KR100212178B1 - 입자농도 및 화학발광 검출을 이용한 개선된 발광 검정 장치 및 방법 - Google Patents
입자농도 및 화학발광 검출을 이용한 개선된 발광 검정 장치 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
서술된 것은 샘플내에 존재할 수 있는 분석대상물에 대한 결합검정 수행방법 및 장치이다. 방법은 하기 단계를 포함한다 : 샘플, 자극될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질, 및 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 입자들을 함유하는 조성물을 형성하고 ; 조성물을 항온처리하여 입자 표식성분을 포함하는 복합체를 형성하고 ; 수집대내에 복합체를 수집하며, 표식물이 발광하도록 표식물을 자극할 수 있는 트리거를 수집대 내로 투입하며 ; 방출된 발광을 측정하여 샘플내 분석 대상물의 존재를 측정한다.
Description
[발명의 명칭]
입자 농도 및 화학발광 검출을 이용한, 개선된 발광 검정 장치 및 방법
본 출원은, 전기화학발광 검정이란 제목의, 현재 포기된, 1988년 11월 3일에 제출된 출원 번호 제 07/266,882 호의 연속인, 1990년 6월 18일에 제출된 출원 번호 제 07/539,389 호의 부분연속출원인, 1991년 2월 6일 제출된 동시계류중 마사이(Massey)일동의 출원 번호 제 07/652,427의 부분연속 출원이고, 본 출원은 전기화학발광 검정이란 제목의 현재는 포기된, 1988년 11월 3일에 제출된 출원번호 제 07/539,389 호의 부분연속 출원이다. 본 출원의 내용은 참고로 여기에 통합된다.
[기술분야]
본 출원은 일반적으로 결합검정(binding assay)을 수행하기 위한 방법 및 장치에 관한 것으로서, 더욱 특별하게는, 검정계의 표식(label) 성분 하나 이상에 의해 방출된 발광을 측정함으로써 분석물의 존재를 측정하는 것들에 관한 것이다. 더욱 명확히, 본 발명은 발광성분이 검정 조성물내에 농축되고 화학발광을 일으키기 전에 수집되는 개선된 감도의, 정밀하고 재생할 수 있으며 정확한 일원적(homogeneous) 또는 이원적(heterogeneous) 특이 결합 검정에 관한 것이다.
[배경기술]
생화학적 및 생물학적 물질에 있어서 분석대상물의 검출 및 정량을 위한 무수한 방법 및 시스템이 개발되어 왔다. 미량의 미생물, 약물, 호르몬, 비루스, 항체, 핵산 및 그 밖의 단백질을 측정할 수 있는 방법 및 시스템은 연구자 및 임상의학자에게 매우 유용하다.
매우 실질적인 대부분의 기술은 잘 알려진 결합 반응, 예컨대 항원 -항체 반응, 핵산 혼성화 기술, 및 단백질-리간드 시스템을 근거로 개발되었다. 많은 생화학적 및 생물학적 결합 시스템에 있어서 고도의 특이성은 조사 및 진단에 가치있는 많은 검정 방법 및 시스템이 생기게 했다. 전형적으로, 분석 대상물의 실재는 하나 이상의 결합물질에 부착된 가시성 표식물의 존재 또는 부재에 의해 지시된다. 광화학적, 화학적, 및 전기화학적 수단을 통해 발광하게 만들 수 있는 표식물이 특히 흥미롭다. 광발광은 물질이 전자기복사선을 흡수할 때 발광하도록 유발시키는 공정이다. 형광 및 인광은 광발광의 유형이다. 화학발광성 공정은 에너지의 화학적 전이에 의한 발광종의 창출을 수반한다.
분석대상물을 함유하는 샘플이 화학발광 표식물로 표식된 반응물과 혼합되는 화학발광 검정기술이 개발되었다. 반응성 혼합물은 항온처리되고 표식된 반응물중 일부는 분석물에 결합한다. 항온처리후, 혼합물의 결합 및 비결합 획분은 분리되고 획분 모두 또는 둘중 하나에 있어서 표식물의 농도는 화학발광 기술에 의해 결정될 수 있다. 한 획분 또는 두 획분 모두에서 결정된 화학발광의 수준은 생물학적 샘플내 분석대상물의 양을 지시한다.
항온처리된 샘플은 발광을 자극하기 위해 전량계 작업 전극에 노출될 수 있다. 고유 화학적 환경에서, 그러한 전기화학발광은 고유 방식으로 그리고 고유 시간에서 작업 전극상에 가해진 전압에 의해 자극된다. 표식물에 의해 생산된 빛은 측정되어 분석물의 존재 또는 양을 지적한다. 상기 전기화학 발광 기술의 더욱 충분한 설명을 위해, PCT 공개출원 US 85/01253(WO 86/02734), PCT 공개출원번호 US87/00987, 및 PCT 공개출원 US 88/03947을 참고로 한다. 상기 언급된 출원의 공개는 참고로 통합된다. 검정과정동안 분리단계를 필요로 하지 않으면서 화학발광 검정을 실행하는 것과 정확하고 민감한 측정을 할 수 있도록 상이한 분석물 농도에서 신호변조를 최대로 하는 것이 바람직하다.
분리 검정을 위한 선행 방법 중에서 전선관내에서 입자들을 자기적으로 분리시킨 후 입자들을 표식물의 분석을 위해 분리된 챔버로 옮기는 것에 관한 미합중국 특허 제 4,141,687 호 및 유럽 특허출원 0,030,087에 서술된 바와 같은 방법이 있다.
비분리 검정을 위한 선행기술 방법중에는 검정의 결합성분 하나 이상에 결합시키기 위해 검정 샘플내에 현탁된 미립상 물질을 이용하는 방법이 있다.
미합중국 특허 제 4,305,925 호는 비탁법 및 혼탁도 측정법을 사용하여 임상관련 단백질 및 펩티드의 검출 및 정량에 관한 것이다. 공개된 방법은 빛의 산란 또는 흡수 기능을 수행하는 라텍스 입자에 항원 또는 항체를 결합시키는 것을 포함한다.
미합중국 특허 제 4,480,042 호는 쉘-코어 입자로 구성된 입자 시약을 이용하는 기술에 관한 것이다. 쉘은 생물학적 관심의 화합물에 공유 결합될 수 있는 관능기를 함유하고, 코어의 고굴절률은 빛 산란 측정에 대한 높은 민감성을 결과시킨다. 기술은 다양한 방법으로 측정 및/또는 검출될 수 있는 응집체를 생산하기 위해 관심있는 다가 항원과 이가항체의 반응에 기인하는 응집반응을 기초로 한다.
미합중국 특허 제 4,419,453 호는 항체 및 면역원과 같은 면역화합물의 존재를 검출하기에 유용한 착색 라텍스 응집반응 테스트 방법의 사용에 관한 것이다.
상기 선행기술에 기초했을 때, 발광 현상이 측정되는 검정에서 미립상 물질을 사용하는 것이 가능하다고 생각되지 않았었다. 자유 화학발광부분으로부터의 발광이 흡수 또는 산란되거나, 그렇지 않으면 미립상 물질로부터 간섭받을 것을 예상했을 것이다.
예상과는 달리, U.S. 출원 번호 266,882(PCT 공개출원 U.S 89/04919)은, 불활성 미립상 물질이 검정계의 결합 반응물 중 하나에 특이하게 결합되는 발광현상을 근거로 한, 민감한 특이성 결합 검정 방법을 기술한다. 검정은 이원적 (하나 이상의 분리단계) 검정 포맷으로 수행될 수 있고 가장 유리하게 일원적 (비분리) 검정 포맷으로 사용될 수 있다.
US 89/04919는 발광현상의 측정을 위해 결합반응을 근거로 한 검정을 위한 조성물에 관한 것이며, 여기에서 조성물은 검정 혼합물의 성분에 결합할 수 있는 표면을 갖는 다수의 현탁입자를 포함한다. 다른 양상에 있어서, 그것은 샘플내 분석대상물을 검출하거나 정량하기 위한 계에 관한 것으로, 이때 계는 발명의 검정 조성물을 사용하여 검정 방법을 수행할 수 있다. 계는 검정 매질내 표식 화합물이 발광하도록 유발하기 위한 수단, 및 샘플내에 분석대상물의 존재를 검출하기 위해 발광을 측정하기 위한 수단을 포함한다.
그러므로, US 89/04919는 샘플내의 분석대상물의 검출을 위한 방법에 관한 것이며, 그 방법은 (1) (a) 분석대상물을 함유한다고 의심되는 샘플, (b)(i) 분석대상물 또는 분석대상물의 유사체, (ii) 분석대상물 또는 그의 상기 유사체의 결합상대, 및 (iii) (i) 또는 (ii)와 결합될 수 있는 반응성 성분으로 구성된 군으로부터 선택된 검정-수행-물질, 여기에서 상기 물질 중 하나는 발광하도록 유발될 수 있는 화학성분을 갖는 표식 화합물에 결합되며, (c) (b) (i) (ii) 또는 (iii)에서 정의된 물질 및/또는 분석물과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 현탁입자들로 이루어진 조성물을 형성하고; (2) 조성물을 항온처리하여 상기 표식 화합물 및 입자를 포함하는 복합체를 형성하고; (3) 표식 화합물이 발광하도록 유발시키며; (4) 조성물에 의해 방출된 발광을 측정하여 샘플내에 분석대상물의 존재를 검출하는 단계들을 포함한다. 상기 동일 방법을 사용하여 검정 조성물 발광과 공지량의 분석물을 함유한 조성물의 발광을 비교함으로써 샘플내의 분석물의 양을 정량할 수 있다.
천연 또는 합성일 수 있는 분석대상물의 유사체는 분석물과 비교가능한 결합 성질을 가지는 화합물이지만, 그외에 더욱 높거나 더욱 낮은 결합능력의 화합물을 포함한다. 본 발명에 사용하기 적당한 결합상대는 잘 공지되어 있다. 실례는 항체, 효소, 핵산, 렉틴, 조인자 및 수용체이다. 분석물 또는 그의 유사체 및/또는 그들의 결합상대와 결합할 수 있는 반응성 성분은 제2항체 또는 단백질 A 또는 단백질 G와 같은 단백질일 수 있거나 아비딘 또는 비오틴 또는 결합반응에 참여할 수있다고 당분야에 공지된 그 밖의 성분일 수 있다.
유리하게, 발광은 특이 결합상대에 결합되든지 또는 비결합되든지 간에, 표식 화합물을 전량계 작업 전극에 노출시킴으로써 유발된 전기화학발광(ECL)에 기인한다. ECL 반응성 혼합물은 빛을 발하는 고유 방식으로 및 고유 시간에서 작업 전극 상에 가해진 전압에 의해 빛을 발하도록 조종가능하게 자극된다. 가시광의 방출은 유리한 특징이지만, 조성물 또는 계는 다른 형태의 전자기복사, 예컨대, 적외선 또는 자외선, X-선, 마이크로파 등을 방출할 수 있다. 용어 전기화학발광 전기화학발광성 발광 발광성 및 발광하다의 사용은 빛 및 다른 형태의 전자기복사선의 방출을 포함한다.
