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KR0169751B1 - 주요 조직 적합성 항원 클라스ii 단백질의 제조방법 및 그것을 고정화한 재료 - Google Patents

주요 조직 적합성 항원 클라스ii 단백질의 제조방법 및 그것을 고정화한 재료 Download PDF

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KR0169751B1
KR0169751B1 KR1019940702037A KR19940702037A KR0169751B1 KR 0169751 B1 KR0169751 B1 KR 0169751B1 KR 1019940702037 A KR1019940702037 A KR 1019940702037A KR 19940702037 A KR19940702037 A KR 19940702037A KR 0169751 B1 KR0169751 B1 KR 0169751B1
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KR
South Korea
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superantigen
protein
histocompatibility antigen
major histocompatibility
antigen class
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KR1019940702037A
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KR940703925A (ko
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케이시 미와
마유미 후쿠야마
타케히코 우치야마
Original Assignee
마에다 카쭈노수케
토오레 카부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 항원제시 세포표면 등에서 볼 수 있는 주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질(이하 MHC클라스Ⅱ라고 칭한다)의 제조방법과 MHC클라스Ⅱ 혹은 MHC클라스Ⅱ의 α 및/또는 β소단위 혹은 그 일부를 주, 섬유, 중공사 등의 재료에 공유결합시키는 것을 특징으로 하는 MHC클라스Ⅱ 고정화재료와 그것을 사용하는 초항원제거모듈을 제공한다.
본 발명은 또한 MHC클라스Ⅱ 혹은 초항원에 친화성을 보유하는 그 MHC클라스Ⅱ의 일부분을 사용한 초항원을 검출 혹은 정량하는 방법과 그것을 위한 측정키트를 제공한다.

Description

[발명의 명칭]
주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질의 제조방법 및 그것을 고정화한 재료
[기술분야]
본 발명은 항원제시 세포표면 등에서 볼 수 있는 주요조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질(이하, MHC클라스Ⅱ라고 약칭한다)의 제조방법 및 MHC클라스Ⅱ 혹은 MHC클라스Ⅱ의 α및/또는 β소단위를 주(珠), 섬유, 중공사 등의 재료에 공유결합시키는 것을 특징으로 하는 MHC클라스Ⅱ 고정화재료 및 그것을 사용하는 초항원제거 모듈에 관한 것이다.
본 발명은 또한 MHC클라스Ⅱ를 혹은 초항원에 친화성을 보유하는 그 MHC클라스Ⅱ의 일부분을 사용한 초항원을 검출 혹은 정량하는 방법 및 그것을 위한 측정키트에 관한 것이다.
[종래의 기술]
MHC클라스Ⅱ는 B세포나 대식세포, 혈관내피세포 등의 세포표면에 존재하며, 항원제시시에 자기 비자기를 식별하기 위해 사용되는 당단백질이다. 최근에 MHC클라스Ⅱ가 세균독소 등의 초항원이라고 칭하는 일군(一郡)의 단백질에 대한 결합단백질인 것이 판명되고, 또한 자기면역질환에 있어서 MHC클라스Ⅱ의 서브클라스에 치우침을 볼 수 있어서 의학·면역학적으로 중요시되기 시작하고 있다.
초항원이라는 것은 종래의 항원과는 다르게 항원제시 세포내에 있어서의 항원처리과정을 거치지 않고 항원제시 세포상의 MHC클라스Ⅱ에 결합하고 나아가서 이 MHC클라스Ⅱ와의 복합체를 형성하여 특정한 Ⅴ영역을 가지고 있는 T세포를 자극하여 면역계를 이상 활성화시키는 일군의 단백질이다.
지금까지 황색포도상구균독소나 연쇄구균독소, 에르시니아균독소, 혹은 수종의 바이러스단백질이나 열충격(heat shock)단백질이 확인되고 있지만 이후에도 특정화될 가능성이 있다.
