KR100227040B1

KR100227040B1 - 토양에서 분리한 바실러스 속 gm44 균주 및 그로부터 분리된 키토산아제

Info

Publication number: KR100227040B1
Application number: KR1019970047237A
Authority: KR
Inventors: 최연진; 김영수; 신용철
Original assignee: 양재정; 두성식품주식회사
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1997-09-12
Publication date: 1999-10-15
Anticipated expiration: 2017-09-12
Also published as: KR19990025566A

Abstract

본 발명은 토양에서 분리한 신규의 바실러스 속 GM44 균주, 전기 균주로부터 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있는 키토산아제의 제조방법 및 그로 부터 분리된 키토산아제에 관한 것이다. 경남 및 전남 지역의 토양에서 분리한 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있는 바실러스 속(Bacillus sp) GM44(KCTC 0377BP)를 LB 액체배지에 접종한 다음 진탕배양하여 접종용 배양액을 수득하고, MS배지에서 대량으로 배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 농축한 다음 세척하여, 이온교환크로마토그래피 및 겔여과 크로마토그래피를 수행하고, 탈이온화수로 투석하여 키토산아제를 제조한다. 본 발명의 균주로부터 제조된 키토산아제는 효소의 생산수율도 높고, 제조된 효소의 비활성도도 높으며, 30 내지 99% 범위의 탈아세틸화도를 가진 키토산에 대하여 높은 활성을 나타내고 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있다.

Description

토양에서 분리한 바실러스 속(Bacillus sp.) GM44 균주 및 그로부터 분리된 키토산아제(chitosanase)

본 발명은 토양에서 분리한 바실러스 속(Bacillus sp.) GM44 균주 및 전기 균주로부터 분리한 키토산(chitosan)올리고당의 제조에 유용한 키토산아제(chitosanase)에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 본 발명은 토양에서 분리한 신규의 바실러스 속 GM 44 균주, 전기 균주로부터 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있는 키토산아제의 제조방법 및 그로부터 분리된 키토산아제에 관한 것이다.

키토산은 D-글루코사민이 β-1, 4결합으로 연결된 다당류로서 일반적으로 키틴(chitin)이 탈아세틸화되어 제조된다. 이러한 키토산은 분자량이 수십만 달톤에 이르는 고분자 물질로서 다양한 산업적 분야에 응용될 수 있으나, 점성이 높고 중성이나 알칼리성 물에 녹지 않는 문제가 있어 산업적인 이용이 제한되어 왔다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 키토산을 분해하여 수용성의 키토산 올리고당을 제조하는 방법이 시도되었다. 특히, 6이상의 중합도를 가진 키토산 올리고당의 경우 인체면역성 강화작용, 항암작용 및 항균작용 등이 큰 것으로 알려져, 고중합도인 키토산 올리고당의 제조가 필요하게 되었다.

키토산을 분해하여 수용성 키토산 올리고당을 제조하는 방법으로는 산분해법과 효소분해법이 알려져 있다. 산분해법을 이용한 키토산 올리고당의 제조방법은 간단한 방법이기는 하지만, 키토산의 분해 결과 단당 및 이당 등 초저분자를 다량 포함하는 키토산 올리고당이 제조되어지며 이러한 초저분자 키토산 올리고당은 인체면역성 강화작용, 항암작용 및 항균작용 등이 미약하다는 문제가 있었다. 반면에, 효소분해법을 이용한 키토산 올리고당의 제조방법은 사용하는 효소에 따라서 다양한 중합도를 갖는 키토산 올리고당을 만들 수 있는 장점이 있으나, 효소분해법의 핵심인 분해효소가 충분히 개발되어 있지 않기 때문에 효소의 개발이 필수적인 것으로 대두되었다.

