비-CG 조직과 관련됨을 밝혔다(Williams et al., 1984, Int, J. Develop. Neurosci 218 : 460-470).

Manthorpe et al (1986, Brain Res. 367 : 282-286)은 병아리 눈에서 CNTF활성을 분리해내는데 이용된 것과 유사한 분리과정을 이용하여 큰쥐 좌골신경 추출물에서 포유류 CNTF활성을 일부 정제하는 것을 보고하였다. 또한, Watters 와 Hendry(1987, J. Neurochem. 49 : 705-713)은 헤파린-친화성 크롬마토그래피를 이용하여 비-변성된 조건하에서 소의 심장조직에서 약 20,000배의 CNTF활성을 농축시키는 방법을 설명하였다. CNTF활성은 손상된 뇌조직에서도 확인되었다.(Manthorpe et al., 1983, Brain Res. 267 : 47-56; Nieto-Sampedro et al., 1983, J. Neurosci. 3 : 2219-2229).

Carnow et al. (1985, J. Neurosci. 5 : 1965-1971)과 Rudge et al., (1987, Develop. Brain Res. 32 : 103-110)에서는 조직 추출물의 웨스턴 블랏에서 CNTF유사활성을 동정하는 방법과 CG뉴우런이 있는 배양접시에서 니트로셀룰로오스 스트립에 접종시킴으로써 CNTF활성을 가지는 단백질 밴드를 확인하며 바이탈 염료를 사용하여 생존세포의 위치를 확인한다. 이 방법을 이용하여 성장쥐 좌골신경과 뇌-유도한 CNTF활성이 병아리 CNTF(20.4K 보다는 다소 다른 크기임 (24KD)이 나타났다.

최근에 CNTF를 U.S 특허 07/570,651 (1980. 8. 20)에서 상술한 바와 같이 박테리아 발현 시스템에서 클론시키고 합성하였다. 재조합 프로브를 이용하여 성장쥐의 조직에 CNTF-mRNA의 크기는 1.2kb 임을 밝혔다. 쥐뇌 CNTF는 짧은 5' 비해독 부위인 77bp 와 600bp 의 오픈 리딩 프레임이 있는 mRNA 에 의해 인코드됨을 밝혔고 이는 약 200개 아미노산 단백질로 추정된다.(Stockli et al., 1989, Nature 342:920-923) 사람 CNTF로 (미국특허 07/570,651, 1990. 8. 20일자) 클론되고 서열을 밝혔는데 이것의 코딩서열은 쥐의 것과 상당히 유사한데 반면 년코딩서영는 다소 보존되어 있지 않다.

[섬모형 향신경성인자의 기능상 특징]

CNTF는 상당수의 생물학적 특징을 가진다. 전술한 것과 같이 CNTF는 E8 병아리 모양 신경절의 뉴우런의 생존과 부교감 신경계 성분을 제공하는 활성을 가진 것으로 설명한다. CNTF의 활성을 가지는 공지된 생물학적 특성은 다음과 같다.

Saadat et al. (1989, J. Cell. Biol. 108:1807-1816)은 쥐 좌골신경 CNTF의 매우 정제된 준비물이 배양시에 쥐의 교감신경 뉴우런의 콜린 작동성 분화를 유도하는 것을 관찰하였다. Hoffman(1988, J. Neurochem. 51:109-113)은 병아리 눈에서 유도된 CNTF활성이 망막 단층 배양에서 콜린-o-아세틸전이 효소의 양을 증가 시킴을 발견하였다.

Hughes et al (1988, Nature 335:70-73)은 이종 신경교 외음부 표면세포 집단이 분만전후 쥐시신경과 뇌에서 유도되고; 이들 외음부 표면세포는 우선 핍지신경교세포에서 발생한 후 타입 2 신경교 성상세포로 발생됨을 보인다. 사용된 배양조건하에서 핍지신경교 세포의 분화는 핍지 신경교세포-타입-2-신경교 성상세포(o-2A) 외음부표면 세포에서 직접적으로 발생되는 반면, 타입-2-신경교성상세포 분화는 CNTF와 유사하거나 또는 동일한 유도성 단백질의 존재를 요구하는 것으로 보인다(Anderson, 1989, Trends Neurosci. 12:83-85).

Heymanns 과 Unsicker (1989. PNAS USA 4:7758-7762)는 신경아세포종 세포 추출물의 고속 상층액에서 병아리 눈 또는 쥐 좌골신경에서의 CNTF활성과 관련된 유사한 효과가 나타남을 관찰하였는데 CNTR 와 동일한 것이 아닌 유사한 (분자량에서) 단백질이 존재함을 지적한다.

Ebendal (1987, J. Neurosci. Res. 17:19-24)에서는 다양한 쥐와 병아리 조직에서 CNTF-유사활성을 찾을 수 있었다. CNTF유사활성은 쥐에서는 다양한 범주에서 나타났으나 병아리 조직에서는 나타나지 않았으며 쥐간, 지라T세포, 하악골 선세포에서는 GG생존 촉진활성의 소량이 관련된 것으로 밝혀졌는데 이와는 달리 심장, 뇌, 골격근육조직은 다량의 생존촉진활성과 관계됨을 볼수 있다. 시험한 조직 가운데 최고의 CNTF-유사활성이 쥐의 신장에서 관계됨을 볼수 있었다.

상기 연구에서 많은 조직과 세포 추출물은 CNTF에 잔응성이 있는 신경집단의 생존을 부양시기는 특정활성이 포함됨을 볼 수 있고 (예로써, 조직배양 생검에서 E8 병아리 모양신경절 누우런의 생존을 부양함) 단일 또는 통일한 단백질이 이들 활성에 책임이 있음을 추측하지 않을 수 없다. 섬유아세포 성장인자 (FGFs)족에서 본것과 같이 (Dionne et al., 1990, EMBO J. 9:2685-2692) 예를 들면, 다수의 폴리펩티드 또는 단백질은 단일 생검에서 통일한 생물학적 활성을 가지고 있다.

병아리 눈과 쥐좌골 신경 CNTF의 신경특이성은 NGF 에 반응이 있는 신경집단과 약간의 중복성을 지님을 처음으로 밝혀내었다. CNTF가 NGF 와 신경특이성이 다소 중복됨을 관찰하였지만 이들 사이의 두드러진 특징은 신경발생 집단에서 CNTF와 NGF 의 역할 경우에서 대부분 밝혀졌다(Skaper and Varon, 1986, Brain Res 389:39-46)발생상의 상이한 역할이 첨가하여 CNTF분자량, 등전점 그리고 NGF 의 항체에 비활성을 보이는 등에서는 NGF 와는 구별된다. 그리고 GGF 뉴우런의 생존에 CNTF의 능력이 요구된다 (Barbin et al., 1984, J. Neurochem. 43:1468-1478).

Lin et al (1989), Science 246:1023-1026)에서는 CNTF가 이전의 보고된 어떠한 단백질과도 유사성이 없었다. Sendtner et al.(미국특허 07/570,651 1990. 8. 20)은 재조합 CNTF는 증배와 복측 척수 뉴우런의 생존을 촉진시키고 또한 정체된 쥐 좌골신경 CNTF는 신생쥐의 병소 안면 신경(Vll 두개골 신경)에 운동신경세포의 죽음을 예방하는 것으로 보인다(Sendtner et al., 1990, Nature 345:440-441).

재조합 DNA 기술을 이용하여 CNTF의 클로닝과 발현은 상당수의 CNTF활성을 발견하게 하였다.

2.3. 성장인자 수용체

단백질 인자에 반응하고 결합을 조절하는 상당수의 수용체가 특징화 되었고 지난 수년간 분자형으로 클론시켰는데 이에는 인슐린, 소판유도성 성장인자, 피하 성장인자, 섬유아세포 성장인자와 다양한 인터루킨과 조혈성장인자의 수용체등이다. 최근의 자료에서 특정 수용체는 다수의 관련 성장인자와 결합할 수 있으며, 다른 경우에는 동일한 인자가 다가수용체와 반응할 수 있다(Lupu et al, 1990, Science 249:1552-1555: Dionne et al., 1990, EMBO, J. 9:2685-2692: Miki et al., 1991, Science 251:72-75). 단백질 인자에 결합하는 대부분 수용체는 막통과 부분을 가지는 인자와 수용체의 외세포 단백질에 단백질 인자의 결합을 유도하는 시그날에 관련된 세포내 도메인에 반응승을 가지는 외세포 단잭질로 특징화 하였다. 많은 수용체가 고친화력으로 이들의 인자와 결합하고 결합에 다른 기능반응을 가지기 위해 적어도 두 개의 별도유닛이 요구된다(Hempstead et al., 1989, Science 243:373-375: Hibi et al., 1990, Cell 63:1149-1157). 주어진 수용체의 세포외와 세포내부분은 다른 수용체에 상응하는 부분과 구조적으로 공통된 모티브를 공유하여 이것이 상이한 수용체들 사이에 친화론적인 그리고 기능상의 연관이 있음을 제시하는 것이된다. 이를 관련성은 매우 불투명한 것으로 단순히 특정구조의 반복 사용을 의미할 수 있다. 예를 들면 관련없는 인자와 결합하는 상이한 수용체 다수가 이들의 세포의 부분에서 “이뮤노글로블린”으로 이용할 수 있고 인자 결합된 부분에서는 다른 수용체가 “사이토킨 수용체” 도메인으로 이용할 수도 있다(Akira et al., 1990, FASCB J. 4:2860-2867). 세포의 결합 도메인의 수용체의 대다수는 인자결합의 반응에 활성화된 티로신-특이 단백질 카이네이즈를 인코드하는 관련된 인트라사이토플라즘 도메인을 포함하고 있다.(Ullrich and Schlessainger, 1990, Cell 61:203-212). 시그날 유도과정의 “활성”인자-결합 기작은 거의 밝혀지지 않았고 티토신 카이네이즈 수용체의 경우도 마찬가지이다. 다른 수용체의 경우에 있어서 세포내 도메인은 기능이 밝혀지지 않은 제2단백질과 연관된 결합성분 또는 미지의 도메인을 인코드하며(Hibi et al 1990, Cell 63:1149-1157). 시그날 유도의 활성도 밝혀지지 않았다.

[발명의 요약]

본 발명은 CNTF수용체(CNTFR) 유전자와 단백질에 관계한다. 감염된 COS세포에서 사람 CNTFR 유전자와 그것의 발현특징과 클로닝에도 기초한다.

본 발명은 CNTFR을 인코드하는 핵산서열을 제공하고 이에서 유도된 단편도 제공한다. 또한 정제된 CNTFR 단백질과 이의 펩티드 단편도 제공한다.

본 발명에서 핵산을 포함한 CNTFR 프로브와 항체프로브는 CNTFR-관련된 분자를 확인하는데 사용될 수도 있다. 예를 들면 본 발명은 CNTFR 과 복합체를 형성하고 CNTFR 기능에 참여하는 분자를 제공한다. 분 발명은 수용체 분자와 유사하거나 또는 교차-활성을 가지고 있으나 CNTFR 과 동일하지는 않다. 이를 특별 구체에서는 CNTFR이 다른 생물학적 연관분자, 특히 IL-6 수용체, PBGF 수용체, CSF-1 수용체, 프로락틴 수용체, IL-2, IL-4 수용체, GM-CSF 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 수용체, 임신-특이적 알파 1-베타 당단백질과 카르시노 배아 항원, 종양표식을 포함한분자에 유사성이 있는 것을 볼 수 있다.

본 발명은 CNTFR 의 다량 발현하는 세포로 구성된 CNTF활성을 감지하는 검사 시스템과 CNTF또는 CNTF유사분자의 저농도에도 매우 민감한 것으로 알려져 있다.

또한 본 발명은 CNTF의 생리학적 역할을 연구하는 실험적인 모델 시스템을 제공한다. 이와 같은 시스템은 (i)CNTF결합의 세포 수용체와 경쟁하는 CNTFR 팹티드의 순환에 노출된 동물로써, CNTF-결핍상태가 되고, (ii) CNTFR 로 면역화시킨 동물, (iii) CNTFR 다량을 발현하여 CNTF에 과인하는 유전자 전이동물, (iv)배아간 세포 기술을 이용한 게놈에서 내발생 CNTFR 유전자가 제거된 유도성 동물과 같은 동물모델들이 포함된다.

본발명의 구체예에서, CNTFR 프로브는 정상 또는 질병상태에서 CNTF에 반응성이 있는 조직과 세포를 확인하는데 이용할 수도 있다. 예를 들면 CNTF관련된 질병으로 고통받는 환자에는 CNTFR 발현이 없는 것으로 나타난다.

또한 본 발명의 CNTFR 유전자와 단백질은 치료요법에 사용될 수도 있다. 예를 들면 이에 한정하는 것은 아니지만, 순환성 CNTFR 은 중추신경계의 손상부위에 CNTF량을 제거하는데도 이용될 수 있다. 재 조합 CNTFR 유전자는 근위축 경화증으로 고통받는 환자와 운동신경과 같은 CNTF에 민감한 조직에 삽입할 수도 있다.

[도면의 간단한 설명]

제1(b)도에서는 cDNA 라이브러리로 감염시킨 COS 세포에 대조적으로 CNTF-결합 부위에서 일차 발현된 후에 수득된 DNA로 COS 세포를 감염시켰다(감염된 COS 세포의 60㎜플레이트에서의 오토라디오그래프; 각각의 검은점이 단일 감염 COS 세포에서의 발현된 CNTF결합부위를 나타낸다). C도에서는 COS 세포가 비-CNTFR 코딩 플라스미드(음성클론) 또는 CNTFR 코딩 플라스미드(양성클론)으로 감염시켰으며 각 플레이트에서는 소량만이 나타났다. D 는 C의 양성, 음성, 클론으로 감염된 COS 세포를 분석하였다.

제3도에서는 왼편의 숫자는 제1메티오닌에서 시작된 아미노산 번호를 나타내고 동일한 잔기와 일정한 치환은 사각형으로 표시하였다. 갭은 유사성을 최대한으로 도입한 것이다.

IL-6=인터루킨 6; CEA=카르시노엠브리 항원; PDGF=소판유도성 성장인자; GSF-1=콜로니 자극인자 1; 알파 1-β GP=알파 1β 당단백질; PRL=프로락틴, EPO=에리트로포에틴; IL-2=인터루킨 2; IL-4= 인터루틴 4, GM-CSF=고립구 대식세포 콜로니 자극인자.