현재 MHC클라스Ⅱ를 단리(單離)하여 얻으려면 포유류세로나 곤충세포에 MHC클라스Ⅱ의 유전자를 도입하여 발현시키거나 혹은 천연적으로 존재하는 MHC클라스Ⅱ를 B세포나 대식세포, 혈관내피세로 등의 세포막으로부터 정제할 필요가 있다.
그러나, 천연형 MHC클라스Ⅱ를 세포막으로부터 대량으로 얻는 경우 막표면의 발현량이 적으므로 대량의 세포를 필요로 하고, 배양세포를 사용했다고 하여도 많은 시간과 비용이 필요하다. 또한, 포유류세포나 곤충세포에 유전자기술을 사용하여 조환형 MHC클라스Ⅱ를 생산하는 경유에도 세포의 배양에 비용과 시간이 많이 필요하다.
현재까지 주요조직 적합성 항원 클라스Ⅰ에 관해서는 대장균을 사용한 발현계에 의한 대량발계가 보고 되고 있지만(K. C. 파아카아 등, 분자면역학, 29권, 371페이지(1992)), MHC클라스Ⅱ에 대해서는 알려져 있지 않았다.
지금까지 MHC클라스Ⅱ고정화재료로서는 MHC클라스Ⅱ를 세포표면 위에 발현시켜서 세포채로 플레이트 위에 흡착시킨 것이나 MHC클라스Ⅱ의 소단위의 부분아미노산 배열을 합성하여 재료 위에 흡착고정한 재료는 보고되고 있다(J. K. 러셀 등, 생화학 및 생물리 연구 커뮤니케이션, 168권, 696페이지(1990)).
또, 초항원을 흡착하는 재료로서는 초항원에 대한 항체를 고정화한 재료가 이미 보고되어 있어서, 초항원의 면역학적측정 등으로 사용되고 있다.
본 발명은 세균류를 사용하여 생산성·조작성을 용이하게 한 것을 특징으로 하는 MHC클라스Ⅱ의 제조방법을 제공하는 것이다.
세균류는 곤충이나 포유류유래의 세포와는 달리 증식속도도 빠르고, 배지조성도 소태아혈청이나 증식인자 등의 고가격인 조성을 필요로 하지 않고, 계대배양이나 배지교환 등의 조작을 필요로 하지 않는다.
그러나, 대장균 등의 세균류의 경우 포유류유래의 단백질은 세균독성 등의 문제에 의해 발현하지 않는 경우가 많다.
본 발명자들은 각종의 발현벡터를 개량검토한 결과 대장균이나 효모균, 고초균 등의 세균에 있어서 MHC클라스Ⅱ를 발현시키는데에 성공하여서 효율적으로 대량으로 단백질을 제조하는 것을 가능케 하였다.
본 발명은 또한 의학적으로는 초항원을 포함하는 MHC클라스Ⅱ친화성의 병인물질을 대상으로 하는 혈액정화시스템의 개발을 또, 면역학적으로는 초항원을 포함하는 MHC클라스Ⅱ친화성의 병인물질의 단리(單離)정제나 효소면역학적 측정으로 사용하는 상기 병인물질 전반을 결합할 수 있는 재료를 제공하는 것이다.
여기에서 상기한 바와 같이 세포채로 고정화한 재료의 경우 MHC클라스Ⅱ 이외의 단백질 등도 고정되어 미지의 활성을 갖게 될 가능성이 있고, 고정화밀도도 임의로 바꾸는 데에는 한계가 있다. MHC클라스Ⅱ의 소단위의 부분아미노산 배열을 합성하고 재료 위에 흡착고정한 재료는 완충액 중에서 고농도의 초항원을 검출할 목적으로는 사용할 수 있지만 혈액으로부터의 초항원의 제거 등의 목적으로는 흡착고정은 리간드의 유리(遊離)를 고려한다면 사용할 수 없다.
