KR100203512B1

KR100203512B1 - 재조합 코아 스트렙트아비딘

Info

Publication number: KR100203512B1
Application number: KR1019940701409A
Authority: KR
Inventors: 코페츠키 에르하르트; 루돌프 라이너; 그로쓰만 아델베르트
Original assignee: 추후제출; 뵈링거 만하임 게엠베하
Priority date: 1991-10-28
Filing date: 1992-10-28
Publication date: 1999-06-15
Also published as: EP0612325A1; EP0612325B1; DE4135543A1; US5672691A; US5489528A; DE59209981D1; ES2199218T3; CA2122135C; JP2621025B2; WO1993009144A1; AU2875492A; JPH06510434A; FI941947A; AU659240B2; ATE239036T1; FI941947A0; CA2122135A1

Abstract

본 발명은 숙주 세포를 코아 스트렙트아비딘을 코드하는 DNA로 형질전환 시키고, 형질전환된 숙주 세포를 적당한 조건하에 배양시키고, 코아 스트렙트아비딘을 코드하는 DNA를 발현시키고, 그리고 재조합 코아 스트렙트아비딘을 숙주 세포 또는 배양배지로부터 분리하는, 재조합 코아 스트렙트아비딘의 분리 방법에 있어서, (a) SEQ ID NO. 1로 표시되는 누클레오티드 서열 또는 (b) 유전자 코드의 축퇴성의 범주내에서 누클레오티드 서열(a)에 상응하는 누클레오티드 서열을 가지는 코아 스트렙트아비딘을 코드하는 DNA가 사용되는 것을 특징으로 하는 재조합 코아 스트렙트아비딘의 분리방법에 관한 것이다.

Description

재조합 코아 스트렙트아비딘

천연 형태의 스트렙트아비딘은 4량체 단백질이며, 각각의 소단위는 159개의 아미노산 길이이고 분자량은 16,450Da이다. 스트렙트아비딘은 스트렙토미세스 아비디니(Streptomyces avidinii)의 배양 여과물로부터 수득된다: [참조 : Chaiet, L. et al., Antimicrob Agents Chemother. 3(1963), 28-32]. 계란의 난백으로부터 단리되는 동종 단백질 아비딘의 특성과 같이, 스트렙아비딘의 특성은 수용성 비타민 H(d-비오틴)에 대한 예외적으로 강력한 비-공유결합이다. 비오틴 한 분자는 스트렙트아비닌 소단위 하나에 결합한다. 즉, 비오틴 4개 분자가 사량체에 결합한다. 이 결합의 해리 상수는 10^-15몰/ℓ이다. 아비딘과는 대조적으로, 스트렙토미세스 아비디니로부터 유도되는 스트렙트아비딘은 글리코실화되지 않으며, 황을 함유하는 아미노산을 전혀 함유하지 않고, 약 pH 6.5에서 낮은 등전점을 갖는다. 아비딘-비오틴시스템 및 특히 스트렙트아비딘-비오틴시스템은 이미 진단 및 분자생물학 분야에서 광범위하게 사용되어 왔다: [참조 : Wilchek, M. and Bayer, E.A., Methods Enzymol. 184(1990), 5-13 및 14-45]. 비오틴-스트렙트아비딘 시스템을 사용하는 실례는 비오틴 또는 스트렙트아비딘을 목표 분자, 예컨대 분석물에, 또는 예컨대 시약 용기표면, 크로마토그래피 배지 또는 생체고분자물질(biopolymer)과 같은 표면에 부착시켜 목표 분자를 고정화시키거나 검출할 수 있게 하는 것이다.