제4도에서는 사람 IL-6수용체화 CNTFR이 인자결합 도메인의 N-말단과 융합된 이뮤노글로블린 도메인을 가진다. 지그재그 라인은 공모양의 이뮤노글로블린과 인자결합 도메인과 연결되어 있다. 제시된 단백질은 gp130과 유사한데 CNTFR과 관계된 것으로 보인다. HuGRHR-사람 성장 호르몬 수용체; RbPRLR-토끼 프로락틴수용체; MoEPOR-쥐 에리스로포에틴 수용체; HuIL2Rβ -사람 인터루킨-2-수용체 β -가닥; HuIL6R-사람 인터루킨 6 수용체; HuCNTFR-사람 섬유형 선경인자 수용체; C-시스테인; X-미지아미노산; W-트립토판; S-세린; F-페닐알라닌.

제5도에서는 RNA 는 8.1에서 설명하는 것과 같이 쥐의 조직에서 준비한다. CNTFR 의 DNA 는 8.1에서 설명하는 것과 같이 pCMX에서 이를 유전자를 포함하는 발현구조에서 유도한다. 조직: 대뇌(CB); 후뇌(HB); 중죄(MB); 간죄(TH/HYP); 선조체(STRI); 해마B(HIP B); 해마 A (HIP A); 피류 (CORT); 후각구(OLF); 성상두뇌(AD BR); 피부(SK); 심장(HRT); 근육(MUS); 폐(LUNG); 장(INT); 신장(KID); 간(LIV); 지라(SPL); 흉선(THY); E17간(E17 LIV).

제7도에서 각 라인마다 총 RNA 양은 10ug 이다. 라인 1, 쥐근원세포주 C2C12mb; 라인 2, 쥐 근-튜브 세포주 C2Cl2mt; 라인 3, 쥐 근-튜브세포주 HPC2 mt; 라인 4, 쥐 근-튜브 세포주 L6 mt; 라인 6, 쥐 신근 디지토럼 장근(EDL 근육; 라인 7, 변성된 골근육; 라인 8; 정제된 사람 근-튜브; 라인 9, 골근육 (RNA 시료는 변성됨) 라인 10; 성인쥐 대뇌; 라인 11; 생작동된 슬와근; 라인 12; 72시간 변성된 쥐 슬와근; 라인 13; 샘-작동한 EDL-근육; 라인 14, 72시간 신경제거한 EDL 근육.

제9도에서는 1집단에서는 사각형은 오른쪽이 되고 점각은 왼편이 된다. NONE=병소(신경제거, 오른쪽)과 콘트롤 (샘-작동, 왼쪽), 제2집단에서는 ALB=병소(왼쪽)과 콘트롤 (우측) PBS/BSA 처리한 슬와근 제6집단에서는 CNTF-병소(우측)과 콘트롤(좌측)CNTF/BSA 처리한 슬와근.

[본 발명의 상세한 설명]

좀더 상술하기 위해 본 발명을 다읍과 같은 소단락으로 나누어 설명한다.

(i) CNTF수용체 클로닝;

(ii) CNTF수용체를 인코드하는 핵산;

(iii) CNTFR 팹티드;

(iv) CNTF수용체 발현;

(v) CNTF수용체 연관된 분자의 확인;

(vi) 발명의 이용

5.1. CNTFR 의 클로닝

본 발명은 CNTFR을 발현하는 표식세포를 선핵하는 방법을 제공하여 CNTF수용체를 클로닝할수 있다. CNTFR 인코딩 서열을 모으는 방법으로 본 발명은 CNTFR 단백질 정제와 CNTFR-인코딩 DNA의 직접적인 클로닝이 가능하다.

예를 들면 CNTFR 표식세포는 선택하여 CNTFR 단백질은 수용체 분자의 정제에 공지된 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 예를 들면 5.6.3에서 설명하는 감지가능성 분자에 CNTF또는 결합된 CNTF일수 있다. 예를 들면 tag 는 방사능 라벨된 항원결정성 또는 항체일수 있는데 CNTF/tag 는 방사능 라벨된 항원결정성 또는 항체일수 있는데 CNTF/tag 는 역으로 표식세포와 교차결합할수 있는데 표식세포의 막연결 단백질이 정제방법으로 정재될 수 있다. 이와 같은 정제방법은 SDS-PAGE 일수 있고 겔에서의 CNTF또는 CNTF/테그의 위치를 확인할 수 있으며 예로써, 방사능 라벨된 CNTF를 이용할 수도 있고 이것의 수용체와 교차결합된 것을 이용하여 자가방사법으로 겔에서 볼수도 있다. 또한 항-CNTF또는 항-테그 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 겔에서의 CNTF/수용체 복합물의 위치를 확인할 수 있다. 미리 준비된 겔전기영동으로 수용체 펩티드의 아미노산 서열이 가능한 단백질의 충분량을 분리하거나 또는 표식세포 추출물에서 CNTFR 분자의 정체에 이용할 수 있는 항-CNTFR의 생산이 가능하다. 정제된 CNTFR에서 수득한 아미노산 서열은 게놈 DNA 라이브러리 특히 표식세포에서 생산하는 CNTFR에서 만들어진 cDNA 라이브러리에서 클론된 핵산을 인코드하는 CNTFR을 확인하는데 사용되는 올리고 핵산 프로브를 변질시키는데 사용될 수도 있다.

또한 CNTFR 은 차감 하이브리드 방법에 의해 클론되고 mRNA 는 CNTFR을 발현하는 표식세포에서 준비하고 비-CNTFR 코딩서열은 CNTFR을 발현하지 않는 뉴런 세포와 같은 세포에서 유도한 mRNA 또는 cDNA 와 mRNA 로 하이브리드함으로써 공제할 수 있다. 감한 후에 남아있는 핵산은 CNTFR-인코딩 서열에서 볼수 있다.

표식세포에서 준비된 핵산은 CNTFR 발현 또는 상기 설명한 기술로 인해 CNTFR 서열이 풍부한데, 이것은 CNTFR을 직접 클론시키는 발현 클로닝 기술에 이용할 수 있다. 예를 들면 CNTFR을 발현하는 표식세포에서 총 게놈 DNA를 준비하고 CNTFR을 발현하지 않은 세포주에 감염되고 표식세포종에서 다른 종을 유도할 수 있고(예로써, 사람 CNTFR-코딩 세포의 DNA를 L 세포와 같은 쥐세포로 감염시킨다). 감염된 세포중 상대적으로 작은수가 CNTFR을 발현하지만 이와 같은 세포는 5.6.3에서 설명한 것과 같이 로젯팅 기술 또는 이뮤노플로레슨스에 의해 확인할수 있고 예를 들면 공지된 기술인 “panning”또는 항체-결합된 마그네틱비드를 사용하거나 또는 형광-활성화된 세포분류에 의해 분리할 수 있다. DNA를 인코드하는 CNTFR 은 감염체에서 게놈 라이브러리를 만드는 수용체 생성 감염체에서 클론될 수 있고 특이 유전원소에 유사한 CNTFR 아미노산 서열 또는 유사한 서열을 형성하는 클론을 분리하거나 번식시킬 수 있다. 예를 들면 사람 DNA 는 Alu 반복서열로 확인할 수 있는데 사람계놈에서 고빈도로 분포되어 있다. 예를 들면 배양된 CNTFR을 인코드하는 감염된 사람 DNA 와 사람 CNTFR을 발현하는 것으로 구성된 비-사람세포는 선택되고, 분포되고, 이들 세포에서 준비된 게놈 DNA는 배양된 비-사람 세포를 감염시키는데 사용할 수 있고 CNTFR, 발현세포를 선택할 수 있다. 이 과정을 반복하면 각 감염단계가 감소되고 사람 CNTFR 발현세포는 라이브러리 클론을 만드는데 클론될 수 있는데 여기에는 반복된 감염체가 실행될 때 CNTFR-인코딩 서열로 구성된 사람 DNA가 포함된다.

CNTFR 발현 세포주 또는 조직 또는 cDNA 발현 라이브러리에서의 RNA를 직접 주입에 의한 제노푸스 오오사이트에 도입시키고 CNTFR을 인코드하는 주입된 오오사이트는 CNTF에 오오사이트를 노출시킴으로써 유도되는 기능적 반응(예로써, 이온 플럭스)를 검사함으로써 확인할 수 있거나 또는 주입된 오오사이트의 표면에 CNTF-결합부위의 존재를 감지함으로써 확인할 수 있다. 반복적인 디바이드 양성풀은 CNTFR을 인코드하는 각 클론의 확인을 유도할수 있다.

cDNA 발현 라이브러리는 CNTFR 보유 표식세포에서 유도되어 일시적인 발현검사에 이용할 수 있다. 본 발명의 적절한 구체에에서, 발현 라이브러리는 SV40 복제 오리진에 결합될 수 있고 일시적인 발현검사는 COS 세포를 이용하여 실행할 수 있다.

CNTFR-발현 전이감염체는 상술한 것과 같이 확인될 수 있고 DNA 를 인코드하는 핵산서열은 미국특허 07/570,651 (1990. 8. 20)에서 설명한 것과 같이 CNTF핵산을 제시하는 것과 같은 방법을 사용하여 발현 시스템에서 이용할 수 있다.

본 발명의 구체에에서, CNTFR 발현 클로닝은 다음과 같이 실시할 수 있다. XH-SY5Y 와 같은 CNTFR을 발현하는 조직 또는 세포주에서 cDNA 라이브러리를 만들 수 있고 cDNA는 발현벡터에 삽입할 수 있다. 이와 같은 라이브러리는 COS M5 세포와 같은 적절한 세포주에 DEAE/클로로퀸 감염 프로토콜에 따라 감염시킬 수 있다. 감염후 수일뒤에 세포는 배양접시에서 분리해내고 다음의 변형을 하는 Aruffo/Seed panning 과정을 거치게 된다(Seed and Aruffo, 1987, PNAS, USA 84:365-3369).

(i) 항-수용체 항체로 감염된 세포를 배양하는 대신에 약 30분간 얼음에서 태그 CNTF(예로써, CNTFmyc)로 일차 배양하고 인산완충염(PBS) 12% 피콜로 원심 분리하여 초가된 리간드를 제거하고, 얼음에서 약 30분간 항-태그 항태(예로써 항-myc 항체 9E10)으로 배양한다.

(ii) 세포를 PBS/2% 피콜에서 돌린후, 항-태그 항체(예로써 항-테그 항체가 9E10 인 항-쥐-항체)를 인지하는 항체로 피복된 판에서 반응시킨다. 플레이트에서 비흡착된 세포를 세척시킨 후 Hirt 상층액은 흡착세포에서 준비하고, 플라스키드 DNA 는 10-20ug tRNA 존재하에서 침전시킨다. 생성된 플라스미드 DNA 는 일렉 트로포레이션과 같은 표준기술을 이용하여 적절한 박테리아(예로써 DH 10 B 박테리아)에 도입시킨다. 형질전환된 박테리아에서의 배양물을 진핵생물 감염과 패닝에 사용되는 플라스미드 DNA를 만드는데 사용할수 있다. 제2차감염, 패닝, 플라스미드 DNA 제조와 형질도입후에 박테리아 형질전환제는 선택성 배지에 플레이트시키고 각 콜로니를 모아 플라스미드 DNA를 만드는데 사용되며, 이와 같은 클론에서 얻은 다수의 DNA는 COS 세포전이 감염에 사용할수 있다. 대부분의 첨가물은 각 콜로니를 검사하기 전에 사용한다. 생성된 CNTF발현하는 COS 세포 결합 부위는 방사능 또는 형광물질 라벨된 인식항체를 사용한 간접 결합 검사를 이용하여 확인할수 있다. 예로 CNTFR-인코딩 핵산은 pCMX-hCNTFR (I2)에 구성되며 이는 수탁번호 B-18789로 NRRL 에 기탁되어 있고 Davis 와 Yancopoulos 에 의한 “포유류 발현 벡터”에도 상술되어있다. 이와 같은 방식으로 확인된 클론은 제한 효소 지도와 핵산 서열화로 분석할수 있다.

CNTFR 인코딩 DNA단편은 표준 하이브리드 기술을 사용한 게놈 DNA 라이브러리에서 CNTFR 유전자를 구성하는 게놈 DNA 서열을 확인하는데 사용된다. 수득된 CNTFR 유전자는 공지된 방법을 사용하여 클론시킬수 있다. 공지된 다수의 벡터-숙주 시스템을 이용할 수 있다. 이용할 수 있는 벡터에는 코스미드, 플라스미드 또는 발현된 바이러스가 포함될수 있는데 사용된 숙주 세포와 벡터 시스템은 서로 적응성이 있어야 한다. 이와 같은 벡터에는 람다유도체, pBR322, pUC 또는 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 등이 포함될수 있다. 재조합분자는 형질도입, 전이감염, 감염, 일렉트로포레이션등을 통해 숙주세포에 도입될 수 있다.

CNTFR 유전자는 형질도입, 트랜스펙트 또는 적절한 숙주세포에 감염에 사용되는 클로닝 벡터에 도입될 수 있고 유전자 서열의 다수 카피가 발생될 수 있다. 상보적인 코헤시브 단부가 있는 클로닝 벡터로 DNA 단편을 연결시킴으로써 가능하다. 그러나 클로닝 벡터에 DNA 단편이 사용한 제한효소 부위가 없을 경우 DNA 단부는 효소를 이용하여 변형시켜야 한다. 벡터로의 삽입을 시키기 위해 중합효소 사슬반응에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머내로 제한효소 절단부위를 결합시기는 것이 좋다. 소요의 부위가 DNA 단부에 뉴클레오티드서열(링커)를 연결시킴으로써 도입될수 있다; 이를 연결된 링커는 제한효소 인식서열을 인코드하는 화학적으로 합성된 올리고 핵산일 수있다. 다른 방법으로 절단된 벡터와 CNTFR 유전자는 동질중합체 단부에 의해 변형될 수 있다.

특이 구체예에서, 숙주세포는 유전자의 다수 복사체를 발생시킬 수 있는 불리된 CNTFR 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열의 결합되어 형질전환될 수 있다. 따라서 유전자는 형질전환체, 필요하다면 분리된 재조합 DNA에서 삽입된 유전자를 제거하므로서, 재조합 DNA 분자를 분리 해넬 수 있다.

5.2. CNTFR을 인코드하는 핵산

전술한 방법과 실시예 6의 방법을 이용하여 다음의 색산서열을 결정하고 이에 상응하는 아미노산 서열을 유추한다. 사람 CNTFR 서열은 제2도에 있다. 이 서열에서 6개의 기능적 등가체 또는 단부는 본 발명에 따라 이용할 수 있다. 본 발명은 돼지, 양, 소, 고양이, 조류, 말 또는 개뿐만 아니라 CNTF활성이 있는 다른 종에서 분리한 CNTFR 유전자에 관계한다. 핵산 하이브리드 검사, 서던 블랏과 노던 블랏에서 사용하는 CNTFR 서열의 하이브리드 부위를 가진다.