US 89/04919에서 기술된 방법은 연구 및 임상 셋팅에서 수행된 다양한 검정에 있어서 극히 소량인 분석물의 검출 및 정량을 허용한다. 그러나, 연구자 및 임상학자들은 상기 검정의 민감성을 증감시키고 그들이 수행될 수 있는 속도를 증가시키는 상기 방법에 의해 수행된 검정의 검출 한계를 낮출 것을 계속하여 요구하고 있다.
표식종으로부터의 신호를 농축시킴으로써 신호를 증가시킨 후 측정 단계에 적용하는 다양한 방법들이 당분야에 공지된다. 미합중국 특허 제4,652,333호에서, 예를 들면, 형광, 인광 또는 원자 형광 표식물로 표식된 입자들은 측정 단계를 수행하기 전에 미세 여과에 의해 농축된다.
측정단계 이전에 예컨대, 자기 반응성 표식입자들을 측정용기의 표면으로 인입시킴으로써, 표식 면역화학종을 농축시키는 것도 당분야에 공지된다. 미합중국 특허 제 4,731,337, 4,777,145, 및 4,115,535에서 예를 들면, 상기 입자들은 용기벽으로 인입된 다음 빛의 형광단 방출이 자극되도록 조사된다.
미합중국 특허 제 4,945,045에서, 입자들은 자기 전극상에서 농축된다. 전기화학반응은 표식된 화학적 매개체에 의해 조장된 전극에서 일어난다. 면역화학적 결합반응은 결합이 일어날 때 변조 신호를 야기시키는 매개체의 효율을 변하게 한다.
[발명의 목적]
따라서 본 발명의 주목적은 결합 검정의 수행을 위한, 일원적 (비-분리) 및 이원적 (분리) 방법, 시약 및 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 부가목적은 미립상 물질을 함유하는 검정 조성물로부터 방출된 화학발광의 측정을 근거로, 비-분리, 특이결합 검정, 시약 및 장치를 제공하는 것이다.
부가 및 관련 목적은 지금까지 이루어졌던 것보다 개선된 민감성, 더욱 빠른 검정시간, 더욱 큰 감도, 더욱 낮은 검출 한계 및 더욱 큰 정확성을 갖는 상기 검정, 시약 및 장치를 제공하는 것이다.
[용어의 정의]
화학 발광은 분자를 고-에너지 들뜬 상태로 되게 하는 에너지가 강력한 화학반응으로부터 유래되는 발광 반응으로서 정의된다. 그러므로 화학발광 반응은 화학에너지가 전자기 복사(자외선, 가시광선 또는 적외선)으로 직접 전환하는 것을 포함한다. 발광은 들뜬-상태 분자가 그의 바닥-상태 에너지 수준으로 되돌아갈 때 일어나서, 그의 바닥-상태에 비해 그의 들뜬 상태의 에너지 및 분자의 특성인 고유 파장을 갖는 광자를 방출한다.
에너지는 많은 화학반응에 의해 생기고; 상기 반응은 발열반응이라 불린다. 대부분의 경우 에너지는 열로서 나타나고 분자내에서 진동, 회전, 및 병진 에너지를 유발한다. 화학발광 반응에서 적어도 일부의 상기 에너지는 고-에너지 들뜬 상태내에서 형성으로 전달된다. 상기는 일반적으로 두 분자의 매우 강력하고 급속한 반응을 요구하며, 그 중 하나는 발광 방출할 수 있다:
양(quantity) H는 전자기 복사의 광자를 나타낸다. h는 플랑크 상수이며는 방출된 빛의 주파수이다.
몇몇 화학발광 반응에서 들뜬-상태 분자 C*의 전자에너지는 그밖의 분자로 이동되고,
그다음 전자기복사의 광자를 방출함으로써 그의 바닥-상태로 쇠한다.
화학발광 검출을 사용하는, 특이 결합 검정, 예컨대 면역검정은 반응물 중 하나를 결합상대 중 하나에 부착된 표식물로서 사용한다. 상기 검정에서, 반응물은 일반적으로 표식물 및 트리거라 불리우며 하기 식에 따라 반응한다:
특이 결합 검정에 사용되었던 화학발광 표식물의 예는 아크리디늄 에스테르, 루미놀, 이소루미날, 옥살레이트 에스테르, 디옥세탄 및 루시페린을 포함한다. 많은 경우, 트리거 분자는 표식물의 들뜬 상태를 일으킬 수 있는 매우 강력한 반응에서 표식물을 산화시킬 수 있는 과산화수소와 같은 산화제이다.
증강제 분자도 때때로 화학발광 공정의 효율을 높이는 수단으로서 화학발광 반응에 사용된다. 상기 분자는 일반적으로 반응의 반응속도를 늦추고 빛 방출의 양자 수율을 증가시킨다.
화학발광 결합 검정은 또한 그곳에서 효소를 표식물로서 사용한다는 것이 증명되었다. 이러한 경우, 효소는 트리거 용액의 존재하에 화학발광 반응을 촉매한다. 한 예는 과산화수소 및 수산화물 이온의 존재하에서 루미놀의 화학발광 반응을 촉매하는 효소 고추냉이 과산화 효소의 사용이다.
용어 화학발광 성분, 표식물, 표식 화합물, 및 표식물질은 교체할 수 있게 사용된다. 발명의 범위내에서 화학발광성분, 표식화합물, 표식물질 및 표식물로 명명된 것들은 분석물 또는 그의 유사체, 분석물 또는 그의 유사체의 결합 상대, 및 더 나아가 상기 언급된 결합 상대의 결합 상대, 또는 분석물, 그의 유사체 또는 상기 언급된 결합상대와 결합할 수 있는 반응성 성분과 같은 분자에 연결된다. 상기-언급된 종류는 또한 하나 이상의 결합 상대 및/또는 하나 이상의 반응성 성분의 조합물에 연결될 수도 있다. 부가적으로, 상기 언급된 종류는 또한 결합상대, 반응성 성분, 또는 하나 이상의 결합상대 및/또는 하나이상의 반응성 성분의 조합물에 결합된 분석물 또는 그의 유사체에 연결될 수도 있다. 다수의 상기 언급된 종류가 직접, 또는 상기 논의된 바와 같이 다른 분자들을 통해, 분석물 또는 그의 유사체에 결합되는 것도 본 발명의 범위내에 있다. 간결하게 하기 위하여, 리간드는 검정-수행-물질로서 언급된다.
용어 검출 및 정량은 측정으로서 언급되며, 정량은 참고 조성물 및 검도의 준비를 요구할 수 있음은 물론이다.
용어 복합체의 수집 및 농도는 검정 조성물 내의 복합체의 농도 및 예컨대 유동 셀의 표면에서 복합체의 농도를 서술하기 위해 교체하여 사용될 수 있다.
유리하게, 발광은 표식 화합물이, 특이 결합 상대에 결합되든 아니면 결합되지 않든 간에, 표식물이 발광하도록 상기 표식물을 자극할 수 있는 트리거에 노출시킴으로써 유발된 화학발광에 기인한다. 바람직하게, 트리거는 표식물이 산화되고 발광하도록 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제이다. 화학발광 반응성 혼합물은 조절가능하게 개시되어 빛을 내는 고유 방식으로 및 고유 시간에서 빛을 방출한다. 가시광의 방출은 유리한 특징이지만, 조성물 또는 계는 다른 유형의 전자기 복사, 예컨대 적외선 또는 자외선, X-선, 마이크로파 등을 방출할 수 있다. 용어 화학발광 및 화학발광성의 사용은 빛 및 다른 형태의 전자기 복사의 방출을 포함한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 미립상-기재 비분리 및 분리 검정을 수행하기 위한 영구 자석을 포함하는 셀의 개략도이다.
제2도는 프라이머로서 비오틴 화학발광 표식 올리고뉴클레오티드 및 화학 발광 표식 올리고뉴클레오티드를 사용하는 직접 삽입 PCR 포맷의 개략도이다.
제3도는 비오티닐화 PCR 및 생성물을 발생하도록 하는 비오티닐화 프라이머를 사용하는 표준 PCR 포맷의 개략도이다.
제4도는 화학발광 표식 올리고뉴클레오티드에 대한 후기 혼성화 동안 단일-가닥 비오티닐화 DNA를 발생하는 비대칭 PCR 검정 포맷의 개략도이다.
제5도는 복합체가 수집대 표면내에 침강하도록 전자석을 이용하는 침강검정 셀의 개략도이다.
제6도는 수집대 표면 아래에 자석의 배향의 기능으로서 수집대 부근에서 역선(力線)의 개략도이다.
제7도는 복합체가 원심분리에 의해 수집대 내에 침착되는 회전 유동셀의 개략도이다.
제8도는 본 발명의 미립상-기재 비분리 및 분리 검정을 수행하기 위한 영구자석을 포함하는 셀의 또 다른 개략도이다.
제9도는 제8도의 셀을 가지고 사용하기 위한 전압 조정 장치의 도시이다.
제10도는 복합체를 침강시키는 중력에 의한 검정을 수행하기 위해 사용된 검정 셀의 개략도이다.
[발명의 상세한 설명]
가장 광범위한 구체예에서, 본 발명은 샘플내에 존재할 수 있는 분석대상물에 대한 결합검정 수행방법이다. 단계는 하기를 포함한다 :
(a) (i) 상기 샘플;
(ii) 자극될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및
(iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 입자들을 함유하는 조성물을 형성하고;
(b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고;
(c) 수집대내에 상기 복합체를 수집하고;
(d) 상기 표식물이 발광하도록 상기 표식물을 자극할 수 있는 트리거를 상기 수집대 내로 투입하며;
(e) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
바람직하게, 트리거는 표식물이 산화되고 화학발광하도록 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제이다. 또한 바람직하게, 입자들은 자기(磁氣) 반응성이고 복합체는 수집대 내에 자기적으로 수집된다.
그 밖의 구체예에서, 검정-수행-물질 또는 입자는 전구체를 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 전환시키기 위한 효소를 부가 함유하고, 이때 트리거는 전구체이다.
발명은 측정대, 즉, 복합체가 발광하도록 야기될 수 있는 표면 상에서 복합체를 수집함으로써 실행되는 한편, 발명은 또한 복합체가 측정대 내에서 수집되는 방법을 포용하며 그 후에 발광을 유발하고 측정할 수 있도록 하는 수단이 그 지역에서 또는 다른 단게에 의해 취해진다.
복합체의 수집은 중력 침강, 여과, 원심분리 및 복합체의 일부를 형성하는 자기 반응성 입자의 자기 인력을 포함하는 몇가지 상이한 방법에 의해 실행될 수 있다. 몇몇 구체예는 하기에서 상세하게 서술된다.
배치 검정이 실행될 수 있는 한편, 연속 또는 반-연속 검정은 유체 셀내에서 실행될 수 있다. 유체 셀에서, 용액이 출구를 통해 셀을 유동시키는 동안 고체-상은 측정 셀 내에 남아 있다. 고체-상(예컨대, 입자들)이 물보다 더욱 밀하다면, 즉, 물보다 더 큰 밀도를 갖는다면, (1.0 g/mL 이상) 입자 상의 중력은 그들을 셀의 바닥으로 낙하하게 한다. 셀은 유체가 셀을 통해 흐를 때 입자가 바닥으로 침강하는 구조일 수 있거나 셀은 대부분의 샘플이 수집대 위의 원주형 구간 내 셀 내에 함유되는 구조일 수 있다. 셀 내의 충분한 주재 시간은 입자들이 화학발광을 유발하기 전에 수집대 내에 침강되도록 제공되어야만 한다.