스트렙트아비딘은 스트렙토미세스 아비디니의 배양 여과물로부터 분비된 단백질로서 분리하는 것이 일반적이다. 그러나, 이런 스트렙트아비딘 제조물은 발효 (긴 발효기간) 또는/및 정제 과정 동안의 단백질 가수분해로 인해 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 서열에 관해서는 이질적이다: [참조 : Argarana, C.E. et al., Nucl. Acids Res. 14 (1986) 1871-1882; Bayer, .. E.A. et al., Methods Enzymol,. 184 (1990), 80-89; Phler, A. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 13933-13937; Hendrickson, W.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86(1989) 2190-2194; Bayer, E.A. et al., Biochem. J. 259(1989) 369-376]. 또한 완전한 천연 스트렙트아비딘은 응집하려는 경향이 있다; [참조 : Phler, A. et., J. Biol. Chem. 262(1987) 13933-13937; Bayer, E. A. et al., Biochem. J. 259(1989) 369-376; Bayer, E.A. et al., J. Biochem. Biopys. Methods 13(1986) 103-112]. 결과적으로, 천연 또는 생물학적 활성의 단배질분해로 인해 짧아진 스트렙트아비딘 단백질을 스트렙토미세스 아비디니로부터 재생가능하게 분리하는 것은 어렵다.

또한, 분리과정 중에 이미 발생하는, 올리고머를 생성시키는 천연 스트렙트아비딘의 응집 및 천연 스트렙트아비딘의 저용해도 [참조 : Phler, A. et al., J. Biol. Chem. 262(1987), 13933-13937]는 스트렙트아비딘이 스트렙트아비딘-비오틴계에 사용되는 경우 문제를 야기시키는데, 이는 스트렙트아비딘의 정확하게 측정할 수 없는 부분이 반응 혼합물로부터 배제되어 측정된 결과의 곡해가 가능하기 때문이다.

천연 스트렙트아비딘의 또 다른 단점은 발효 및 제조과정 동안에 천연 스트렙트아비딘이 이것의 N-말단 및 C-말단에서 제한된 정도로 단백질 분해적으로 처리된다는 것이다. 따라서, 통상 상이한 분해 생성물의 혼합물이 얻어지는 것이 일반적이고, 이러한 단백질분해적 처리의 최종 생성물은 약 125 내지 127개의 아미노산을 갖는 코아단백질이다: [참조 : Pahler, A. et al., J. Biol. Chem. 262(1987) 13933-13937; Bayer, E.A. et al., Bilchem. J. 259(1989) 369-376]. 단백질분해적 프로세싱은 비오틴 콘쥬게이트에 대한 스트렙트아비딘의 결합 특성을 개선시킨다 : [참조 : Bayer, E.A. et al., Biochem, J. 259(1989) 369-376]. 그러나, 통상적으로 얻어지는 분해 생성물들의 혼합물은 정확하게 재생가능한 결합 특성을 가지고 있지 않아서 측정된 결과들의 곡해가 있을 수 있다.

스트렙트아비딘의 재조합체 제조 방법은 EP-B 0 198 015호에 기재되어 있다. 천연 스트렙아비딘 신호 서열에 의한 천연 스트렙트아비딘의 대장균에서의 이종 발현 및 분비는, 페리플라즈마(periplasma)로 분비되는 스트렙트아비딘 변이체를 초래한다. 그러나, ECO 아비딘으로 표시되는 이들 스트렙트아비딘 변이체들은 또한 그것들의 C-말단에서 이질적이다. 더욱이, 스트렙토미세스 아비디니 신호서열은 대장균에서 완전히 절단되지 않으며, 그 결과로서 분자의 N-말단은 천연 스트렙트아비딘과 비교하여 13개의 추가의 아미노산을 함유한다.

대장균에서의 재조합 스트렙트아비딘의 이종 발현, 그것의 봉입체(inclusion bodies)형태로서의 분리 및 재생은 티.사노와 씨.알.칸토르에 의해 간행물에 기재되어 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(1990), 142-146]. 이것은 천연 스트렙트아비딘 분자의 아미노산 15 내지 159개를 함유하는 N-말단이 절단된 스트렙트아비딘 융합 단백질이다. 그러나, 재생되고 정제된 스트렙트아비딘 융합 단백질의 일부분(30 내지 50%)은 응집되어 올리고머를 형성한다.

본 발명의 목적은 선행 기술의 단점들이 최소한 부분적으로 제거된 동종 스트렙트아비딘 돌연변이 단백질(코아 스트렙트아비딘)을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 추가의 목적은 다양한 분석용 및 제조용으로, 특히 진단 시험에 적당한 동종 코아 스트렙트아비딘에 대한 신뢰할 만하고, 간단하며, 재현가능하고 경제적인 제조방법을 개발하는 데에 있다.