예로써 제2도에 설명된 핵산 서열은 기능적으로 등가의 분자를 인코드하는 서열을 제공하는 치환, 추가 또는 결실과 같은 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 본 발명에 따르면 CNTF에 결합하는 능력이 있는 경우 분자는 제2도에 설명된 서열을 가지는 분자와 기능적으로 등가이거나 활성이 있으며, 자연 CNTFR 과 비교할만한 친화력으로 CNTF에 반듯이 결합할 필요는 없다.

핵산코딩서열의 변형으로 인해 제2도와 실제로 동일한 아미노산을 인코드하는 다른 DNA 서열은 본 발명에 이용될수 있다. 이때는 서열 내에 기능적으로 아미노산을 인코드하는 상이한 코돈에 의한 치환으로의 변형을 포함한(이때 침묵돌연변이라함) 제2도에 설명된 CNTFR 부분 또는 전부의 핵산 서열일 수 있다.

또한 본 발명의 재조합 CNTFR-인코딩 핵산서열은 CNTFR 의 진행과 발현의 변형시키기 위해 조직될 수 있다. 예로, CNTFR 유전자는 프로모터 서열 또는 리보좀 결합부위와 결합될 수도 있고 CNTFR 인코딩 서열의 상류에 시그날 서열이 삽입되어 CNTFR 분비를 허용하고 수득하여 이용할 수 있다.

또한 시험관내에서 또는 생체내에서 주어진 CNTFR 이 돌연변이 되어, 해독, 개시 또는 종료시열을 만들거나 또는 파괴될 수 있고 또는 코딩부위에 변화를 만들거나 또는 새로운 제한 효소 부위를 형성할 수 있거나 또는 이미 존재하는 것을 파괴할 수도 있다. 공지된 기술을 이용하여 시험관내에서 부위-직접돌연변이를 일으킬 수도 있다(Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551).

5.3. CNTF폡티드

본 발명은 제2도의 아미노산 서열을 가진 CNTFR 단백질, 단편 그리고 유도체를 제공하거나 또는 적어도 30%의 유사성을 가지는 단백질과 등가의 기능체를 제공한다. 본 발명은 적어도 6개의 아미노산, 항원결정부위 또는 기능적으로 활성화된 것으로 구성된 CNTFR 단백질의 유도체 또는 단편을 제공한다. 제2도의 아미노산 서열을 가진 CNTFR 단백질은 약 42kb의 분자량을 가진다.

본 발명의 CNTFR 단백질 또는 그 단편 또는 유도체는 서열내에 잔기의 기능적으로 등가의 아미노산 잔기의 치환으로 인한 침묵변화를 포함하는 아미노산의 일부 또는 전부일 수 있다. 서열내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 비슷한 극성을 가진 아미노산으로 치환되어 기능적으로 등가체로 작용하여 침묵변화가 된다. 서열내에서의 아미노산이 속하는 글라스내의 다른 부류에서 선택할수 있다. 예로써 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라린, 트립토판과 매티오닌이 포함된다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진과 글루타민이 포함된다. 양성(염기성) 아미노산이 아르지닌, 니신과 히스티딘이 포함된다. 음전하 아미노산은 아스파라딕산과 글루타민산이 포함된다. 본 발명의 범위내에 CNTFR 단백질 또는 그 단편 또는 그 유도체는 포스포릴레이션, 글리코실레이션, 교차결합, 아실레이션, 단백질 절단, 항체분자내에 연결, 막분자 또는 다른 리간드에의 연결등에 의해 해독 후에 변형될 수 있다(Ferguson et al., 1988, Ann. Reve. Biochem 57:285-320).

본 발명의 CNTFR 폡티드는 재조합 핵산 발현 기술 또는 기존의 폡티드 합성 기술을 이용하여 만들 수 있다.

5.4. CNTFR 의 발현

재조합 CNTFR을 발현시키기 위해 CNTFR 단백질 또는 그 단편을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 적절한 발현 벡터에 삽입하는데 예로 삽입된 단백질 코딩서열의 전사와 해독에 필수성분을 가지는 벡터라야 한다. 필수적인 전사와 해독새그날은 원래 CNTFR 유전자 또는 그 인접 부위에 의해 공급받을 수 있다. 단백질-코딩서열을 발현시키는 데는 다양한 숙주-벡터 시스템을 이용할 수 있다. 이에는 바이러스(백산 바이러스, 아데노바이러스 등)감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스 감염된 (베큘로 바이러스) 곤충세포시스템, 효모 벡터를 포함하는 이스트와 같은 미생물 또는 박테리아 파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA를 포함하는 형질전환된 박테리아가 포함된다. 이들 벡터의 발현원소는 그 크기나 특이성이 다양하다. 이용되는 숙주-벡터시스템에 따라 적절한 전사와 해독원소가 사용된다.

본 발명의 특이적 구체예에서, CNTFR 유전자는 NRRL 의 B-18790과 같은 pCMX 발현벡터로 구성된다. 벡터로 DNA 단편을 삽입하는데 설명한 방법중에는 적절한 전사/해독 콘트롤 시그날과 단백질 코팅서열로 구성된 키메릭유전자를 가지는 발현벡터를 만드는데 사용할 수 있는 것도 있다. 이 방법에는 시험관내에서 재조합 DNA 와 합성기술 그리고 생체내에서 재조합(유전적 재조합)이 포함된다.CNTFR단백질 또는 펩티드 단편을 인코드하는 핵산서열의 발현은 제2핵산 서열에 의해 조절을 받아 재조합 DNA 분자로 형질전환된 숙주에서 CNTFR 단백질 또는 펩티드가 발현된다. 예를 들어 CNTFR 발현은 공지된 프로모터/인헨서로 제어받을 수 있다. CNTFR 발현을 조절하는 프로모터는 SV40 초기 프로모터부위(Bernoizt and Chambon, 1981, Natrue, 290:304-310), CMV 프로모터, 라우스 실코마 바이러스의 3' 말단 반복부위를 가진 프로모터(Yamamoto, 1980, Cell, 22:787-797), 허피스 티미딘 티나제 프로모터(Wafner et al., 1981, FNAS, 78:144-1445); 메탈로니아닌 유전자의 조절서열(Brineter et al., 1982, Nature 296:39-42). β -락타메이즈 프로모터와 같은 원핵생물 발현벡터(Villa-Kamaroff, et al., 1978, PNAS, U.S.A. 75:3727-3731) 또는 tac 프로모터 (DeBoer, et al., 1983, PNAS USA 80;21-25); Gal 4 프로모토와 같은 곰팡이 또는 이스트 프로모터, PGK (포스로글리세릴 카이네이즈 프로모터, 알칼리안 포스포타제 프로모터등이 포함되고 다음의 동물전이 조절부위 특히 조직특이성이 있고 유전자 전이동물에 이용되는 것; 췌장소포 세포에 활성이 있는 엘라스타제 I 유전자 조절부위(Swift et al., 1984,Cell 38 : 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 : 399-406; MacDonald, 1987, Hepatology 7 : 425-515) 췌장 베타 세포에 활성이 있는 인슐린 유전자 조절부위(Hanahan, 1985, Nature, 315 : 115-122), 임파세포에 활성이 있는 이뮤노글로블린 유전자 조절부위(Grosschedl et al., 1984, Cell, 38 : 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318 : 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol 7 : 1436-1444) 고환, 가슴, 임파와 유발세포에 활성이 있는 쥐유선 종양 바이러스 조절부분(Leder et al., 1986 Cell 45 : 485-495), 간에 활성이 있는 알부민 조절부위(Pinkert et al., 1987 Genes and Devel. 1 : 268-276), 간에 활성이 있는 알파-페토단백질 유전자 조절부위 (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5 : 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235 : 53-58); 간에 활성이 있는 알파-1-항트립신 유전자 조절부위((Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1 : 161-171), 골수세포에 활성이 있는 베타-글로빈 유전자 조절부위(Mogram 1985, Nature 315 : 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46 : 89-94); 뇌의 핍지 신경교세포에 활성이 있는 미앨린 염기성 단백질 조절부위(Readhead et al., 1987, Cell 48 : 703 : 712); 골근육에 활성이 있는 마이오신 경사슬-2 유전자 조절 부위 9Sani, 1985, Nature, 314 : 283-286)과 시상하부에 활성이 있는 가나도트로픽배출 호르몬 유전자 조절부위(Mason et al., 1986, Science 234 : 1372-1378).

CNTFR 유전자 삽입체를 포함하는 발현벡터는 다음의 세가지 방법에 의해 확인할수 있다. (a) DNA-DNA 하이브리드, 9b) “표식” 유전자의 유 또는 무,(c) 삽입된 유전자의 발현. 제1방식에서 발현벡터에 삽입된 외부유전자를 DNA-DNA 하이브리드로 감지할 수 있는데 이때 삽입된 CNTFR 유전자와 유사한 서열로 구성된 프로브를 이용한다. 제2방식에서 재조합 벡터/숙주 시스템이 특정“표식” 유전자 기능의 유무에 따라 선택되고 확인되는데(티미딘 카이나제 활성, 항생제, 저항성, 형질전환 표현형, 베큘로바이러스의 병소형성등) 이는 벡터에 삽입된 외부유전자로 인한 것이다. 예를 들어 CNTFR 유전자가 벡터의 표식유전자내에 삽입될 경우 CNTFR 삽입체를 포함하는 재조합체는 재조합체에 의해 발현되는 외부 유전자 생성물을 검사함으로써 확인된다. 이와 같은 방법은 CNTFR 유전자 생성물의 물리적 또는 기능적 특징에 기초하는데 예를 들면 CNTFR을 직접적으로 인지하는 항체 또는 CNTF에 대한 수용체의 결합이 된다.

정상적으로 CNTFR을 발현할 수 없는 세포는 재조합된 CNTF인코딩 핵산으로 감염시키고 CNTF에 감염체를 노출시켜 기능적 CNTFR 의 발현을 검사하고 CAMP 량의 증가를 검사한다.

공지된 기술을 이용하여 확인되고, 분리된 특정 재조합 DNA 는 번식시키는데 사용한다. 적절한 숙주시스템과 배양조건이 결정되면, 재조합 발현벡터는 대량 증식된다. 이미 설명한 것과 같이 발현벡터에는 다음과 같은 벡터 또는 유도체가 포함될 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 백신 또는 아데노바이러스와 같은 사람 또는 동물 바이러스; 베큘로바이러스와 같은 곤충바이러스; 이스트 벡터; 람다와 같은 박테리아 파지; 플라스미드와 코스미드 DNA 벡터.

숙주세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하고 또는 변형시키거나 특정방식으로 유전 생성물을 만들어가는 것으로 선택한다. 특정 프로모터의 발현은 특정 인듀서하에서 상승될 수 있다. 따라서 유전조작된 프로모터에서의 발현은 조절할 수 있다. 또한 상이한 숙주 세포는 단백질의 해독과 해독후 변형 프로세싱(글리코실화,절단)에 의한 특정지작을 가진다. 적절한 세포주 또는 숙주시스템은 발현될 외부 단백질의 변형과 프로세싱에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어 박테리아 시스템에서의 발현은 글리코실화안된 코어 단백질 생성물을 만드는데 이용될수 있다. 이스트에서의 발현은 글리코실화된 생성물을 만드는데 사용할 수도 있다. 포유류에서의 현은 상이한 CNTFR 단백질 “원형” 글리코실화 반응을 확인하는데 사용된다. 더욱이 상이한 벡터/숙주 발현 시스템은 단백질 절단과 같은 프로세싱 반응에 따라 상이한 크기로 나타날 수 있다.

CNTFR 유전자를 발현하는 재조합체가 확인되면 유전자 생성물을 분석한다. 이것은 생성물의 물리적 또는 기능적 특징에 기초하여 얻을 수 있다.

CNTFR 단백질이 확인되면, 크로마토그래피(이온교환, 친화력, 컬럼사이즈 크로마토그래피), 원심분리, 용해도차이 또는 단백질을 정제하는데 사용되는 다른 기술을 이용하여 분리하고 정제될 수 있다. 특히 CNTFR 단백질은 CNTF가 결합된 친화성 컬럼에 결합시킴으로써 분리할 수 있다.

CNTFR을 인코드하는 DNA 또는 RNA 서열에 상보적인 핵산서열을 제공한다. 특히 안티센서 올리고뉴클레오티드를 합성하고 이는 CNTFR mRNA 부분에 상보적이다.

5.5 CNTFR 관련된 단백질의 확인

동일한 인자에 다수의 수용체가 결합할 수 있는 것이 다가수용체-인자 시스템이 된다. 이것은 CNTF의 경우가 되는데 본 발명에서는 cDNA 발현 라이브러리를 만드는데 RNA를 사용하는 것을 제외하고 여기서 설명된 CNTFR을 수록하는데 사용된 동일한 구조에 의해 추가의 다른 CNTF수용체의 확인이 가능하다. 소스는 별도의 CNTFR을 발현할 수 있는 것으로 선택하고 CNTFR에 기인하는 CNTF-결합의 존재를 추측할 수 있다(CNTFR 서열에서 발생된 유전적 프로브와 항체 리젠트는 여기에서 설명한 CNTF와 세포주 또는 조직에 결합하는 CNTF의 단백질과 비교하는데 사용될 수 있다). 또한, 하나의 관련된 인자이상으로 결합할 수 있는 수용체로 인해 CNTFR 의 확인은 이들 수용체가 결합할 수 있는 원래의 리간드를 확인하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 CNTFR 서열은 CNTFR 관련분자의 확인에 사용될 수 있다. CNTFR은 다른 다수의 수용체와 공유하는 모티브를 가진다. CNTFR 의 외세포 부분에는 N 말단에 “이뮤노그로블린” 도메인과 짧은 힌지부분에 “이뮤노글로블린” 도메인과는 별도의 “ 사이토칸 수용체” 도메인을 가지고 있다. 많은 수용체가 “ 이뮤노글로블린” 또는 “사이토킨 수용체” 도메인과 유사하다. 단 한종의 수용체-IL-6 수용체 CNTFR 의 도메인의 특정배열을 공유하고 있다. IL-6 수용체는 IL-6 결합에 반응에 요구되지 않는 것으로 보이는 매우 짧은 사이토플라즘 도메인을 가진 CNTFR 과 유사하다(Hibi et al., 1990 cell 63:1149-1157),최근의 IL-6수용체의 신규한 시그날 트렌스듀서 즉 gp130을 클론시켰다.이 트렌스듀서는 혼자서는 IL-6 에 결합하지 않으나 IL-6 수용체에 결합할 수 있는 고도의 친화성을 제공하고 IL-6 시그날을 변환시키는데 요구된다(Hibi et al., 1990, Cell 63:1149-1157).CNTFR의 클로닝은 다른 공지된 수용체에 발견되지 않는 L-6 수용체와 중요한 특징을 공유하고 있어 신규한 수용체족이라 정의한다.

