KR100196208B1 - 악티노바실루스 플루로뉴모니아 서브 유니트 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지의 흉막폐열에 대해 돼지를 보호하는데 유효한 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 악티노바실루스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae =App)세포로부터 유래된 헤모라이션 및/또는 대식세포 독소와 42kD OMP 제제물을 포함하며, 이 백신은 App 감염에 대해 완전 보호를 유도하며, 이종성 보호를 유도한다.

Description

악티노바실루스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae) 서브유니트 백신

제1도는 42kD의 농축된 OMP 제조물을 전개시킨 SDS/PAGE 겔을 조사한 것이다.

제2도는 회복기 돼지의 혈청을 사용한 프로테이나제-K OMP 제조물의 웨스턴 블로팅이다.

레인1 및 4 : 미정제 OMP, 레인2, 3, 5 및 6 : 정제 OMP, 레인1 내지3 : 대조용 처리된 것, 레인4 내지 6 : 프로테이나제-K 처리된 것.

제3도는 백신 접종 후의 혈청을 사용한 박테리아 용해물의 웨스턴 블로팅이다.

제4도는 정제된 용혈독소(B)과 표식용 단백질(A)을 전개시킨 SDS-PAGE 겔을 조사한 것이다.

제5도는 세파크릴 S-1000 칼럼을 사용한 용혈독소의 용출 프로파일이다.

제6도는 표식용 단백질(A)과 -20℃ 또는 37℃에서 보관된 정제 용혈독소(B)을 겔에서 조사한 것이다.

제7도는 App 혈청형 1 용혈독소에 대해 유도된 모노클론 항체를 사용한 미정제 용혈독소 제조물과 정제 App 혈청형 5b 용혈독소(^*)의 웨스턴 블로팅이다.

제8도는 App 혈청형 2의 Mat에 대해 유도된 모노클론 항체를 사용한 미정제 Mat 제조물의 웨스턴 블로팅이다.

본 발명은 악티노바실루스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae = App) 감염으로부터 돼지를 보호하기 위한 백신 조성물 및 이와 같은 백신을 투여함으로써 돼지를 보호하기 위한 방법에 관한 것이다.

돼지의 주요 호흡기 질환인 돼지 흉막폐염은 전세계에 만연된 것으로 과급성치사, 급성 질환의 돼지를 치료하는 일 및 만성 감염 동물의 시판 유예 등 돼지 산업에 있어 심각한 경제적 손실을 야기한다. 이 질환의 병인학적 매개체로서 악티노바실루스 플루로뉴모니아(에이.플루로뉴모니아)가 동정되었다. 이 매개체는 일차적으로 동물들간의 직접 접촉에 의해 전달되며, 그로 인해 초래된 감염은 과급성 내지 만성까지의 다양한 임상 경로를 나타낸다. 이 질환은 일차적으로 고열, 심각한 호흡장애, 기침 및 식욕 감퇴와 같은 임상 징후를 나타내는 호흡계 감염이다. 이 질환의 개시는 급속하며, 질병률과 사망률이 높다. 병리학적으로 폐내의 폐렴 병변의 전개 및 분포가 중요하다.

물론 백신(=백신접종) 프로그램에 따라 돼지에 있어서 상기와 같은 에이.플루로뉴모니아 감염증을 제어하려는 시도가 있었다.

이 목적을 위해 돼지들을 불활성화시킨 에이.플루로뉴모니아 박테리아인 세균백신으로 백신 접종하였다. 상기와 같은 백신의 불리한 점은 부차적인 심각한 부작용이다. 또한 세균백신 백신 접종은 일차적으로 에이.플루로뉴모니아의 특정 혈청형에 대해서만 특이성이 있고 다른 에이.플루로뉴모니아 혈청형에 대해서는 보호성이 없는 (리포)폴리사카라이드에 대한 항체를 생성한다. 또한 에이.플루로뉴모니아의 세균백신은 실제 감염에 대한 예방성이 적다.

또한, 에이.플루로뉴모니아의 캡슐 추출물이 예방용 항원으로 보고된 바 있다. 그러나 돼지와 쥐를 상기와 같은 추출물로 면역화시킨 결과 단지 부분적인 면역성만이 얻어졌다. 또한, 캡슐을 주성분으로 하는 백신도 동종 예방성만을 유도하였는데, 즉 특정 혈청형의 에이.플루로뉴모니아로부터 유도된 캡슐 백신을 백신 접종시킨 돼지들은 다른 혈청형의 에이.플루로뉴모니아로 공격 당하면 보호되지 못하였다.

약독화된 생 에이.플루로뉴모니아 백신은 또한 부적절하게 약독화된 병원균을 동물에 접종시킬 위험성 및 약독화된 박테리아가 병원성 상태로 복귀됨으로써 접종된 동물에 질환을 일으킬 수 있는 가능성과 그 병원균을 다른 동물에 전파시킬 수 있는 위험성을 비롯한 많은 결점이 있다.

따라서, 안전하고 혈청형에 비의존성이며, 돼지에게 강력한 예방 면역 반응을 유발하는 에이.플루로뉴모니아 백신에 대한 요구는 계속되었다.

즉, 본 발명의 목적은 에이.플루로뉴모니아로부터 유도된 2개 이상의 상이한 서브유니트 성분의 혼합물을 주로 함유하며, 에이.플루로뉴모니아 세포가 실질적으로 없고, 돼지의 에이.플루로뉴모니아 감염에 대해 양호한 예방성을 유도하며, 혈청형 비의존성인 것이 특징인, 돼지 플루로뉴모니아에 대한 서브유니트 백신을 제공하는 것이다.

본 발명은 에이.플루로뉴모니아 세포가 실질적으로 없는 에이.플루로뉴모니아 백신을 제공하는데, 상기 백신은 SDS-PAGE에서 측정 시 약 42 kD인 주요 우성 항원성 단백질 성분을 함유하는 에이.플루로뉴모니아의 외막 단백질 제조물과 1) SDS-PAGE에서 약 105 kD인 에이.플루로뉴모니아의 용혈독소(Hly)(=용혈독소) 및 2) SDS-PAGE에서 약 120 kD인 에이.플루로뉴모니아의 대식세포 독소(Mat)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 독소로부터 유도된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 SDS-PAGE에서 약 42 kD로 측정된 주요 우성의 항원성 단백질 성분을 함유하는 에이.플루로뉴모니아의 외막 단백질 제조물과 에이.플루로뉴모니아의 용혈독소 및/또는 대식세포 독소를 혼합하면 종래 기술의 백신으로 얻을 수 없었던 우수한 예방성을 특징으로 하는 돼지의 에이.플루로뉴모니아 감염에 대한 백신으로 사용할 수 있다는 것을 발견하였다.

용혈독소가 돼지에 있어서 몇몇 방어 기작을 유도한다는 사실은 공지된 것이다. 그러나, 용혈독소 및/또는 대식 세포 독소와 42 kD OMP 제조물을 둘 다 함유하는 백신은 강독성의 에이.플루로뉴모니아 박테리아를 사용한 공격에 대해 완전한 이종(heterologous) 예방성을 유도하였다(실시예3 및 5). 즉, Hly 또는 Mat 성분과 42 kD OMP와의 조합물은 예상하지 못했던 백신의 예방성을 증가시키는 효과를 나타냈다.

용혈독소(Hly)는 - 에이.플루로뉴모니아 세포 배양 상등액에서 분리할 수 있는 칼슘 유도성 단백질이며, - SDS-PAGE에서 측정 시 분자량이 105±5 kD이며(본 명세서에 기술됨), - 용혈독소가 분리된 혈청형에 의존성이 있는 것을 특징으로 하며, 적혈구에 대한 용혈 활성을 갖고 있고, 열과 프로테이나제 K 처리에 민감하다.

용혈독소의 용혈 활성은 하기 실시예2.1에 요약된 시험 방법에 의해 확인할 수 있다.

용혈독소의 용혈 활성은 불안정하며 저장 과정 중에 분해되어 105 kD 단백질의 분자량이 감소되지만, 그 면역 특성은 불활성화되지 않는다. 따라서, 용혈 활성을 없앤 상기 용혈독소이나 또는 면역 특성을 그대로 가지고 있는 용혈독소의 항원성 단편을 본 발명에 의한 백신에 사용할 수 있다.

혈청형1 내지 12 중에서 혈청형 1, 5a, 5b, 9, 10 및 11 타입만이 용혈활성이 있는 용혈독소를 생산하며(실시예2.1), 기타 혈청형들은 용혈 활성을 갖고 있는 105 kD 단백질 용혈독소화 혈청학적으로 근연성이 있는 등가의 비용혈성 105 kD 단백질을 생산한다(실시예2.3). 상기 면역학적 등가물이나 또는 그의 단편도 본 명세서에 기재된 용혈독소에 포함되는 것이다.

또한 에이.플루로뉴모니아의 용혈성 혈청중 하나로부터 얻어진 용혈독소에 대해 유발된 항혈청은 다른 용혈성 에이.플루로뉴모니아 혈청형(실시예2.3)에서 얻어진 용혈독소의 용혈 활성을 교차중화한다.