본 발명에 따른 목적은 숙주세포를 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA로 형질전환시키고, 형질전환시킨 숙주 세포를 적당한 조건하에서 배양하고, 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA를 발현시키고, 재조합 코아 스트렙트아비딘을 숙주세포 또는 배양기로부터 분리시키는 재조합 코아 스트렙트아비딘의 분리방법에 의해 달성되는데, 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA로서, (a) SEQ IDNO. 1로 표시된 누클레오티드 서열 또는 (b) 유전자 코드의 축중(degeneracy)범위내에서 누클레오티드 서열(a)에 상응하는 누클레오티드 서열을 갖는 DNA를 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 방법은 동종성이어서, 특히 진단용으로 적당한 코아스트렙트아비딘이 얻어지는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 코아 스트렙트아비딘은 필요에 따라 N-말단에 메티오닌 잔기를 함유할 수 있다.

코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA의 제조, 적당한 숙주세포의 형질전환 및 이들 숙주 세포들의 배양 뿐만 아니라 재조합 생성물의 발현 및 분리는, 전형적으로 문헌 [Molecular Cloning, T. Maniatis, I.F. Fritsch and J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기재되어 있는 당업자에게 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA의 제조는 C-말단 아미노산 서열;

을 코드화하는 DNA 단편 만큼 3'단부를 단축시키고, N-말단 아미노산 서열;

을 코드화하는 DNA단편 만큼 5'단부를 단축시킴으로써 스트렙트아비딘 구조 유전자(예컨대 브리티쉬 바이오테크놀로지 리미티드 (British Biotechnology Limited)로부터 입수가능함)로 출발하여 수행될 수 있다.

코아 스트렙트아비딘을 직접적으로 발현(해독을 개시)시키기 위해서, Met를 코드화하는 서열 ATG를 코아 스트렙트아비딘 유전자의 5' 단부에 부착시켜야 한다. 메티오닌 개시코돈은 어떤 경우에는 사용된 숙주 유기체에 따라 해독후에 세포성 메티오닐-아미노펩티다제에 의해 다시 절단된다[Dalboge, H. et al., FEBS L. 266(1990) 1-3]. 스트렙토미세스 아비디니의 배양 여과물로부터의 분비 및 정제 동안에 이루어지는 천연 스트렙트아비딘의 프로세싱과는 대조적으로, 이러한 프로세싱은 N-말단 메티오닌 잔기에 제한되고, 프로세싱의 정도는 본 발명의 목적에 따라 재현가능하게 제조될수 있는 일정한 조성의 산물이 수득되도록, 미생물의 배양 및 발현 동안의 조건들을 선택하여 결정된다.

발현 벡터의 선택은 선택된 숙주세포에 의존한다. 다양한 숙주 세포에 대한 적당한 벡터들은 당업자에게 잘 알려진 것들이며, 따라서 본원에서 보다 상세하게 설명할 필요는 없을 것 같다.

숙주 세포로서 원핵생물 또는 이스트 같은 미생물을 사용하는 것이 편리하다. 대장균을, 이것에 대한 적당한 발현 플라스미드와 조합하여 사용하는 것이 특히 바람직하다. 숙주 세포는 본 발명에 따라 사용되는 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 하나 이상의 DNA의 복제물을 함유한 재조합 플라스미드에 의해 널리 공지된 방법으로 형질전환 된다. 이를 위해 다중 복제 기원을 가지는 재조합 발현 플라스미드가 사용되는 것이 바람직하다. 즉, 세포당 20개 이상, 바람직하게는 100개 이상의 복제물이 형질전환된 세포내에 존재하게 된다. 예컨대, 플라스미드 pUC19의 복제 기원은 다중 복제 기원으로서 적당하다.

본 발명에 따른 코아 스트렙트아비딘을 제조하기 위하여, 코아 스트렙트아비딘 코드화하는 DNA를 형질전환된 숙주 세포내에서 쉽게 조절될 수 있는 프로모터의 제어하에 놓는다. 이 경우, 추가의 플라스미드는 세포의 성장 단계 동안에 조절가능한 프로모터를 비활성화시키는 리프레서(repressor) 단백질의 과잉발현을 초래하는 형질전환된 숙주 세포내에 존재하는 것이 바람직하다. 이런 진보된 방법의 구체예에서, 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA는 조절가능한 프로모터를 활성화시키는 유도물질을 첨가하여 발현시킬 수 있다.