이들 수용체의 제1, 제2그룹 사이의 유사성이 유사부위에 상응하는 DNA 또는 항제 프로브에 의해 추가의 관련된 수용체를 확인하는데 사용되거나 아미노산 유사부위를 공유하는 부위에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 변성시키는 중합효소 사슬반응을 이용하여 확인할 수도 있다(Maisonpierre et al., 1990, Science 247:1146-1451). 본 발명품은 CNTFR 이 IL-6 수용체로써 동일한 시그날 트렌스듀서를 인용하는지 또는 관련된 분자를 이용하는 지를 검사 하기 위해 사용할 수도 있다. 마지막으로 CNTFR-관련된 수용체의 확인은 이들 수용체에 결합할 수 있는 신규한 리간드의 확인데 도움이 된다. 본 발명에 따르면 제2도에 제시된 핵산 서열 또는 단백질 서열에서 유도된 CNTFR 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드와 DNA 라이브러리로 스크린함으로써 상술한 신규한 족을 인코드하는 클론을 확인할 수있다. 하이브리드 반응의 엄중성이 감소하므로써, 족의 다양한 멤버를 확인할수 있는 기회가 증가된다. 서열화된 족의 멤버가 공유하는 서열을 이용할 수도 있고 매우 고도로 보존된 부분은 추가의 멤버를 확인하는데 유용하다. 라이브러리 스크리닝은 Benton, Davis (1977,Science, 196:180) 또는 Grunstein, Hogness (1975, PNAS, 72:3961-3965)의 하이브리드 기술을 이용하여 실행할 수 있다. 하이브리드에 의해 확인된 클론은 분석하여 신규한 멤버는 제한 효소 지도와 서열화기술을 이용하여 확인될 수 있다. CNTFR 슈퍼패밀리의 추가 멤버를 확인하는데 PCR 기술을 이용하는 것이 좋다(Saiki et al,1985, Science 230:1350-1354). 예로써 공지된 CNTFR 서열에 상응하는 센서와 안티센서 프라이머는 PCR에 사용되고 특히 cDNA를 이용한 기술에 사용될수 있다.

적절한 클로닝 벡터로 PCR 생성물질을 삽입하는데 사용되는 제한요소 절단부위가 포함된다. PCR 생성물을 적절한 벡터에 사용하고 생성된 클론을 신규한 족멤버를 스크린 할수도 있다. 이와 같은 스크린은 공지된 서열에 상응하는 프로브를 이용하여 하이브리드 분석하는 것을 포함한 표준기술을 이용하여 실행할 수 있다. 예를 들면 특정 CNTFR 단백질의 상이한 부분을 나타내는 프로브는 PCR을 이용하여 생성된 클론에서의 DNA를 가지는 이중 필터에서 낮은 엄격성에서 하이브리드될 수 있다 다양한 클론은 몇몇 프로브와는 하이브리드 된다. 신규한 족멤버는 하이브리드 조건의 엄격성을 증가시킴으로써 확인할수 있고 신규한 멤버는 높은 엄격성에서는 다소 약하게 하이브리드하는 공지된 것에서 유도된 프로브와는 동일하지 않다. 또한 신규한 멤버는 표준기술을 이용한 제한효소지도 또는 서열분석으로 확인할 수 있다. 또한 구제에에서 본 발명은 CNTFR과 복합체를 형성하고 CNTFR기능에 참가하는 분자를 제공한다. 에로써 서열화 분석에 의하면 CNTFR은 사이토플라즘 도메인을 소유하지 않는 것으로 보이는데, 이것은 GPI 연결된 글리코실-포스타티딜이노시롤을 통해 막에 결합되어 있을수 있다(Ferguson et al., 1988,Ann Rev, Biochem. 57:582-320). 이로써 적어도 다른 한분자가 CNTFR과 연관되어 세포막에 가로지른 시그날 변환에 첨가한다. 예를 들면 이와같은 단백질은 IL-6R과 연관된 GP130 일수 있는데(Tag et al., 1989,Cell 58:573-581). 이는 CNTFR과 연관된 분자는 화학적 연결,항-CNTFR 항체와의 공침전 CNTF/ 테그 또는 단백질 또는 지방 정제기술을 이용하는 방법으로 분리되고 확인될 수 있으나 이에 한정하지는 않는다.

또한 본 발명은 CNTFR에 결합할 수 있는 CNTF이상의 분자를 제공한다. 이와 같은 분자는 CNTFR 에 결합하는 다른 정상 리간드, 펩티드, 펩티드 유도체와 비-펩티드 성분룰(펩티드 도미메릭)을 포함한 분자가 된다.

5.6 발명의 이용

5.6.1 검사 시스템

본 발명은 본 발명의 CNTFR 분자를 발현하는 CNTF반응성이 있는 세포 또는 세포주에서 CNTF에 생리적인 반응성을 측정함으로써 감지할 수 있는 펩티드 또는 비-펩티드에 노출시킴으로써 CNTF활성과 유사한 활성 또는 CNTF활성을 검사하는 시스템을 제공한다. 생리학적인 반응은 2.2에서 설명한 것을 포함한 CNTF의 생물학적 효과와 특정 핵산서열의 포스포릴화반응 CNTF에 의해 직간접적으로 유도되는 반응에 의해 제2과정의 유도, 모양학적 변화, 모양신경질세포, 운동신경, 푸르킨지세포 또는 해마뉴우런과 같은 살아있는 세포를 지탱시킬수 있는 능력등이 포함된다.

본 발명의 적절한 구체적예에서 CNTF와 CNTFR 사이의 기능적인 상호작용은 c-fos 와 c-jun을 포함한 많은 성장인자 자극된 막봉과 시그날에 반응성이 있는 “초기즉시”일차반응 유전자의 생산에서 증가분을 측정함으로써 관찰할 수 있다. 예로써, 초기 즉시 유전자의 활성화는 초기 즉시 유전자 mRNA 량의 노던블랏 분석에 의해 감지할 수 있다. 본 발명의 구체적예에서 c-fos 또는 c-jun mRNA 량은 CNTF와 배양 시킨 표식세포에서 준비된 mRNA의 노던블랏에 의해 결정한다. 본 발명의 구체적예에서 표식세포가 CNTF에 결합에 의해 선택되거나 또는 특정 재조합 CNTF코딩핵산을 생산하는데 CNTF또는 CNTF유사활성에 반응하는 것이 표식세포가 된다. 본 발명에서 CNTF유사활성은 CNTF와 동일하거나 그렇지 않은 유사한 생물학적 활성을 의미하는데 이와 같은 활성은 fos 와 jun 프로모터와 같은 특별히 초기 즉시 프로모터의 활성이 포함되나 이에 한정하지는 않는다.

본 발명은 CNTF또는 CNTF유사활성을 스크린하는 성분들에 이용할 수 있는 신규한 시스템을 개발한다. CNTF에 결합할 수 있는 표식세포는 CNTFR-인코팅 핵산에 감염에 의해 생성되거나 또는 형광-활성화된 세포분류, 로젯트의 침전과 같은 것으로 확인하고 분류할 수도 있다.

표식세포주가 일단 생성되거나 또는 확인되면 CNTF에 민감한 세포를 선택하는 것이 바람직하다. 이와 같은 표식세포는 상당수의 CNTFR을 가지는데 관련된 풍부한 CNTFR을 가지는 표식세포는 다량의 CNTF가 결합하는 표식세포를 선택함으로써 확인되고, 세포를 CNTF/tag 로 배양하고 상대적으로 다량의 형광 물질을 만드는 면역형광 검사를 하게 된다. CNTF에 민감한 세포는 CNTF결합에 대한 반응에서 c-fos 또는 c-jun 과 같은 초기즉시 유전산물의 급작스런 증가등의 상대적으로 강한 생물학적 반응을 보인다. CNTF에 민감한 표식세포를 이용한 검사 시스템을 개발함로써 본 발명은 상대적으로 적은 CNTF활성을 감지할 수 있는 CNTF또는 CNTF유사활성을 감지하는 방법을 제공한다. 특히 재조합 DNA 기술을 이용하여 본 발명은 CNTF에 매우 민감한 CNTF표식세포를 제공한다. 예로써 5.1에서 제시한 방법에 따라 클론된 CNTF-수용체 유전자는 자연적으로 CNTF반응이 있는 세포에 삽입되고 재조합 CNTF유전자가 다량 발현되어 생성된 표식세포는 세포 표면에서 다수의 CNTFR을 발현시킨다.

또한 표식세포는 CNTF/수용체 결합 반응에서 다량의 재조합 유전자를 발현하도록 구성된다. 이와 같은 재조합 유전자는 감지가능한 산물과 연결되는 것이 적절하다. 예를 들어 즉시 초기유전자의 전이조절부위(예로 프로모터/인헨서부분)은 표식세포로 도입될 수용체 유전자의 발현을 제어하는데 사용될 수 있다. 강력한 프로모터/인헨서에 의해 표식세포에서 다량 복사 될때 초기 즉시유전자/수용체 유전자 구조는 CNTF결합의 증폭반응을 만드는데 이용될 수 있다. 예로써, CNTF-반응 프로모터(c-fos 또는 c-jun 프로모터)는 β-갈락토시다제 성장호르몬, 클로람 페니콜 아세틸 프랜스퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 루시퍼라제 또는 β-글루코로니다제를 포함한 감지가능한 수용체 유전자의 발현을 조절하는데 사용된다.

공지된 기술인 이들 수용채 유전자의 생성물 감지는 제약학적 성분물의 CNTF또는 CNTF유사활성의 민감성 인디케이터로써 작용할 수도 있다.

전술한 것과 같이 CNTFR-인코딩 또는 수용체 유전자 구조는 전이감염, 일렉트로포레이션, 칼슘 침전/DEAE 덱스트란 방법, 쎌건과 전이유전자로써의 상기 구조를 가지 유전 전이동물의 생산을 포함한 방법으로 표식세포에 삽입할 수 있는데 상기 방법을 이용하여 CNTF표식세포를 선택할 수 있다.

본 발명의 검사시스템은 CNTF관련 질병치료시에 이용할 수 있는 제약학적 성분물을 효과적으로 선발할 수 있다. 예로, 퇴행성 소뇌에 치료에 효과가 있고 CNTF활성의 제약학적 성분을 스크린하는데 바람직하다. 본 발명의 구체예에서 CNTF에 반응성이 있는 푸르킨지 세포를 확인하고 분리하여 멀티웰배양판의 미량웰에 배양한다. 시험시료 또는 CNTF가 첨가된 배양배지를 여러번 희석하여 적절한 콘트롤이 있는 웰에 분배한다. 세포는 생존개선, 축색발육등을 검사하고 시험시료와 CNTF의 활성과 이와 연관된 활성을 검사한다. 운동신경 병소도 CNTF에 상당한 반응성이 있었다(Sendtner, 1990, Nature 345 : 440) CNTF유사 성분물이 CNTF와 같이 운동신경 세포의 죽음을 방지하는지를 확인할 수 있다. CNTF반응성 운동신경은 운동신경 질환을 검사하는데 유용한 성분물을 확인하는 검사시스템에 이용할 수 있다. 축색이 제거되는 운동신경세포 죽음을 방지하는데 효과적인 CNTF를 고려하면서 척수손상치료, 근위축 측면 경화증과 당뇨신경병의 치료시에 혈액장벽을 통과시키는데 요구되는 약물을 포함한 이들 질환의 치료에 효과적인 약을 만드는데 있어서 본 발명의 방법과 같은 신뢰성 있고 민감한 선별시스템에 접근하는 것이 필수적이다. 특정조직에 반응이 있는 CNTF반응을 감지하는 것과 관련된 특정질환일 경우 이들 질병의 치료는 외생 CNTF를 환자에게 공급하는 것이다. 그러나 내성 CNTF보다 반감기가 길거나 또는 CNTF길항으로써 작용응 하거나 또는 특정조직에 표식이 될수 있는 분자를 개발해야 한다. 따라서 본 발명은 특정성질을 가진 분자를 확인하는데 사용할 수 있는 효과있고 민감한 스크린 시스템을 만드는데 사용될 수 있다.

5.6.2. 실험 모델 시스템

본 발명은 생리적인 CNTF역할을 연구하는 실험모델 시스템을 제공한다. 이 모델시스템에서 CNTF펩티드, 펩티드단편 또는 그 유도체는 시스템내에 만들어지거나 공급할 수 있는 것이다. 이와 같은 모델 시스템은 CNTF초과 또는 결핍의 효과를 연구하는데 사용될 수도 있다. 실험 모델 시스템은 세포 또는 조직배양시 또는 전체동물에서 동물 또는 조직배양 시스템에서의 조직 또는 특정세포 또는 특정기간(배발생포함)등 유도성/또는 발생적으로 제어되는 프로모터에 의해 CNTFR 발현을 조절받는 위와 같은 세포 또는 조직에서의 CNTF의 증감효과를 연구하는데 사용된다. 본 발명의 구체에서의 CMV 프로모터는 유전전이 동물에서의 CNTFR 발현을 조절하는데 이용될 수 있다. 여기에서 사용된 “유전전이동물”의 의미는 사람이 아닌 동물에서 세포전부 또는 일부가 전이유전자를 가지는 모자이크를 포함하는 동물을 말한다. 예로써 Brinster 1989, PANS, 82 : 4438-4442에서 제시한 수정란이 미량주입에 의해 만들어질 수 있다.

본 발명은 또는 CNTFR 에 직접 반응성이 있는 자가면역 반응의 자가면역 질환에 모델 시스템을 제공한다. 이와 같은 모델에는 CNTFR 의 면역화 량으로 면역화된 동물과 향-CNTFR 항체 또는 세포 조절면역성을 만드는데 사용될 수 있다. 이와 같은 모델 시스템을 만드는데 있어서 BCG 와 같은 면역 어쥬번트와 CNTFR 의 공동 주입이 바람직하다.