발명의 또 하나의 구체예에서, 검정 조성물의 나머지 이상의 밀도를 갖는 현탁 입자를 함유하는 검정 조성물은 입자를 측정대로 옮기기 위해 원심분리에 놓여지고 거기서 연속하여 화학발광을 유발하도록 예컨대, 트리거와 접촉하게 된다.
상기 구체예에서, 측정 셀은 샘플 및 샘플 봉입물을 급속히 회전시키는 수단과 함께 제공된다. 원심분리력은 샘플내 입자들이 샘플 봉입물의 회전축으로부터 외부로 이동하게 하고 샘플 봉입물의 외부 표면 상에서 수집되게 한다.
세번째 구체예에서, 입자는 검정 조성물로부터의 여과에 의해 제거될 수 있다. 상기 구체예에서 입자들의 밀도가 검정 조성물의 나머지보다 더 클 필요는 없다. 발명, 입자들은 용액으로부터 분리되고 여과기를 통해 용액을 인입시킴으로써, 예컨대 펌핑하고 여과기의 표면 상에 입자를 수집함으로써 농축된다.
바람직한 구체예에서, 현탁 입자들은 자기 반응성이고, 예컨대, 그들은 상자성상자성(常磁性) 또는 강자성(强磁性)일 수 있고, 입자에 자기장을 걸어 측정대내에서 수집된다. 측정 셀에는 자석이 장치된다. 자석의 자기장은 입자들이 배치 셀 내에 있을 때 또는 그들이 유동 셀을 통해 흐를 때 힘을 입자들에게 가하여, 입자들을 용액의 대부분으로부터 자석에 가장 근접하여 있는 셀의 표면 상으로 분리시킨다.
결합 검정을 위한 몇가지 상이한 이원적 및 일원적 포맷은 복합체를 수집하고 농축시키기 위해 상기 서술된 방법을 사용하여 이행될 수 있다. 이원적 결합 검정에서 복합체는 표식물로부터 발광을 측정하기 전에 조성물로부터 분리된다. 일원적 검정에서, 결합(고체 상에) 및 비결합 표식 시약의 분리는 행해지지 않는다.
일원적 검정에서, 복합체가 수집대에서 농축될 때, 표식물로부터 측정된 신호는 농축 단계가 없을 때보다 더욱 크다. 반면, 비복합체 표식 시약으로부터의 신호는 변화되지 않는다. 따라서, 측정 셀 내 비복합체 표식 시약의 존재에도 불구하고, 수집된 복합체로부터의 신호는 복합체의 수집이 없는 검정에서보다 더욱 강하다. 결합 검정에 대한 검출 한도는 수집 과정의 결과로서 더욱 개선된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 현장 분리 단계는 일원적 결합 검정과정에 포함된다. 검정 조성물, 즉, 샘플, 검정 수행 물질 및 입자들이 측정 셀 내로 펌핑되고 복합체가 수집대 내에 수집된 후, 제 2 유체는 표식물 또는 표식 시약이 없는 셀을 통해 펌핑되고, 이로써 검정 조성물의 비결합 성분으로부터 복합체의 현장 세척 또는 분리를 수행한다. 상기 검정 과정은 기술적으로 이원적 결합 검정이다. 그러나, 측정 셀 내부에서 분리를 수행하는 능력은 그것이 부가의 분리 장치를 요구하지 않고 그 과정은 일반적으로 외부의 분리 방법보다 더욱 빠르다는 점에서 유리하다.
이원적 결합 검정은 검정 조성물의 성분을 혼합하고 그들을 예정된 시간 동안 반응시킴으로써 발명을 사용하여 수행된다. 그 다음 검정 조성물은 입자에 적용된다. 그 다음 화학발광은 복합체 또는 용액으로부터 측정된다. 농축 단계 후 복합체로부터의 화학 발광의 측정은 농축 없이 가능한 것보다 더욱 낮은 검출 한도 및 보다 나은 정확성을 지닌 분석물의 측정을 허용한다.
다른 구체예에서, 발명은 샘플내에 존재할 수 있는 분석 대상물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법에 있다. 단계는 하기를 포함한다 :
(a) (i) 상기 샘플;
(ii) 자극될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및
(iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 입자를 함유하는 조성물을 형성하고;
(b) 상기 조성물을 항온처리하여 상기 표식 성분 및 입자를 포함하는 복합체를 형성하고;
(c) 전극의 표면에서 상기 복합체를 수집하고;
(d) 상기 표식 화합물을 트리거와 접촉시킴으로써 발광하도록 유발시키며, 상기 트리거는 전기화학에너지의 도입시 전구체 분자의 전환에 의해 예를 들면 상기 전극에 전압을 걸어 현장에서 형성하며;
(e) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
복합체는 표식물이 산화되고 화학발광하도록 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제를 수집대내에 투입함으로써, 예컨대, 들뜨고 화학발광하도록 유발되는 전극 표면 상에서 수집될 수 있다. 본 발명에 따라, 산화제는 전구체 분자의 전환에 의해 현장에서 형성된다. 샘플을 함유하는 조성물은 또한 전구체 분자를 함유할 수 있거나, 전구체 분자는 항온 처리 전에, 항온 처리 후이지만 자기적으로 수집하기 전에, 또는 항온처리된 복합체를 자기적으로 수집한 후에 투입될 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 샘플에 존재할 수 있는 분석 대상물에 대한 결합 검정 수행 방법에 관한 것이다 :
(a) (i) 상기 샘플;
(ii) 산화될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질;
(iii) 분석물 및/ 또는 상기 검정-수행-물질과 특이하게 결합할 수 있는 다수의 코팅 자기 입자들; 및
(iv) 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 자기적으로 전환될 수 있는 분자를 함유하는 조성물을 형성하고;
(b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고;
(c) 전극의 표면에서 상기 복합체를 자기적으로 수집하고;
(d) 상기 전극에 전압을 걸어 상기 분자를 상기 산화제로 전환시켜, 상기 표식물이 산화되고 발광하도록 하며;
(e) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
본 발명의 또한 하기 단계들을 포함하는, 샘플내에 존재할 수 있는 분석 대상물에 대한 결합 검정 수행 방법에 관한 것이다 :
(a) (i) 상기 샘플;
(ii) 산화될 때 발광할 수 있는 표식화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및
(iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 코팅된 자기 입자들을 함유하는 조성물을 형성하고;
(b) 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 전기화학적으로 전환될 수 있는 분자를 상기 조성물에 투입하고;
(c) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식화합물을 포함하는 복합체를 형성하고;
(d) 전극의 표면에서 상기 복합체를 자기적으로 수집하고;
(e) 상기 전극에 전압을 걸어 상기 분자를 상기 산화제로 전환시켜 상기 표식물이 산화되고 발광하도록 하며;
(f) 방출된 발광을 검출하며 분석대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 샘플내에 존재할 수 있는 분석대상물에 대한 결합 검정을 수행하기 위한 방법에 관한 것이다 :
(a) (i) 상기 샘플 ;
(ii) 산화될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및
(iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 코팅된 자기 입자들을 함유하는 조성물을 형성하고;
(b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고;
(c) 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 전기화학적으로 전환될 수 있는 분자를 상기 조성물에 투입하고;
(d) 전극의 표면에서 상기 복합체를 자기적으로 수집하고;
(e) 상기 표식물이 산화되고 발광하도록, 상기 전극에 전압을 걸어 상기 분자를 상기 산화제로 전환시키며;
(f) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
발명은 또한 더 나아가 하기 단계들을 포함하는, 샘플내에 존재할 수 있는 분석 대상물에 대한 결합 검정 수행 방법에 관한 것이다 :
(a) (i) 상기 샘플 ;
(ii) 산화될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및
(iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 코팅된 자기 입자들을 함유하는 조성물을 형성하고;
(b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고;
(c) 전극의 표면에서 상기 복합체를 자기적으로 수집하고;
(d) 전기화학적으로 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 전환될 수 있는 분자를 상기 조성물에 투입하고;
(e) 상기 표식물이 산화되고 발광하도록, 상기 전극에 전압을 걸어 상기 분자를 상기 산화제로 전환시키며;
(f) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
바람직한 구체예에서, 현탁입자들은 자기 반응성이고, 예컨대 그들은 상자성 또는 강자성일 수 있고, 입자에 자기장을 걸어, 측정대 내에서 되도록이면, 전극의 표면에서 직접 수집된다. 측정 셀에는 자석이 장치된다. 자석의 자기장은 입자들이 배치 셀 내에 있을 때 또는 그들이 유동 셀을 통해 흐를 때 힘을 입자상에 가하여, 입자들을 용액의 대부분으로부터 자석에 가장 근접하여 있는 셀의 표면 상으로 분리시킨다. 자석이 적당한 배향으로 그리고 화학발광 검출 시스템의 작업 전극에 거의 근접하게 놓인다면 입자들은 작업전극의 표면 상에서 농축할 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명 뿐 아니라 이들의 그밖의 목적 및 특징은 임의 바람직한 구체예의 하기 설명으로부터 더욱 명확하고 충분하게 이해될 것이다.
발명은 결합 반응에 참가할 수 있는 분석 대상물에 널리 적용가능하다. 상기 반응은, 예컨대, 항원-항체, 리간드 수용체, DNA 및 RNA 상호작용, 및 그밖의 공지된 반응을 포함한다. 발명은 다성분 샘플내에 상기 분석 대상물의 존재를 정성 및 정량 검출하기 위한 상이한 방법 및 검정에 관한 것이다.
[샘플]
고체, 유탁액, 현탁액, 액체, 또는 기체 형태일 수 있는 분석대상물을 함유할 수 있는 샘플은, 예를 들면, 세포 및 세포-유도 생성물, 물, 식품, 혈액, 혈청, 모발, 땀, 요, 변, 조직, 침, 오일, 유기용매 또는 공기로부터 유래될 수 있다. 샘플은 예를 들면, 물, 아세토니트릴, 디메틸 설폭시드, 디메틸 포름아미드, n-메틸-피롤리돈 또는 알코올 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
[분석물]
전형적인 분석대상물은 전세포 또는 표면 항원, 준세포성 입자, 비루스, 프리온, 비로이드, 항체, 항원 합텐, 지방산, 핵산, 단백질, 지방단백질, 다당류, 지방다당류, 당단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 세포성 메타볼라이트, 호르몬, 약제, 합성 유기 분자, 유기 금속성 분자, 정신안정제, 바르비투레이트, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 당, 레시틴, 재조합체 또는 유도 단백질, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 샘플내에 존재하는 무기분자이다. 전형적으로, 분석대상물은 10-3몰 이하, 예를 들면 10-12몰 만큼 낮거나 더 낮은 온도로 존재한다.