발현 조건을 공지된 방법으로 조정하여서, 바람직하게는 재조합 코아 스트렙트아비딘을 가용성 세포 성분들로부터 쉽게 분리될 수 있는 소위 봉입체의 형태로 생성시킨다. 이러한 방식으로 얻어진 봉입체를 다음 단계로, 공지된 방식으로 용해시키고, 예컨대 EP-A 253 823에 기재되어 있는 방법에 따라 재생시켜, 생물학적으로 활성인 가용성 코아 스트렙트아비딘을 생성시킬 수 있다.

그후에 재생된 코아 스트렙트아비딘을 바람직하게는 크로마토그래피에 의해 미세 정제시키는 것이 바람직하다. 크로마토그래피를 위해서 예컨대 친화성 크로마토그래피 물질, 이온 교환물질 또는 소수성 크로마토그래피용 물질이 적당하다.

본 발명은 또한 코아 스트렙트아비딘을 코드화하하고,

(a) SEQ ID NO. 1로 표시된 누클레오티드 서열 또는

(b) 유전자 코드의 축중 범위내에서 누클레오티드 서열(a)에 상응하는 누클레오티드 서열을 가지는 재조합 DNA에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 정의된 재조합 DNA의 하나 이상의 복제물을 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 기본 벡터는 플라스미드인 것이 편리하지만, 바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 다중 복제 기원을 가진다. 또한 본 발명에 따라 벡터내의 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA는 바람직하게는 조절가능한 프로모터의 제어하에 놓인다.

또한, 본 발명은 상기 정의된 재조합 DNA로 또는 이것을 함유하고 있는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.

마지막으로 본 발명은 N-말단에 메티오닌 잔기가 있거나 없는 SEQ ID NO. 2로 표시된 아미노산 서열을 특징으로 하는 재조합 코아 스트렙트아비딘에 관한 것이다.

본 발명에서 언급된 플라스미드 및 미생물은 부다페스트 조약의 규정에 따라, 독일 데-3300 브라운슈바이크 마쉐로더베크 1베에 소재하는 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSM)에 기탁되었고, 하기의 기탁번호를 갖는다.

대장균 K12 RM 82 : DSM 5445 : 1991. 10. 2. 기탁

pSAM-코아/pUBS 500 : DSM 6720 ; 1991. 9. 20. 기탁

서열 목록에서, SEQ ID NO. 1은 코아 스트렙트아비딘의 DNA 서열을 나타내고, SEQ ID NO. 2는 N-말단에 메티오닌 잔기가 있는 코아 스트렙트아비딘의 단백질 서열을 나타낸다. 제1도는 코아 스트렙트아비딘 발현 플라스미드 pSAM 코아의 플라스미드 지도를 나타낸다. 제2도는 비오틴이 있는 경우(곡선2)와 없는 경우(곡선1)에, 본 발명에 따른 코아 스트렙트아비딘의 원편광 이색성(CD) 스펙트럼(2a) 및 스트렙토미세스 아비디니의 종래의 코아 스트렙트아비딘의 원편광 이색성(CD) 스펙트럼(2b)을 도시한다.

하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것이다.

1.1 C-말단이 절단된 스트렙트아비딘 유전자(플라스미드 pUC18-BBG9-C)의 구성

하기의 플라스미드 구성에서, 천연 스트렙트아비딘 구조 유전자의 3'단부를 하기의 C-말단 아미노산 서열을 코드화하는 DNA단편 만큼 단축시켰다:

이것을 위해, 플라스미드 pUC 18-BBG9 (스트렙트아비딘 유전자가 삽입되어 있는 pUC18벡터, British Biotechnology Limited (WO89/03422))를, 제한 엔도누클레아제 Nhel과 HindⅢ로 절단하고, 약 2.7kbp 길이의 Nhe Ⅰ/HindⅢ 단편을 분리하여 하기의 합성 DNA 단편과 연결하였다.