또한 부분배열만으로는 초항원에 대한 결합력이 낮아서 초항원의 검출 및 정량을 할 경우에 충분한 성능을 얻지 못한다. 더욱이 항체 고정화재료로는 초항원 1종류마다 다른 항체를 고정화한 재료가 각각 필요하게 된다.
[발명의 개시]
본 발명은 이와 같은 종래기술의 문제점을 해소하려고 하는 것으로서 다음의 구성을 보유한다.
즉, 본 발명은
(1) 주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질을 코드하는 유전자를 사용하여 미생물을 형질전환하는 것을 특징으로 하는 주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질의 제조방법,
(2) 주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질 또는 그 일부분을 공유결합에 의해 고정화한 재료,
(3) 주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질의 α소단위 또는 그 일부분을 공유결합에 의해 고정화한 재료,
(4) 주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질의 β소단위 또는 그 일부분을 공유결합에 의해 고정화한 재료,
(5) 상기한 (2) 내지 (4)의 어느 하나에 기재된 재료를 포함하는 초항원 제거 모듈,
(6) 주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질 또는 초항원과의 친화성을 보유하는 그주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질의 40아미노산잔기 이상의 길이를 보유하는 부분을 사용하는 것을 특징으로 하는 초항원을 검출하는 방법,
(7) 주요 조직적 합성 항원 클라스Ⅱ 단백질 또는 초항원과의 친화성을 보유하는 그 주요 조직적 합성 항원 클라스Ⅱ 단백질의 40아미노산잔기 이상의 길이를 보유하는 부분을 사용하는 것을 특징으로 하는 초항원을 정량하는 방법에 관한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 MHC클라스Ⅱ α소단위를 대장균내에서 발현시키기 위한 발현용 벡터의 개략도.
제2도는 MHC클라스Ⅱ β소단위를 대장균내에서 발현시키기 위한 발현용 벡터의 개략도.
제3도는 MHC클라스Ⅱ 고정화주에 의한 TSST-1의 완충욕액으로부터의 제거량과 반응시간과의 관계.
제4도는 MHC클라스Ⅱ를 고정화한 중공사를 사용했을 경우에 혈청으로부터의 TSST-1의 제거량과 반응시간의 관계.
제5도는 MHC클라스Ⅱ, MHC클라스Ⅱ β소단위 및 β소단위의 부분배열펩티드를 고정한 플레이트를 사용한 효소면역측정(샌드위치법)에 있어서의 SEA농도와 450㎚의 흡광도와의 관계.
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
본 발명에 사용한 MHC클라스Ⅱ를 코드하는 유전자는 이미 보고되어 있는 DNA배열(L. J. Stern et al., Cell, 68권 465페이지(1992), D. A. Wettstein et al., J. Exp. Med., 174권 219페이지(1991))을 근거로 하여 PCR 용의 DNA프라이머를 작성하고 B세포등의 사람세포 중에서 일반적인 방법, 예를들면 「유전자증폭PCR법(단백질·핵산·효소임시증간) 35권 17번(1990)」에 기재된 방법, 에따라 PCR법에 의해 복제하여 얻었다. 이 DNA가 코드하는 단백질의 조제법으로서는 유전자 조환기술을 이용하여 대장균, 효모균, 곤충세포나 포유류세포내에서 발현시키는 방법이 있다.
이중 증식의 속도등의 생산효율이 높이·배양조건 등의 조작성의 장점에서 생각하면 대장균이나 효모균 혹은 고초균을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 발현방법으로서는 본 단백질을 코드하는 DNA 혹은 그 일부에 단백질 합성개시신호와 종결신호 또, 균체밖으로 분비시킬 때에는 분비신호를 부가한 다음 각종 공지의 발현벡터에 결합시켜서 직접 본 발명의 단백질 혹은 그 일부를 발현시키는 방법 또, 다른 펩티드 예를들면, 인터류킨2, 말토스결합단백질, β갈라토시다아제, trpE단백질 등과의 융합단백질로서 발현시키는 방법이 있다. 더욱이 발현후의 단백질의 정제의 용이함을 고려하여 MHC클라스Ⅱ의 활성이 유지된다면 히스티딘의 6량체등을 부가해도 된다.