[검정-수행-물질]
분석대상물을 함유하는 샘플과 혼합되는 검정-수행-물질은 (i) 상기 정의된 바와 같은, 첨가된 분석대상물 또는 그의 유사체, (ii) 분석대상물 또는 그의 상기 유사체의 결합상대, 및 (iii) (i) 또는 (ii)와 결합할 수 있는, 상기 정의된 바와 같은 반응성 성분으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 함유하며, 이때 상기 물질 중 하나는 발광을 유발할 수 있는 화합물 또는 성분, 예컨대 화학발광 성분에 연결된다. 표식물질은 전세포 또는 표면 항원, 준세포성 입자, 비루스, 프리온, 비로이드, 항체, 항온, 합텐, 지방, 지방산, 핵산, 다당류, 단백질, 지방단백질, 지방다당류, 당단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 세포성 메타볼라이트, 호르몬, 약제, 정신안정제, 바르비투레이트, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 당, 비생물학적 중합체(바람직하게 가용성), 레시틴, 재조합체 또는 유도단백질, 합성 유기 분자, 유기 금속성 분자, 무기분자, 비오틴, 아비딘 또는 스트렙타비딘일 수 있다. 한 구체예에서, 시약은, 항체, 항원, 핵산, 합텐, 소 뉴클레오티드 서열, 올리고머, 리간드, 효소, 또는 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 단백질 A, 단백질 G, 또는 이들의 복합체, 또는 단백질 상호작용을 통해 일차 결합상대와 결합할 수 있는 다른 이차 결합상대에 접합된 화학발광 성분이다.
천연 또는 합성일 수 있는, 분석 대상물의 유사체는, 전형적으로 분석물에 필적하는 결합 성질을 가지는 화합물이지만, 더욱 높거나 더욱 낮은 결합성능의 화합물일 수도 있다. 분석물 또는 그의 유사체와, 및/또는 그의 결합 상대와 결합할 수 있는 결합 상대, 및 화학발광 성분이 분석물에 연결될 수 있는 것은, 적당하게 제 2 항체 비오틴 또는 결합반응에 참가한다고 당분야에 공지된 그 밖의 성분이다.
화학발광 성분의 기능은 트리거, 특히 산화제를 반응계내로 투입한 결과로서 전자기 복사를 방출하는 것이다. 상기를 행하기 위해, 그들은 들뜬 에너지 상태로 자극될 수 있어야만 하고 또한 들뜬 상태로부터 하강시, 빛의 광자와 같은 전자기 복사를 방출할 수 있어야만 한다.
트리거는 전기화학에너지의 도입에 의해 전구체 분자의 현장 전환에 의해 형성되는데, 예를 들면 물은 전극상에 전압 파형을 가함으로써, 과산화 또는 초과산화수소와 같은 산화제로 된다. 제 2 실례로서, 전구체로서 산소 분자는 전기화학적으로 환원되어 트리거인, 과산화수소를 형성한다.
본 발명에 따라 혼입된 화학발광 성분의 양은 계에 따라 서로 다를 것이다. 일반적으로, 이용된 상기 성분의 양은 상기 언급된 조성물 또는 계로부터, 검출가능한, 및 원한다면, 정량가능한, 전자기 에너지의 방출을 결과시키기에 효과적인 양이다. 분석 대상물의 검출 및/또는 정량은 전형적으로 공지된 양의 분석대상물 및 화학발광 성분으로 개발된 눈금 표준에 의해 방출된 발광과 분석대상물 및 화학발광 성분을 함유하는 샘플로부터의 발광의 비교로부터 행해진다. 상기는 일원적 포맷을 가정한다. 이원적 방식에서, 먼저 논의된 바의 분리는 화학발광 분석 이전에 실행된다.
임의의 당업자에게 인지될 수 있는 바와 같이, 화학발광 성분의 양 및 확인은 우세한 조건에 의존하여, 각 계에 따라 서로 다를 것이다. 원하는 결과를 얻기에 적절한 화학발광 성분, 및 이들의 충분한 양은 불필요한 실험 없이, 여기에서의 언지에 따라 장치된다면, 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
[입자들]
입자들은 유리하게 직경 0.05-200, 바람직하게 0.1-100, 가장 바람직하게 0.5-10를 갖는 미립상 물질, 및 분석물 및/또는 상기 부괄호 (b)(i), (b)(ii), 또는 (b)(ii)에 정의된 하나 이상의 다른 물질에 결합될 수 있는 표면 성분으로 구성된다. 예를 들면, 미립상 물질은 가교 전분, 덱스트란, 셀룰로스, 단백질, 유기 중합체, 스티렌/부타디엔 공중합체, 아크릴로니트릴/부타디엔/스티렌 공중합체, 비닐아세틸 아크릴레이트 공중합체, 또는 염화비닐/아크릴레이트 공중합체와 같은 스티렌 공중합체, 불활성 무기 입자, 이산화 크롬, 철, 규소, 규소 혼합물, 및 단백질 유사 물질의 산화물, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 바람직하게 입자들은 화학발광계내에 현탁된다.
[화학발광 측정 장치]
발명의 검정을 실행하기 위한 장치는 제1도에 설명된다. 제1도는 유리한 화학발광 장치를 공개하지만, 본 발명의 방법은 장치(10)의 적용에 제한되지 않으며, 오히려 표식 성분을 수집하기 위한 수단을 포함하는 다른 타입의 화학발광 장치에 이용될 수 있다. 발명의 방법이 정적 또는 유동-통과방식으로 실행될 수 있는 한편, 장치(10)는 결합 검정 샘플을 포함하는 많은 타입의 샘플에 대해 두드러진 이점을 제공하는 유동-통과 셀을 포함한다. 발명의 화학발광 검정을 실행하기 위한 장치의 부가 세부사항은 지정 공개된 PCT 출원 US 89/04854 및 U.S 90/01370에 공개된다.
장치(10)는 측정 셀(12), 유리하게 광전자증배관(PMT), 광전다이오우드, 전하 결합 장치(charge coupled device), 사진 필름 또는 유제 등일 수 있는 빛 검출/측정 장치(14), 및 유체가 셀을 향해, 셀을 통과하여, 그리고 셀로부터 수송되게 하는, 유리하게 연동 펌프인, 펌프(16)를 포함한다. 대안적으로, 좋은 대체 펌프가 사용될 수 있다. 셔터기구(18)가 셀(12)과 PMT(14) 사이에 제공되고 화학발광 측정 기간 동안 셀(12)에 PMT(14)를 노출시킬 때만 열려지도록 조절가능하게 가동된다. 셔터 기구는 예를 들면, 정비중엔 닫혀질 수 있다. 또한 장치(10)에 포함되지만 제1도에 도해되지 않은 것은 그 속에 각종 부품들을 넣고 화학 발광 측정 동안 어떠한 빛으로부터 PMT(14)를 막아주도록 계획된 차광 차우징이다.
셀(12) 그 자체는 플렉시글라스로 유리하게 구성될 수 있는 제 1 마운팅 블록(20)을 포함하며, 이는 유입관(22) 및 배출관(24)을 통과시킨다. 마운팅 블록(20)은 셀(12)이 상응하는 장치(10)의 가동동안 클리닝 및/또는 콘디쇼닝 및/또는 측정 용액을 보유하는 셀(12)의 샘플-보유볼륨(30)의 한측면을 형성하는 제2, 내부 표면(28) 및 제1, 외부 표면(26)을 가진다. 유입관 및 배출관(22,24)는 외부 표면(26)에서부터 내부 표면(28)까지 마운팅블록(20)을 통과하고 샘플-보유 볼륨(30)으로 통한다. 제 2 마운팅 블록(32)은 화학발광 성분에 의해 방출된 화학발광성 빛의 파장에서 실질적으로 투명한 제료로 유리하게 구성된다. 따라서 마운팅 블록(32)은 유리하게 유리, 플라스틱, 석영 등으로 형성되고 제 1 외부 표면(34) 및 제 2, 내부표면(36)을 가진다. 제 2 마운팅 블록(32)은 테플론 또는 그 밖의 비-오염성 재료로 유리하게 구성된, 환상 스페이서(38)에 의해 제1마운팅 블록(20)으로부터 분리된다. 따라서, 마운팅 블록(30)의 외부 표면(34)은 샘플-보유 볼륨(30)의 제2측면을 형성한다. 스페이서(38)는 내부 모서리(44)가 샘플-보유 볼륨(30)의 측벽을 형성하는 중공(42) 및 외부 부분(40)을 가진다. 외부 부분(40)은 제1 마운팅 블록(20)의 내부 표면(28)에서 제2 마운팅 블록(32)의 외부 표면(34)까지 밀폐하여 임의 용액이 두 표면들(28,34) 사이의 샘플-보유 볼륨(30)으로부터 새어나가는 것을 막는다.
유입관(22)은 스페이서(38)에 인접한 이들의 제1 말단(50)에서 샘플-보유 볼륨(30)과 교차하고 배출관(24)은 스페이서(38)에 인접한, 이들의 제2 말단(52)에서 샘플-보유 볼륨(30)과 교차한다. 이로써 유입관(22), 샘플-보유 볼륨(30) 및 배출관(24)의 병용은 셀(12)을 향한, 셀을 통과한 그리고 셀로부터의 좁은 폭의, 실질적인 층 흐름 용액에서 연속 흐름로를 제공한다.
펌프(16)는 유리하게 배출관(24)에 위치하여 샘플 볼륨으로부터의 용액을 유입관(22)내로 화살표 A 의 방향으로 끌어 당긴다. 용액은 유입관(22), 샘플-보유 볼륨(30) 및 배출관(24)을 통과하여 화살표 B의 방향으로 흘러 나갈 것이다. 대안적으로, 펌프(16)는 유입관(22)에 위치하며 장치(10)을 통과한 용액을 밀어 낼 수 있다. 유리하게, 유입관(22), 샘플-보유 볼륨(30) 및 배출관(24)을 통한 상기 동일한 흐름로는 셀(12)을 통과하는 모든 용액 및 유체에 사용됨으로서, 각 유체는 이전의 유체를 셀(12) 외부로 향하게 하는 유체역학적 클리닝 작용을 수반한다. 펌프(16)는 임의 시간 동안 셀내 특정 용액을 보유하기 위하여 그의 가동을 일시 중지하도록 조정될 것이다.
발명의 검정을 실행하기 위한 그 밖의 장치는 제8도 및 제9도에서 설명된다. 제8도는 유리한 화학발광 장치를 공개하지만, 본 발명의 방법은 장치(10)에서의 적용에 제한되지 않으며, 오히려 전구체를 트리거로 전환시키는 전기화학적 에너지를 제공하는 작업 전극 또는 다른 자극시키는 표면 및 표식 성분을 수집하기 위한 수단을 포함하는 다른 타입의 화학발광 장치에서도 이용될 수 있다. 본 발명의 방법이 정적 또는 흐름-통과 방식으로 실행될 수 있는 한편, 장치(10)는 결합 검정 샘플을 포함한 많은 타입의 샘플에게 두드러진 이점을 제공하는 흐름-통과 셀을 포함한다. 발명의 화학 발광 검정을 실행하기 위한 장치의 부가적인 세부사항은 지정된 공개 PCT 출원 US 89/04854 및 U.S 90/01370에 공개된다.