＊＊＊: 정지 코돈

(구조물 : pUC 18-BBG9-C). 원하는 DNA 서열은 DNA 서열화에 의해 확인하였다.

1.2 대장균 발현벡터 pD-NX의 구성

플라스미드 pD-NX는 디아겐 컴패니(Diagen Company, Dsseldorf 소재)로부터 구입할 수 있는 플라스미드 pQE-6(pDS56/RBSⅡ, Nco1)의 유도체이며, 이것으로부터 프로모터가 없는 클로르암페니콜-아세틸전이효소 유전자(CAT)를 분리하였다.

이것을 위하여, 플라스미드 pDS56/RBSⅡ, Nco1을 제한 엔도누클레아제 Nhel 및 Xbal으로 소화시켜, 약 2.6kbp 길이의 Nhel/Xbal 벡터 단편을 분리하고, Nhel 및 Xbal 절단 부위들의 양립할 수 있는 말단들을 연결반응(ligation)에 의해 연결시켰다(구조물 : pD-NX).

1.3 N-말단 및 C-말단이 절단된 스트렙트아비딘 유전자(플라스미드 : pSA-코아)의 구성

하기의 플라스미드 구성에서, 천연 스트렙트아비딘 구조 유전자의 5'단부를 하기 N-말단 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 단편 만큼 단축시켰다 :

이것을 위해, 상기 설명된 바와 같이 제조된 플라스미드 pUC18-BBG9-C를 제한 엔도누클레아제 Pstl으로 소화시키고, Pstl절단 부위의 3'돌출 단부를 T4-DNA중합효소로 소화시켜 제거하고, DNA를 HindⅢ로 재절단하고, 약 390bp길이의 Pstl(블런트)/HindⅢ스트렙트아비딘 단편을 분리하고, 클레노우 중합효소로 Ncol 절단부위의 5'-돌출 단부를 채운, 약 2.6kbp길이의 Ncol(블런트)/HindⅢ pD-NA벡터 단편내로 연결시켰다(구조물 : pSA-코아).

1.4 코아 스트렙트아비딘 다중복제물 발현 플라스미드 pSAM-코아의 구성

대장균에서 플라스미드 복제물 수를 증가시키기 위하여(유전자량 효과), 플라스미드 pSA-코아의 pMB1복제 기원을 플라스미드 pUC19의 다중복제 기원으로 대체시켰다. [Chambers, S.P. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 29(1988) 572-578].

이것을 위해 pSA-코아로부터 얻은 약 1kbp 길이의 AflⅢ/BglⅠ단편을 pUC19로부터의 유사한 단편으로 대체시켰다 [Yanish-Perron, C. et al., Gene 33(1985) 103-119](구조물 : pSAM-코아). pSAM-코아의 플라스미드지도는 제1도에 도시되어 있다. 플라스미드 pSAM-코아는 DSM 6720하에 pUBS500과의 플라스미드 혼합물로서 기탁하였다.

[실시예 2]

대장균내에서 코아 스트렙트아비딘의 발현

코아 스트렙트아비딘의 발현을 위해서, 대장균 K12 균주 RM82(DSM 5445) [ED 8654의 메티오닌 복귀 돌연변이체(revertant), Murray, N. E. et al., Mol. Gen. Genet. 150(1977) 53-61]를 코아 스트렙트아비딘 발현 플라스미드 pSAM-코아 (암피실린 내성) 및 lacl^q리프레서 플라스미드 pUBS500(카나마이신 내성, 구성 및 설명은 EP-A 0 373 365호 참조)으로 형질전환시켰다.

RM82/pUBS500/pSAM-코아 세포를 50㎎/ℓ의 암피실린과 50㎖/ℓ의 카나마이신을 함유하고 있는 DYT 배지(1% (w/v) 이스트 추출물, 1%(w/v) 박토 트립톤, Difco, 및 0.5% NaCl)내에서 550nm에서의 광학 밀도가 0.6 내지 0.9가 되도록 배양시킨 후, IPTG로 유도시켰다 (최종농도 1-5mmol/ℓ). 4 내지 8시간의 유도 단계 후에 세포를 원심분리에 의해 수득하고, 25mmol/ℓ의 Tris-HCI 완충액, ph 7.5로 세척하고 추가로 처리할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