키토산을 분해하는 효소로서는 키토산아제(chitosanase)가 알려져 있으며, 지금까지 키토산아제를 생산하는 미생물로서는 바실러스(Bacillus) R-4(참조 : Y. Tominaga et al., Biochemica et Biophysica Acta, 410:145-155(1975)), 바실러스(Bacillus) 7-M(참조 : 일본공개특허공보 소61-280277호), 바실러스 서큐란즈(Bacillus circulans) LCC-1(참조 : 일본공개 특허공보 소 63-94971호), 바실러스 푸밀루즈(Bacillus pumilus) BN-262(참조:일본공개특허공보 평 2-79972호)등이 알려져 있다. 그러나, 이러한 미생물을 이용하여 키토산아제를 제조하였을 경우 제조 수율이 1.0 내지 5.4U/ml로 낮아 산업적으로 이용하기에 한계가 있었다. 또한, 이들로부터 생산되는 키토산아제를 이용한 키토산 분해물의 경우 2당 및 3당의 함량이 13내지 40%로 높은 반면에 5당, 6당 및 그 이상의 올리고당 함량이 20% 이하에 불과하며, 80%이상의 탈아세틸화도를 가진 키토산은 잘 분해하는 반면에, 그 이하의 탈아세틸화도를 가진 키토산은 잘 분해하지 못한다는 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있는 키토산아제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 토양에서 분리한 신규한 바실러스 속 미생물에서 정제하여 제조한 키토산아제가 고중합도의 키토산 올리고당의 제조에 적합함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 신규한 키토산아제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 키토산아제를 생산하는 토양에서 분리한 신규의 바실러스 속(Bacillus sp.) GM 44균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 전기 균주로부터 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있는 키토산아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

제1도는 pH변화에 따른 본 발명의 키토산아제의 상대 활성도를 나타낸 그래프이다.

제2도는 pH변화에 따른 본 발명의 키토산아제의 안정성을 상대 활성도로 나타낸 그래프이다.

제3도는 반응온도의 변화에 따른 본 발명의 키토산아제의 상대 활성도를 나타낸 그래프이다.

제4도는 반응온도의 변화에 따른 본 발명의 키토산아제의 안정성을 상대 활성도를 나타낸 그래프이다.

제5도는 키토산아제의 농도 변화에 따른 키토산아제에 의한 키토산 분해도를 나타낸 그래프이다.

제6도는 반응 시간별로 키토산아제의 작용에 의해 제조되는 키토산 올리고당의 조성을 그래프로서 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

우선, 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있는 균주를 분리하기 위하여, 경남 및 전남 지역의 토양에서 채취한 시료를 멸균증류수에 희석하여 MS배지(0.5%키토산, 0.5% 효모추출물, 0.2% K₂HPO₄, 0.1% KH₂PO₄, 0.07% MgSO_4.7H2O. 0.05% NaCl, 0.05% KCl, 0.01% CaC12)에서 배양하였다. 그런다음 각 균락을 순수분리하여 각 균락별로 키토산아제의 활성을 측정하고 키토산의 분해산물인 올리고당의 조성을 분석하여, 키토산아제의 활성이 높고 고중합도의 올리고당을 생산하는 균주를 선발하였다. 선발된 균주에 대하여 형태학적 생리학적 및 생화학적 특성을 조사한 결과, 종래의 키토산아제 생산 균주들과는 다른 미생물학적 특성을 가진 새로운 균주이며 바실러스(Bacillus)속에 속하는 것으로 밝혀져 바실러스 속(Bacillus sp.) GM44로 명명하고 1997년 9월 2일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0377BP로 기탁하였다.

이하에서는 전술한 바와 같이 분리 및 동정한 균주로부터 고중합도의 키토산아제를 제조하는 방법을 공정별로 나누어 구체적으로 설명하고자 한다.

제1공정 : 바실러스 속 GM 44의 종배양

박토-트립톤 1.0%, 박토-효모추출물 0.5% 및 NaCl 1.0%를 함유하며 pH금이 접종하고 30℃에서 15시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용한다.

제2공정 : 바실러스 속 GM 44의 본배양

전기에서 배양한 종배양액 4내지 6%, 가장 바람직하게는 5%를, 1내지 3% 가장 바람직하게는 2%의 탄소원, 0.5 내지 3.5%의 질소원을 함유한 MS배지(참조: 후술하는 표 1)에 접종하고, 100내지 400, 가장 바람직하게는 400rpm, 25 내지 37℃, 가장 바람직하게는 30℃, 초기 pH 6.8 및 1vvm의 통기조건에서 48내지 72시간 동안 발효시킨다. 이때, 탄소원으로는 글리세롤, 포도당, 글루코사민, 설탕, 가용성 전분 및 키토산을 사용하며 질소원으로는 암모늄클로라이드, 암모늄설페이트, 옥수수 침전물, 폴리펩톤, 펩톤, 트립톤 및 효모추출액을 사용한다.