장치(10)는 전기화학적 셀(12), 유리하게 광전자증배관(PMT), 광전다이오우드, 전하 결합 장치(charge coupled device), 사진 필름 또는 유제 등일 수 있는 빛 감지/측정 장치(14), 및 유체가 셀을 향해, 셀을 통과하여, 그리고 셀로부터 수송되게 하는, 유리하게 연동 펌프인, 펌프(16)을 포함한다. 대안적으로, 좋은 대체 펌프가 사용될 수 있다. 셔터 기구(18)가 셀(12)과 PMT(14)사이에 제공되고 화학발광 측정 기간 동안 셀(12)에 PMT(14)를 노출시킬 때만 열려지도록 조절가능하게 가동된다. 셔터 기구는 예를 들면, 정비중엔 닫혀질 수 있다. 또한 장치(10)에 포함되지만 제1도에 도해되지 않은 것은 그 속에 각종 부품들을 넣고 화학발광 측정 동안 어떠한 외부 빛으로부터 PMT(14)를 막아주도록 계획된 차광 차우징이다.
셀(12) 그 자체는 유리하게 플렉시글라스로 구성될 수 있는, 제1 마운팅블록(20)을 포함하며, 이를 통해 유입관(22) 및 배출관(24)이 지나간다. 마운팅 블록(20)은 셀(12)이 상응하는 장치(10)의 조작동안 클리닝 및/또는 콘디쇼닝 및/또는 측정 용액을 보유하는 셀(12)의 샘플-보유 볼륨(30)의 한측면을 형성하는 제2, 내부 표면(28) 및 제1, 내부표면(26)을 가진다. 유입관 및 배출관(22,24)는 외부표면(26)에서부터 내부 표면(28)까지 마운팅 블록(20)을 지나가고 샘플-보유 볼륨(30)으로 통한다. 제2 마운팅 블록(32)은 화학발광 성분에 의해 방출된 화학발광 빛의 파장에서 실질적으로 투명한 재료로 유리하게 구성된다. 그러므로 마운팅 블록(32)은 유리하게 유리, 플라스틱, 석영등으로 형성되고 제1 외부 표면(34) 및 제2, 내부 표면(36)을 가진다. 제2 마운팅 블록(32)은 테플론 또는 그 밖의 비-오염성 재료로 유리하게 구성된, 환상 스페이서(38)에 의해 제1 마운팅 블록(20)으로부터 분리된다. 따라서, 마운팅 블록(30)의 외부 표면(34)은 샘플-보유 볼륨(30)의 제2 측면을 형성한다. 스페이서(38)는 내부 모서리(44)가 샘플-보유 볼륨(30)의 측벽을 형성하는 중공(42) 및 외부 부분(40)을 가진다. 외부 부분은 제1 마운팅 블록(20)의 내부표면(28)에서 제2 마운팅 블록(32)의 외부 표면(34)까지 밀폐하여 임의 용액이 두 표면들(28,34) 사이의 샘플-보유 볼륨(30)으로부터 새어나가는 것을 막는다.
유입관(22)은 스페이서(38)에 인접한 이들의 제1 말단(50)에서 샘플-보유 볼륨(30)과 교차하고 배출관(24)은 스페이서(38)에 인접한, 이들의 제2 말단(52)에서 샘플-보유 볼륨(30)과 교차한다. 이로써 유입관(22), 샘플-보유 볼륨(30) 및 배출관(24)의 병용은 셀(12)을 향한, 셀을 통과한 그리고 셀로부터의 좁은 폭의, 실질적은 층 흐름 용액에게 연속 흐름도를 제공한다.
도해된 구체예에서, 작업 전극(58)을 포함하는 작업 전극계(54)가 제1 마운팅 블록(20)의 내부 표면(28) 상에 설치된다. 다른 구체예에서, 유리하게 둘 이상의 작업 전극이 제공될 수 있다. 관심있는 전기화학 및 화학발광 반응이 일어날 수 있는 곳에 작업 전극(58)이 있다. 작업 전극(58)은 고체 전량계 전극이고 따라서 유리하게 백금, 금, 탄소 또는 상기 목적에 효과적인 그 밖의 재료로 구성된다. 작업 전극(58)에 접속된 선로 접속기(62)는 제1 마운팅 블록(20)을 통과하여 지나간다.
접속기(62)는 제2도에 도해된, 전압 조정(66)의 제1, 작업 전극 단자(64)에 접속된다. 유리하게 전압 조정(66)은 일정전위기가 전압 신호를 작업 전극(58)에 공급하고 임의로 화학발광 측정 동안 그곳에서 흘러 나오는 전류를 측정하는 방식으로 가동한다.
전압 조정(66)의 일정전위기 가동은 카운터 전극(56) 및, 임의로 그러나 유리하게, 기준 전극(70)을 통해 부가 실행된다. 카운터 전극(56) 및 작업 전극(58)은 화학반응에 전압을 가하고 샘플내에서 전구체의 트리거로의 전기화학적 전환을 자극하고/하거나 셀(12)의 표면을 클리닝 및 콘디쇼닝을 위한 에너지를 제공하는 샘플-보유 볼륨(30)내에서 용액에 퍼텐셜을 가하는 계면을 제공한다. 카운터 전극(56) 선로접속기(60)에 의해 전압 조정(66)의 제2, 카운터 전극단자(78)에 접속된다.
기준 전극(70)은 작업 전극(58)에 의해 가해진 전압이, 예를 들면, 기준에 대하여 +1.2 볼트로 언급되는 기준 전압을 제공한다. 기준 전극(70)은 유리하게 셀(12)로부터 이격된 위치(80)에서 배출관(24) 내에서 위치되고 선로접속기(82)를 통해 전압 조정(66)의 제3 기준 전압 단자(84)에 접속된다. 3 전극방식에서, 전류는 기준 전극(70)을 통하여 흐르지 않는다. 기준 전극(70)은 균형이 유지되고 공지되며 안정한 전압을 제공하도록 3 전압 가동방식으로 사용될 수 있으므로, 유리하게 은/염화은(Ag/AgCl)으로 구성되거나 포화 칼로멜 전극(SCE)이다. 전압 조정(66)은 작업 전극(58) 및 카운터/기준 전극으로서 전극(56)만을 사용하는 2전극 가동방식으로 실시할 수 있다. 상기 2 전극 가동 방식에서, 카운터/기준 전극(56)은 전압 조정(66)상의 전압 조정단자(78 및 84)에 전기적으로 접속된다. 상기 경우, 전압 조정(66)은 본질적으로 배터리로서 작동한다. 전압 조정(66)은 전압신호를 작업 및 카운터 전극(58 및 56)에 공급하고 임의로 각각의 전극을 통해 흐르는 전류를 측정한다. 기준 전극(70)은 대안적으로 덜 안정한 전압을 제공하지만, 접촉시 용액에 관해서 측정가능한, 백금, 금, 스테인레스강 또는 그 밖의 재료로 구성된 소의 준-기준(quasi-reference) 전극일 수 있다. 2 및 3 전극 방식 모두에 있어서, 기준 전극(70 도는 56)은 작업 전극(58)에 적용된 전압이 측정되는 데 대한 기준을 제공하는 목적을 충족시킨다. 균형이 유지된 전압 기준은 보통 더욱 유리하다고 고려된다. 전압 조정(66)은 그의 일정전위기 가동으로 기준 전극(70)에 대비한 작업 전극(58)에서 공지된 전압을 제공하는 한편 작업 전극(58)과 카운터 전극(56) 사이의 전류 흐름을 측정함으로써 다양한 전극을 조정한다. 상기 목적을 위한 일정전위기는 잘 알려졌으므로, 전압 조정(66)의 내부 구조는 상기-인용된 기능을 산출하는 임의의 통상적인, 시판용 일정전위기에 해당할 수 있지만, 그 자체로선 본 발명의 일부를 형성하지 않는다. 실제로, 장치(10)는 대안적으로 내부 전압 조정(66) 없이 구성될 수 있고, 전극(56, 58, 72, 74 및 70)에 요구된 전압 신호를 제공하기 위해 분리 조정되는 외부 일정전위기에 접속되도록 개조될 수 있다. 하기 서술된 바와 같은 특이방식으로 적용된 상기 전압 신호는 작업 전극(58)의 표면에 대한 그리고 유리하게 전체로서 셀(12)의 표면에 대한 반복가능한 초기 조건을 제공하며, 이의 특징은 화학발광 측정시 개선된 정확성에 상당히 공헌한다는 것이다.
펌프(16)는 유리하게 배출관(24)에 위치하여 유입관(22)내로 화살표 A 의 방향으로 용액을 샘플 볼륨으로부터 인입한다. 용액은 유입관(22), 샘플-보유 볼륨(30) 및 배출관(24)을 통과하여 기준 전극(70)을 지나고 화살표 B의 방향으로 흐를 것이다. 대안적으로, 펌프(16)는 유입관(22)에 위치하며 장치(10)을 통과한 용액을 밀 수 있다. 유리하게, 유입관(22), 샘플-보유 볼륨(30) 및 배출관(24)을 통한 상기 동일한 흐름로는 셀(12)을 통과하는 모든 용액 및 유체에 사용됨으로서, 각 유체는 이전의 유체를 셀(12) 외부로 향하게 하는 유체역학적 클리닝 작용을 수행한다. 펌프(16)는 임의 시간 동안 셀(12)내에 고유 용액을 보유하기 위하여 그의 가동을 일시 중지하도록 조정될 수 있다.
장치(10)의 흐름-통과 구조는 작업 전극에 가변성 전압이 가해지도록 또는 가동전 퍼텐셜에서 계속 유지되도록 하는 한편, 작업 전극(58)(또는 카운터 및 기준 전극 56,70)을 공기에 노출시키지 않고 하나 이상의 용액에 연속해서 노출되도록 한다. 기준 전극(70)에 대한 회로를 개방하는 공기에 대한 노출은, 작업 전극(58)상의 표면 조건의 재생산성을 파괴하는 미지의 무작위 전압 변동을 허용한다. 흐름-통과 구조는 전극계(54)가 청소되고 조절되는 시작단계, 및 하나 이상의 측정 파형 또는 소사(sweep)가 화학발광을 자극하는 추정 단계 사이에서 신속한 교호를 허용한다.
[검정 매질]
전극이 전구체 분자를 산화제로 전화시키는 전기화학에너지를 투입하며 상기 표식물이 산화되고 발광하는 계를 작동시키기 위해, 전극이 담그어지고 전구체 분자를 함유하는 전해질을 제공하는 것이 필요하다. 전해질은 그를 통해 전하가 이온에 의해 운반되는 상이다. 일반적으로, 전해질은 액체상이고, 물내 하나 이상의 염 또는 기타 종류, 유기 액체 또는 유기 액체의 혼합물, 또는 물과 하나 이상의 유기 액체의 혼합물의 용액이다. 그러나, 다른 형태의 전해질도 발명의 임의 구체예에서 유용하다. 예를 들면, 전해질은 유체--예컨대, 액체, 증기 또는 사류(supercritical fluid)--내에 하나 이상의 물질의 분산일 수 있거나, 고체, 증기 또는 사류내 하나 이상의 물질의 용액일 수 있다.
전해질은 적당하게 물내 염의 용액이다. 염은 바람직하게 나트륨 염 또는 칼륨 염일 수 있지만, 다른 양이온의 혼입도 양이온이 화학발광 상호작용 서열을 방해하지 않는 한, 임의 구체예에 적당하다. 염의 음이온은 포스페이트일 수 있고, 예를 들면, 다음 음이온의 사용도 발명의 임의 구체예에서--다시 한번, 선택된 음이온이 화학발광 상호작용 순서를 방해하지 않는 한 허용된다.