이와 같이 상이한 혈청형들로부터 얻어진 여러 용혈독소류들 사이에 밀접한 면역학적 관계가 있는 것으로부터 예산되는 바와 같이, 에이.플루로뉴모니아 감염에 대한 백신에는 42 kD OMP 제조물 이외에 입수용이한 임의의 용혈성 에이.플루로뉴모니아 혈청형 또는 균주로부터 얻어질 수 있는 용혈독소를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 백신에 첨가되는 용혈독소는 용혈독소의 형질발현을 촉진하는 조건하에서 에이.플루로뉴모니아 세포를 배양하고, 그 상등액을 상기 세포들로부터 분리해냄으로써 용이하게 얻을 수 있다. 용혈독소는 한외여과법 및 황산암모늄 침전법으로 정제한 뒤 분자체 크로마토그래피시켜 추가 정제할 수 있다.

정제 과정 중 용혈성 균주로부터 유도된 용혈독소가 풍부한 분획분은 실시예2.1에 개략된 시험 방법에 따라 적혈구에 대한 용혈 활성을 조사함으로써 모니터할 수 있다.

본 발명에 따른 백신에 함유할 수 있는 일군의 용혈독소류는 하기 개략된 방법에 따라 혈청형 1의 에이.플루로뉴모니아 세포로부터 분리할 수 있다.

a. 상기 박테리아를 0.01% NAD, 1% 이소비탈(Isovitale) X와 25mM CaCl₂가 보충된 콜럼비아 브로쓰중에서 6시간 동안 배양하는 단계;

b. 이와 같이 얻은 상기 배양물의 무세포 상등액을 분자량 컷오프 값이 300,000 D인 필터를 사용하여 농축하는 단계;

c. 황산암모늄을 55% 포화도로 첨가하여 상기 농축된 상등액으로 부터 침전시킨 후, 그 침전물을 10분간 16,000 × g에서 원심분리하는 단계;

d. 10mM 트리스-HCI 완충액 중에 재용해시킨 침전물을 세파크릴 S-200 칼럼상에서 분리하는 단계;

e. 일차 용출된 피크를 수거하는 단계.

상기 분리 방법은 또한 에이.플루로뉴모니아 혈청형으로부터 유도된 용혈독소를 얻는 데에도 사용할 수 있다(혈청형 1 용혈독소의 정제 및 일부 특징은 Frey, J. 와 Nicolet, J.에 의해 FEMS Microbiol. Letters (1988), 55, 41∼46에 보고되었다).

대식세포 독소(Mat)는 다음과 같은 것을 특징으로 한다.

- 상기 대식세포 독소는 에이.플루로뉴모니아 세포 배양물의 상등액으로부터 얻을 수 있는 단백질이다.

- 상기 대식세포 독소는 SDS-PAGE에서 측정 시 분자량이 120±10 kD이다(본 명세서에 개략됨).

- 상기 Mat는 Ser(?)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met의 N-말단 아미노산 서열을 갖고 있다.

- 상기 Mat는 열에 민감하고 프로테이나제 K 처리에 민감한, 돼지 폐포의 대식세포에 대한 세포독성을 나타낸다.

Mat의 세포독성 활성은 실시예4.1에 개략된 시험 방법에 따라 확인할 수 있다.

Mat의 세포독성 활성은 불안정하며 저장하는 동안 분해되어 120 kD인 단백질의 분자량이 감소하지만, Mat의 면역성에 있어서 이와 같은 감소 현상은 그리 중요하지 않다.

따라서, 대식세포에 대한 세포 독성을 없앤 상기 단백질이나, 또는 면역 특성은 그대로 갖고 있는 그의 항원성 단편을 본 발명에 기재된 백신에 사용할 수 있다.

혈청형 1 내지 12 중에서 에이.플루로뉴모니아 대조 균주인 혈청형 2, 3, 4, 6 및 8은 Mat를 생산한다. 또한, 특정 혈청형의 세포로부터 얻어진 Mat에 대해 유발된 항체는 상기 Mat 제조물의 대식세포에 대한 세포독성 활성을 중화한다(실시예4).

상이한 혈청형으로부터 유도된 Mat 간에 밀접한 면역학적 관계가 있음을 볼때 본발명에 의한 백신은 Mat를 생산하는 입수 용이한 임의의 에이.플루로뉴모니아 혈청형 또는 균주로부터 제조할 수 있을 것으로 예상된다.

본 발명에 의한 백신에 혼합되는 Mat는 Mat의 형질발현을 촉진하는 조건하에서 에이.플루로뉴모니아 세포를 배양하고, 이 세포로부터 상등액을 분리함으로써 용이하게 얻을 수 있다. 상기 Mat는 한외여과, 크로마토그래피 및 한외여과에 의한 농축 단계로 추가 정제할 수 있다.

정제 과정 동안 Mat가 풍부한 분획분은 하기 실시예4.1에 개략된 시험 방법에 따라 그 대식세포에 대한 세포독성 활성을 조사함으로써 모니터할 수 있다.

본 발명에 의한 백신에 첨가되는 일군의 대식세포 세포 독소는 하기 방법에 따라 얻어서 특성 규명한다.

a. 0.01% NAD가 보충된 콜롬비아 브로쓰 중에서 에이.플루로뉴모니아 혈청형 2 세포의 박테리아를 37℃에서 약6시간 동안 배양하는 단계;

b. 상기 배양 상등액을 분자량 컷오프 값이 300,000 D인 필터를 사용하여 한외여과함으로써 농축시키는 단계;

c. CL4B 칼럼상에서 상기 농축물을 용출시키는 단계;

d. 일차 용출된 피크를 수거하는 단계;

e. 0.45㎛ 셀룰로오즈 아세테이트 필터를 통해 상기 독소를 여과하는 단계.

이와 같은 분리 방법은 동일하거나 상이한 혈청형의 다른 균주로부터 Mat를 얻는 데에도 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 백신의 비독소 성분은 주요 우성의 항원성 단백질로서 SDS-PAGE에서 측정 시 42±5 kD OMP인 단백질(본 명세서에 개략함) 또는 그의 항원성 단편을 함유하는 에이.플루로뉴모니아 세포의 외막 단백질 제조물(42 kD OMP 제조물)이며, 여기에서 42 kD OMP는 열변형성이 있으며, 프로테이나제 K 처리에 민감하다.

혈청형 1 세포 유래의 42 kD OMP 제조물에 대해 유발된 항혈청은 에이.플루로뉴모니아의 혈청형 1 내지 12 유래의 세포 용해물들과 강력하게 교차 반응한다. 상기 항혈청은 웨스턴 블로팅 방법에 있어서 42 kD OMP를 인지하는 항체를 주로 함유하는 바, 상기 42 kD OMP는 상기 정제된 OMP 제조물에 존재하는 주요 우성의 항원성 단백질이다(실시예1.2). 이로부터 예측할 수 있는 바와 같이 에이.플루로뉴모니아 감염에 대한 백신은 용혈독소 및/또는 Mat 이외에도 에이.플루로뉴모니아 혈청형중 임의의 입수용이한 혈청형으로부터 얻을 수 있는 42 kD OMP 제조물을 함유하는 백신으로 제조할 수 있다.

상기 42 kD OMP 제조물은 42 kD OMP의 형질발현을 촉진하는 조건하에서 상기 에이.플루로뉴모니아 박테리아를 배양하고, 초음파 처리, 마쇄 또는 프렌치프레스 등을 이용하여 상기 에이.플루로뉴모니아 세포를 파열한 후 그 세포막 분획분을 침강시키고, 상기 분획분을 밀도구배 침강법으로 처리하거나 또는 트리톤 X-100 또는 사르코실 같은 계면 활성제에 의한 내막의 차등 용해도를 이용해 용해시킨 후 원심분리시킴으로써 상기 분획분을 내막과 외막으로 추가 정제하고, 필요하다면 42 kD OMP를 더 농축시킨 OMP를 더 농축시킨 OMP 제조물을 제조하는 단계로 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 백신에 첨가되는 42 kD 단백질이 농축된 일군의 외막 단백질 제조물은 하기 방법에 따라 혈청형 1의 에이.플루로뉴모니아 세포로부터 분리할 수 있다.

a. 상기 박테리아를 0.1% NAD가 보충된 브레인 하트 침출 브로쓰 중에서 배양하고;

b. 원심분리에 의해 박테리아 세포를 수거하고 10 mM HEPES 완충액내에 재현탁하고;

c. 초음파 처리로 상기 박테리아 세포를 파열시키고;

d. 원심 분리에 의해 커다란 세포 조각은 제거하고 그 상등액을 1시간 동안 100,000×g에서 원심 분리하여 전체 막 단편을 수거한 뒤 HEPES 완충액 중에 재현탁시키고;

e. N-라우로일사르코신산 나트륨(사르코실)를 최종 농도가 1%(w/v) 되게 첨가한 후 1시간 동안 교반하고;

f. 100,000×g에서 1시간 동안 원심 분리하여 외막 단백질을 수거한 뒤 H₂O 중에서 재현탁시킨다.

상기 분리 방법은 입수 용이한 모든 에이.플루로뉴모니아 혈청형 유래의 42 kD OMP 제조물을 얻는데 사용할 수 있다.