제3공정 : 바실러스 속 GM 44의 본 배양액으로부터 키토산아제의 제조

전기에서 배양된 본 배양액을 우선 원심분리하여 상등액을 한외여과기(분자량 cut-off : 10,000달톤)을 사용하여 농축하고 10mM 소디움 아세트산 완충용액(pH 5.0)을 사용하여 세척하였다. 이어, 이온교환 크로마토그래피를 수행하여 0내지 0.5M의 NaCl의 직선농도구배로서 용출하여 0.3M NaCl농도에서 키토산아제 분획을 수득하고, 겔여과 크로마토그래피를 수행하여 키토산아제 활성 분획을 수득한 다음, 탈이온화수로 투석하고 동결건조한다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] 미생물의 분리

경남 및 전남지역의 토양에서 채취한 시료 중 약 1g씩을 멸균증류수 10ml에 현탁하여 희석한 다음, MS한천배지(표 1, pH 6.8)에 희석액 100μl를 도말하고 30℃에서 1주일간 정치배양하여, 통상의 방법에 따라 500여종의 균주를 순수분리하였다. 이러한 분리균주를 5ml의 MS액체배지에 접종하고 30℃에서 180rpm으로 진탕하면서 5일간 배양한 다음, 배양액을 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 이어, 상등액의 키토산아제 활성 및 그에 의한 키토산의 분해산물을 분석하였다. 이때, 키토산아제 활성은 키토산 용액으로부터 생성되는 환원당의 양을 디니트로 살리실릭산(dinitrosalicylic acid : DNS)방법(참조 G.L. Miller, Analytical Chemistry, 31:426-428(1959))으로 측정하여 결정하였으며, 상등액의 키토산아제를 이용한 키토산의 분해산물인 올리고당의 조성은 박층크로마토그래피로 분석하였다. 그 결과, 500여종의 분리균주에서 키토산아제를 활성이 높고, 고중합도의 올리고당을 생산하는 균주를 최종 선발하였다. 전기에서 키토산아제 활성 단위(unit : U)는 분당 1μmole의 D-글루코사민을 생산하는 효소의 양으로 정하였다.

[표 1 : 본 발명의 미생물 분리에 사용된 MS 배지의 조성]

[실시예 2] 미생물의 동정

실시예 1에서 분리한 균주의 분류학적 동정을 버지(Bergey)의 방법에 따라 수행하고(참조: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, Springer-Verlag Co.(1974)), 분리균주의 형태학적 생리학적 및 생화학적 특성을 다음의 표 2에 요약하였다. 이 결과에 따르면, 본 발명의 균주는 종래의 키토산아제 생산 균주들과는 다른 미생물학적 특성을 가진 새로운 균주이며 바실러스 속(Bacillus sp.)에 속하는 것으로 밝혀져 바실러스 속(Bacillus sp.) GM44로 명명하고, 1997년 9월 2일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0377BP로 기탁하였다.

[표 2] 본 발명의 바실러스 속 GM 44의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성

[실시예 3] 키토산아제의 제조에 미치는 탄소원의 영향

박토-트립톤 1.0%, 박토-효모추출물 0.5% 및 NaCl 1.0%를 함유하며 pH가 7.0으로 조정된 LB 한천배지에서 배양한 콜로니를 5ml LB액체배지에 한 백금이 접종하고 30℃에서 15시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 배플(baffle)이 장착된 500ml용량의 삼각 플라스크에 MS 액체배지 100ml를 넣고 통상의 방법으로 멸균하여 본배양에 사용하였으며 이때 탄소원으로서 키토산 대신에 여러 가지 탄소원을 0.5%의 농도로 첨가하였다. 100ml본 배양액에 종배양액을 5%(v/v)접종하고 30℃, 180rpm에서 5일간 배양한 다음, 세포상등액을 회수하여 실시예 1의 방법에 따라 키토산아제의 활성을 측정한 결과 표3에 나타낸 바와 같이 바실러스 속 GM44 균주는 탄소원의 종류에 상관없이 키토산아제를 제조하였다. 특히, 포도당 및 가용성 전분을 탄소원으로 사용하는 경우 가장 높은 활성의 효소가 제조되어, 포도당 혹은 가용성 전분의 농도에 따른 키토산아제의 생산 수율을 조사하였으며 표4에 요약한 바와 같이, 2내지 3%의 포도당 가용성 전분 배지에서 가장 높은 효소 활성이 나타났다.