[실시예 3]

대장균에서의 코아 스트렙트아비딘 발현의 분석

1㎖의 원심분리된 배양기로부터의 세포 펠릿(RM82/pUBS500/pSAM-코아 세포)을 0.25㎖의 10mmol/ℓ의 인산염 완충액, pH 6.8 및 1mmol/ℓ의 EDTA중에 재현탁시키고 세포를 초음파 처리에 의해 용해시켰다. 원심분리 후에, 상층액에 1/5부피의 5×SDS 샘플 완충액(1×SDS 샘플 완충액 : 50mmol/ℓ의 Tris-HCI, pH6.8, 1% SDS, 1% 메르캅토 에탄올, 10% 글리세롤, 0.001% 브로모페놀블루)을 첨가하였다. 불용성 세포 파편 분획을 6 내지 8M의 우레아가 첨가된 0.3㎖의 1×SDS 샘플 완충액에 재현탁시키고, 샘플을 5분 동안 95℃에서 인큐베이션한 후 원심분리하였다. 그 후에, 단백질을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)(Laemmli, U.K., Nature 227(1970) 680-685)에 의해 분리하고, 쿠마시에 브릴리언트 블루 R염료로 염색하였다.

또한, 전기영동적 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 필터상에 전달하여 고정시키고 [Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76(1979) 4350], 스트렙트아비딘-면역반응성 단백질을 양으로부터의 특이적인 항-스트렙트아비딘 항혈청으로 검출하였다.

대장균에서 합성된 코아 스트렙트아비딘 단백질은 동종성이었고, 오로지 불용성 세포 파편(IB) 분획 중에서 발견되었다. SDS PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되는 절단된 코아 스트렙트아비딘 단편은 없었다. 코아 스트렙트아비딘에 대한 발현 수율은 전체 대장균 단백질에 대해 30-50%였다. 코아 스트렙트아비딘의 단백질 서열은 SEQ ID NO. 2에 나타난다.

[실시예 4]

대장균으로부터의 활성 코아 스트렙트아비딘의 제조

4.1 세포 융해 및 봉입체(IB)의 제조

40g(습윤 중량)의 대장균 RM82/pUBS500/pSAM-코아 세포를 200㎖의 0.1mol/ℓ의 Tris-HCI, pH 7.0중에서 0℃에서 현탁시키고, 60㎎의 라이소자임을 첨가하고 20분 동안 0℃에서 인큐베이션하였다. 2mmol/ℓ의 MgCl₂및 1㎎/100㎖의 DNase(Boehringer Mannheim GmbH, Cat. NO. 104159)를 첨가한 후, 고압분산에 의하여 세포를 완전히 기계적으로 파괴시키고, 계속해서 DNA를 25℃에서 30분 동안 소화시켰다. 용해 용액을 계속해서 100㎎의 60mmol/ℓ의 EDTA, 6%의 Triton × 100 및 1.5mol/ℓ의 NaCl, pH 7.0과 혼합하고 추가로 30분 동안 0℃에서 인큐베이션하였다. 그 후에, 불용성 성분들(세포 파편 및 IB)을 소르발(Sorvall) 원심분리기를 사용하는 원심분리에 의하여 침강시켰다.

펠릿을 200㎖의 0.1mol/ℓ의 Tris-HCI, 20mmol/ℓ의 EDTA, pH6.5에 재현탁시키고 30분 동안 25℃에서 인큐베이션하였다. 그 후에 IB 제조물을 원심분리에 의하여 분리하였다.

4.2 IB의 가용화

10g의 IB 펠릿(습윤 중량)을 40㎖의 0.1mol/ℓ의 Tris-HCI, 6mol/ℓ의 구아니딘-HCI, 10mmol/ℓ의 EDTA, pH7.0중에서, 1시간 30분 동안 4℃에서 교반시켜 현탁시켰다. 불용성 성분들을 원심분리에 의하여 분리하고, 투명한 상층액을 0.1mol/ℓ의 Tris-HCI, 6mol/ℓ의 구아니딘-HCI, 10mmol/ℓ의 EDTA, pH7.0에 대해 투석시켰다(3×3ℓ, 24시간, 4℃).