5.6.2.1. 증가된 CNTF활성 모델

실험 모델 시스템은 과량 CNTF활성의 효과를 연구하는데 사용될 수도 있다. 이와 같은 시스템에서 CNTF에 대한 반응성은 만들어지지 않는 세포의 모델 시스템에서 CNTFR 의 수가 증가 하도록 할수도 있다. 정상적으로 CNTFR을 발현하는 세포에서 선택적으로 증가된 수의 CNTFR을 제공하는 것이 바람직하다.

CNTFR 유전자를 가진 바이러스로 감염된 CNTF의 수를 증가시켜 생산하는 세포의 제조도 할수 있다. 또는 전이 감염에 의해 CNTFR 유전자를 세포에 제공할 수도 있다.

모델 시스템이 동물일 경우 재조합 CNTFR 유전자는 CNTFR 유전자를 가지는 바이러스에 의해 감염된 동물세포에 도입된다. 또한 전이유전자로 CNTFR 유전자를 가지는 유전전이 동물을 만들 수 있다.

CNTFR 의 발현을 확실히하기 위해 CNTFR 유전자는 적절한 프로모터의 제어하에 놓이게 된다. CNTFR 유전자는 구조적인 또는 조직 특이적인 프로모터의 제어하에 놓이는 것이 적절한데 여기에는 CNS 뉴우런 특이 애노다제, 신경섬유, 티로신 하이드록시라데 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, HIV LTR 의 UV 활성프로모터 (Valeri et al., 1988, Nature 338 : 78-81) 또는 CMV 프로모터 또는 발생상의 제어된 프로모터와 같은 유도성 프로모터가 포함될 수 있다.

세포에서의 CNTFR 수를 증가시키기 위해서는 내성 CNTF의 반응성이 증가되어야 한다. 모델 시스템에 CNTF가 없거나 미량있는 경우 CNTF는 시스템에 첨가되어야 한다. 초과량의 CNTF활성의 효과를 검사하기 위해 모델 시스템에 추가의 CNTF를 첨가해도 된다. 과발현 CNTF(또는 분비된 CNTF)는 이미 CNTFR을 발현한 세포에서의 CNTF의 양의 증가의 효과를 연구하는데 적절한 방법이 될수 있다. 더욱 적절하게는 모든 세포에서 CNTFR을 발현하고 CNTF에 기능적 반응성이 있는 세포를 결정하고 제2수용체 성분을 확인할 수 있다.

5.6.2. 감소된 CNTF활성모델

마찬가지로 감소된 CNTF활성의 효과를 연구에는 사용할 수 있는 모델 시스템도 만들 수 있다. 이 시스템은 CNTF를 요구하는 과정 또는 뉴우런의 확인을 허용하고 잠재적인 치료요법의 표식을 나타낸다. 이와 같은 시스템에서 CNTF에 대한 반응성은 CNTF에 반응을 유도하는데 비효과적으로 되기위해 만들어지거나 또는 세포표면과 연관없는 재조합 CNTFR을 제공함으로써 감소된다.

예로써, CNTFR 단백질, 펩티드 또는 유도체는 시스템에 공급되어 CNTF에 결합하는 내성 CNTFR 과 공급된 CNTFR 이 경쟁하여 CNTF의 반응성이 감소하게 된다. CNTFR 은 시스템에 첨가되거나 또는 시스템에 의해 만들어진 무세포 수용체일 수 있다. 예로써 막통과 도메인이 부족한 CNTFR 단백질은 시스템내의 세포에 의해 만들어지는데 세포를 만들어내는 무축 CNTFR 이 된다. 또한 CNTFR 단백질, 펩티드 또는 유도체는 시스템내의 세포의 공간에 첨가될 수도 있다.

본 발명의 구체예에서 재조합 CNTFR 유전자는 유사한 재조합에 의한 비활성 또는 “노크아웃” 내생 유전자로 사용하여 CNTFR 부족 세포, 조직 또는 동물이 생성된다. 예로써 재조합 CNTFR 유전자는 CNTFR를 비활성화시키는 neo 유전자와 같은 삽입 돌연변이를 포함하도록 만들 수 있고 적절한 프로모터하에 이와 같은 구조가 전이감염, 유도 주사등과 같은 기술을 이용하여 배간세포와 같은 세포에 유입될 수 있다. 이 구조를 가지는 세포는 G418 저항성에 의해 선택될 수 있다. 원래 CNTFR 유전자가 부족한 세포는 서든 블랏팅 또는 노던 블랏팅 또는 발현검사등에 으해 확인될 수 있다. CNTER 유전자가 부족한 세포는 CNTFR 이 결핍된 유전전이 동물을 만들기 위해 초기 배세포와 융합될 수 있다. 내성 CNTF를 발현하지 않는 동물은 두 개의 표현형이 완전히 짝을 이루거나 또는 추가의 CNTF유사인자 또는 수용체가 존재하지 않음을 암시한다.

이와 같은 동물은 특이적 신경집단 또는 생체내 과정등 정상적으로 CNTF에 의존하는 것에 사용될 수 있다. 이들 집단은 동물에서 CNTFR을 발현하지 않거나 CNTF에 반응성이 없는 경우에 효과가 있다고 볼수 있다.

CNTF에 내생 수용체와 경쟁 가능한 재조합 CNTFR 단백질, 펩티드 또는 유도체는 시스템내의 세포표면에 발현될 수 있다. 그러나 CNTF결합을 유도하지 않는 것으로도 만들 수 있다.

전술한 재조합 CNTFR 단백질, 펩티드 또는 유도체는 CNTF에 내생 CNTFR 친화성과 상이한 또는 다른 친화력으로 CNTF에 결합할 수 있다. CNTF반응을 좀더 효과적으로 감소시키기 위해 CNTFR 단백질, 펩티드 또는 유도체는 자연 수용체에 의해 나타나는 것보다 더 큰 친화력으로 CNTF에 결합할 수 있다.

모델 시스템내에서 CNTFR 단백질, 펩티드 또는 유도체가 생성된다면 CNTFR 단백질, 펩티드 또는 유도체를 인코드하는 핵산이 감염, 유도, 전이감염 또는 전이유전자로 시스템내에 공급될 수 있다. 전술한 것과 같이 CNTFR 유전자는 조직특이적프로모터 또는 유도성 프로모터 또는 발생단계에서 조절된 프로모터등 적절한 프로모터하에 위치한다.

본 발명의 특이 구체예에서 내생 CNTFR 유전자는 유사한 재조합에 의한 돌연변이 CNTFR 유전자에 의해 대체될 수 있다.

본 발명의 구체예에서 CNTFR 발현은 CNTFR 단백질 발현을 감소시키는데 효과적인 CNTFR 항-센서 RNA 또는 DNA 량으로 CNTFR 발현세포에 제공함으로써 감소될 수 있다.

5.6.3. 진단상의 응용

본 발명에 따르면 CNTFR 프로브는 정상 또는 질병상태에서 CNTFR 에 반응성이 있는 세포와 조직을 확인하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 이와 같은 세포에서 CNTFR을 감지하는 것으로 구성된 CNTF반응성이 있는 세포를 확인하는 방법을 제공한다. CNTFR 발현은 CNTFR mRAN 전사 또는 CNTFR 단백질 생산에 의해 알수 있다. CNTFR 발현은 CNTFR 핵산 또는 단백질을 확인하는 프로브를 이용하여 감지할수도 있다.

CNTFR 발현을 감지하는데 사용될 수 있는 프로브는 공지된 방법에 의해 CNTFR-인코딩 RNA을 감지하는데 사용할 수 있는데 이 방법에는 하이브리드, 노던블랏분석 또는 PCR 관련기술등이 된다.

사용된 다양한 프로브는 US 07/532,285 에 제시한 것과 같이 태그 CNTF일 수 있다.

본 발명에서 “태그” CNTF는 제2차 감지성분물(tag)이 부착된 CNTF분자를 여미한다. 감지 가능한 성분물은 방사선 동위원소, 형광발생물질 또는 수용체에 결합할 수 있는 리간드 또는 색깔 또는 촉매활성으로 감지할 수 있는 물질등이 된다. 구체예에서 태그는 항원결정부위로 구성되는데 항체는 태그에 결합할 수 있다. 또다른 구체예에서 태그 자체가 항체일 수도 있고 본 발명의 구체예에서는 단클론항체 RP3-17 이다. 태그는 CNTF의 생물학적 활성을 간섭하지 않고 태그 감지방법에서 CNTFR이 CNTF에 결합을 실제적으로 방해하지 않아야 한다.

태그는 공지된 기술을 사용하여 CNTF에 부착시킬 수 있다. 본 발명의 적절한 구체예에서 태그는 CNTF에 공유적으로 결합할 수 있고 어떤 경우에는 비공유력에 의해 태그에 부착될 수 있다(예로, 태그가 이뮤노글로블린 분자일 경우).

태그는 부착된 CNTF의 생물학적 활성을 실제적으로 변형시키지 않고 그것의 감지기능을 유지할 수 있는 적절한 분자크기이어야 한다. 태그가 항원 결정부위를 제공할 경우 적어도 5-15개 아미노산으로 구성된다.

본 발명의 특이적 방법에서 CNTF는 “패취” 중합효소 사슬반응을 이용하여 태그할 수 있고 CNTF는 공지된 항원결정부위에 상응하는 C-단부 10개 아미노산을 가지도록 만들어진다. 예로써 이러한 항원결정부위는 사람 c-myc 프로토-온코겡 단백질의 에피토프에 상응한다.

예로써, “ 패취” PCR 방법은 다음과 같이 열 개 아미노산 myc 태그를 부착시키는데 사용한다(본 발명에서는 유사한 방법에 의한 부착된 아미노산을 제공한다). 박테리아 발현구조에 유일한 제한효소 절단부위의 CNTF서열상류에 상응하는 5’ PCR 프라이머는 템플레이트로 CNTF-반응세포에서의 cDNA를 사용하여 3’ 단부 CNTF서열과 펩티드 tag을 인코드하는 핵산서열에 상응하는 뉴클레익산으로 구성된다.

PCR 반응은 유일한 제한효소 절단부위에 결합되는 핵산서열을 포함한 패취 프라이머 서열에 상응하는 3’ 프라이머로 구성된다. 구체예에서 5’ 와 3’ 프라이머는 다량 패취 프라이머에서 사용될 수 있고 5’ 와 패취 프라이머 사이의 PCT 증폭은 수회 PCR 사이클후에 중지되는데 5’ 와 3’ 프라이머 사이의 증폭이 개시되어 총길이 CNTF/tag 서열이 다량 생산될때까지 지속된다. “패취” 기술은 어렵고 시간이 많이드는 합성에서 긴프라이머가 요구되는 것을 해결할 수 있다. 증폭된 CNTF/tag 생성물은 정제되어 생성물단부에 만들어진 제한효소 절단부위에서 절단된고 발현벡터의 절단부위에 상응하는 위치에 서브클론된다. 예로써 CNTF-myc tag을 만들기 위해 다음의 프라이머를 이용할 수 있다 :5’ 프라이머=5’ GAC TCG AGT CGA CAT CGG AGG GG ATG GGA TGCC 3’ (SEQ ID NO : 3); 패취 프라이머=3’ CTA AAG AG CCT CCT AGA CAT AGA CAT CGC CGG CGT ATCG 5’ (SEQ ID NO : 4); 프라이머는 5’ 프라이머와 3’ 프라이머 패취 프라이머의 비율을 100ng; 100ng; 1ng 으로사용 한다. CNTF/tag 발현은 1990년 8월 20일자 “CNF” 미국출원 07/570,651 과 1991년 4월 4일 공고된 PCT W091/04316 에 상술된 것으로 시행하였다.

본 발명은 이뮤노글로블린 분자 또는 2부분 항체의 Fc F(ab)₂, 또는 F(ab’)로 구성된 태그를 제공한다. 태그는 CNTF에 결합할 수 있고 다클론 또는 단클론항체일 수 있다.

본 발명에 따르면 태그 CNTF는 전술한 세포에 CNTF의 결합 또는 부착을 촉진시키는 상태하에서 세포를 배양한다. 대부분의 경우 표준 배양상태에서 얻을 수 있다. 예로써 본 발명의 적절한 구체예에서 세포는 태그 CNTF존재하에서 약 30분간 배양한다. 태그가 항체일 경우 우선 세포에 CNTF를 결합시킨다음 결합안된 리간드는 세포를 세척하여 제거하고 그 다음 항-CNTF항체 tag를 첨가한다.

본 발명의 구체예에서 CNTF-반응성 세포표면의 태그 CNTF는 (이하 표식세포라 칭함) 로젯팅 검사로 감지되는데 인디케이터 세포는 CNTF/tag를 보유하는 세포와 배양시에 태그와 결합할 수 있고 이들은 표식세포의 CNTF/tag 에 흡착하고 결합된 인디케이터 세포는 CNTF-tag 소유 세포주위의 로젯트와 같은 덩어리를 형성한다. 이러한 로젯트는 플레이트 세포에서 표준 현미경 기술로 볼수 있거나 농도 원심분리에 의해 로젯트와 비-로젯트로 분리할 수도 있다. 본 발명에서 신경세포와 같은 표식세포를 배양하고 RPMI 1640, 10% 태아소혈청, 2mM 글루타민 배지에서 웰당 약 200세포의 농도를 플레이트 한다. 플레이트된 세포는 세포흡착을 위해 습윤 5% CO₂ 대기 인큐베이터에서 37℃에서 16 내지 24시간 배양한다. 그다음 초과 세포배양배지를 제거하고 세포는 tag CNTF와 실온에서 30분간 배양시킨다. 세포는 1% BSA 가 보충된 PBS 로 수회 세척하여 결합안된 리간드를 세척해내고 태그 분자를 인식하는 항체 10ug/㎖ 으로 실온에서 약 30분간 배양한다. 세포를 PBS 로 여러번 세척하여 결합안된 항체를 제거한다. 그다음 표식세포 (항-tag-항체가 결합된 CNTF/tag 보유)는 항-tag-항체에 결합하는 로젯팅 인디케이터 세포 현탁액 0.2%로 1시간동안 실온에서 배양한다.

플레이트를 PBS 로 세척하고 상대조 현미경으로 로젯트를 검사한다. 예를 들면 항-tag 항체가 쥐에서 생성될 경우 인디케이터 세포는 다른 종에 의해 만들어지는 항-(쥐 이뮤노글로블린)항체로 적혈구 세포에 코팅시킴으로써 만들 수 있다. 인디케이터 세포는 Albino 의 과정에 따라 염을 0.01% CrCl₃.6H₂O로 희석시킨 것에서 항-이뮤노글로블린 항체(농도는 1㎎,㎖ 이상)와 적혈구 세포를 배양하여 만든다. 공지된 방법을 이용할 수도 있다.