[표 3 : 키토산아제 생산에 미치는 탄소원의 영향]

[표 4 : 키토산아제 생산에 미치는 포도당과 전분 농도의 영향]

[실시예 4] 키토산아제의 제조에 미치는 배양온도의 영향

2%가용성 전분을 탄소원으로 사용한 MS 액체배지를 이용하여 25,30 및 37℃의 세가지 배양온도에서 키토산아제의 생산성을 조사하였으며, 그 결과는 다음의 표5에 요약하였다. 다음의 표에 나타난 바와 같이 30℃에서 배양한 경우 가장 높은 키토산아제 활성이 나타났다.

[표 5 : 키토산아제 생산에 미치는 배양온도의 영향]

[실시예 5] 키토산아제의 제조에 미치는 질소원의 영향

2% 가용성 전분을 탄소원으로 사용한 MS 액체배지에 0.5% 효모추출물 대신, 여러종류의 질소원을 0.5%첨가하여 각 질소원에 따른 키토산아제의 생산성을 조사하였으며 그 결과를 표 6에 요약하였다. 다음의 표 6에 나타난 바와 같이 유기 및 무기 질소원 중에서 폴리펩톤 혹은 효모추출액을 사용하는 경우 각각 14.5U/ml, 13.5U/ml로 높은 효소 생산성을 보였다.

[표 6 : 키토산아제 생산에 미치는 질소원 종류의 영향]

[실시예 6] 발효조에서의 배양시 키토산아제의 생산 수율

LB 한천배지에서 자란 콜로니를 5ml LB배지에 한 백금이 접종하고 30℃에서 15시간 진탕배양한 후 이것을 1차 종배양액으로 사용하였으며, 배플이 있는 500ml 용량의 삼각플라스크에 LB 액체배지 100ml를 넣고 통상의 방법으로 멸균하여 2차 종배양 배지로 사용하였다. 2차 종배양 배지에 1차 종배양액을 1%(v/v)접종하고 30℃, 180rpm조건하에서 3내지 8시간 배양하여 2차 종배양액을 제조하였다. 5리터 교반식 발효조에 2%가용성 전분을 탄소원으로 함유한 MS액체배지 3리터를 넣고 통상의 방법으로 멸균한 다음, 멸균된 발효조에 2차 종배양액을 5% 접종하고 1vvm으로 통기하면서 30℃에서 초기 pH6.8의 조건하에서 3일간 배양하였다. 이때 발효조의 교반속도는 50,100, 200 또는 400rpm으로 조정하였다. 2% 가용성 전분과 0.5%효모추출액이 함유된 MS배지를 사용하는 경우 발효조의 교반속도에 따라 효소 생산성이 매우 민감하게 변화하여 표7에 나타낸 바와 같이 100rpm이하의 교반속도하에서는 15.3 내지 17.8U/ml의 효소가 생산되었으나 200rpm이상의 교반속도하에서는 효소 생산성이 현저히 감소되었다. 그러나 400rpm으로 교반하는 경우에는 2% 가용성 전분과 0.5% 효모추출물이 포함된 MS 배지에 질소원으로서 폴리펩톤을 첨가하면, 효소 생산성을 현저히 증가되어 표8에 나타낸 바와 같이 400rpm의 교반하에서 질소원 폴리펩톤의 농도를 증가시킬수록 효소 생산성이 증가되고 2.5% 폴리펩톤을 첨가하는 경우 최대 45.8U/ml의 효소 생산성이 나타났다. 이러한 질소원의 첨가효과는 효소의 최종 생산성은 달라졌지만, 펩톤, 효모추출물, 트립톤, 옥수수침출물, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트 등 폴리펩톤 이외의 질소원에 대해서도 동일하게 나타났다. 이상의 실험을 통하여 탄소원으로 2%가용성 전분, 질소원으로서 효모추출물 0.5%, 폴리펩톤 2.5%을 함유한 MS배지로 부터 400rpm, 30℃, 초기 pH 6.8, 1vvm의 통기조건 하에서 발효시작 후 48내지 72시간째에 최대 약 46U/ml의 효소를 생산할 수 있었다.