바람직하다면, 42 kD OMP는 본 기술 분야에 공지된 방법을 통해 균질하게 정제할 수 있는데, 즉 상기 42 kD OMP 제조물로부터 42 kD OMP의 예방성에 영향을 주지 않는 조건하에서 1종 이상의 계면활성제로 추출한 후 추가로 이온 교환 크로마토그래피 또는 분자체 크로마토그래피로 정제하여 42 kD OMP 자체를 용해시켜 정제한다.

본 발명에 의한 백신에 첨가되는 42 kD OMP, Mat와 용혈독소는 화학적 합성법, 에이.플루로뉴모니아 세포 배양물로부터 정제하는 방법 또는 재조합 DNA 기법에 의해 얻을 수 있다.

재조합 DNA 기법의 경우 전술한 단백질 또는 그의 단편을 암호하는 핵산 서열은 각각의 클론들에 대해 상기 핵산 서열을 함유하는 게놈성 에이.플루로뉴모니아 DNA 뱅크를 선별함으로써 동정할 수 있는데, 예컨대 용혈독소, Mat 또는 42 kD OMP에 대해 유발된 폴리클론 또는 모노클론 항체와의 특이 반응을 이용하여 선별한다. 상기 헥산 서열은 형질발현에 영향을 미치는 각종 DNA 서열에 결찰시켜 소위 재조합 핵산 분자를 제조하고, 이 분자는 적절한 숙주를 형질발현시키는데 사용할 수 있다. 그와 같은 하이브리드 DNA 분자는 비루스내에 존재하는 플라스미드 또는 핵산 서열로부터 유도될 수 있다. 숙주세포는 박테리아 같은 원핵 세포에서 유래된 것 또는 포유류 세포와 같은 진핵 세포에서 유래된 것이 있다. 형질전환된 숙주 세포를 사용하여 용혈독소 또는 42 kD OMP를 생산하고, 그 후 이 단백질들을 분리하여 본 발명에 의한 백신에 첨가할 수 있다.

다른 구체예로서, 동일하거나 상이한 미생물에 클로닝한 42 kD OMP와 용혈독소 및/또는 Mat를 암호하는 유전자를 함유하는 비루스 또는 박테리아와 같은 비병원성 미생물을 함유하는 생벡터 백신을 제조할 수 있다.

본 발명에 의한 백신은 모두 에이.플루로뉴모니아로부터 유도된 용혈독소 및/또는 Mat 성분과 42 kD OMP 제조물 성분으로부터 얻어진다. 이 백신은 각 성분들이나 면역 특성을 보유하는 각 성분의 항원성 단편을 함유하거나, 또는 상기 개략된 재조합 DNA 백신의 형태로 존재할 수 있다.

에피토프를 함유하는 본 발명의 백신을 구성하는 단백질 성분 중에서 면역화학적 활성인 적합한 폴리펩티드 단편은 소위 펩스칸 방법에 기초한 특허 출원 WO86/06487, Geysen, H.M. 등(Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998-4002, 1984), Geysen, H.M. 등(J. Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987)에 기재된 방법에 의해 밝혀졌는데, 이 방법은 목적하는 완전 폴리펩티드의 일부 서열에 상응하는 부분적으로 중복성인 일련의 폴리펩티드를 합성하고 항체와 그들의 반응성을 조사하는 것으로 구성된다.

또한, 본 명세서에 기재된 아미노산 서열을 갖고 있는 폴리펩티드의 다수 영역들은 현재 공지된 에피토프와의 구조적 일치성과 이론적인 면을 기초로 한 소정의 에피토프들이다. 이러한 영역들은 Hopp와 Woods(Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824∼3828, 1981)에 의한 친수성도 기준과 Chou와 Fasman(Advances in Enzymology 47, 45-148, 1987)에 따른 2차 구조를 조합하여 결정한다.

이와 유사하게, 필수적인 T-세포 에피토프는 베르조프스키의 양친매성 기준(Science 235, 1059-62, 1987)을 참조로 한 이론적 근거에 따라 판단할 수 있다. 소 단편들은 그들의 면역원성을 증가시키기 위해 캐리어 분자에 결합시키는 것이 바람직하다. 이 목적에 적합한 캐리어들은 천연 중합체(키홀 림펫 헤모시아닌, 알부민, 독소와 같은 단백질), 폴리아미노산(폴리리신, 폴리알라닌)과 같은 합성 중합체 또는 사포닌 같은 양친매성 화합물의 미셀 같은 거대분자들이다. 대안적으로, 이와 같은 단편들은 그의 중합체, 바람직하게는 선형 중합체 상태로 제공될 수도 있다.

특히, 용혈독소 성분은 혈청형 1, 5a, 5b, 9, 10 또는 11의 에이.플루로뉴모니아 균주로부터 얻는 것이 좋다.

본 발명에 의한 백신 중에 함유되는 Mat 성분은 혈청형 2, 3, 4, 6 또는 8의 에이.플루로뉴모니아 세포로부터 얻는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 가장 바람직한 백신은 에이.플루로뉴모니아의 42kD OMP 제조물, 용혈독소와 Mat로부터 얻어지는 3가 백신이다.

이와 같은 3가 백신은 상기 42kD OMP를 혈청형 1 세포로부터 얻고, 용혈독소를 혈청형 5b 세포로부터 얻으며, Mat를 혈청형 2 세포에서 얻으면 매우 바람직한 결과를 제공할 수 있다.

본 발명에 의한 백신은 통상의 능동 면역화법에 따라 투여한다. 즉, 투여 제제에 적합한 방법으로 일회 또는 반복 투여하며, 치료학적으로 유효하고 면역원성을 나타낼 정도의 양을 투여한다. 상기 백신은 피내, 피하, 근육내, 정맥내 또는 비강내 투여할 수 있다.

1회 투여량당 전술한 성분들의 농도는 돼지당 약 1㎍ 내지 약 1㎎ 범위내이다. 바람직한 범위는 돼지당 약 25㎍ 내지 200㎍이다.

본 발명에 의한 백신은 용혈독소 및/또는 Mat 성분과 42kD OMP 제조물 성분을 혼합함으로써 면역 활성을 갖는 조성물로 제조한다.

근육내 주사와 같은 비경구 투여를 위해서는 상기 성분을 적절한 약학적 허용 담체, 즉 수성 매체 또는 물을 함유한 현탁액과 조합시켜 사용하는데, 흔히 면역활성 및/또는 저장 기간을 증가시키기 위해 다른 성분과 혼합할 수도 있다. 이들 성분들은 염, pH 완충액, 안정제, 유화제, 면역 반응을 증가시키기 위한 보조약(예컨대, 비타민 E의 수중유적형 유탁액, 유중수적형 유탁액, 알루미늄 화합물, 뮤라밀디펩티드, 사포닌, 폴리음이온, 양친매성 화합물 또는 블록 (공)중합체) 및 보존제 등이 있다.

또한, 상기 백신은 다른 질환을 위한 기타 면역화 성분과 혼합하여 다기능 백신을 제조하거나 항생제 같은 다른 약제와 혼합할 수도 있다. 예를 들면, 다기능 백신은 슈도래비스 비루스, 전이성 위장염 비루스, 돼지 파보비루스, 돼지 인플루엔자 비루스, 미코플라스마 하이오뉴모니아, 에스케리키아 콜리, 에리시플로트릭스 루시오파티, 보르데텔라 브론키셉티카와 파스튜렐라 뮬토시다 같은 돼지 병원균 중 1종 이상의 병원균의 항원성 물질을 더 첨가하여 제조할 수 있다.

[실시예 1]

[1. 42kD의 외막 단백질(OMP)을 농축한 제조물의 정제 및 특성 규명 방법]

OMP의 정제 방법은 주로 바렌캄프 등에 의해 설명된 바 대로 수행하였다(Barenkamp et al. J. Infect. Dis. 143, 668∼676, 1981).

App 혈청형 1의 표준 균주는 0.01% NAD가 보충된 브레인 하트 침출 브로쓰중에서 하룻밤 배양하고, 배양된 박테리아를 원심 분리로 수거한 뒤 10 mM Hepes 완충액(pH 7.4) 중에 재현탁시켰다. 박테리아 세포는 빙수에서 냉각시키면서 브란손 소피니어(타입 B-12)를 사용해 대부분의 박테리아가 파괴되어 OD₆₆₀이 최소 90%까지 감소될 때까지 초음파 처리하였다. 커다란 세포 조각은 20분간 5,000×g에서 원심 분리후, 10분간 10,000×g에서 원심 분리하여 제거하였다. 상등액을 1시간 동안 100,000×g에서 초고속 원심 분리하여 막을 수거하고, Hepes 완충액 중에 재현탁시켰다. 커다란 불용성 물질은 원심 분리(11,000×g에서 20분간) 및 5㎛ 필터에 의해 여과 제거하였다. 이 여액에 N-라우로일사르코신산 나트륨(사르코실)을 최종 농도가 1%(w/v) 되게 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 사르코실 불용성 OMP를 100,000×g에서 1시간 동안 펠릿화시킨 뒤, H₂O 중에서 재현탁시키고 0.45㎛에서 여과하였다. 정제된 OMP 제조물은 라엠리 방법에 의해 SDS-PAGE중에서 전개시켰다(Nature 227, 680∼684; 1970). 단백질 함량은 표준 물질로서 BSA를 사용하여 변형된 폴린 시오칼투 분석법(Folin-Ciocalteu, J. Biol. Chem. 73, 627; 1927)으로 측정하고, 탄수화물 함량은 표준 물질로서 글루코즈를 사용하여 듀보이스 등에 의한 페놀-황산 분석법(Dubois et al, Anal. Chem. 28, 350∼356, 1956)으로 측정하였다.