4.3 재생

재생은 25℃에서, 2㎖분취액의 코아 스트렙트아비딘 가용화물(40㎎/㎖)을, 1.6ℓ의 0.1mol/ℓ 인산나트륨, 5mmol/ℓ EDTA, pH7.0에 20분 간격으로 20회 첨가함으로써 수행하였다.

재생 반응을 완료시킨 후, 불용성 성분들을 원심분리에 의해 분리시키고, 코아 스트렙트아비딘을 함유하는 투명한 상층액을 더 처리하였다.

4.4 재생 제조물의 농축 및/또는 투석

재생 제조물을 구아니딘-HCI을 제거하기 위해 필요에 따라 막 여과에 의해 농축시키고 및/또는 원하는 완충액에 대해 투석시킬 수 있다.

[실시예 5]

대장균으로부터 재생된 코아 스트렙트아비딘의 정제

재생 제조물로부터의 코아 스트렙트아비딘은 필요에 따라 당업자에게 널리 공지된 크로마토그래피 방법을 이용하여 추가로 정제시킬 수 있다.

전농축 및 투석 후에 Q-세파로스-ff 상에서의 이온 교환 크로마토그래피에 대한 코아 스트렙트아비딘의 정제

재생 제조물을 교반된 세포내에서 한외여과에 의하여 120㎖로 농축시키고, 원심분리하여 불용성 잔류물을 제거하고, 계속해서 20mmol/ℓ의 Tris-HCI, pH8.5에 대해 투석시켰다(2×10ℓ, 24시간, 4℃). 동일한 완충액으로 평형화시킨 Q-세파로스-ff 컬럼(3×28cm, V=200㎖)을 농축 및 투석된 재생 제조물로 로딩시키고(1 컬럼부피/시간, 1CV/h), 280nm에서의 용출물의 흡광도가 완충액의 블랭크 값에 도달할 때까지 평형화 완충액으로 세척하였다. 결합된 물질을 평형 완충액 중에서 0 내지 150mmol/ℓ의 NaCl구배로 용출시켰다(10 CV, 1CV/h).

적정-시험에서의 활성(비교 : 실시예 6.2)

비활성 : 샘플의 단백질 함량으로 나눈 적정 시험에서의 활성.

용출로부터의 적당한 분획을 풀링시키고(pool)(V=200㎖), 교반된 세포내에서 농축시키고, 재증류수에 대해 투석시키고(2×15ℓ, 70시간, 4℃), 냉동시키고, 동결건조시켰다.

[실시예 6]

대장균으로부터의 정제된 코아 스트렙트아비딘의 특성 확인

6.1 SDS PAGE

재생되고 정제된 코아 스트렙트아비딘의 동종성 및 순도를 SDS PAGE에 의해 조사하였다[Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685].

재생되고 정제된 코아 스트렙트아비딘은 SDS PAGE에서 동종성(단일 밴드)이었고 (분자량 : 약 13,500), 98% 이상의 순도를 가지며, N-말단 메티오닌의 약 70-90%가 프로세싱되었다.

6.2 활성의 측정(비오틴 결합 시험)

코아 스트렙트아비딘의 활성을 비오틴으로 적정하여 측정하면서, 복합체 형성에 의해 유발된 233nm에서의 흡광도의 변화를 모니터하였다. 1유니트는 샘플에 의한 1㎍비오틴의 결합으로서 정의한다.

단백질 측정은 280nm에서 흡광도를 측정함으로써 수행하였다. 1% 용액의 흡광 계수(extinction coefficient)는 280nm에서 ∈=34이다 [Green, M., Methods Enzymol. 184(1990) 51-67].

측정된 비활성(19.4 유니트/㎎ 단백질)은 결합하는 화학양론적 비오틴 대 코아 스트렙트아비딘이 1이상(단량체에 대하여)이라는 것에 상응한다.

6.3 분광학적 특성 확인

비오틴 결합에 의해 유발된 구조적 변화를 CD 분광학에 의해 모니터 하였다. 이것을 위해 스펙트럼을 비오틴의 첨가전 및 첨가후에 기록하고, 이들 스펙트럼을 스트렙토미세스 아비디니로부터 종래 방식으로 제조된 코아 스트렙트아비딘의 동일 방식으로 얻어진 스펙트럼과 비교하였다.