[표 7 : 키토산아제 생산에 미치는 교반속도의 영향]

[표 8 : 키토산아제 생산에 미치는 폴리펩톤의 영향]

[실시예 7] 키토산아제 정제

탄소원로서 2% 가용성 전분, 질소원으로서 효모추출물 0.5% 및 폴리펩톤 2.5%을 함유한 3리터 MS배지를 본배양액으로 사용하고 여기에 실시예 3의 방법에 따라 제조한 종배양액을 5% 접종한 다음, 400rpm, 30℃, 초기 pH 6.8, 1vvm의 통기조건 하에서 60시간 배양하였다. 배양 후 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 배양 상등액 2,900ml를 회수하여 상등액 중의 키토산아제 활성을 실시예 1의 방법에 따라 측정하였으며 이때의 활성은 배양액 ml당 45U로서 총 130,500U였다.

배양 상등액을 한외여과기(분자량 cut-off : 10,000달톤)를 사용하여 300ml로 농축하였고, 계속해서 10mM 소디움 아세트산 완충용액(pH5.0)3리터를 사용하여 3회 세척하였다. 세척 후의 효소 농축액은 30ml였으며 총 효소활성은 91,350U로서 약 70%의 회수율을 보였다. 효소 농축액을 10m M소디움 아세트산 완충용액(pH 5.0)으로 평형화된 CM-세파로즈 FF칼럼(직경 5cm x 길이 10cm)에 주입하고 이온교환 크로마토그래피를 수행하였으며, 담체에 결합된 효소는 0내지 0.5M의 NaCl 직선농도구배로서 용출하여, 약 0.3M NaCl농도에서 키토산아제 분획을 수득하였다. 그런 다음, 키토산아제 분획을 농축하고, 수퍼덱스(Superdex) 200칼럼에 주입하여 겔여과 크로마토그래피를 수행하였으며 키토산아제 활성 분획을 수득하여, 탈이온화수로 투석하고 동결건조시켰다. 그 결과, 2.5그램의 키토산아제 건조분말이 제조되었으며 총 키토산아제 활성은 약 55,000U였다.

[실시예 8] 키토산아제의 효소학적 특성

[실시예 8-1] 키토산아제의 작용기간

본 발명의 균주에서 정제된 키토산아제는 키토산에 작용하여 β-1,4결합을 절단하며, 절단 방식은 내부절단형이였다. 키토산이 분해되면 1당과 2당은 거의 생성되지 않고, 3당 내지 8당을 포함하는 키토산 올리고당이 만들어지며, 주반응산물은 4당 내지 6당이었다.

[실시예 8-2] 키토산아제의 기질특이성

키토산아제는 키토비오즈(chitobiose), 키토트리오즈(chitotriose), 펩티드글리칸 및 전분 등을 분해하지 못하였으며, 키토테트라오즈-키토헵타오즈의 키토산 올리고당에 대해서는 비교적 낮은 활성을 보였고 키토산 및 CM-키토산에 대해서는 높은 활성을 보였다. 또한, 콜로이달 키틴(colloidal chitin)과 카르복실 메틸 셀루로오즈(CM-cellulose)에 대해서는 매우 낮은 활성을 보였다. 이러한 여러가지 기질에 대한 키토산아제의 상대 활성도는 표1에 나타낸 바와 같다.

키토산 기질의 탈아세틸화도가 효소 활성도에 미치는 영향은 표2에 나타낸 바와 같았다. 키토산아제는 약 80% 탈아세틸화도를 가진 키토산에 대해서 최대의 활성도를 보였으며, 그 이외에 약 30내지 90%범위의 탈아세틸화도를 가진 기질에 대해서 최고활성 대비 80% 이상의 활성을 유지하였다.