MHC클라스Ⅱ의 세균에 대한 독성을 고려한다면 발현할 때에 융합단백질 등의 형태로 불용성의 과립체를 형성시키거나 T7리보누클레아제·프로모터나 열충격프로모터등의 전자개시제어능이 높은 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 이때 융화단백질과 MHC클라스Ⅱ의 사이에 단백분해효소(예를 들면 활성화혈액응고 제10인자(Xa인자) 1gA단백분해효소)인식부위나 화학시약(예를들면 시아노겐브로마이드)에 의한 절단부위를 도입하여 단백분해 효소나 화학시약을 사용하여 소화·분리하는 것도 가능하다. 발현후의 MHC클라스Ⅱ혹은 그 일부의 정제로는 공지의 방법이 사용되는데 예를들면 유안(硫安)침전법, 이온교환크로마토그래피, 친화성(affinity)크로마토그래피, 젤여과, 소수크로마토그래피 등을 들 수 있고, 또 메소드인엔자이몰로지(아카데믹사 1980)에 기재된 방법을 적응시킬 수 있다. 더욱이 프로테인디술피드이소메라제, 티오레독신, 프로티오닌, 글루타티온이나, β-머캅토에탄올등을 첨가하여 소단위의 디술피드결합을 교정해도 된다.
또한 α소단위 및 β소단위를 따로따로 발현시킨 다음에 재구성하려면 양 소단위를 같은 몰량씩 혼합하여서 4℃ 내지 60℃, 보다 바람직하게는 20℃ 내지 40℃의 온도로 5분이상, 보다 바람직하게는 60분이상 방치한다. 그리고 혼합할 때에 약간의 변성제(예를들면 1M요소 10%아세토니트릴등)를 첨가하고 상기한 온도범위내에서 투석(透析)하면서 재구성하는 것도 가능하다.
본 발명에서의 MHC클라스Ⅱ를 고정화한 재료는 색체막중에서 얻어지는 천연형 MHC클라스Ⅱ 혹은 그 α및/또는 β소단위 혹은 그것들의 일부분, 혹은 세포나 세균을 형질전환하여 얻을 수 있는 조환(組煥)형 MHC클라스Ⅱ 혹은 그 α및/또는 β소단위 혹은 그것들의 일부분을 주, 섬유, 중공사, 직물, 플레이트, 시험관등의 재료위에 공유결합에 의해 결합하여 얻을 수 있다.
이중에서 MHC클라스Ⅱ는 대량, 효율적으로 입수할 수 있기 때문에 조환형(組煥型) 특히 대장균 혹은 효모균에 의해 생산된 것이 보다 바람직하다.
이와같이 MHC클라스Ⅱ의 발현 고정화법, 담체를 검토하여 MHC클라스Ⅱ의 활성을 손상시키지 않는 고정화재의 개발에 성공하여 본발명에 이르렀다.
본 발명의 상세한 설명은 다음과 같다.
(1) MHC클라스Ⅱ
MHC클라스Ⅱ는 B세포·단핵구등의 항원제시세포를 그대로 혹은 Υ-인터페론등에 의해 자극을 가하기는 했지만 세포막상으로부터 직접 단리정제한 천연형 MHC클라스Ⅱ 혹은 CHO세포, L세포등의 포유류 유래의 세포나 곤충세포를 형질전환하여 얻어지는 MHC클라스Ⅱ 생산세포로부터 정제하는 조환형 MHC클라스Ⅱ를 사용할 수가 있다. 이중에서 대량, 효율적으로 입수할 수 있기 때문에 조환형 특히 대장균이나 효모균 혹은 고초균에 의해 생산된 것에 보다 바람직하다. 더구나 MHC클라스Ⅱ의 소단위만 혹은 그 부분배열의 고정으로도 결합의 강도를 생각하면 아미노산40잔기 이상의 분자량을 보유하는 것이 바람직하고 보다 바람직하게는 αβ복합체를 사용한다.