스펙트럼을 하기 조건하에서 Jasco J-600 CD분광계로 기록하였다 : 재조합 코아 스트렙트아비딘 또는 스트렙토미세스 아비디니로부터의 코아 스트렙트아비딘(동결 건조물)을 재증류수에 2μmol/ℓ의 농도로 용해시키고 광경로가 5mm인 큐벳에 넣고, 8초의 댐핑(damping)(시간 상수)에서 기준 큐벳내의 재증류수에 대해 200 내지 250nm의 범위에서 20nm/분의 주사 속도로 측정하였다. 계속해서 비오틴을 약 6μmol/ℓ의 농도로 측정 큐벳에 첨가한 후, 스펙트럼을 동일 조건하에서 다시 기록하였다.

대장균으로부터의 정제된 코아 스트렙트아비딘의 스펙트럼(제2a도) 및 스트렙토미세스 아비디니로부터 종래 방식으로 제조된 코아 스트렙트아비딘의 스펙트럼(제 2b도)은 상이하지 않다.

[서열 목록]

SEQ ID NO. 1

서열의 형 : 핵산

서열의 길이 : 387 염기쌍

SEQ ID NO. 2

서열의 형 : 단백질

서열의 길이 : 128 아미노산

Claims

원핵생물 숙주 세포를 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA에 의해 형질전환시키고, 형질전환된 원핵생물 숙주 세포를 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA가 발현되는 조건하에서 배양시키고, 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA를 발현시키고, 재조합 코아 스트렙트아비딘을 원핵 생물 숙주세포 또는 배양기로부터 분리하는 것을 포함하는, 재조합 코아 스트렙트아비딘의 분리방법으로서, (a) SEQ ID NO. 1로 표시되는 누클레오티드 서열 또는 (b) 유전자 코드의 축중 범위내에서 누클레오티드 서열(a)에 상응하는 누클레오티드 서열로 구성된 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA가 사용되는 방법.
제1항에 있어서, 대장균이 숙주 세포로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 숙주 세포가 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA의 하나 이상의 복제물을 함유하는 재조합 플라스미드에 의해 형질전환됨을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 다중 복제 기원을 가지고 있는 재조합 플라스미드가 사용됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 형질전환된 숙주 세포 중의 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA가 조절가능한 프로모터의 제어를 받음을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA의 발현이 조절가능한 프로모터에 대한 유도물질의 첨가에 의해 달성됨을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 재조합 코아 스트렙트아비딘이 봉입체의 형태로 숙주 세포로부터 분리되고, 계속해서 봉입체의 가용화 및 재생이 수행되어 가용성의 생물학적 활성 코아 스트렙트아비딘이 형성됨을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 재생된 코아 스트렙트아비딘이 크로마토그래피로 정제됨을 특징으로 하는 방법.
코아 스트렙트아비딘을 코드화하고, (a) SEQ ID NO. 1로 표시되는 누클레오티드 서열 또는 (b) 유전자 코드의 축중 범위내에서 누클레오티드 서열(a)에 상응하는 누클레오티드 서열로 구성된 재조합 DNA.
제13항에 따른 DNA의 복제물을 하나 이상 함유함을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제14항에 있어서, 플라스미드임을 특징으로 하는 벡터.
제15항에 있어서, 다중 복제 기원을 가짐을 특징으로 하는 벡터.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 코아 스트렙트아비딘을 코드화하는 DNA가 조절가능한 프로모터의 제어를 받음을 특징으로 하는 벡터.
플라스미드 pSAM-코아 DSM 6720.
제13항에 따른 DNA에 의해 형질전환되거나 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 벡터에 의해 형질전환됨을 특징으로 하는 숙주 세포.
SEQ ID NO. 2로 표시된 아미노산 서열로 구성된 재조합 코아 스트렙트아비딘.
진단 시험 과정 및 친화성 크로마토그래피를 위해 사용되는 제20항에 따른 재조합 코아 스트렙트아비딘.
N-말단 Met 잔기가 없는 SEQ ID NO. 2로 표시된 아미노산 서열로 구성된 재조합 코아 스트렙트아비딘.