OMP의 열변형성은 겔에 장입하기 전에 시료 완충액중의 시료들을 여러 온도(30℃ 내지 100℃)에서 10분 간 예비처리함으로써 SDS-PAGE법으로 시험하였다.

프로테이나제-K 처리에 대한 OMP의 민감성은 다음과 같이 시험하였다. 시료는 5 mM EDTA와 0.5% SDS가 보충되고 100㎍/㎖의 프로테이나제-K(Boehringer)를 함유하는 10 mM 트리스-HCI 완충액(pH 7.5)중에 단백질 농도가 약 0.05㎎/㎖가 되도록 조정하였다. 37℃에서 3시간 동안 천천히 교반하면서 배양한 뒤 4℃에서 하룻밤 보관하고, 프로테이나제-K로 처리된 시료와 대조 처리된 시료를 SDS-PAGE 중에서 전개시켰다. 겔은 CBB 또는 은으로 염색하거나(Wray 등, Anal, Biochem. 118, 197∼203; 1981) 또는 회복기의 돼지 혈청으로 웨스턴 블로팅하는데 사용하였다(Anal. Biochem. 120, 46∼512; 1982). 사용된 돼지의 항혈청은 모두 App 혈청형 2 또는 9의 야생 감염 후 생존한 돼지로부터 얻은 회복기 혈청 또는 App 혈청형 1, 2, 5a 또는 9로 실험실적 감염 후 생존한 돼지로부터 얻은 회복기 혈청이었다.

[결과]

정제된 OMP 제조물의 단백질-탄수화물비는 1:0.8이었다. CBB 염색한 정제된 OMP 제조물의 SDS-PAGE 결과 총 박테리아 용해물 및 미정제 총 막 제조물과 비교하여 명백히 농축된 42kD의 이중 밴드가 주단백질로서 나타났다. 제1도는 정제된 OMP 제조물을 겔 스캔한 예로써 시마즈 데이타 레코더(DR-2)와 연결된 시마즈 이중-파장 TLC 스캐너(CS-903)를 사용하여 실시한 결과이다. 상기 42kD 단백질의 순도는 단백질을 기준으로 하여 약 60%인 것으로 나타났다.

SDS-PAGE 실시 이전에 정제된 OMP를 여러 온도에서 예비처리한 결과 70℃ 또는 그 이상의 온도에서 예비처리한 뒤에 42kD 단백질이 주요 밴드로 나타났다. 60℃ 이하에서 예비처리한 뒤에는 42kD의 밴드가 전혀 나타나지 않은 반면 약 200kD에서 다른 주요 밴드가 나타났다. 이 200kD 밴드는 70℃ 또는 그 이상에서 예비처리한 후에는 사라졌다. 따라서, 42kD OMP가 열 변형성 단백질임이 명백해졌다.

정제된 OMP는 SDS-PAGE 전에 프로테이나제-K로 예비처리하고, CBB로 겔을 염색한 결과, 프로테이나제-K로 처리한 후에는 주요 42kD 단백질 뿐 아니라 어떠한 밴드도 관찰되지 않았으나, 대조 처리시에는 겔내의 단백질 패턴에 영향이 없다는 것을 알 수 있었다. 겔을 은 염색한 결과 프로테이나제-K 처리후 단지 몇몇 저분자량의 밴드(12 내지 20kD)만이 나타났으나, 대조 처리된 시료에서는 주요 42kD 밴드를 포함한 정상 패턴의 밴드들이 나타났다. 회복기의 돼지 혈청으로 겔을 웨스턴 블로팅한 결과 프로테이나제-K 처리후에는 어떠한 밴드도 발색되지 않았으나 대조용 처리한 후에는 정상 패턴이 발색되었다(제2도). 즉, 회복기의 돼지 혈청은 은 염색된 겔에서 관찰되는 프로테이나제-K 내성의 저분자량 밴드들에 대해 지향성인 항체를 포함하고 있지 않다는 것이 분명하였다. 결론적으로, 42kD OMP는 프로테이나제-K에 의한 단백분해 작용에 민감하다.

[2. 정제된 42kD OMP의 항원성 시험]

[방법]

유중수적형 유탁액 상태인 정제된 42kD OMP를 20㎍(전술한 바와 같이 정제된 것) 기니아 피그에게 피하주사하여 백신 접종시켰다. 백신 접종 4주후 혈청을 채혈하고 박테리아 용해물에 대해 웨스턴 블로팅 시험을 실시하였다(박테리아 용해물은 혈청형 1 내지 10의 App 표준 균주로부터 다음과 같이 제조하였다. 박테리아는 균주당 3개의 큰 15㎝ 초콜릿 아가 플레이트로부터 수거하여 약 0.3% 포르말린을 함유한 약 10㎖의 PBS(0.04M, pH 7.2) 중에 현탁시켰다. 박테리아는 OD₆₆₀의 값이 약 90%의 감소를 나타낼 때까지 필요한 만큼 브란손 소니피어 B-12로 초음파 처리시켜 용해시켰다. 박테리아와 큰 세포 조각은 스핀 다운시키고 용해물은 0.45㎛ 필터를 통해 여과하였다. 이 용해물을 단백질 농도가 1㎎/㎖가 되도록 조절하였다).

[결과]

제3도에 도시한 바와 같이 백신 접종에 대한 반응은 주로 42kD (이중) 밴드에 대해 지향성이었다. 비록 백신은 App 혈청형 1 표준 균주로부터 정제된 42kD OMP로부터 제조하였지만, 항체는 혈청형 1 내지 10에 대한 App 표준 균주의 용해물에 존재하는 유사한 42kD (이중) 밴드를 인식하였다. 따라서, 42kD OMP는 시험된 모든 App 혈청형 중에 존재하는 공통된 교차 반응성 항원임을 알 수 있었다.

[실시예 2]

[1. App 균주의 용혈 활성]

[방법]

균주들의 용혈 활성은 실질적으로 Frey와 Nicolet(Intec. Immun. 56, 2570-2575; 1988)에 의해 개시된 바와 같이 시험하였다. 박테리아는 1% 이소비탈X^TM(BBL), 0.01% β-NAD(시그마)와 25 mM CaCl₂(Merck)가 보충된 콜럼비아 브로쓰(Difco) 중에서 37℃하에 4 내지 6시간 동안 대수기의 중반 말기까지 증식시켰다. 박테리아 세포는 10분간 12,000g에서 스핀 다운시키고, 상등액은 트리스 완충 식염수(TBS; 0.85% NaCl 중의 10mM 트리스-HCl, pH 7.5)로 순차 희석물을 만들었다. 이 상등액 희석물에 TBS 중의 2% 말 적혈구 현탁액을 동일 부피로 첨가하였다. 혼합물을 교반하면서 2시간 동안 37℃에서 배양한 뒤 밤새 4℃에서 정치 배양시켜 적혈구를 침강시켰다. 산출된 상등액의 흡광도는 540nm(A₅₄₀)에서 측정하였다. 매 분석 시마다 1부의 증류수와 1부의 2% 말 적혈구를 함유하는 100% 대조군을 4개 이상 함께 시험하였다. 음성 대조군으로는 PBS 1부와 2% 적혈구 1부를 함유하는 혼합물을 사용하였다. 용혈 활성은 평균 100% 대조군에 비해 25%의 용혈 반응을 나타내는 배양 상등액의 희석 배수로 나타내었다. 시료는 비희석된 시료가 평균 100% 대조군에 비해 최소한 25%의 용혈 반응을 나타낼 때 양성으로 판정하였다. 음성 대조군은 A₅₄₀이 0.100을 넘지 않게 하여 적혈구 현탁액에 대한 정성 대조용(quality control)으로 사용하였다.

[결과]

표 1에서 하기 결과는 App 표준 균주에 대해 얻은 것이다. 상기 방법에 기재된 분석법을 사용하였을 때, App 혈청형 1, 5a, 5b, 9, 10 및 11은 용혈성이 있었으나, 다른 혈청형은 음성이었다.

App 야생 분리 균주를 시험하였을 때에도, 똑같은 혈청형들이 용혈성이 있었다.