(2) 고정화법
고정화법으로 공유결합, 이온결합, 배위결합, 소수결합 혹은 포괄법을 사용한 결합 혹은 흡착하는 방법등이 있지만 고정된 단백질의 유리를 방지하기 위해서는 공유결합이 보다 바람직하다.
또한 단백질의 고정에는 단백질의 아미노기, 카르복실기. 술피드기를 사용하는 방법이 일반적이지만, MHC클라스Ⅱ의 N말단측에 초항원의 결합부위가 있다는 것을 고려한다면 카르복실기를 사용한 고정화방법이 보다 바람직하다.
(3) 고정화담체
MHC클라스Ⅱ를 고정화하는 담체는 폴리메틸메타아크릴레이트, 폴리스틸렌, 폴리술폰, 폴리아릴아민, 폴리비닐알코올 혹은 그것들의 유도체등의 합성고분자나 셀룰로오스, 키토산 혹은 그들 유도체등과 같은 천연고분자 세라믹이나 금속등의 무기재료로 구성되는 주, 섬유, 중공사, 플레이트, 시험관등을 사용할 수가 있다. 이중 고정화재료로서는 관능기의 삽입이 용이한 고분자화합물을 사용하는 것이 보다더 바람직하고, 형태로서는 조작성이나 표면면적의 크기 때문에 중공사, 주, 섬유, 직물등이 보다더 바람직하다.
이와같이 하여 얻어지는 MHC클라스Ⅱ 고정화재료에 있어서 MHC클라스Ⅱ의 활성을 최대한으로 사용할 수가 있는 결합법을 검토한 결과 혈액속에 두어도 초항원을 특이적으로 포착결합할 수 있는 혈액정화모듈을 확립하여 본 발명의 성공에 도달하였다.
또 초항원을 검출정량하는 방법으로서는 MHC클라스Ⅱ 혹은 MHC클라스Ⅱ α소단위 혹은 β소단위 혹은 그것들의 부분배열펩티드를 사용하여 1종류의 고정화재료로 초항원전체를 포착할 수가 있게 되었다.
초항원에 대한 결합성은 단백질의 3차구조에 영향을 미치므로 초항원을 보다 강력하게 결합시키기 위해서는 아미노산잔기수30mer이상, 보다 바람직하게는 40mer이상, 보다 더 바람직하게는 소다위전체배열, 더욱 바람직하게는 α 및 β소단위로 구성된 MHC클라스Ⅱ가 좋다.
이하 실시예를 들어서 본발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 본 발명이 이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
[실시예 1]
[MHC클라스Ⅱ α소단위의 대장균에서의 발현]
MHC클라스Ⅱ α소단위는 다음과 같이 제작했다.
열충격프로모터를 보유하고, β갈락토시다아제 및 혈액응고인자의 Xa인자의 인식부위를 코드하는 배열을 포함하는 pUEF의 EcoRI 부위와 XbaI 부위사이에 MHC클라스Ⅱ α소단위유전자를 삽입하여 pUEx-α를 제조하였다(제1도). 이때, 출발벡터로 사용된pUEF 는 공지의 pUEX1백터(아마샴사의 카탈로그 p91. 1990)의 BamH1위치에 Xa인자부위를 도입하여 제조된 것이다. 상기 pUEX-α백터를 사용하여 대장균을 형질전환하고 L배지에서 30℃, 8시간 배양한 다음 배지온도를 42℃로 상승시켜서 15분간 유도한다. 유도후 배양온도를 37℃로하고 다시 2시간 배양한 후 배양액으로부터 대장균을 회수했다. 이때, 숙주미생물로 사용된 대장균은 E. coli HB101주 또는 E. coli JM109주이다.