[표 1 : 여러가지 기질에 대한 키토산아제의 상대활성도]

[표 2 : 키토산 기질의 탈아세틸화도에 따른 키토산아제의 상대활성도]

[실시예 8-3] 키토산아제의 최적 pH와 pH 안정성

키토산아제를 50℃에서 10분간 반응시키는 경우 반응액의 pH에 따른 키토산아제의 상대활성도를 제1도에 나타내었다. 본 발명의 효소는 pH4 내지 8의 범위에서 작용하고 최적 pH는 6.0이었다. 또한 30℃에서 1시간 반응시키는 경우, 효소액의 pH가 효소의 안정성에 미치는 영향을 제2도에 나타내었으며 pH 3내지 10사이에서 비교적 안정하였다.

[실시예 8-4] 키토산아제의 최적 온도와 온도 안정성

반응온도에 따른 키토산아제의 상대활성도를 제3도에 나타내었으며, 본 효소의 최적 반응온도는 70℃였다. 키토산아제를 pH 5.0에서 1시간 동안 반응시키는 경우 반응 온도에 따른 효소의 상대활성도는 제4도에 나타내었으며, 40℃에서 16시간까지 비교적 안정하였으나, 50℃이상의 온도에서는 급격히 실활되었다.

[실시예 8-5] 키토산아제의 반응산물

키토산아제는 키토비오즈와 키토트리오즈를 분해하지 못하였다. 또한 키토테트라오즈와 키토펜타오즈에 대해서 비교적 낮은 분해 활성을 가지고 있었으며 분해 후 2당 및 3당을 주로 생산하였다. 키토헥사오즈로부터는 2당, 3당 및 4당이 주로 생산되었으며, 키토산으로부터는 1당을 전혀 생산하지 않고 소량의 2당만을 생산하였다. 본 효소는 키토산으로부터 최종반응산물로서 3당 내지 8당의 올리고당을 생성하였다.

[실시예 8-6] 키토산아제의 저해제

키토산아제의 활성은 1mM의 HgCl₂PbCl₂및 AgNO₃에 의해서 현저히 저해되었으며, 0.4M이상의 NaCl 혹은 KCl 에 의해서 50%이상의 활성이 저해되었다.

[실시예 8-7] 키토산아제의 분자량

소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(sodium dodecylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis)방법으로 분석한 키토산아제의 분자량은 약 45,000달톤이었다.

(실시예 8-8) 키토산아제의 아미노 말단의 아미노산 서열

키토산아제의 아미노-말단 1번부터 20번까지의 아미노산 서열은 알라닌-(미정)-(미정)-리신-글루탐산-메티오닌-리신-프로린-페닐알라닌-프로린-글루타민-글루타민-발린-아스파라진-티로신-알라닌-글리신-발린-이소루이신-리신이였다.

이상과 같은 특성을 가진 바실러스 속 GM 44균주의 키토산아제는 ⅰ)효소작용의 최적 pH, 최적 온도, 분자량, 금속이온에 의한 저해 효과 및 아미노-말단의 아미노산 서열 등이 기존에 알려진 효소와는 달랐으며, ⅱ)약 30내지 99%범위의 탈아세틸화도를 가진 키토산 기질에 대하여 높은 효소 활성을 가지고, ⅲ)키토산으로부터 주로 3당 내지 8당의 키토산 올리고당을 생성하며 특히 5당이상의 고중합도 키토산 올리고당을 50%이상 생산하며, ⅳ)효소의 생산성이 배양액 ml당 약 46U/ml로 높고: v) 분리정제된 효소의 비활성도가1744.3U/단백질 mg로 높다는 점을 고려할 때 기존에 알려진 미생물 유래의 키토산아제와는 다른 신규한 효소였다.