[2. 용혈독소의 정제 및 특성 규명]

[방법]

용혈독소를 정제하기 위해 App 혈청형 1 또는 혈청형 5b 표준 균주를 1% 이소비탈X , 0.01% NAD와 25 mM CaCl가 보충된 콜럼비아 브로쓰 중에서 약 6시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 모든 단계는 4℃에서 실시하였다. 박테리아는 원심 분리(16,000×g에서 30분)후, 셀룰로즈 아세테이트 막 필터(Sartorius)를 사용해 0.45㎛ 여과법으로 제거하였다. 무세포 상등액을 PTMK필터(분자량 컷오프값 300,000; 폴리설폰)가 구비된 Minitan 시스템(Millipore)을 사용해 한외여과시켜 농축하였다. 용혈독소는 55% 포화 황산암모늄 중에서 하룻밤 동안 침전시키고 10분간 16,000×g에서 원심 분리한 뒤 10 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5) 중에 재용해시켰다. 최종적으로 용혈독소는 세파크릴 S-200 또는 CL4B 칼럼(Pharmacia)을 통해 용출 완충액으로 10 mM 트리스-HCl 완충액(pH 7.5)을 사용해 용출시켰다. 일차 용출된 피크가 용혈독소를 포함하고 있었다. 정제된 용혈독소 제조물을 라엠리 방법(Naure 227, 680-684; 1970)에 의해 SDS-PAGE 중에서 전개시켰다.

모든 혈청형의 배양 상등액을 황산암모늄 침전시켜 모든 혈청액으로부터 미정제 용혈독소 제조물을 제조하였다. 모든 제조물은 특별한 언급이 없는 한 -70℃에서 보관하였다.

열 민감성은 60℃에서 10분간 배양 상등액을 가열한 뒤 용혈 활성을 측정(전술한 것 참조)함으로써 시험하였다. 프로테이나제 K 처리에 대한 민감성은 배양 상등액을 37℃에서 10분간 0.02 ㎎/㎖ 프로테이나제 K(Boehringer; T. album에서 얻음)와 함께 배양한 뒤 용혈 활성을 측정함으로써 시험하였다.

트립신에 대한 감도는 37℃에서 10분간 0.02㎎/㎖ 트립신(시그마) 존재하에 배양 상등액을 배양한 뒤 0.03㎎/㎖ 트립신-억제제(시그마)를 첨가하고, 37℃에서 10분간 추가 배양한 뒤 시험하였다. 0.6㎎/㎖를 함유하는 정제된 용혈독소를 0.1㎎/㎖ 프로테이나제-K와 함께 37℃에서 3시간 동안 배양한 후 SDS-PAGE시켰다. 정제된 용혈독소의 안정성은 여러 온도에서 여러 기간 동안 제조물을 저장한 뒤 SDS-PAGE로 분석하여 시험하였다.

[결과]

혈청형 1과 혈청형 5b 표준 균주로부터 상기 방법에 설명된 과정에 따라 정제된 용혈독소는 둘 모두 SDS-PAGE에서 CBB 염색 후 105kD 위치에 밴드를 나타냈다. 정제된 혈청형 5b 용혈독소의 겔스캔은 제4도에 도시하였다. SDS-PAGE에서 겉보기 분자량이 약 105kD으로 나타났으나, 본래의 용혈독소는 분자량 컷오프값이 300kD인 필터를 통해 여과하면 필터 상에 잔류한다. 또한, 겔여과법으로 얻어진 용출 프로파일을 살펴보면, 본래의 용혈독소 또는 그의 집합체는 분자량이 적어도 10×10 D이라는 것을 알 수 있다(제5도). 즉, 표식용 단백질로서 소의 티로글로불린(분자량이 약 669kD; 시그마)을 가지고 세파크릴 S-1000(파마시아) 컬럼을 이용한 결과, 용혈독소는 공극 부피 직후에 바로 용출된 반면 티로글로불린은 잔류하였다.

정제된 용혈독소 제조물 중의 단백질과 탄수화물 비율은 약 10:1이었다.

표 1에 기재한 표준 균주들의 배양 상등액으로부터 얻은 미정제 용혈독소 제조물 모두 SDS-PAGE에서 105kD위치에 유사한 밴드를 나타내었다. 또한, 전술한 분석법으로 시험한 용혈 활성이 없는 표준 균주들도 모두 용혈성 균주와 유사한 105kD 단백질 밴드를 나타냈다.

정제된 용혈독소는 정제 과정을 박테리아 배양 후 2 내지 3일내에 실시하는 경우 용혈 활성을 계속 보유하고 있었다. 용혈 활성은 용혈독소를 -70℃에서 보관하면 안정하였지만 4℃ 또는 그 이상의 온도에서 보관하면 몇일 이내에 모두 상실되었다. 또한, SDS-PAGE에서 105kD 단백질도 정제된 용혈독소를 4℃ 또는 그 이상의 온도에서 보관한 결과 안정하지 못하였다. 용혈독소를 4℃, 실온 또는 37℃에서 7일간 보관하면, 이 단백질 밴드의 겉보기 분자량은 단계적으로 감소하였고, 37℃에서 보관한 후에는 약 65kD까지 감소하였다. 이와 같은 현상의 예로서 -20℃와 37℃에서 보관된 정제 용혈독소의 겔스캔을 제6도에 도시하였다.

용혈성 혈청형에 속하는 균주(표 1 참고)의 배양 상등액 중의 용혈 활성은 60℃에서 10분간 가열함으로써 완전히 소실되었다. 배양 상등액의 용혈 활성은 또한 프로테이나제-K 또는 트립신 처리에 민감하였다. 또한, 0.5% 포르말린을 배양물에 첨가하고 실온 또는 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 경우에도 용혈 활성은 파괴되었다.

[3. 정제된 용혈독소의 항원성 시험과 항혈청의 교차 반응]

[방법]

App 혈청형 1, 2, 5a 또는 9로 실험적 감염 시 생존하였으나 App 감염에 전형적인 폐의 병변이 크게 진전된 돼지로부터 회복기 돼지의 혈청을 채혈하였다.

전술한 혈청형 1 또는 5b 표준 균주로부터 정제한 정제 용혈독소를 토끼에게 6주 간격으로 2회 근육내 주사함으로써 초면역 혈청을 얻었다. 즉, 토끼에게 각각 프로인트 완전 보조액과 프로인트 불완전 보조액 중에 첨가한 혈청형 1의 정제 용혈독소 100㎍의 투여량을 2회 투여하여 토끼를 면역시켰다. 한편, 정제된 혈청형 5b의 정제 용혈독소는 25㎍의 투여량을 토콜 유도체 유탁액 중에 혼합하여 2회 투여함으로써 토끼를 면역시켰다.

App 혈청형 5b로부터 정제한 용혈독소에 대한 고면역 혈청을 토끼 중에서 유발시켜 여러 온도, 즉 -70℃, 4℃ 및 실온에서 장시간 동안 보관하였다. 토끼에게 유중수적형 유탁액 중의 용혈독소 25㎍을 6주 간격으로 2회 근육내 투여하였다. 여러 온도에서 제조물의 노화 시간은 초회항원 투여시에는 75일이었고 추가항원 투여시에는 118일이었다. 예비면역 혈청으로 혈청학적 시험(ELISA, 웨스턴 블롯)한 바에 따르면 모든 동물들은 SPF형이거나 또는 최소한 App를 함유하지 않았다. 항혈청은 추가항원 주입 이후 2주째에 채혈하였다.

하이브리도마 세포주를 생성하는 모노클론 항체(Mab)는 표준 방법에 따라 제조하였다. Balb/c 마우스는 App 혈청형 1의 정제 용혈독소로 면역시켰으며, 비장 세포는 Ag8 골수종 세포와 융합시키고 양성의 하이브리도마 세포들은 한계 희석법으로 클로닝시켰다. Mab를 하이브리도마 배양 상청액 또는 마우스 복수액으로부터 얻었다.

정제된 형청형 1과 5b의 용혈독소를 피복 항원으로 사용하여 표준 방법에 따라 ELISA(Enzyme-linked immunoserbent assay; 효소 결합 면역흡착 분석법)를 실시하였다. 항 혈청을 1:100으로 예비희석한 후 연속적으로 희석하였다. 대조군 흡착값은 1:100 희석된 예비-면역 혈청으로부터 계산하였다. ELISA 역가는 대조군 흡착값의 1.15배 이상인 흡착 값을 나타내는 최고의 혈청 희석률로 정의하였다.

미정제 용혈독소 제제와 정제 용혈독소의 웨스턴 블롯팅은 전술한 바대로 수행하였다.

항혈청에 의한 용혈 활성의 중화는 다음과 같이 시험하였다. 배양 상청액은 전술한 바와 같이 제조하였다. 항혈청을 1:25로 예비희석하고 TBS로 연속 희석하였다. 희석하지 않은 배양 상청액의 동부피를 항혈청 희석액에 첨가한 후 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 상기 혼합물을 전술한 용혈활성에 대하여 시험하였다. 중화 역가는 2배 희석한 배양 상청액에 비해 50% 용혈 현상을 제공하는 혈청 희석률로서 정의하였다. 각 분석시 음성 대조군으로는 예비면역 혈청을 사용하였다.

[결과]

표 2에 제시된 바대로, App 혈청형 1, 5a 또는 9로 감염시 생존한 회복기 돼지의 혈청은 혈청형 1 및 5b로부터 정제된 용혈독소에 대한 ELISA에 있어서 높은 항체 역가를 나타내는 바, App 혈청형 1, 5b 및 9의 배양 상청액의 용혈 활성을 중화시켰다. 회복기 돼지의 혈청형 2의 혈청만이 혈청형 1과 5b 용혈독소에 대한 ELISA에 있어서 보통의 항체 역가를 나타내었지만 용혈 작용의 중화는 검측할 수 없었다.