조성물은 수성이 아닐 수도 있다. 사류가 어떤 경우에 유리하게 이용될 수 있기는 하나, 비수성 조성물내 유기 액체로 이루어진 전해질을 활용하는 것이 더욱 전형적이다. 수성 전해질처럼, 비수성 전해질도 그를 통해 이온에 의해 전하가 운반되는 상이다. 보통, 상기는 염이 유기 액체 매질내에 용해됨을 의미한다. 적당한 유기 액체의 예는 아세토니트릴, 디메틸설폭시드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 메탄올, 에탄올, 및 전술한 것 둘이상의 혼합물이다. 실례로서, 유기 액체에 가용성인, 테트라부틸암모늄 테트라플루오로보레이트와 같은, 테트라알킬암모늄 염이 그들과 함께 사용되어 비수성 전해질을 형성할 수 있다.
전해질은, 발명의 임의 구체예에서, 완충계이다. 인산염 완충액이 종종 유리하다. 예는 인산나트륨/염화나트륨의 수용액, 및 인산나트륨/불화나트륨의 수용액이다.
[발명의 다른 양상]
본 발명은 또한 시약 조성물에 관계한다. 널리, 시약 조성물은 발명의 검정계의 성분 중 어느 하나 즉, (a) 전해질, (b) 화학발광 성분을 함유하는 표식 화합물, (c) 자기 반응성 입자를 포함한 입자들, (d) 분석대상 또는 분석대상의 유사체, (e) 분석대상 또는 그의 유사체의 결합 상대, (f) (d) 또는 (e)와 반응할 수 있는 반응성 성분, (g) 트리거 전구체 분자, 또는 (h) 화학발광-반응 증강제일 수 있다. 시약은 사용의 편의를 위해 각자 서로 결합될 수 있고, 즉, 2 성분, 3 성분, 및 고급 복합 성분 혼합물이 제조될 수 있는데, 단 계획된 검정에서 저장동안에는 그들의 기능을 손상시키도록 서로 반응하지 않는다. 바람직하게, 시약은 입자뿐만 아니라 하나 이상의 다른 성분을 함유하는 2-성분 또는 다성분 혼합물이다.
본 발명은 또한 키트에 관한 것이다. 키트는 상기 열거된 성분 (a) 내지 (h) 중 하나 이상을 함유하는 용기를 포함할 수 있거나 키트는 발명의 계 및 검정 방법에 사용하기 위한 모든 경우, 상기 성분의 혼합물로 이루어진 상기 서술된 바와 같은 하나 이상의 시약 조성물을 함유하는 용기를 함유할 수 있다.
[발명의 바람직한 구체예의 설명]
폭넓은 범위의 입자들이 발명의 입자-기재 검정에 이용될 수 있는 한편, 일반적으로 입자는 1.0 내지 5.0 g/mL의 밀도 및 바람직하게 1.1 내지 2 g/mL의 밀도를 가진다. 최적 밀도의 선택은 당분야내에 있으며, 중력-구동 검정에서의 설정 등급은 검정 속도 및 수집대내 복합체의 균일층은 창출하려는 바램사이에서 균형을 취한다.
폭넓은 범위의 평균 직경을 갖는 입자들도 이용될 수 있다. 0.001 내지 100의 평균 직경을 갖는 입자가 사용될 수 있고 바람직하게 입자는 0.01 내지 10의 평균 직경을 가진다.
검정 조성물내 입자들의 폭넓은 농도 범위 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 농도는 1-10,000/mL 내지 바람직하게 5-1000/mL 범위일 수 있다. 바람직하게, 입자들의 밀도, 그들의 크기 및 그들의 농도는 입자가 적어도 0.5 mm/분의 속도로 및 바람직하게 더욱 빠른 속도로 가라앉도록 선택된다.
발명 수행의 여과 방식에서, 여과 수단은 바람직하게 평균 직경으로서 측정된 기공 크기, 입자의 평균 직경의 널리 0.01 내지 90% 및 바람직하게 상기 직경의 10% 내지 90%를 가진다.
기술은 발명의 검정에 사용될 수 있는 다수의 자기 입자를 설명하였다. 예를 들면, U.S 특허 제4,628,037, 4,695,392, 4,695,393, 4,698,302, 4,554,088, U.K. 특허 출원 GB 2,005,019A 및 EP 0.180,384는, 성공적으로 사용될 수 있는 자기 입자들의 일종을 서술한다. 입자는 상자성 또는 강자성일 수 있고 자기 입자가 면역검정에 사용될 수 있기 위해 결합화합물이 커플링되는 각종 재료로 코우팅될 수 있다. 바람직하게 본 발명에 사용된 자기입자는 적어도 0.001 cgs 단위의 자화율(susceptibiblity)이고 바람직하게 자화율은 적어도 0.01 cgs 단위이다. 자기 입자는 넓은 범위의 밀도, 즉 물보다 실질적으로 낮은, 0.01 내지 5 g/mL 및 바람직하게 0.5-2 g/mL을 가질 수 있다. 입자 크기는 0.001-100및 되도록이면 0.01-10범위일 수 있다. 입자의 농도는 널리 1-10,000/mL 및 바람직하게 5-1000/mL 범위일 수 있다.
바람직하게 사용되는 자기 입자는 자기장이 전극 표면에서 제거된 후, 입자들을 멸자(滅磁)시키고 검정 셀을 털어낼 수 있기 위해, 실시예 EP 0,180,384에 서술된 바와 같은 낮은 잔류 자기성을 가진다. 바람직하게 자기 입자의 밀도, 농도 및 입자 크기는 침강 시간이 적어도 0.5 mm/분이 되도록, 바람직하게는 상기 속도 이상이 되도록 선택된다.
[검정]
다양한 검정이 본 발명이 방법을 사용하여 실행될 수 있다.
검정은 제2도에 제시된 대로 수행되었다. 반응에 기인한 생성물은 비오틴 및 화학발광 표식물로 표식되었다. 스트렙타비딘 비드는 비오틴 스트렙타비딘 결합에 의해서 이관능화 DNA를 포획하고 나서 세척된다. 그 다음 비드 결합 생성물은 화학발광 표식물을 검출하는 분석에 적용된다.
검정은 제3도에 제시된 대로 수행되었다. 비오티닐화된 PCR 생성물은 스트렙타비딘 비드 상에서 포획되었고 비오티닐화되지 않은 가닥은 제거되었다. 그다음 비드 결합 PCR 생성물은 화학발광 표식 올리고 뉴클레오티드와 함께 혼성화된다. 그리고 나서 표식물을 감지하기 위한 화학발광 분석이 행해진다.
검정은 제4도에 제시된 대로 수행되었다. 혼성체는 스트렙타비딘 비드 상에서 포획되었다. 그리고 나서 세척없이 화학발광 분석이 행해진다.
[실시예]
[실시예 1-11]
[계기화, 재료 및 방법]
(1) 계기화
제1도에 설명된 흐름-통과 장치를 사용하였다.
태플론 가스킷(3.81 MM(0.15'')두께)
플락시글라스 명판
유입 튜우빙 = 1.0668 MM(0.042'') id 폴리프로필렌
흡인률 : 0.01-5 mL/분 가변성.
Hamamatsu R374 PMT (저이득 적색 감지관)를 사용하는 광도계; PMT
전압 가변 0-1400V
[실시예 1]
[미립자를 검출하기 위한 화학발광 장치 및 방법]
침강 셀을 사용하는 자기 수집.
미립자물을 침강시키기 위해 자기력을 사용하여 검정을 수행하기 위한 셀을 제5도에 제시한다. 참조번호 21은 투명한 창을, 참조 번호 22는 가스킷을, 참조번호 23은 셀 블록내 유입을, 참조 번호 25는 샘플 배출을, 참조 번호 26은 셀 블록 자체를 그리고 참조 번호 27은 전자석을 말한다.
셀 블록의 평면을 수평으로 세운다. 완충액내 표식미립자(Dynal)을 연동 펌프를 사용하여 셀내로 인입시킨다. 미립자가 세포에 도착한 후 펌프를 끈다. 셀 챔버내 미립자를 12 볼트 및 1.5 amps에서 작동하는 전자석(27)을 사용하여 생겨난 자기장에 의해 수집대로 인입시킨다. 전자석의 적용에 의해, 미립자의 침착 속도를 미립자가 오직 중력으로 인해 침강할 때 관찰한 것보다 더욱 월등히 증가시킨다.
[실시예 2]
[미립자의 침착을 위한 방법 및 화학발광 장치]
수집셀을 사용하는 자기 수집
검정을 제1도에 서술된 바와 같은 셀 내에서 실행한다. 제1도에 관하여, 참조 부호 32는 투명한 창을, 참조 부호 38은 가스킷을, 참조부호 22는 셀 블록내 유입을, 참조부호 20은 셀 블록 그 자체를, 참조부호 24는 샘플 배출을 그리고 참조부호 37은 영구자석을 말한다.
셀 블록의 평면을 수평으로 배향한다. 완충액내 표식 미립자(Dynal)을 연동 펌프(11)에 의해서 셀로 가져간다. 샘플 투입 전에, 영구자석(37)을 수집대 아래로 0.8890 mm(0.035 인치)의 거리에서 바로 접하여 위치시킨다. 샘플이 셀로 끌려감에 따라, 미립자는 자석의 영역에 의해 형성된 대로, 수집대내에 모인다. 펌프를 끈다. 수집 시간이 길수록, 더 많은 입자가 모인다.
[실시예 3]
[미립자의 침착을 위한 자석의 사용]
[자기장 배향]
영구자석이든 전자석이든 간에 자석에 끌린 미립자는 자기장의 배향에 따라 정렬한다. 제6도는 셀 표면의 근처에서 셀 블록(8 및 4), 각각의 상면에 평행(A) 및 수직(B)인 결과의 입자 배열 및 자기장을 나타낸다. 수집대내 입자의 배향이 트리거와의 후속 접촉의 효율에 영향을 미칠 것임은 당업자에게 명백해질 것이다.
[실시예 4]
[여과에 의한 입자 수집 및 농도]
자기 반응성, 비-자기 반응성, 및 폭넓은 범위의 밀도인 미립자를 유리하게 막 여과기의 표면 상의 여과에 의해 수집될 수 있다. 발명의 한 구체예에서, 입자의 수집이 구멍의 막힘을 야기시키지 않을 정도의 충분한 높은 표면 밀도에서 그리고 입자의 직경보다 더 작지만 되도록이면 입자 직경보다 실질적으로 더 작은 구멍 크기를 갖는 여과막의 부분을 통해 입자를 펌핑한다. 그 다음 입자로부터 화학발광을 유발하고 발광을 측정하여 입자상의 화학발광 표식물의 양을 측정할 목적으로 트리거를 통해 트리거 용액을 펌핑함으로써 수집 입자를 트리거에 노출시킨다.
또 하나의 구체예에서, 상기 서술된 바대로 구멍 크기를 갖는 막 여과기를 흡수성 재료의 표면 상에 부착시키거나 놓아 모세관 또는 심지가 여과기를 통해 유체의 흐름을 유발하는 임의 장치를 요구하지 않고 막 여과기를 통해 미립자를 함유한 유체를 동시에 인입시킬 것이다.