[실시예 9] 키토산 올리고당의 생산

4그램의 키토산을 2%(v/v) 빙초산이 포함된 탈이온수 100ml에 넣고 완전히 녹여 4%키토산 용액을 만들고, 4%키토산 용액 100ml에 10U, 20U, 30U 또는 40U의 키토산아제를 첨가하여 반응시간에 따른 키토산의 분해도를 측정하였으며, 그 결과는 제5도에 나타낸 바와 같다. 20U 이상의 효소를 처리하는 경우 24시간 이내에 대부분의 키토산이 분해되었고, 그 이후로는 분해가 진행되지 않았다. 또한, 20U의 키토산아제가 처리된 8,12 또는 20시간째에, 시료를 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 키토산 올리고당 조성을 조사였을때, 제6도에 나타낸 바와 같이 8시간째의 시료에서는 6당 이상의 당이 전체 올리고당의 약 40%를 차지하였으나 반응시간이 증가될수록 점차감소되어 20시간째는 약 25% 정도를 보였고, 3당, 4당 및 5당은 증가되었다. 본 발명의 효소는 키토산을 분해하여 최종반응산물로서 3당, 4당, 5당 및 6당의 키토산 올리고당을 주로 생산하였으며 이들은 총올리고당 함량의 95%를 차지하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이 본 발명은 토양에서 분리한 신규한 바실러스 속 GM44 균주 및 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있는 키토산아제의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 균주로부터 제조된 키토산아제는 효소의 생산수율도 높고, 제조된 효소의 비활성도도 높으며 30내지 99%범위의 탈아세틸화도를 가진 키토산에 대하여 높은 활성을 나타내고 고중합도의 키토산 올리고당을 제조할 수 있다.

Claims

키토산아제를 생산하는 바실러스 속(Bacillus sp.) GM 44(KCTC 0377BP)
ⅰ) 제1항의 바실러스 속(Bacillus sp.) GM 44(KCTC 0377BP)균주를 LB한천배지에서 배양하고 LB 액체배지에 접종한 다음 30℃에서 15시간 진탕배양하여 접종용 배양액을 수득하는 공정;

ⅱ) 전기에서 수득한 접종용 배양액을 1내지 3%의 탄소원, 0.5내지 3.5%의 질소원을 함유한 MS배지에 4내지 6%의 비로 접종하고, 100내지 400rpm, 25내지 37℃, 초기 pH 6.8 및 1vvm의 통기조건에서 48내지 72시간 동안 배양하는 공정; 및,

ⅲ) 전기 공정의 배양액을 원심분리하여 상등액을 농축하고, 세척한 다음, 이온교환크로마토그래피를 수행하여 0내지 0.5M의 NaCl의 직선농도구배에서 용출하며, 겔여과 크로마토그래피를 수행하고, 탈이온화수로 투석하는 공정을 포함하는 키토산아제의 제조방법
제2항에 있어서,

LB배지는 박토-트립톤 1.0%, 박토-효모추출물 0.5% 및 NaCl 1.0%를 함유하며 pH가 7.0으로 조정된 것을 특징으로 하는 키토산아제의 제조방법.
제2항에 있어서,

MS배지는 0.2% K₂HPO₄, 0.1% KH₂PO₄, 0.07% MgSO₄·7H₂O, 0.05% NaCl, 0.05% KCl, 0.01% CaCl₂를 함유하며 pH가 6.8로 조정된 것을 특징으로 하는 키토산아제의 제조방법
제2항에 있어서,

탄소원은 글리세롤 포도당, 글루코사민, 설탕, 가용성 전분 및 키토산으로 구성된 그룹으로 부터 선택되는 1종 이상의 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 키토산아제의 제조방법.
제2항에 있어서,

질소원은 암모늄클로라이드, 암모늄설페이트, 옥수수 침전물, 폴리펩톤, 펩톤, 트립톤 및 효모추출액으로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 1종 이상의 물질을 사용하는 것을 특징으로 하는 키토산아제의 제조방법.
바실러스 속(Bacillus sp.) GM 44균주(KCTC 0377BP)로부터 생산되며, 다음과 같은 특성을 가지는 키토산아제,

ⅰ) 키토산에 작용하여 β-1,4결합을 내부절단형으로 절단하며 키토산을 분해하여 3당 내지 8당의 키토산 올리고당을 생성하고,

ⅱ) 최적 pH는 6.0, 최적 반응 온도는 70℃이며;

ⅲ) 분자량은 약 45,000달톤이고; 및,

ⅳ) 아미노-말단 1번부터 20번까지의 아미노산 서열은 알라닌-(미정)-(미정)-리신-글루탐산-메티오닌-리신-프로린-페닐알라닌-프로린-글루타민-글루타민-발린-아스파라진-티로신-알라닌-글리신-발린-이소루이신-리신이다.