App 혈청형 1과 5b 유래의 정제 용혈독소에 대한 토끼의 초면역 항혈청은 모두 혈청형 1과 5b 용혈독소 둘다에 대한 ELISA에 있어서 높은 항체 역가를 나타내며, 상기 항혈청은 모두 혈청형 1, 5b 및 9의 용혈독소를 중화하는 반응을 나타내었다.

App 혈청형 1 용혈독소에 대하여 제조된 4가지 상이한 MAb는 두가지 혈청형 1과 5b 용혈독소에 대하여 ELISA에서 높은 역가를 나타내지만 용혈 작용의 중화는 나타내지 않았다. 시험한 모든 App 혈청형 1의 항혈청(회복기 돼지 혈청, 초면역 토끼 혈청과 MAbs)은 웨스턴 블롯팅 법에서, 혈청형 1과 5b의 정제 용혈독소 중의 105kD 밴드 뿐만 아니라 모든 App 혈청형(1 내지 12)의 미정제 용혈독소 제조물 중의 105kD 밴드와 반응하였다. 그 일예로서, 미정제 용혈독소 제조물과 정제 App 혈청형 5b 용혈독소의 상기 MAb 중 하나와의 웨스턴 블롯을 제7도에 나타내었다.

결론적으로, 1) 105kD 불안정 용혈독소는 활성 감염 중과 정제 용혈독소로의 면역화 후 모두 항원성이었으며; 2) 항용혈독소 항체는 전술한 분석법에서 시험된 바대로 용혈독소 활성이 없는 균주를 비롯하여 모든 App 혈청형 (1 내지 12)에 의해 생성된 유사 105kD 항원과 교차 반응을 나타내었으며; 3) 생성된 항체는 이 항체가 용혈성 혈청형 유래의 105kD 항원에 의해 유도된 경우라면 각종 혈청형의 용혈활성에 대한 교차 중화 반응을 나타내었다. 즉, MAb가 용혈 작용과 관련되지 않은 에피토프를 인지한다는 것이 분명하였다.

전술한 바와 같이, 4℃ 이상의 온도에서 정제 용혈독소를 보존하면 SDS-PAGE에서의 겉보기 MW가 105kD로부터 65kD으로 점차 감소하였다.

표 2에서 제시된 항혈청은 105kD 용혈독소에 대하여 생성되며 감소된 겉보기 MW(자료는 제시되지 않음)를 노화된 용혈독소 제조물을 이용한 웨스턴 블롯팅 시 여전히 반응적이었다. 토끼를 면역시킨 후 노화된 제조물의 항원 특성은 표 3에 나타내었다. 결론적으로 SDS-PAGE에서 겉보기 MW가 감소된 노화 용혈독소는 App 혈청형 1과 5b의 본래 105kD 용혈독소와 반응성이 있는 항체를 여전히 생성하는 것으로 나타났다. 항체 역가가 감소한 것도 관찰되지만 65kD의 노화 용혈독소 제조물로 면역화한 경우에는 항체 역가가 매우 높은 항혈청을 생성하였다. 이와 같은 항혈청은 또한 용혈독소 작용에 대한 중화 반응도 나타내었다.

App 혈청형 1과 5b 유래의 정제된 105kD 용혈독소에 대한 ELISA 중에서의 log 역가.

[실시예3]

[App 공격에 대한 돼지의 백신 접종 예방]

[방법]

돼지를 App로 감염시키는 방법으로서 데빌비스(DeVilbiss) 65 초음파 분무기(DeVilbiss Co., 미국 펜실베니아주 소재)를 사용하여 에어로졸에 노출시키는 방법을 사용하였다. 이와 같은 분무기의 사용은 App 병인 연구 및 더 구체적으로 백신의 평가에 관한 문헌(Sebunya et al. Cam. J. Comp. Med. 47, 48-53; 1983)을 통해 제안된 바 있다.

혈청형 1과 5a의 App 표준 균주(표1)를 감염에 이용하였다. 박테리아는 약6시간 동안 0.01% NAD가 보충된 브레인 하트 침출 브로쓰, 또는 1% IsoVitalex 과 0.01% NAD가 보충된 콜롬비아 브로쓰 중에서 증식시키고 원심분리로 수거한 후 생리 식염수 중에 원하는 농도로 재현탁시켰다. 초코렛 아가 평판배지 상에서 생존 균주를 계수하였다. 조절식 우리에서 SPF 조건하에 동물을 사육한 후 음압하에 피험물을 투여하였다. 투여시 약 50㎖의 박테리아 현탁액을 15분동안 분무하였다. 분무기는 투여방 외부에 놓고 에어로졸 챔버를 바닥 위 약 1.50m 위치에 벽을 통해 관통 파이프를 연결시켰다. 한번의 실험에서 모든 백신 접종 동물과 대조군 동물을 함께 동일한 투여방 안에서 감염시켰다. 그 후 2주 동안 동물을 관찰하였다. 감염 2주 후 생존한 돼지 뿐만 아니라 죽은 돼지를 부검하여 병리학적 병변에 대해 조사하였다. 전형적인 App 폐병변, 즉 출혈성 괴사 섬유소 흉막폐염을 폐의 감염 비율에 근거하여 0 내지 4의 등급으로 나타내었다. 0= 병변 없음; 1= 25% 이하 감염; 2= 25% 이상 내지 50% 이하 감염; 3= 50% 내지 75% 이하 감염; 4= 75% 이하 감염.

여러 가지 출처의 돼지로 실험을 실시하였는데, 여러 백신과 여러 항원 투여량으로 여러 시기에 백신 접종을 실시하고 App 혈청형 1과 5a 박테리아로 감염시켰다. 모든 백신은 매번 2㎖의 투여량을 목의 근육내로 투여하였다. 1차와 2차 백신 접종 사이의 시간 간격은 6주인 반면, 감염은 2차 접종후 2주째에 돼지에게 실시하였다. 백신 중에 함유된 항원 투여량은 정제된 제조물의 총 단백질 함량을 기준으로 계산하였다.

항원은 실시예1.1에 기재된 바대로 정제된 42kD 외막 단백질(OMP)제조물, 실시예2.2에 기재된 바대로 정제한 용혈독소(Hly) 또는 여러 혈청형의 불활성 App 박테리아를 함유하는 2종의 시판용 백신이다. 이 세균백신들은 제조자의 지시에 따라 투여하고 각 실험의 결과는 하기에 상세히 기재하였다.

[결과]

실험1(표 4)은 2가지 시판용 세균백신은 그 중에 감염 균주(App1)와 동일한 혈청형의 불활성 박테리아를 함유하고 있었지만 감염에 대한 예방 작용을 유도하지는 못한다는 것을 나타내었다.

실험2(표 5)는 App 혈청형 1로부터 정제한 용혈독소와 42kD OMP 제조물의 배합물로 돼지를 백신 접종하면, App 폐 병변 뿐만 아니라 사망률 면에 있어서 App 5a 감염에 대하여 거의 완전한 예방 작용을 나타낸다는 것을 입증하였다. 이 경우에 폐 병변의 평균 등급은 0.3이었으며, 이것은 돼지 1마리만이 해부시 하나의 작은 App 폐 소결절을 나타낸다는 것을 의미한다.

실험3(표 6)에서는 App 혈청형 5b에서 정제한 용혈독소와 혈청형 1에서 정제한 42kD OMP 제조물의 배합물을 여러 각종 투여량으로 매우 어린 돼지에게 백신 접종한 후 App 혈청형 1로 감염시켰다. 대조군 동물과 비교하여 각종 항원 투여량을 백신 접종한 모든 돼지들은 App 감염 사망률과 App 폐 병변 면에서 완전히 예방되었다.

실험4(표 7)는 실험3과 매우 유사하지만 돼지의 출처와 상태만이 상이한 조건하에 실험한 것이다. 실험3에서는 백신 항원에 대한 모항체가 없는 SPF 돼지를 사용하였으나, 실험4에서는 백신 성분에 대해 높은 항체 역가를 갖는 암퇘지에서 출생한 돼지를 사용하였다. 생후 5주째에 돼지는 2가지 백신 성분인 용혈독소와 42kD OMP에 대하여 1:100 내지 1,1000 사이의 ELISA 항체 역가를 나타냈다. 또한, 이 실험에서 모항체가 있는 돼지에게 용혈독소와 42kD OMP 제조물의 배합물을 백신 접종한 경우에도 App 혈청형 1에 대한 감염 예방성을 나타내었다.

이와 같은 백신 실험을 통해 용혈독소와 42kD OMP 제조물 둘다로 돼지를 백신 접종하면 App 감염에 대하여 완전한 예방성이 유도된다는 것을 알 수 있었다. 이와 같은 예방성은 동종의 App 혈청형(App 감염 혈청형과 동일한 혈청형으로부터 정제한 항원)에 대해서 뿐만 아니라 이종의 App 혈청형(App 감염 혈청형과 상이한 App 혈청형으로부터 정제된 항원)에 대해서도 유도되었다.

a) SPF 돼지 : 생후 12주째에 1차 백신접종, 돼지 3 또는 4 마리/그룹

b) Delsuvac HP : 네델란드에 소재하는 Mycofarm 제품

App 혈청형 1,2,3,6,8 및 9의 박테리아 함유.