또 β-갈라토시다아제와의 융합단백질로하여 파라아미노페닐1-티오 β-D-갈락토피라노시드고정화컬럼을 사용하여 정제를 할 수 있고, β-갈락토시다아제와 MHC클라스Ⅱ의 사이에 Xa인자의 인식부위가 존재하기 때문에 단백질 발현후에 Xa인자에 의해 소화시켜 보호단백질인 β-갈락토시다아제를 포함하지 않는 MHC클라스Ⅱ α소단위를 얻을 수가 있다.
[실시예 2]
[MHC클라스Ⅱ의 β소단위의 불용성단백질로서의 발현]
MHC클라스Ⅱ의 β소단위를 다음과 같이 제작하였다.
먼저, pATH백터의 trpE 유전자(Methods in Enzymology vol. 194 pp477-490(1991))의 뒤에 Xa인자부위를 삽입하고(삽입방법은 NATURE VOL. 309 (19 84. 6. 28)에 개시), 상기 Xa인자부위 뒤에 S4(Methods in Enzymology vol. 194 pp477-490(1991))를 삽입하여 pEES4를 얻는다.
상기 pEES4에 헥사히스티딘 유전자를 도입하여 pEHMS4를 얻는다. 이를 보다 상세히 기술하면, pEES4를 EcoR1라고 하는 제한효소로 절단한 후, 끝을 평활화한다. 이어서 Hind Ⅲ이라는 제한효소로 절단한다. 한편, PCR로 증폭된 S4부분도 Hind Ⅲ이라는 제한효소로 절단한다. 이 2개를 혼합하여 pEHMS4를 얻는다.
이어서, pFHMS4벡터상의 S4와 Xa인자부위를 절단하고, 그 대신에 1gA 단백질 분해효소부위를 도입하여 pT1 백터를 얻는다.
이와같이, 트립토판프로모터를 보유하고 trpE단백질 및 IgA단백분해효소의 인식부위를 코드하는 배열을 포함하는 pT1벡터의 EcoRI부위와 HindⅢ부위 사이에 MHC클라스Ⅱ β소단위 유전자를 삽입하여 pTr1-β를 제조하였다(제2도).
상기 재조합된 pTr1-β벡터를 사용하여 대장균을 형질전환하고 M9배지에서 37℃ 8시간 배양한 다음 인돌아크릴산을 사용하여 유도한다. 유도후 2시간 배양한 다음 배양액으로부터 대장균을 회수하였다. 이때, 숙주미생물로 사용된 대장균은 E. coli HB101주 또는 E. coli JM109주이다.
또 trpE단백질과 융합단백질로하여 목적단백질은 불용성부분으로 침전한다. 불용성부분을 2M요소를 포함하는 트리스완충액으로 세정후, 8M요소를 포함하는 트리스완충액을 사용하여 목적 융합단백질을 가용화한다. 가용화 할 때에 환원제로서 1mM디티오스레이톨이나 2% β-미캅토에탄올을 첨가하면 회수율이 향상되어서 보다 바람직하다. 가용화후 즉시 겔여과법에 의해 분자량분획을 하여서 혼입되어 있는 지질이나 다른 불용성이 강한 단백질과 분리한 다음에 20mM트리스염산완충액(pH7.4) 50mM염화나트륨완충액중에서 투석한다. 투석후에도 침전물은 얻어지지 않고 융합단백질은 100%회수 가능하다. 이때, 분자량분획을 실시하지 않고 투석해도 가용화성분으로 목적단백질은 얻을 수 있지만, 대부분은 투석후에 불용성부분으로 침전한다.