적절한 구체예에서, 상기 서술한 바와 같은 입자 크기를 갖는 막 여과기를 막의 표면이 화학발광 장치내 작업전극 구실을 할 수 있게 금속 또는 그 밖의 전기 전도성 재료의 얇은 필름으로 코팅한다. 전도성 막을 마이크로일렉트로닉스 장치의 이차가공에 흔히 사용된 방법, 즉, 열 증발 또는 증착에 의해 막의 표면에 쉽게 적용시킨다.
그러한 여과기를 유동 셀에 쉽게 설치하여 유체의 흐름도가 여과기를 통과하도록한다. 흐름내 입자를 임의 외부 세척 장치없이 이원적 검정을 실행하기 위한 신속하고 간단한 수단에게 현장 제공하여 흐름내 입자를 여과기에 걸리게 하고 쉽게 세척한다.
[실시예 5]
[원심분리법에 의한 입자 수집 및 농축]
제7도에 제시된 회전 유동 셀은 발광을 측정하기 위해 복합체를 수집하는 또 하나의 수단을 제공한다. 회전 운동을 셀에 전하는 동안 검정 용액(61)을 회전마개(63)를 통해 셀(62)내로 펌핑한다. 더욱 밀한 복합체 입자를 수집대내로 농축시킨다. 셀은 여진히 회전하는 한편 용액은 셀의 외부로 통과한다. 셀 창(67)을 통과한 빛 출력을 광전자증배관(65)으로 측정한다. 빛 출력을 수집대로부터 관리하고 곡선 거울 표면(66)에서의 반사를 셀의 중앙에 놓는다. 그 다음 셀을 다음 순환을 위해 씻고 닦는다. 멈췄거나 회전하는 셀을 가지고 상기를 실행할 수 있다.
[실시예 6]
[적당한 표면 농도에서 표식된 비-특이 단백질을 수반한 입자의 코팅]
4.5비코팅 자기 반응성, 폴리스티렌 M-450 DYNABEADS(DYNAL, Oslo, Norway) 30 mg(1 mL)를 150 mM 인산염 완충액 pH 7.5 용액을 수반한 자기 분리에 의해 2mL/세척을 사용하여 세척하였다. 0.05% 티메라솔을 가진 인산염 완충 살린(PBS) 1m 내 아크리디늄 에스테르 표식 항체(London Diagonostics LumaTag TSH 표식항체) 150을 입자에 첨가하였다. 상기 혼합물을 교반과 함께 실온에서 밤새 항온처리시킨다. 그다음 용액을 입자로부터 자기 분리하였고 유체를 제거하였다. 미반응 부위를 막기 위해, 0.05% 아지드나트륨을 가진 3% BSA/PBS 1mL을 입자에 첨가하였고, 결과의 용액을 실온에서 2 시간 항온처리하였다. 입자를 5회(2mL/세척)세척한 다음, 최종적으로 저장 중 동일 완충액 6mL 내에 재현탁시켰다.
[실시예 7]
[자기 반응성 입자를 사용하는 화학 발광 측정]
자기 반응성 입자(Dynal, Oslo, Norway)를 실시예 6에 서술된 대로 표식 단백질로 코팅하였다. 코팅 입자를 인산염 완충액으로 3회 세척한 후 0.5% 과산화 수소 및 0.1 NHO3내 30/mL 현탁액 2mL을 만든다. 연동 펌프를 사용하여, 입자 현탁액 500유동 셀 내로 인입시킨다. 입자들이 셀을 통해 흐를 때, 그들을 자석에 의해 수집대 내로 유인하고 농축시킨다. 입자를 자기적으로 수집한 후, 0.25 N NaOH, 0.5% 과산화수소의 용액을 셀을 통과하여 인입시키는 동안, 화학발광을 입자가 수집대내에 농축되는 곳인 유동 셀 상에 집중된 Hamamatsu R374 광전자증배관을 사용하여 측정한다.
[실시예 8]
[물리적으로 흡착된 양(sheep) 항-갑상성 자극 호르몬(TSH) 코팅 다이날 입자의 제조]
표면상에 -OH 잔기를 가진 4.5비코팅 자성, 폴리스티렌 입자(DYNAL, DYNABEADS M-450 DYNAL A.S. Oslon Norway) 1mL을 150mM 나트륨 카르보네이트/비카르보네이트 pH 9.6용액을 수반한 자기 분리에 의해 2mL/세척을 사용하여 세척한다. 카르브/비카르브 용액 1mL 내 정제된 단일분지계 항-TSH 항체(목록 번호 5064031, Ventrex Laboratories, Inc., Portland, Maine) 0.5mg을 입자에 첨가한다. 상기 혼합물을 혼합하면서 실온에서 밤새 교반한다. 그 다음 용액을 입자로부터 자기적으로 분리하고 제거한다. 0.05% 아지드나트륨을 수반한 3% BSA/PBS 1mL을 첨가하고 미반응 부위를 막기 위해 교반하면서 실온에서 2시간 항온처리한다. 입자를 5회(2mL/세척)세척한 다음 최종적으로 저장 중 동일 완충액 1mL 내에 재현탁시킨다. 최종 농도는 3 중량%이다.
[실시예 9]
[갑상선 자극 호르몬(TSH)에 대한 1단계 분리 샌드위치 검정]
혈청 캘리브레이터(London Diagnostics TSH LumiTAG Kit) 100, 인산염 완충액 내 LumaTag TSH 아크리디늄 에스테르-표식 항체(London Diagnostics) 25및 인산염 완충액 내 항-TSH-DYNAL 입자(실시예 8) 25를 합하고 혼합하면서, 실온에서, 15분 동안 폴리프로필렌관 내에서 항온처리한다. 그 다음 입자를 자기 분리에 의해 세척한 다음 pH 4, 10 mM 카르보네이트/비카르보네이트 완충액 500에 재현탁시킨다. 상기 세척 과정을 2회 더 반복하였다. 입자를 유동 셀(실시예 2) 내로 인입시키고 자기적으로 수집하고 화학 발광 반응을 자극하기 위한 용액을 유동 셀(0.5% 과산화수소, 0.25N NaOH)을 통해 인출한다. 각 샘플에 대한 화학 발광을 실시예 2에 서술된 대로 측정한다. 화학발광 세기는 샘플에 존재하는 분석물의 농도에 직접 비례한다(분석물의 농도 증가에 따라 세기 증가).
[실시예 10]
[갑상선 자극호르몬(TSH)에 대한 1단계 비 분리 샌드위치 검정]
혈청 캘리브레이터(London Diagnostics TSH LumiTAG Kit) 100, 인산염 완충액 내 LumaTag TSH 아크리디늄 에스테르-표식 항체(London Diagnostics) 25및 인산염 완충액 내 항-TSH-DYNAL 입자(실시예*) 25를 합하고 혼합하면서, 실온에서, 15분 동안 폴리프로필렌관 내에서 항온처리한다. 결과를 읽기 전에, pH 4 100 mM 카르보네이트/비카르보네이트 1mL를 첨가한다. 입자를 유동 셀 내로 인출하고(실시예 2), 자기적으로 수집하고, 화학 발광 반응을 자극하기 위한 용액을 유동 셀(0.5% 과산화수소, 0.25N NaOH)을 통해 인출한다. 각 샘플에 대한 화학 발광을 실시예 2에 서술된 대로 읽는다. 화학발광 세기는 샘플에 존재하는 분석물의 농도에 직접 비례한다(분석물의 농도 증가에 따라 세기 증가).
[실시예 11]
[트리거를 발생시키기 위해 효소를 사용하는 화학발광 TSH 면역검정]
고체상으로서 자기 반응성 미립자를 그리고 표식물로서 아크리디늄 에스테르를 사용할 때, 실시예 2에 서술된 장치를 사용하여 TSH 면역검정을 실행할 수 있다. 효소, 포도당 산화효소를 사용하여 트리거의 전구체(포도당)를 트리거(과산화수소)로 전환시킨다. 효소 포도당 산화효소는 포도당을 글루콘산 및 과산화수소로 산화시키는 것을 촉매한다. 과산화수소의 존재하에서 아크리디늄 에스테르를 들뜬 상태로 산화시킨다. 산화된 들뜬 생성물의 바닥상태로의 후속 복귀는 정량되는 빛의 방출을 야기시킨다. 특이항체 및 효소 포도당 산화 효소로 코팅된 자기 미립자를 사용할 수 있다(항체 및 효소(sigma chemical) 둘다 0.5mg이 코팅을 위한 입자에 첨가됨을 제외하고는 실시예 8에서 처럼 제조됨). 대안적으로, 각 시약(항체 또는 효소)으로 코팅된 분리입자를 혼입하고 검정에서 사용할 수 있다(실시예 8에서 서술된 대로 분리 제조됨).
TSH 면역 검정은 당분야에 공지된 2-부위 샌드위치 검정을 근거로 한다. 단일 분지계 항-TSH 항체 코팅 자기 미립자를 실시예 8에 서술된 대로 제조한다. 효소 포도당 산화효소 코팅 자기 미립자를 항체 코팅 자기 미립자와 동일한 방법으로 제조한다. 아크리디늄 에스테르 표식 단일분지계 항-TSH 항체 및 TSH 스탠다드를 London Diagnostics로부터 얻는다. 효소 기질 용액은 D-포도당(100 mg/ml)을 함유한 100 mM 인산칼륨 완충액으로 구성된다.
일련의 관(1275 mm 폴리프로필렌)을 조립하고 검정될 샘플 및 표준물에 따라 표식시킨다. 표준물 또는 샘플 또는 대조군 100, 아크리디늄 에스테르-표식 항체 100및 항-TSH 항체 및 효소 코팅 미립자의 혼합물 100를 각 관에 첨가한다. 관을 15분 동안 혼합시키면서 실온에서 항온 처리한다. 항온처리하고 나서, pH 4, 100mM 카르보네이트/비카르보네이트 완충액 1ml를 첨가한다. 입자를 유동 셀(실시예 2)내로 인출하고, 자기적으로 수집하며 포도당 기질 용액을 유동 셀내로 인출한다. 각 샘플에 대한 화학발광은 실시예 2에서 서술된 대로 읽는다. 화학발광 세기는 샘플에 존재하는 분석물의 농도에 직접 비례한다(분석물의 농도 증가에 따라 세기 증가).
[실시예 12-14]
[계기화, 재료, 및 방법]
(1) 계기화
제8도 및 제9도에 서술된 대로, 3가지 전극을 이용하는 유동-통과 장치를 사용하였다.
작업 전극 -- Au 디스크, 3mm 직경
카운터 전극 -- Au 디스크, 3mm 직경
기준 전극 -- Ag/AgCl
태플론 가스킷(3.81 MM(0.15'')두께)
플락시글라스 면관
유입 튜우빙 = 1.0668 MM(0.042'') id 폴리프로필렌
흡인률 : 0.01-5 mL/분 가변성.