Pleurovac : 아일랜드에 소재하는 Bloxham Veterinary Products Ltd. 제품. App 혈청형 1, 2, 3, 4, 6 및 8 박테리아 함유.

c) 감염 현탁액 중의 생균수 : 1×10 /㎖

d) 폐의 병변 비율을 근거로 한 0 내지 4등급으로 나타낸 App 폐 병변 정도.

0= 병변 없음, 1= 1∼25%, 2= 26∼25%, 3= 51∼75%, 4= 75%.

a) 시판용 App가 없는 돼지 : 생후 8주째에 1차 백신접종, 돼지 3마리/그룹

b) 백신 제조물 : 유중수적형 유탁액

c) 감염 현탁액 중 생균수 : 6×10 /㎖

d) 표 4의 주해 참고

a) SPF 돼지 : 생후 4주째에 1차 백신접종, 돼지 3마리/그룹

b) 백신 제제 : 토콜 유도체 유탁액

c) 감염 현탁액 중 생균수 : 7.4×10 /㎖

d) 표 4의 주해 참고

e) 전형적인 App 징후나 병리적 현상 없이 원인 불명으로 1마리가 죽은 동물 그룹을 나타냄.

a) 모항체가 있는 시판용 돼지 : 생후 5주째에 1차 백신 접종, 돼지 3마리/그룹

b) 백신 제제 : 토콜 유도체 유탁액

c) 감염 현탁액 중 생균수 : 7.4×10 /㎖

d) 표 4의 주해 참고

[실시예 4]

[1. App 균주의 세포 독성 작용]

[방법]

세포독성 시험을 하기 위하여 App 배양 상청액을 돼지 폐포의 대식세포와 함께 배양하였다. 폐포 대식세포는 0.01M EDTA 와 20mM Hepes(pH 7.4)가 보충된 행크스 평형 염류 용액(Flow)으로 돼지의 폐를 세정함으로써 분리하였다. 이 세포를 EDTA가 없는 상기 용액으로 3회 세척한 후 최종 원심 분리하여 얻은 세포를 10% 소 태아 혈청(Gibco)이 보충된 RPMI 1640 배지(Flow) 중에 현탁하고 최종적으로 2×10 /㎖ 농도로 조정하였다. 각 웰마다 원형 유리 커버 슬립(Ø12mm; Tamson)을 갖춘 조직 배양 판(24웰; Costar)에 웰마다 최종 세포 현탁액을 0.5㎖ 접종하고 37℃에서 2시간 동안 5% CO대기 하에 반응시켜 대식세포를 부착시켰다. 그 후 무혈청 RPMI 1640으로 배양판을 3회 세척하였다.

0.01% β-NAD(시그마)가 보충된 콜롬비아 브로쓰(Difco) 중에서 박테리아를 4 내지 6시간(37℃) 동안 대수기 중반 말기까지 증식시켰다. 원심 분리로 박테리아를 제거하고 0.5㎖의 상청액을 대식 세포가 있는 조직 배양 판에 각 웰마다 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 대식 세포가 부착된 커버 슬립을 RPMI 1640으로 3회 세척하고 PBS 중의 0.05% 트립판 블루(Merck) 20㎕ 방울이 점적된 유리 슬라이드 상에 마주보게 배치하였다. 트립판 블루를 흡수하여 청색으로 염색된 사세포의 비율을 위상차 현미경으로 조사하였다. 음성 반응 대조군으로는 콜롬비아 브로쓰와 함께 배양한 대식세포를 사용하였다.

[결과]

표 8에 나타낸 바와 같이, 모든 App 표준 균주는 이 박테리아로부터 얻어지는 활성인 폐포 대식 세포에 대해 세포독성이었다. 음성 반응 대조군은 10% 이하의 대식 세포 독성을 나타내었다. 용혈성 균주의 세포독성은 실시예 2에 기재된 용혈독소로 인한 것인 반면, 비용혈성 균주는 다른 독성 분자를 생성할 것이다. 용혈성 작용과 대조적으로, 대식세포 독성은 박테리아가 CaCl미보충상태에서 증식되는 경우 발현되었다.

a) 본 실시예의 방법에 기술된 바대로 측정한 죽은 대식세포의 비율

b) 실시예 2.1에 기술된 분석법으로 측정한 용혈성

c) 120 kD 보다 다소 위에 위치한 가시 밴드로서, 모노클론 항체 Int33-8과 반응하지 않음(실시예4.3 참조).

[2. App 대식세포 독소(Mat)의 정제 및 특성 규명]

[방법]

대식세포 독소를 정제하기 위하여 실시예2에 기재된 비용혈성 균주인 App 혈청형 2를 약 6시간 동안 37℃ 하에 0.01% NAD가 보충된 콜롬비아 브로쓰 중에서 증식시켰다. 더 정제하기 위하여, 대부분 실시예2.2에 기재된 용혈독소 정제법, 즉 원심분리로 박테리아를 제거하고, MW 컷오프 값이 300.000인 필터를 사용한 한외여과법으로 배양 상청액을 농축시킨 후 세파로즈 CL4B 칼럼을 통해 농축물을 용출시키는 등의 방법으로 처리하였다. 1차 용출된 피크에서 독성의 활성이 나타났다.

이 독소는 항원이나 활성의 손실 없이 0.45㎛ 셀룰로즈 아세테이트 필터(Sartorius)를 통해 여과할 수 있었다.

미정제 Mat 제조물은 배양 상청액을 황산 암모늄 침전시켜 모든 혈청형으로부터 제조하였다. 모든 제조물은 특별한 언급이 없는 한 -70℃ 또는 -20℃에서 보관하였다.

열민감성, 프로테이나제 K 민감성 및 Mat 안정성은 용혈독소에 관한 실시예2.2에 기재한 바대로 시험하였다. SDS-PAGE는 라엠리의 방법으로 실시하였다.

N 말단 아미노산 분석은 전술한 바대로 제조한 Mat 제조물을 전기 영동 및 전기 블롯팅으로 처리한 후 얻어지는 샘플로 실시하였다.

개략하면, PAGE 겔을 라엠리 시스템(Nature 227, 전술함)에서 사용되는 전개용 겔 완충액으로 제조하였다. 전기 영동후, 단백질을 이동 완충액으로서 10mM CAPS(pH9∼11)/10% 메탄올을 사용하여 PVDF(Immobilon-P , 물/밀리포어)상에 블롯팅하였다.

블롯에서 얻은 단백질을 사용하여 HPLC(모델 120A, 어플라이드 바이오시스템즈)에 온라인 연결된 자동 서열 분석기(펄스-액체, 모델 477A, 어플라이드 바이오시스템즈)를 이용한 에드만 분해법으로 서열 분석함으로써 단계적으로 해리되는 PHT-아미노산을 확인하였다.

[결과]

전술한 방법에 의해 혈청형 2 표준 균주로부터 정제한 대식세포 독소(Mat)도 4℃에서 2 내지 3일 이내에 정제를 실시한 후 독성을 그대로 나타냈다. 혈청형 2 표준 균주는 실시예2에 기재된 바와 같은 불활성 용혈독소를 생성하기 때문에, 120kD 밴드는 Mat로 간주된다.

미정제 Mat 제조물은 혈청형 2, 3, 4, 6 및 8의 상청액 SDS-PAGE에서와 유사한 120kD 밴드를 나타냈다. 혈청형 10의 배양 상청액을 120kD 보다 다소 높은 위치에서 밴드를 나타냈다(표 8). 또한, 다수의 혈청형 2와 5의 야생 분리물에서도 유사한 120kD 밴드가 나타났다.

대식세포 독성은 Mat 제조물을 60℃ 이상에서 15분 동안 처리하거나, 프로테이나제 K로 처리한 후에 완전히 소실되었다.

SDS-PAGE 중의 120kD 단백질은 -20℃에서 저장 시에는 안정하지만, 4℃에서 3개월간 보관한 결과 SDS-PAGE 중의 120kD 밴드가 붕괴되었다.

Mat의 N-말단 아미노산 서열분석은 다음의 아미노산 서열을 나타냈다:

Ser(?)-Thr-Ile-Thr-Leu-Met

(?)은 아미노산의 불확실한 지정을 의미한다.

[3. 대식세포 독소(Mat)의 항원성과 항혈청의 교차 반응]

[방법]

실시예 2.3에 기재된 회복기 돼지의 혈청을 사용하였다. 모노클론 항체(MAb)를 생성하는 하이브리도마 세포주를 표준 방법으로 제조하였다. 하이브리도마 ELISA에서 App 혈청형 2의 정제 Mat와 반응성이 있으나 정제된 App 혈청형 1 또는 5b 용혈독소와 반응성이 없는 MAb를 생성하는 하이브리도마를 선별하였다.

웨스턴 블롯팅은 전술한 바와 같이 실시하였다. Mat 활성 중화 시험은 항혈청 희석액에 동일한 부피의 App 배양 상청액을 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 실시예4.1에 기술된 바대로 독성 시험하여 실시하였다.