본 발명의 구체예에서 표식세포의 표면의 태그 CNTF는 직간접의 형광을 내는 태그, 항체와 반응하는 분자를 이용하여 감지할 수 있다. 형광은 형광 활성화된 세포 분류기술을 이용하여 CNTF/태그-보유세포를 분리하기 위해 이용되거나 현미경 관찰시에 사용될 수 있다. 본 발명의 구체예에서 표식세포를 적정하고 4℃에서 30분간 CNTF/tag 와 소듐 아지드(0.05%)를 포함하는 완충액으로 재현탁시킨다. 세포는 3회 세척한 후 5분동안 원심분리시킨다. 세포를 10ug/㎖ 농도에서 항-태그항체로 30분간 4℃에서 배양시킨 후 상기와 같이 세척하여 바이오틴 항- 이뮤노글로블린과 스트랩타아비딘-텍사스 레드컨쥬게이트로 30℃에서 4분간 배양한다. 세포를 세척하고 마운틴액으로 재현탁시켜 형광현미경으로 검사한다.

본 발명은 발색 테그, 촉매테그와 같은 다른 종류의 테그로도 감지할 수 있다. 특정테그의 감지방법은 데그에서 시그날을 만드는데 필요한 조건에 따라 달려있는데 공지된 기술에 숙지된 자는 알수 있다.

사용된 다른 프로브는 항-CNTFR 항체이다.

본 발명에서 CNTFR 단백질, 단편, 그 유도체는 항-CNTFR 항체를 발생시키는 이유노겐으로 사용할 수도 있다. 단백질 합성용 재조합 기술을 이용하여 CNTFR 단백질 풍부량을 만들기 위해 CNTFR 한정량의 문제는 회피한다.

항-CNTFR 면역 반응을 만드는 환경을 개선하기 위해 CNTFR 의 아미노산 서열을 분석하여 증가된 면역성에 연관된 분자의 위치를 확인한다. 예로써, 아미노산 서열을 컴퓨터 분석하여 CNTFR 의 친수성을 나타내는 표면특성, 유연성, 항원인덱스, 양쪽성 헬릭스, 쉬트, 2차구조를 나타내는 컴퓨터 플로트를 나타내는 표면에피토프를 확인한다. 상이한 종에서 CNTFR 의 추정한 아미노산 서열을 비교하고 상대적으로 상이한 위치를 확인한다. 이들 상이부분은 다양한 종간의 면역발생성이 유사한 것으로 보인다.

CNTFR 에 직접적인 단클론 항체를 만들기 위해 배양에서의 연속 세포주의 항체분자 생산을 제공해줄 수 있는 기술을 이용한다.

예로써 Kohler 와 Milstein 에 의해 개발된 하이브리도마 기술(1975, Nature 250 : 495-497)과 트리오마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마기술(Kozbor et al, 1983, Immunology Today 4 : 72) 와 사람 단클론 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마기술(Cole etal, 1985 단클론 항체와 암치료 Alan R. Liss, Inc. p77-96)과 본발명의 범위에 속하는 유사기술등이다.

치료용으로의 단클론 항체는 사람 단클론 항체 또는 키메릭사람-쥐(또는 다른 종) 단클론 항체일 수 있다. 사람 단클론 항체는 공지된 다수의 기술에 의해 만들 수 이다.(Teng 1983, Immunology Today 4 : 72-79 : Olsson, 1982, Meth. Enzymol. 92 : 3-16). 키메릭 항체분자는 사람은 불변부위와 쥐항원 결합부위를 가지도록 만들어진다.(Morrison 1984, PANS, 81 : 6851, Takeda, 1985, Nature 314 : 452).

공지된 다양한 공정이 CNTFR 에피토프에 대한 다클론 항체를 만드는데 이용될 수 있다. 항체를 생산하기 위해 다양한 숙주동물 토끼, 쥐등에 CNTFR 단백질, 유도체등을 주사하여 면역화시킨다.숙주에 따른 면역반응을 증가시키기 위해 각종 어쥬빈트가 사용될 수 있는데 플루이드(컴플리트와 인컴플리트), 리졸레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리안이온, 펩티드, 오일유제, 키롤 림페트 헤모시아닌, 디니트로페놀과 같은 표면활성물질, 알루미늄하이드록시드와 같은 미네랄겔, BCG, 코리네박테리움 파르붐과 같은 유용한 인체 어쥬빈트를 포함하나 이에 한정하지는 않는다.

공지된 기술에 의해 CNTFR 에피로프에 대한 항체 클론을 만든다. 재조합 DNA 방법(Maniatis 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manuel, Cold Spring Harbor Lab)은 단클론 항체분자와 이것의 항원결합부분을 인코드하는 핵산서열을 만드는데 사용될 수 있다.

면역흡착 또는 면역친화성 크로마토그래피, HPLC 등과 같은 공지된 기술을 이용하여 정제할 수 있다.

본 발명은 항체분자와 이 항체의 단편을 제공한다. 분자의 에피토프를 포함하는 항체를 만들수도 있다. 예를 들면, 항체를 펩신처리하여 F(ab’)2 단편을 만들 수 있고 F(ab’)2 단편의 이황화결합을 환원시켜 Fab’ 단편을 만들고, 펩신과 환원제를 항체에 처리함으로써 Fab를 만들 수 있다.

전술한 프로브는 CNTFR을 발현하지 않는 조직 또는 세포를 확인하는데 사용할 수도 있다. 또는 이들 방법은 종양과 같은 변이조직에 의해 CNTFR 의 발현을 확인하는데 사용할 수도 있다. 또한 건강한 사람의 세포 또는 조직과 환자의 세포 또는 조직에서의 CNTFR 의 발현을 비교하여 진단시에 사용할 수도 있다.

유체는 혈액 또는 척수액과 같은 체액을 말한다. 건강한 사람의 것과 환자의 CNTFR 발현 량의 차이는 CNTF대사에 일차 또는 2차적으로 관련됨을 알 수 있다. 예를 들어 CNTFR 의 양이 증가된 경우에는 환자의 질환은 정상적인 CNTF양에 매우 민감한것과 연관된 것이고 환자의 CNTF량이 낮아 수용체의 수가 보상에 의해 증가된 것이다. 이런 원인론은 환자에 CNTF주입함으로써 구별할 수 있다. 환자의 상태가 악화되면 그는 CNTF초민감성으로 고통을 받는 것이고 개선될 경우 CNTF길항 치료요법은 경우에 따라 선택된다. 발현에서의 차이는 단백질 또는 RAN 량으로 감지할 수 있는데 환자의 건강한 사람의 CNTFR 단백질 또는 CNTFR RAN 량을 측정하는 것이다.

전술한 프로프는 미국출원 07/532,285 에 상술한 것과 같이 검사 시스템에서 CNTF-반응세포를 선별하거나 세포분류방법에 따라서도 가능하다.

5.6.4. 치료상의 응용

본 발명은 CNTFR 단백질 펩티드단편, 그 유도체 효과량으로 치료가능한 신경질환 환자의 치료방법을 제공한다. 치료방법은 CNTFR, CNTFR 항, CNTFR 길항 또는 항-CNTFR항체등을 주입하는 것으로 구성된다.

본 발명은 적절한 제약학적 수용체내에 CNTFR 단백질, 펩티드단편 또는 유도체로 구성된 제약학적 성분물을 제공한다.

CNTFR 단백질, 펩티드단편, 또는 유도체는 국소적으로 또는 시스템상으로 주입된다. 적절한 주입방법은 정맥내로, 포막내로, 동맥내로, 비강내, 구강, 피하, 복막 또는 국소주사 또는 외과이식등이 포함되나 이에 한정하지는 않는다.

신경퇴행성질환/신경외상의 이해가 분명해지도록 내생 CNTF의 효과 의존선이 감소되는 것이 유익함을 알 수 있다. 그러므로 신경계 외상부위에서는 CNTF길항을 제공하는데 여기에는 CNTF결합시 내생 세포수용체와 경쟁이 가능한 무세포 CNTFR 이 포함될 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 이와같은 환경하에서 전체적으로 보다는 손상부위에 국소적으로 제공하는 것이 좋다. 이식으로 CNTFR을 이용하는 것도 적절하다.

특정상태에서는 CNTF반응성을 증가시키는 것도 유익하다. 이와 같은 증상으로 고통받는 환자에 CNTFR 의 수 또는 결합친화력을 증가시키는 것이 유익하다. 이것은 유전자 요법에 의해 가능하다. 적절한 세포에서, 재조합 CNTFR 의 선택적 발현은 조직특이성 또는 유도성 프로모터에 의해 제어받는 유전자를 이용하거나 또는 재조합 CNTFR 유전자를 가지는 복제결핍바이러스로 감염에 의해 만들어질 수 있다. CNTF에 민감성의 증가로 이익을 보는 상태는 근위측 측면 경화증, 웨르디그-호프만질환, 만성 말초척수 근육위축과 포스트-포일오 증후군등이 포함되거나 이에 한정하지는 않는다. 이와같은 치료는 당뇨병, 파킨슨질환, 알즈헤이머 질환과 헌팅론 질환과 연관된 신경성 질환의 치료에 이용된다.

본 발명은 특이조직의 질환치료 또는 CNTF의 주사에 의해 세포-타입을 제공하는데, 조직 또는 세포-타입은 CNTF수용체를 발현함으로써 확인할 수 있다. 구체예에서 CNTFR 유전자가 근육세포에서 발현되고 CNTF는 신경제거 근위측과 연관된 근육 증량과 마이오파이브라 단백질의 손실을 방지한다. 따라서 본 발명은 신경근육과 연관된 질환 또는 근육세포질환의 치료방법을 제공하는데 다음과 같은 치료가 필요한 환자에 주사함으로써 구성된다. I) 발현될 CNTFR 또는 기능적으로 활성부분 또는 유도체를 인코드하는 핵산서열로 구성된 핵산분자, 또는 ii) CNTF또는 기능적으로 할성부위 또는 유도체가 된다. 이러한 질환은 근육의 위축 또는 발육이상 변화등으로 기본적으로 병의 원인이 되는 것이된다. 예로써, 근육위축은 신경외상으로 인한 신경제거(신경과 근육접촉의 손실)로 인한 것인데 : 외부 독소 또는 약물에 의한 퇴행성, 대사적 또는 염증성(글리안-바래 증후군)측면 신경질환 또는 신경손상이 된다. 구체예에서 신경위축은 운동신경 질환으로 인한 신경제거에서 오는 것이다. 이러한 운동신경질환은 성상 운동신경질환이 되는데 근위축 측면 경화증(ALS 또는 Lou Gehrig 질환), 유아의 청년 척수근육위축증과 멀티포컬 컨덕션 블록으로 인한 자가면역 운동신경증등이 포함된다. 또다른 구체예에서, 만성부위로 근위축증이 발생된다. 이러한 무위위축은 발작, 척수손상, 뇌손상, 또는 다른 증추 신경계손상으로 인한 마비와 외상(골절, 삠, 탈골)또는 장시간 휴식으로 인한 골근육 마비등이 되나 이에 한정하지는 않는다. 또다른 구체예에서 암악태질, 만성질환 단식 또는 횡문근종, 흉선과 당뇨와 같은 내분비질환 등의 영양결핍 및 대사상의 스트레스로 근위축이 온다. 근위축은 듀켄, 베커, 근경직, 피스코스카풀로휴메랄, 에머리-드레이푸스, 눈인두, 견갑골-상완, 지대, 콘제니탈 타입과 헤레디토리근병과 같은 발육이상으로 인한 수도 있다. 또다른 구체예에서 근위축은 선천성 근병으로 인한 것인데 비나인 콘제니탈 하이포토니아 센트랄 코어질환, 네말린근병, 마이오류브랄 근병등이 포함되나 이에 한정하지는 않는다. 또한 CNTFR 인코팅 핵산 또는 CNTFR 인코딩 핵산 또는 CNTF와 이것이 활성단편 또는 유도체는 후천성 근병의 치료에 사용된다. 근육, 다근염과 피부염을 포함하는 염증으로 근병이 발생한다. 독성근병은 클로퀸, 클로로파이브레이트, 콜히친, 독소루비신, 에탄올, 하이드록시클로로퀸, 올가노포스페이트, 페리헥실린과 빈크리스틴등이 포함된 약물에 의한 것이나 이에 한정하지는 않는다.

또한 본 발명의 구체예에서 과다의 CNTFR, CNTF의 과민성, 과다 CNTF로 고통받는 환자는 CNTFR 유전자 코딩부분에 상응하는 항-센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드 또는 항-센스 RNA 효과량을 주입함으로써 CNTFR 의 발현이 감소되어 치료한다.

6. 실시예 : CNTFR 의 발현클로딩

6.1. 재료와 방법

6.1.1. CNTFR 발현라이브러리 구조

SH-SY5Y 세포는 pCMX 발현 벡터(미국특허 07/678,408)와 pCDM8 벡터 유도체를 이용하여 cDNA 라이브러리의 제조에서 mRNA 원료로써 이용된다. cDNA 라이브러리의 삽입체는 1kb 이상 크기는 아가로스 젤에서 선택한다.

6.1.2. “ 패닝”방법

Seed 와 Aruffo 에 의해 개발된 “패닝”방법은 다음과 같이 변형된다 : 수용체를 인지하는 항체로 세포를 배양하는 대신데, 30분간 얼음에서 CNTF/myc(1μg/m1)으로 일차세포를 배양하고, 초과 리간드를 제거하기 위해 PBS/2% 피콜을 통해 회전시키고, 얼음에서 30분간 Oncogene Sciences, Menhasset에서 수독된 PEIO 항체로 배양된다. 또다시 PBS/2% 피콜로 회전시킨후 시그마에서 수득한 항-myc 펩티드 쥐 단클 항체로 피복된 플레이트에서 “패닝”한다. 플레이트는 다음과 같이 준비한다 : 박테리오라지칼 60㎜ 플레이트(팔콘 1007 또는 등가) 또는 피숴 8-757-12 와 같은 10cm 접시에 항-myc 쥐 단클론항체를 피복하고 ph 9.5 50mM트리스-염산 10㎎/㎖ 으로 희석한다. 6cm 접시에 피복될 3㎖ 항체 또는 10cm 접시에는 10㎖ 항체를 사용하여 약 105시간동안 플레이트에 항체를 노출시키고 다음 접시에서 항체를 제거하고, 1.5 시간동안 방치한후, 제3 접시로 옮긴다. 플레이트는 0,15M 염화나트륨으로 세척하고 PBS에서 3㎖ 1㎎/㎖ BSA 로 24시간 배양한다. 특히 “패닝”은 다음과 같이 실시 한다. 세포를 100㎜ 배양접시에 배양한다. 각 배양접시에서 배지를 흡출하고 2㎖ PBS/0.5mMEDTA/0.02% 아지드를 첨가하고 혼합물을 30분간 37℃에서 배양하여 배양접시에 세포를 떼어낸다. 세포는 짧은 파스테르 피펫으로 활발히 저작하고, 각 배양접시에 세포를 수득하여 원심분리 튜브에 넣고 2.5(200xg) 세팅하여 4분간 회전시킨다. 세포는 0.5-1.0㎖ PBS/EDTA/아지드/5% FBS 로 재현탁시켜 얼음에서 30분간 CNTF/myc FH 배양한다. 동량의 PBS/EDTA/아지드를 첨가하고, 조심스럽게 3㎖ PBS/EDTA/아지드/2% 피콜층을 만든 후 2.5에서 4분간 스핀한 후 상층액은 흡출한다. 세포는 30분간 PE10 항체로 얼음에서 배양시키고, PBS/EDTA/아지드에 넣고 3㎖ PBS/EDTA/아지드/5%FBS를 포함하는 항-myc 쥐단클론 항체피복된 배양접시에 첨가한다. 세포는 2종 60㎜ 접시에서 일종 60㎜ 항체로 첨가되고 실온에서 1-3시간 방치한다. 접시에 흡착되지 않는 초과세포는 PBS/5% 혈청 또는 배지(3㎖ 로 2 내지 3회)로 부드럽게 세척해낸다.