일정 전위기 : 마이크로프로세서 조절
Hamamatsu R374 PMT (저이득 적색 감지관)를 사용하는 광도계;
PMT 전압 가변 0-1400V
[실시예 12]
[중력에 의해 미립자를 수집하기 위한 장치 및 방법]
제10도에 제시된 바와 같은 셀 내에서 측정을 수행한다. 중력을 사용하여 검정을 수행하기 위한 장치를 나타내는 제10도를 참조한다. 장치의 구성요소는 참조번호 11에 의해 확인된 투명한 창, 참조번호 12에 의해 확인된 가스킷, 유입(13)을 포함하는 블록, 작업전극(14), 카운터 전극(15) 및 배출구멍(16)을 포함한다. 셀 블록의 평면이 수평, 즉 지구 중력장의 방향과 수직이다. 완충액내 표식 미립자(Dynal)를 연동 펌프를 사용하여 셀로 인입시킨다. 펌프를 입자가 셀에 도착하면 끈다. 셀 챔비내 미립자는 작업 전극 표면상에 낙하한다. 미립자의 낙하 속도를 10mm 의 거리 동안 0.5 mm/분으로 대략 일정하다고 예정한다. 침강하는 입자수는 시간과 낙하 속도의 함수이다. 화학 발광 세기는 작업 전극상에 침강하는 입자수에 비례한다. 표면에 도달하는 입자수, 즉 화학발광 세기를 작업 전극 상에서 유체 샘플의 높이에 의해 제한한다.
[실시예 13]
[미립자의 침착을 위한 화학발광 장치 및 방법]
수집셀을 사용하는 자기 수집
제8도에 서술된 바와 같은 셀내에서 검정을 실행한다. 제8도에 관하여, 참조번호 32는 투명한 창을, 참조번호 38은 가스킷을, 참조번호 22는 셀 블록내 유입을, 참조번호 58은 작업전극을, 참조번호 35는 셀블록 자체를, 참조번호 24는 샘플 배출을 그리고 참조번호 37은 영구자석을 말한다.
셀 블록의 평면을 수평하게 배향시킨다. 화학발광 완충액내 표식 미립자(Dynal)을 연동 펌프를 사용하여 전기화학 셀로 인입시킨다. 샘플 투입 전에, 영구 자석(34)을 (0.889 mm(0.035 인치)의 거리에서 작업전극/용액 계면 바로 아래에 위치시킨다. 샘플이 셀로 인입됨에 따라, 미립자들은 수집대내에 모이고, 예를 들면 자석의 영역에 의해 한정된 대로, 작업 전극 상의 지역위에 침착한다. 전 샘플이 침강된 후 펌프를 끄고 자석을 철수한다. 수집 시간이 길수록, 더 많은 입자가 침착한다. 작업전극상의 입자 농도 증가는 증가된 화학발광 세기를 결과시킨다.
[실시예 14]
[자기 반응성 입자를 사용하는 화학발광 측정]
자기 반응성 입자(Dynal, Oslo, Norway)를 실시예 6에 서술된 대로 표식 단백질로 코팅한다. 코팅 입자를 인산염 완충액으로 3회 세척한 후 pH 4, 100mM 카르보네이트/비카르보네이트 완충액내 30/mL 현탁액 2mL을 제조한다. 연동 펌프를 사용하여, 입자 현탁액 500유동 셀 내로 인입시킨다. 입자가 작업전극으로 유동할 때, 그들을 자석에 의해 작업전극상에 끌어들이고 농축시킨다. 입자가 자기적으로 수집된 후, 0.25 N NaOH의 용액을 셀을 통해 인입시킨다. 전구체 분자가 하기 하나 이상의 방법에 의해 트리거 분자로 전환시킴으로써 화학발광을 발생시킨다:
(1) 퍼텐셜 파형을 전기화학 전극을 적용하여 물(전구체)를 산화시켜, 작업 전극에서 과산화 수소 및 다른 산화시키는 종류(트리거)를 형성한다. 과산화수소 및 다른 산화사키는 종류는 아크리티늄 에스테르 표식물이 화학 발광 반응을 자극한다.
(2) 용액에 용해된 산소(전구체)가 환원되어 식에 따라 과산화수소(트리거)를 형성할 수 있도록 퍼텐셜 파형을 전기화학 전극에 적용한다.
상기 전기화학 반응은 포화 칼로멜 전극에 비해 작업 전극에 대략 -0.4V의 적용시 일어난다. 과산화수소는 아크리디늄 에스테르 표식물의 화학 발광 반응을 자극한다.
(3) 물의 산화 전기분해에 의해 작업 전극에서 산소가 발생되도록 퍼텐셜 파형을 전기화학 전극에 적용한다. 그 다음 물의 전기분해에 의해 창출된 산호(전구체)가 환원되어 과산화수소(트리거)를 형성하도록 파형을 전기화학 전극에 적용한다. 과산화수소는 아크리디늄 에스테르 표식물의 화학발광 반응을 자극한다.
입자들이 작업 전극 상의 수집대내에 농축되었던 유동 셀 상에 집중된 Hamamatsu R374 광전자증배관을 사용하여 화학발광을 측정한다.
Claims (20)
- 하기 단계들로 구성된, 샘플내에 존재할 수 있는 분석대상물에 대한 결합검정 수행 방법: (a) (i) 상기 샘플; (ii) 자극될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및 (iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 입자들을 함유하는 조성물을 형성하고; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고; (c) 수집대내에 상기 복합체를 수집하고; (d) 상기 표식물이 발광하도록 상기 표식물을 자극할 수 있는 트리거를 상기 수집대 내로 투입하며; (e) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
- 제1항에 있어서, 상기 트리거는 표식물이 산화시킬 수 있는 산화제인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 입자들은 자기(磁氣) 반응성이고 상기 복합체를 수집대 내에 자기적으로 수집하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 산화제가 과산화 또는 초과산화 수소인 방법.
- 제1항에 있어서, 검정-수행-물질이 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 전구체를 전환시키기 위한 효소를 함유하는 것을 특징으로 하고, 상기 크리거가 전구체인 방법.
- 제5항에 있어서, 효소가 포도당 산화효소이고, 전구체가 포도당이며 산화제가 과산화수소인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 입자가 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 전구체를 전환시키기 위한 효소를 함유하는 것을 특징으로 하고, 상기 트리거가 전구체인 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 입자가 0.1-5 g/mL의 밀도를 갖는 검정 방법.
- 제7항에 있어서, 평균 직경으로서 측정된 상기 입자의 크기가 0.001-100범위인 검정 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 조성물내 입자의 농도가 1-10,000/mL인 검정 방법.
- 하기로 구성된, 화학발광 결정에 기초한, 샘플내에 존재할 수 있는 분석대상물에 대한 결합 검정 수행 장치 : (a) 샘플 함유 볼륨을 형성하고 수직 원주대를 갖고 유입 및 배출 수단을 갖고, 셀 및 상기 원주대의 실질적인 볼륨 아래에 위치된 자기장을 발생시키기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 셀; 및 (b) 수집대 내에 발생된 화학발광을 결정하기 위한 수단.
- 하기 단계들로 구성된, 샘플내에 존재할 수 있는 분석 대상물에 대한 결합 검정 수행 방법 : (a) (i) 상기 샘플; (ii) 자극될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및 (iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 입자를 함유하는 조성물을 형성하고; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 상기 표식 성분 및 입자를 포함하는 복합체를 형성하고; (c) 전극의 표면에서 상기 복합체를 수집하고; (d) 상기 표식물을 트리거와 접촉시킴으로써 발광하도록 유발시키며, 이때 상기 트리거는 전기화학에너지의 도입시 전구체 분자의 전환에 의해 현장에서 형성되며; (e) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
- 제12항에 있어서, 상기 트리거가 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 입자가 자기 반응성이고 상기 복합체를 전극의 표면에서 자기적으로 수집하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 분자가 물이고, 상기 트리거는 과산화 또는 초과산화수소인 방법.
- 하기 단계들로 구성된, 샘플에 존재할 수 있는 분석 대상물에 대한 결합 검정 수행 방법 : (a) (i) 상기 샘플; (ii) 산화될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; (iii) 분석물 및/ 또는 상기 검정-수행-물질과 특이하게 결합할 수 있는 다수의 코팅 자기 입자들; 및 (iv) 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 자기적으로 전환될 수 있는 분자를 함유하는 조성물을 형성하고; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고; (c) 상기 복합체를 전극의 표면에서 자기적으로 수집하고; (d) 상기 표식물이 산화되고 발광하도록상기 전극에 전압을 걸어 상기 분자를 상기 산화제로 전환시키며; (e) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
- 하기 단계들로 구성된, 샘플내에 존재할 수 있는 분석 대상물에 대한 결합 검정 수행 방법 : (a) (i) 상기 샘플; (ii) 산화될 때 발광할 수 있는 표식화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및 (iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 코팅된 자기 입자들을 함유하는 조성물을 형성하고; (b) 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 전기화학적으로 전환될 수 있는 분자를 상기 조성물에 투입하고; (c) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식화합물을 포함하는 복합체를 형성하고; (d) 상기 복합체를 전극의 표면에서 자기적으로 수집하고; (e) 상기 표식물이 산화되고 발광하도록, 상기 전극에 전압을 걸어 상기 분자를 상기 산화제로 전환시키며; (f) 방출된 발광을 검출하며 분석대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
- 하기 단계들로 구성된, 샘플내에 존재할 수 있는 분석대상물에 대한 결합 검정 수행 방법 : (a) (i) 상기 샘플 ; (ii) 산화될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및 (iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 코팅된 자기 입자들을 함유하는 조성물을 형성하고; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고; (c) 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 전기화학적으로 전환될 수 있는 분자를 상기 조성물에 투입하고; (d) 상기 복합체를 전극의 표면에서 자기적으로 수집하고; (e) 상기 표식물이 산화되고 발광하도록, 상기 전극에 전압을 걸어 상기 분자를 상기 산화제로 전환시키며; (f) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
- 하기 단계들로 구성된, 샘플내에 존재할 수 있는 분석 대상물에 대한 결합 검정 수행 방법 : (a) (i) 상기 샘플 ; (ii) 산화될 때 화학발광할 수 있는 표식 화합물에 연결된 성분을 함유하는 검정-수행-물질; 및 (iii) 분석물 및/또는 상기 검정-수행-물질과 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 코팅된 자기 입자들을 함유하는 조성물을 형성하고; (b) 상기 조성물을 항온처리하여 입자 및 상기 표식 화합물을 포함하는 복합체를 형성하고; (c) 상기 복합체를 전극의 표면에서 자기적으로 수집하고; (d) 상기 표식물을 산화시킬 수 있는 산화제로 전기화학적으로 전환될 수 있는 분자를 상기 조성물에 투입하고; (e) 상기 표식물이 산화되고 발광하도록, 상기 전극에 전압을 걸어 상기 분자를 상기 산화제로 전환시키며; (f) 방출된 발광을 검출하여 분석 대상물의 샘플로부터의 존재 또는 부재를 결정한다.
- 하기로 구성된, 화학 발광 결정에 기초한, 샘플내 존재할 수도 있는 분석 대상물에 대한 결합 검정 수행 장치 : (a) 유입 및 배출 수단을 갖고 수직 원주대를 갖고 샘플 함유 볼륨을 형성하고, 셀 및 상기 원주대의 실질적인 볼륨 아래에 위치된 전극 및 자기장을 발생시키기 위한 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 셀; 및 (b) 상기 전극에 전압을 거는 수단; 및 (c) 수집대내에서 발생된 화학발광을 결정하는 수단.
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