[결과]

App 혈청형 1, 5a 및 9로 감염된 돼지의 혈청이 아닌 App 혈청형 2의 감염에서 생존한 회복기 돼지의 혈청이 웨스턴 블롯팅시 Mat 제조물의 120kD를 인지하였다. App 혈청형 2에 대한 회복기 혈청도 Mat 활성을 중화시켰다.

MAb Int 33-8은 Mat 활성을 중화시켰으며 혈청형 2,3,4,6 및 8의 미정제 Mat 제조물 중의 120kD 밴드와 교차 반응을 하였으나 다른(표준) 혈청형과는 반응하지 않았다(제8도).

120kD 밴드와의 반응성은 혈청형 2 야생 분리물과 혈청형 5의 일부 야생 분리물에서 얻은 미정제 Mat 제조물에서 나타났다. MAb-Int 33-4는 웨스턴 블롯에서 혈청형 2 제조물에서 얻은 120kD 밴드와만 반응하였고 다른 혈청형의 제조물과는 반응하지 않았다.

전술한 바와 같이, 정제 Mat를 4℃에서 3개월간 보관하면 CBB로 염색함 SDS-PAGE에서 120kD 밴드가 붕괴되는 것으로 나타났다. 그러나, 이와 같이 노화된 제조물을 웨스턴 블롯팅한 결과 약 70 내지 80 kD의 밴드가 MAb Int 33-8과 반응성이 있는 것으로 나타났다.

[실시예 5]

[3가 백신을 이용한 백신 접종으로 App 감염에 대한 돼지 예방 방법]

실시예3에 기술된 바대로 감염 처리하였다. 예컨대, 1가지 실험(실험8)에서는 10 의 생 박테리아를 함유하는 6시간 배양물을 돼지의 비강내로 1㎖ 투여하였다. 사용한 감염 균주는 App 혈청형 1의 표준 균주이거나, 혈청형 2 또는 9의 App 야생 분리물이었다.

실시예 3에 제시된 바대로 백신 접종을 하였다. 백신 중에 함유된 항원 투여량은 정제된 제조물의 총 단백질 함량을 기준으로 계산하였다. 항원은 실시예 1.1에 기재된 바대로 정제한 42kD 외막 단백질(OMP), 실시예2.2에 기재된 바대로 정제한 105kD 용혈 독소(Hly) 및 실시예4.2에 기재된 바와 바대로 정제한 120kD 대식세포 독소(Mat)이다.

각 시험의 더 상세한 내용은 이하 결과에 제시하기로 한다.

[결과]

실험5(표 9)에서는 App 혈청형 2 감염에 대한 예방에 2가의 105kD 용혈독소와 42kD의 OMP 백신(실시예3에서 사용되기도 함)을 사용하여 시험하였다. 제시된 바대로, 이 백신은 병변에 대해 다소 예방 작용을 나타내었지만 혈청형 2의 감염을 완전히 예방하지는 못하였다. 따라서, 결론적으로 이 백신은 App 혈청형 2에 대한 완전한 예방 작용을 제공하기 위해서는 기타 성분(예컨대, 실시예4에 기재된 120kD 대식세포 독소)을 함유해야만 한다.

실험6(표 10)에서는 돼지에게 혈청형2로부터 정제한 120kD 대식세포 독소(Mat)와 혈청형 1로부터 정제한 42kD OMP를 함유하는 백신, 또는 혈청형 2로부터 정제한 120kD Mat, 혈청형 1로부터 정제한 42kD OMP 및 혈청형 5b로부터 정제한 105kD 용혈독소(Hly)를 함유한 백신을 접종하였다. 120kD Mat와 42kD OMP를 함유한 2가의 백신은 App 혈청형 1에 의한 감염 후 병변에 대해 예방성을 나타내지 못하였다. 이러한 예방성의 결여는 실시예3에 따라서 App 혈청형 1에 대한 예방성을 나타내기 위해서는 백신이 105kD 용혈독소를 함유해야만 하고 감염에 사용된 App 혈청형 1 균주가 120kD Mat를 형질발현하기 때문인 것으로 예상된다. 놀랍게도 혈청형 5b 세포로부터 정제한 105kD Hly를 2가 백신에 첨가하면 App 혈청형 1 감염에 대하여 완전히 예방되는 것으로 나타났다.

실험7(표 11)에서는 실험6과 동일한 2가 및 3가 백신을 사용하여 App 혈청형 2 감염에 대한 예방성에 관해 시험하였다. 제시된 바와 같이, 두 백신 모두 App 혈청형 2 감염에 대해서는 사망률과 폐 병변 면에서 매우 양호한 예방성을 나타내었다. 따라서, 2가의 105kD Hly/42kD OMP 백신에 120kD Mat를 첨가하여도 App 혈청형 2에 대한 예방성이 있는 백신이 만들어진다.

실험8(표 12)에서는 120kD Mat, 42kD OMP와 105kD Hly를 함유하여 실험7에서 사용된 것과 동일한 3가 백신이 전혀 이종성인 App 혈청형 9 균주의 감염으로부터 돼지를 예방한다는 것을 알 수 있었다.

a) SPF 돼지 : 생후 12주째 1차 백신 접종, 돼지 3마리/그룹

b) 백신 제제 : 토콜 유도체 유탁제

c) 감염 현탁액 중의 생균수 : 1.9×10 /㎖

d) 표 4의 주해 참고

a) SPF 돼지 : 생후 7주째 첫번째 백신 접종 ; 3마리/그룹

b) 백신 제제 : 토콜 유도체 유제

c) 피실험물 투여 현탁액중 생존수 : 2.1×10 /㎖

d) 표 4의 주해 참고

a) SPF 돼지 : 생후 12주째 1차 백신 접종, 돼지 3마리/그룹

(단, 감염 투여 이전에 죽은 1마리는 제외함)

b) 백신 제제 : 토콜 유도체 유탁제

c) 감염 현탁액 중의 생균수 : 5×10 /㎖

d) 표 4의 주해 참고

a) SPF 돼지 : 생후 5주째 1차 백신 접종, 돼지 3마리/그룹

b) 백신 제제 : 토콜 유도체 유탁제

c) 10 생 박테리아를 비측으로 투여

d) 표 4의 주해 참고

Claims (19)

1. 악티노바실루스 플루로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumoniae) 세포를 실질적으로 함유하지 않는 에이.플루로뉴모니아 감염에 대해 돼지를 예방하기 위한 백신에 있어서, ① SDS-PAGE에서 측정 시 약 105kD인 에이.플루로뉴모니아의 용혈독소 및 ② SDS-PAGE에서 측정 시 약 120kD인 에이.플루로뉴모니아의 대식세포 독소로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 독소와 SDS-PAGE에서 측정 시 약 42kD인 주요 우성 항원 단백질 성분을 함유하는 에이.플루로뉴모니아의 외막 단백질 제조물을 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
2. 제1항에 있어서, 상기 백신은 상기 외막 단백질 제조물, 상기 용혈독소 및 상기 대식세포 독소를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 백신은 혈청형 1, 5a, 5b, 9, 10 또는 11 세포의 용혈독소를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 백신은 혈청형 2, 3, 4, 6 또는 8 세포의 대식세포 독소를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
5. 제2항에 있어서, 상기 백신은 혈청형 1세포의 외막 단백질 제제, 혈청형 5b 세포의 용혈독소 및 혈청형 2세포의 대식세포 독소를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
6. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 돼지의 다른 병원균의 항원성 물질을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
7. 제6항에 있어서, 상기 돼지 병원균은 가성광견병 비루스 또는 돼지 인플루엔자 비루스인 것을 특징으로 하는 백신.
8. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 백신은 보조제를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
9. 악티노바실루스 플루로뉴모니아 세포가 실질적으로 없는 에이.플루로뉴모니아 감염에 대한 돼지 예방용 백신을 제조하는 방법에 있어서, SDS-PAGE에서 측정된 약 42kD인 주요 우성 항원 단백질 성분을 갖고 있는 에이.플루로뉴모니아의 외막 단백질 제조물과, ① SDS-PAGE에서 측정 시 약 105kD인 에이.플루로뉴모니아의 용혈독소 및 ② SDS-PAGE에서 측정 시 약 120kD인 에이.플루로뉴모니아의 대식세포 독소로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 독소를 함유하는 에이.플루로뉴모니아 항원성 물질을 면역 활성을 나타내는 조성물로 혼합하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 백신을 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하여 에이.플루로뉴모니아 감염에 대해 돼지를 예방하는 방법.
11. 제3항에 있어서, 상기 백신은 혈청형 2, 3, 4, 6 또는 8 세포의 대식세포 독소를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
12. 제3항에 있어서, 돼지의 다른 병원균의 항원성 물질을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
13. 제4항에 있어서, 돼지의 다른 병원균의 항원성 물질을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
14. 제11항에 있어서, 돼지의 다른 병원균의 항원성 물질을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
15. 제3항에 있어서, 상기 백신은 보조제를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
16. 제4항에 있어서, 상기 백신은 보조제를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
17. 제6항에 있어서, 상기 백신은 보조제를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
18. 제7항에 있어서, 상기 백신은 보조제를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
19. 제11항에 있어서, 상기 백신은 보조제를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.