6.1.3. CNTFR을 포함하는 클론의 확인

표준과정에 따라 DEAE/클로로퀸을 사용하여 발현 라이브러리에서 플라스미드 NDA를 COSM5 세포로 감염시킨다(100㎜ 접시당 250-500㎎) 감염 2일 후 세포를 접시에서 떼어내고, 상기 설명한 ARUFFO/SEED 패닝 과정을 실시한다.

플레이트에서 비흡착된 세포를 세척한 후에 Hirt 상층액(1967, J. Mol. Biol. 26 : 365-369)을 준비하여 10-20㎍ tRNA 존재하에 플라스미드 DNA를 침전시킨다. 생성된 DNA를 일렉트로포레이션으로 DH108 박테리아(Electromax, BRL)에 도입한다. 일렉트로포레이트된 박테리아의 배양물은 트랜스펙션과 패닝에 사용될 플라스미드 DNA를 만드는데 사용될 수 있다; 이 플라스미드 DNA로 감염된 COS 세포의 플레이트는 간접-이오디네이트 항체 결합 검사에 의해 CNTFR을 발현하는 COS 세포의 수를 나타낸다. 감염체의 패닝/플라스미드 DNA 분리/일렉트로포레이션을 끝낸 후, 일렉트로포레이션에서 생성된 박테리아 형질전환체를 암피실린 플레이트에 도달한다. 각각의 박테리아 콜로니를 수득한 각 콜론에서 준비된 플라스미드 DNA는 검사를 위해 COS 세포로 각각 감염시킨다. 15 플라스미드중 14개가 감염된 COS 세포에서 CNTF결합부위를 발현하였는데 이 검사는 간접 항체 결합검사와 FACS 분석에 의해 알 수 있다.

6.1.4.¹²⁵I-hCNTF결합검사

라이브러리, 농축 라이브러리, 각각 클론에서의 플라스미드 DNA로 COS 세포를 감염시킨다. 48시간 후, 배지를 제거하고 결합 완충액(RPMZ, , 1640, 10% FBS, 0.1% NaN3) 0.25㎖ 로 대체하는데, 여기에는¹²⁵I-hCNTF또는 라벨 안된 hCNTF가 포함되어 있다.¹²⁵I-hCNTF로 실온에서 60분간 배양한다. 배양이 완전히 종료된 후,¹²⁵I-hCNTF용액을 제거하고 세포는 결합완충액 1.0㎖ 로 3회 세척후, 0.1N 수산화나트륨 0.25㎖ 로 용해시킨다. 용융물을 12×75㎜ 폴리스티렌 튜브에 넣고, 감마카운터에 둔다. 비특이적 결합은 적어도 100배의 라벨 안된 hCNTF첨가에 의해 정량된다. 마지막으로 플레이트를 세척하여 자가방사시킨다.

6.1.5. FACS 분석

감염된 COS 세포는 연속적으로 CNTF/myc, Pe10항체, FITC-라벨된 염소항-쥐항체로 배양시킨다. 그 다음 세포를 배양접시에서 떼어내어 FACS 분석을 한다. 양성과 음성 플라스미드의 감염결과가 제10도에 나타나 있다. 플라스미드를 포함하는 CNTER로 감염된 COS 세포에는 다량의 증가된 형광을 발하는 소집단을 가지고 있다.

6.1.6. hCNTF의 요오드 반응

10㎍ hCNTF(560㎍/㎖ 10mM NaPO₄pH7.4)를 20℃에서 15분간 락토퍼옥시다제 6ng/㎕을 이용하여 1mCi¹²⁵INa로 배양한다. 15분 후에 반응을 0.1M 염화나트륨 0.1% BSA와 0.1% 사이토크롬 C, 0.3% HOAc, 0.05% 페놀레드와 0.02% NaN₃을 포함하는 완충액 동량으로 종료시킨다. TCA 침전카운트에서 정량할 수 있다. 나머지는 0.05M NaPO₄, 0.1M 염화나트륨, 0.5ng/㎖ 프로타민설패이트와 1ng/㎖ BSA로 등가시킨 바이오레드 PD-10 바이오겔 컬럼에 넣고 프렉션을 수득하여 TCA 침전카운트로 정량한다.

6.1.7. CNTFR 서열화

교재에 따라 다이디옥시 2중가닥 DNA를 사용하여 서열화를 실시한다.

6.1.8. 간접¹²⁵I-염소 항-쥐 항체 결합검사

라이브러리, 농축 라이브러리 또는 개별 클론에서의 플라스미드 DNA를 COS 세포에 감염시킨다. 48시간 후 세포는 다음의 성분을 포함하는 PBS(Ca, ㎎) 15% FBS로 30분간 배양한다.

1) 1㎍/㎖ CNTF-myc

2) 10㎍/㎖ PE10

3)¹²⁵I 염소 항-쥐 항체(GaM) (0.5-1 μCi/㎖ )

세포는 각 단계마다 3×5 분씩 PBS/5% FBS로 세척한다. 최종세척후에 플레이트는 자가방사시킨다.

각 클론후, 총 결합된 자가방사활성의 양은 핸드-헬드 감마카운터로 알 수 있다.

6.2. 결과와 토론

6.2.1. 제한효소분석

제한효소 분석에서 14개 양성클론을 4그룹으로 나눈다.

a) I2=I7(2kb)

b) I1=I5=I6(2kb)

c) I4=I8=I9=I11=I14=I15(4kb)

d) I10=I12=I13(1.6kb)

(I3은 음성,

각 집단에서는 효소 PstI으로 절단에서 동일한 밴드 패턴이 나타난다. 제한효소 분석에서 4가지 집단의 클론이 겹치고, 예비, 서열 자료는 5´ 단부에서 겹치는 서열을 공유함을 확인할 수 있다. (b) 집단은 진핵 프로모터에 대해 벡터에서 잘못된 방향으로 삽입됨을 알 수 있다. 표 1에서 본 것과 같이, 이들 클론은 다른 클론에 대해 낮은 발현을 한다. 이들 클론에서의 전사는 벡터의 폴리링커의 아래부위의 약한 미지의 프로모터에서 발생한다.

6.2.2. 시험관에서의 전사와 해독

4가지 클론의 부류를 코드하는 단백질을 특징화하기 위해 벡터의 폴리링커의 5´ 부위에서 T7 프로모터에서 모두 전사된다. 시험관내의 해독후에 생성물은 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동한다. (a) 그룹은 T7 프로모터에 대해 잘못된 방향이기 때문에 단백질을 생성하지 않는다. 다른 세가지 집단은 모두 동일한 크기의 단백질을 생산하므로 이들은 동일한 단백질을 인코드함을 증명하는 것이다.

[표 1]

6.2.3. CNTF의 결합분석

제1(b)도와 1(c)도 및 표 1에 나타낸 것은 9E10 항 myc 항체와¹²⁵I 염소 항-쥐항체를 이용한 간접 LNTF-myc 결합검사의 결과이다. 제1(b)도에서는 비농축된 라이브러리의 감염에서 얻은 것이 표의 좌측이고 표의 우측은 동량의 DNA를 패닝한 후 얻어진 플라스미드 DNA의 감염을 나타낸 것이다. 우측에서 다수의 검은 점이 보이는데 각각은 자가방사에 의해 감지된 CNTF-myc 결합부위를 발현하는 단일 COS 세포를 나타낸다.

6.2.1에 나타난 각각의 양성 클론에서 헨드-헬드 감마 카운터로 총방사능을 측정한다. 각 클론 I1-I15의 검사결과가 표 1에 나타나 있고 이 표에서 보면 15개 클론 중 14개 클론이 간접 항체 결합검사에 나타난 것과 같이 CNTF결합부위를 발현시킨다. 또한, 각 클론의 몇몇 단편을 자가방사한 것이 제1(c)도에 나타내었다.

제1(d)도에 나타난 것과 같이 간접 결합의 2차 설명에서는 CNTF-myc와 차례로 9E10 항체 FITC-라벨된 염소항-쥐항체, FITC 라벨된 염소항-쥐항체, FACS 분석을 한다. 양성클론으로 감염된 COS 세포는 음성클론으로 감염된 세포와 비교하면 CNTFR의 발현에서 약 100배 증가됨을 설명한다.

표 2에 나타낸 것과 같이 CNTFR을 이용해서 얻어진 간접결과 자료는 직접¹²⁵I-GNTF 결합으로 증명하였다. 감염된 COS 세포에서 발현되는 수용체는 특별히 이오딘화된 CNTF에 결합하고 그 다음 CNTF-myc 리간드와 결합하여 CNTFR에서의 SH-SY5Y 세포는 클론되었다. 각 감염된 COS 세포는 SH-SY5Y 세포보다는 세포당 수용체가 약 30배 많이 발현된다.

[표 2]

단층결합검사는 3×10⁵SH-SY5Y 세포/웰 또는 6.5×10⁴COS 세포/웰을 이용하여 24웰 배양 플레이트에서 실시한다. 특히 CPM 결합은 지정한 농도에서¹²⁵I-CNTF의 1000배 초과함에 CPM 결합을 가감함으로써 계산할 수 있다. 비특이적 결합은 감염 안된 COS 세포에서 감지할 수 있다.

COS 세포는 일반적으로 20-40% 세포가 감염된 후 48시간 뒤에 검사하였다. 20% COS 세포가 감염되었다고 추정하면 특히 CPM 결합은 각 감염된 COS 세포는 SH-SY5Y 세포보다 세포당 30배 이상의 수용체를 발현하는 것을 나타낸다.

6.2.4. CNTFR의 서열과 다른 CNTFR과의 유사성

다른 수용체와 CNTFR은 공유되는 모티프가 있다. CNTFR의 세포의 부분에는 N-단부에 “이뮤노글로블린”이 있고 짧은 힌지부위에 의해 “이뮤노글로블린”과는 다른 “사이토킨 수용체” 도메인이 별도로 있다. 많은 수용체는 “이뮤노글로블린” 또는 “사이토킨수용체” 도메인과 유사한데(제3도), 단 한가지-IL-6수용체-는 CNTFR과 이들 도메인의 동일한 특성 배열을 공유한다(제3도와 제4도). IL-6 수용체는 CNTFR과 가장 연관된 단백질이다(제4도). 흥미로운 것은 IL-6 수용체가 CNTFR과 유사한데, 이는 IL-6 결합의 개시에 필요하지 않은 매우 짧은 세포질내 도메인을 가지고 있기 때문이다(Hibi et al., 1990. ceu. 63 : 1149-1157). CNTFR의 클로닝에서 다른 공지된 수용체에서는 발견되지 않은 IL-6 수용체의 중요한 특성을 공유하며 새로운 수용체 집단으로 분류한다. IL-6R과 CNTFR 사이의 유사성은 CNTFR이 IL-6 수용체 또는 연관 분자와 같이 동일한 시그날 변환체를 이용한다는 것이다. 마지막으로, CNTFR 관련된 수용체의 확인은 이들 수용체에 결합할 수 있는 신규한 리간드의 확인에 도움이 된다.

7. 실시예 : CNTFR의 메시지의 조직분포

7.1. 재료와 방법

7.1.1. CNTFR 프로브 준비

hCNTFR의 코딩 부위를 pCMX 발현 벡터내로 클로닝시키는 것은 미국특허출원 “포유류 발현벡터”에서 설명하고 최종 생성된 발현벡터는 제6도에 나타내었다. CNTFR 서열의 염기 889에서 1230까지의 PCR 프로브를 합성하여 노던분석의 프로브로 이용한다.

7.1.2. RNA 준비와 노던블랏

Sprague-Dewley 쥐에서 선택한 조직을 절단해내고 즉시 액체질소에서 냉각시킨다. Bothwell 1990(Methods of Cloning and Analysis of Enkaryotic Genes Boston, MS. Jones and BartleH)에서 상술한 것과 같이 3M Licl, 6M 우레아에서 조직을 균질화하여 RNA를 분리해낸다. RNA(10㎍)은 1% 아가로스-폴리아미드겔을 통해 전기영동시켜 분리하고 pH7 10xSSC로 미세튜브로 나일론 막에 옮긴다(MagnaGraph, Micron Separation Inc). RNA는 UV로 노출시켜 막에서 UV- 연결된 것이 된다(Stratalinker, Stratagen). 0.5M NaPO₄(pH7), 1% BSA(FractionV, Sigma) 7% SDS, 1mM BDTA(Mahmoudi 1989, Biotechniques, 7 : 331-333), 100㎍/㎖ 음파파쇄된, 변성된 연어 정액 DNA 존재하에서, 방사능 라벨된 프로브로 68℃에서 하이브라드시킨다. 필터는 68℃에서 0.1% SDS, 3KSSC로 세척하고 1시간 자가방사한 후, 70℃에서 하나 또는 두 개의 스크린(Cronex, DuPont), X-레이 필름(SAR-5, Kodak)으로 현상한다. 겔을 메티디움 브로마이드로 착색하면 상이한 시료에서의 총 RNA량을 검사할 수 있다(Maisonpierre et al., 1990, Science 247 : 1446-1451)

7. 2. 결과

제5도에서와 같이, 좌골신경, 아드레날린과 근육에서는 매우 낮은 량이, 중추신경계의 조직에서는 감지할 정도의 CNTFR mRNA를 감지할 수 있다. 이것으로 CNTF는 향신경성 활성과 근병활성을 가지는 것으로 설명되고 특정 질환의 중추신경계와 근육에서 관련하는 것으로 설명할 수 있는데, 환자가 정신적인 퇴화성으로 고통받는 듀치니스 근이상 발육과 선천성 근병 이상발육 등이 된다. 근육에서의 CNTFR 발현은, 근육생리학에 CNTF가 중요한 역할을 하고 있음을 나타내는 것이다. 따라서, 뉴우런의 작용에 첨가하여 CNTF는 근육에서 향근제의 기능을 하고 또는 근육의 발생 또는 분화에 영향을 끼친다.

[실시예 8] CNTF수용체는 GPI 연결에 의해 세포표면에 연결되어 있다는 증거.

8.1. 재료와 방법

SH-SY5Y세포는 10% 비활성 fbs를 첨가한 RPMI배지로 24-웰 플레이트(Falcon)에서 배양하였다. CNTF-결합전에 포스포리파제(와 콘트롤) 처리를 하여 배지는 흡출시키고 세포는 PBS(+Ca/Mg)로 2회 세척한 후, 최종 농도가 500mU/PLC) 유무에 관계없는 PBS(+Ca/Mg)로 45분간 37℃에서 배양한다. 세포는 결합완충액(PBS+Ca/Mg)와 (5% fbs)으로 3회 세척한 후 라벨 안된 CNTF(약 100피코몰)을 포함하는 결합 완충액 250㎕에서 30분간 실온으로 배양시킨다. PI-PLC 처리 전에 이오딘화된 CNTF를 결합시키는 실험에서 세포는 우선 초과량의 라벨 안된 CNTF유혹은 무상배에서 37℃에서 45분간 CNTF포함된 결합완충액으로 배양한다. 세포는 PBS(+Ca/Mg)로 3회 세척하고 PI-PLC(최종 농도500mU/㎖ )가 보충된(또는 안된) PBS(+Ca/Mg)로 45분간 배양한 다음 세포를 결합완충액으로 세척한다. 모든 경우에 있어서, 세포는 0.1N 수산화나트륨에서 카운터 하기전에 용해시킨다음 카운터한다.

8.2. 결과와 토의

CNTF수용체 서열은 소수성 부분내에서 코드된 단백질이 종료되어 그 다음 추가분의 세포질 도메인이 따르는 것을 볼 수 있다. 이 구조는, 막통과 도메인이 결핍되고 GPI-연결을 통한 세포 표면에 부착된 막단백질에는 C-말단부가 있음을 상기할 수 있다(Ferguson and Williams, 1988), 따라서 CNTF수용체가 GPI 연결을 통해 세포면에 연결되어 있는지를 검사하는 실험을 실행한다. 표 3에서 볼 수 있듯이 PI-PLC로 SH-SY5Y 세포가 CNTF에 결합되는 능력을 상실하고, CNTF는 GPI-연결을 통해 세포 표면에 연결되어 있는 것과 일치한다. 그러나, SH-SY5Y 세포에 결합된 CNTF는 PI-PLC 처리로는 해리시킬 수 없다(표 3). 흥미로운 것은 IL-b 수용체의 가용형태는 IL-6 시그날 변환에 요구되는 제2막 단백질(GP 130)과 밀접하게 연결된다. 따라서, CNTF결합전에 CNTF수용체 해리의 방지는 CNTF, 그것의 수용체와 시그날 변환체 사이에 연결로 인한 것이다(GP 130 또는 GP 130 유사체) 또는 CNTF수용체 CNTF수용체의 구조를 변형시켜 PI-PLC에 다소 민감성이 떨어지게 한다(몇몇 GPI-연결된 단백질은 PI-PLC 저항성 형을 가진다).

GPI-연결에 의한 세포 표면에 부착된 GPI 수용체를 발견한 것이 중요한 분지점이 된다. 이와 같은 방식으로 막에 연결된 제1공지된 성장인자 수용체는 GPI-연결임을 나타낸다. 몇몇 단백질이 GPI 연결형과 통상적인 막통과 도메인형을 가지고 있기 때문에 CNTF수용체는 IL-6 수용체가 GPI-연결형을 가진 것과 비슷하게 막통과 도메인을 인코드하는 또다른 C-단부를 가질 가능성을 발견한다. 성장인자 수용체의 GPI 연결형은 수용체 제어와 배출의 신규한 기작에 이용될 수 있다. 예로서 표면수용체의 내림조절은 추가의 세포질 포스포리파제 활성을 활성화시켜 GPI-연결 수용체를 해리함으로써 신속히 발생한다. 이들 해리된 수용체는 가용성 IL-6 수용체가 IL-6에 결합되어 GPI 30을 발현하는 세포를 활성화시키는 방식으로 CNTF에 결합했을 때 또는 단독일 경우에 다른 세포에서도 활동을 할 수 있다.

CNTF활성을 차단시킬 수 있는 PI-PLC를 이용한 CNTF수용체의 해리는 매우 중요한 의미를 가진다. 클론된 CNTF수용체로 인해 CNTF의 효과를 관찰할 수 있다. 치료요법적으로, PI-PLC는 CNTF수용체를 해리하는데 사용되고 CNTF활성이 결정적인 경우엔 CNTF활성을 차단하는데 사용할 수도 있다.

CNTF수용체의 PI-PLC 해리로 CNTF차단성이 CNTF, 그것의 수용체와 시그날 변환 단백질 사이에 3차 복합체를 형성하기 때문이라면 이 수용체의 모양은 분자적으로 변환분자를 확인하고 클론하는데 사용할 수도 있다.

[표 3]

9. 생체내에서 신경제거한 쥐 골근육에서의 CNTF효과

여기에서 실시하는 실험의 목적은 생체내에서 신경제거한 골근육에서 정제된 재조합 CNTF의 효과를 검사하고 CNTF가 근중압과 근섬유 단백질 손실과 같은 근위축과 연관된 표면적인 변화를 방지할 수 있는지를 결정하는 실험이다. CNTF수용체가 골근육의 근원세포와 근튜브에서 발현함을 알았고, CNTF는 근중압과 신경위축과 연관된 근섬유 단백질 함량의 손실을 방지한다.

9.1. 골근육의 마이오튜브와 근원세포에서 CNTFR이 발현된다.

제5도에 나타난 CNTF의 일차 세포표식을 확인하기 위하여 다양한 쥐조직에서 유도한 RNA 시료로 노던 블랏분석을 실행한다. 사람 CNTFR 코딩부위에서 유도된 프로브로 중추신경계에 일반적으로 제한되게 발현하는 2kb 전자체를 확인하는데 이 때 골근육에서는 상당히 높은량이, 부신과 좌골신경에서는 상당히 낮은 량이 있다.

골근육에 특히 CNTFR 발현 분석은 특이한 쥐근육, 정제된 사람근육 마이오튜브, 쥐의 몇가지 골근육세포주에서 준비한 mRNA를 이용하여 노던 블랏링으로 실행하였다(제7도). CNTFR의 사람 프로브를 이용하여 몇가지 근육 RNA 시료에서 두 종의 mRNA(2.0과 1.7kb)를 감지하였다. 제7도에서는 CNTF수용체는 마우스(라인1과 2) 또는 쥐(라인 3과 4)의 마이오튜브와 근원세포 근육세포주에서 동시에 발현하고 쥐의 적색의 느린 연축 술와근 근육과 흰색, 빠른-연축 EDL근육에서도 발현한다(각각 라인5와 6). CNTFR mRNA량이 술와근(라인12)와 EDL 근육(라인14)에서 증가하는데 이들은 72시간 동안 허위 작동된 콘트롤(라인11과 13)에 관계하여 일차로 신경제거된 것이다. 가장 높은 발현되는 사람의 태아 골근육에서 유도된 마이오튜브의 RNA 시료에서 관찰되었다. 마이오튜브를 배양하여 섬유아세포로부터 정제하고 RNA 분리전에 형광 활성된 세포분류에 의해 비근육세포에서 정제한다(라인8). 두 개의 별도의 CNTFR mRNA종은 근육 세포 노던블랏에서 확인할 수 있고 1.7kb CNTF수용체 메시지는 근원세포 세포주 C2C12mb에서 적절히 발현되고(라인1) 수용체에서 절단된 형으로 나타낼 수도 있다.

9.2. CNTF는 근위축과 연관된 근육압박과 근성뮤 단백질 함량의 손실을 방지한다.

9.2.1. 신경제어술

본 연구에서 사용된 다양한 동물집단을 표 4에서 나타내었다. 일반적으로 세 동물이 단일 집단으로 구성된다. 모든 실험집단에서 우측후자의 피부에서 약 20cm를 절단한 다음 외과적 과정에서 절단된 20cm은 허위-수술을 실행하기 위해 좌측-후지에서 절단된다.

동물집단 2-6에서 우측후지의 슬와근은 말초신경 32 내지 35㎜를 남겨두고 중간부분에서 우측 좌골신경 2-5㎜를 떼어내는 외과술로 신경을 제거하였다(제8도의 a). 허위-수술에서는 콘트롤로 사용한 좌측 슬와근은 동일한 근육에서 술와근육의 신경 분포점에서 좌골신경 32-35㎜를 부드럽게 당김으로써 실시할 수 있다. 모든 외과술은 동물을 가벼운 클로로-펜타바르비롤 마취하에서 실시한다(0.3g/㎏). 동물집단 1(콘트롤)에서는 아무런 신경제거를 하지 않고 주사도 하지 않으며, 모든 동물은 100 내지 150g이 된다.

9.2.2. 치료

동물집단 1과 2는 치료하지 않았다. 동물집단 4는 1㎎/㎖ BSA를 포함하는 PBS(PBS/BSA)를 4일간 매일 근육내로 주사한다. 동물양쪽에 근육중앙부에 여러번 주입한다. 4집단 동물은 4일간 매일 1㎎/㎖ BSA를 포함하는 재조합 쥐CNTF(1㎎/㎏)를 주입한다. 전술한 것과 같이 동물의 양면에서 여러회 주입한다. 5집단에서의 동물은 매일 피하로 rCNTF/BSA를 주입한다. 6집단에서의 동물은 PBS/BSA를 매일 피하내로 주사한다.

[표 4]

9.2.3. 근육무게와 단백질 분석

외과적으로 신경을 제거 후 92시간 뒤 동물의 목을 잘라 죽이고 슬와근을 힘줄에서 떼어낸다. 슬와근을 얼음위에 저울에 얹고 힘줄은 제거하고 더 이상의 건조를 막기위해 근육을 즉시 무게를 단다. 근섬유 단백질 균질물을 만들기 위해 절단된 슬와근을 모으고 냉동실에서 잘게 썬다. 0.32M 슈크로스와 3mM MgC_l2를 포함하는 PBs로 균질화시킨다(2.5% w/v). 균질물은 약 800xg에서 원심분리하고 상층액은 Bio-Rad Dye 결합과정을 이용하여 근육당 총 근섬유 단백질을 검사한다.

제9도에서는 신경제거된 슬와근이 96시간째에서 약 25% 습윤중량에서 상당히 감소됨을 설명하였다(p<0.01).

PBS/BSA의 매울주입은 신경제거에 연관된 근육중량 손실에 별 효과가 없는 것이다. 그러나 CNTF(1㎎/㎏)BSA를 매일 쥐의 신경제거된 슬와근에 주입하면 허위 수술 콘트롤보다 약 5% 가벼워진다. 신경제거처리된 CNTF의 습윤 중량과 허위수술된 슬와근은 수술 안된 콘트롤에서 상당히 다르지 않다. 매일 4시간 피하내로 주입된 CNTF는 신경제거 유도된 근섬유 단백질 손실을 방지하고 근육의 근중량에서 단백질 손실과 병행된다(표 5). 근육내로 주입할 때 총 근섬유 단백질에서 CNTF의 효과가 낮은 것으로 보인다.

[표 5]

CNTF수용체는 골근육에서 마이오튜브와 근원세포에서 발현되고 CNTF는 신경위축과 연관된 근중량 손실과 근섬유 단백질의 손실을 방지할 수 있다.

10. 미생물 기탁

다음의 기탁은 1991년 3월 26일 NRRL(1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604)에서 실행된 것이다.

플라스미드 pCMX-hCNTFR(I2)를 가지는 대장균은 hCNTFR 인코딩 서열로 구성된 플라스미드를 발현하고 기탁번호는 NRRL B-18789이다.

각종 참고문헌이 본 명세서에 첨부되어 있다.

본 발명은 본 발명의 설명을 위한 실시예 또는 기탁물에만 한정하는 것이 아니라 본 발명의 영역에 속하는 범위 내에서의 기능적으로 등가의 변화등이 포함된다. 또한 본 발명의 다양한 변화와 첨부된 청구범위 내에서 본 기술분야에 숙지된 자에게 이해 가능한 변형이 속함을 알 수 있다.

Claims

제2도(SEQ ID NO:1)에 도시된 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 정제되고 분리된 핵산분자.
제2도(SEQ ID NO:1)에 도시된 아미노산 서열을 가진 단백질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 순수한 정제된 핵산분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 발현을 제어할 수 있는 제어 유전자의 핵산 서열이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제1항, 2항 또는 3항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자가 도입된 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
제2도(SEQ ID NO:1)에 도시된 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 순수 분리 단백질.
제2도(SEQ ID NO:1)에 나타난 핵산 서열을 가지는 재조합 핵산분자를 포함하는 세포에 있어서, 이때 세포는 포유류 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 이스트 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
제1항에 따르는 핵산분자를 인코드하는 재조합 CNTF수용체 단백질을 발현시키는 세포에 있어서, 이때 세포는 포유류 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 이스트 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
제2항에 따르는 핵산분자를 인코드하는 재조합 CNTF수용체 단백질을 발현시키는 세포에 있어서, 이때 세포는 포유류 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 이스트 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
CNTF수용체를 인코드하는 재조합 핵산을 포함하는 세포에 있어서, 이 때 세포는 포유류 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 이스트 세포에서 선택되고, CNTF을 인코드하는 재조합 핵산을 가지지 않는 동일한 세포 형보다 상대적으로 많은 CNTFR을 세포 표면에 발현시키는 것을 특징으로 하는 세포.
제1항 또는 2항에 따르는 핵산 서열분자에 상보적인 것을 특징으로 하는 순수한 핵산분자.
NRRL에 기탁되어 수탁번호가 B-18789인 플라스미드 pCMX-hCNTFR에 CNTF수용체 핵산 서열이 포함된 것을 특징으로 하는 핵산.