얻어진 가용성부분을 IgA단백분해효소로 소화 후, 소수크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 겔여과 등의 방법에 의해 보호단백질인 trpE단백질을 포함하지 않는 MHC클라스Ⅱ β소단위를 얻을 수가 있다. 소수크로마토그래피나. 이온교환크로마토그래피에 의한 목적단백질을 정제의 단백분해효소 소화전에 실시하는 것도 가능하다.
[실시예 3]
[MHC클라스Ⅱα 및 β소단위로부터의 재구성]
실시예 1 및 2에서 작성한 MHC클라스Ⅱ의 α 및 β소단위를 각각의 농도가 5㎎/㎖이 되도록 8M요소 10mM 염화마그네슘 100mM 염화나트륨을 포함하는 트리스염산완충액(pH7.4)에 용해한다. 용해 후, 단백질용액을 4℃로 1M요소를 포함하는 10mM 염화마그네슘, 100mM 염화나트륨을 포함하는 트리스염산환충액(pH7.4)중에서 투석한다. 투석후 다시 30℃로 요소를 포함하지 않는 10mM 염화마그네슘, 100mM 염화나트륨을 포함하는 트리스염산완충액(pH7.4)중에서 투석하여 HMC클라스Ⅱ복합체를 얻을 수가 있다.
[실시예 4]
대장균을 사용하여 생산한 MHC클라스Ⅱ를 주위에 고정화했다. 고정화는 MH C클라스Ⅱ를 1㎎/㎖의 농도가 되도록 50mM붕산완충액(pH8.0) 5㎖로 용해한 수용액중에 숙신이미드기를 보유하는 키토산주를 1㎖첨가하고 4℃로 8시간 반응시켰다. 반응후, 0.5M트리스염산완충액(pH8.0) 50㎖에 의해 미반응의 관능기의 불활화와 미반응단백질의 세정을 하였다. 고정화주의 아미노산분석결과에 의해 고정화량은 주 1㎖당 2.3㎎단백질이었다. 이와같이 하여 작성한 MHC클라스Ⅱ고정화주 및 트리스염산완충액에만 반응시킨 숙신이미드기를 보유하는 키토산주를 각각 0.5㎖씩을 1㎎/㎖의 농도로 황색포도규균외독소(TSST-1)를 포함하는 수용액중에 첨가한 결과 제3도에 표시하듯이 MHC클라스Ⅱ 고정화주에 있어서만 독소의 흡착이 관찰되고 MHC클라스Ⅱ가 독소와의 결합활성을 보유한채로 재료상에 공유결합에 의해 고정화된 것이 표시되었다. 제3도중 ○는 MHC클라스Ⅱ 고정화주이고, ●는 미반응주를 표시한다.
MHC클라스Ⅱ 고정화주에 있어서만 TSST-1농도의 저하를 관찰할 수 있었다.
[실시예 5]
대장균을 사용하여 생산한 MHC클라스Ⅱ를 중공사막위에 고정화하였다. 고정화는 MHC클라스Ⅱ를 1㎎/㎖의 농도가 되도록 50mM붕산완충액(pH8.0) 5㎖로 용해할 수용액중에 아미노기를 보유하는 폴리술폰중공사 1g을 첨가하고 4℃로 8시간 반응시켰다.
반응에는 촉매로서 카르보디이미드를 첨가했다. 고정화중공사의 아미노산분석에 의해 고정화량은 중공사 1g당 2.0㎎단백질이었다. 이와같이 하여 작성한 MHC클라스Ⅱ고정화중공사와 미반응중공사를 각각 0.5g씩 사용하여 모듈을 제작하고 1㎎/㎖의 농도로 황색포도구균외독소(TSST-1)를 포함하는 혈청을 순화시킨결과 제4도에 표시하듯이 MHC클라스Ⅱ고정화중공사에 있어서만 독소의 흡착이 관찰되고 MHC클라스Ⅱ고정화중공사에 의해 독소의 혈액중으로부터의 제거가 가능한 것이 표시되었다. 제4도중 ○는 MHC클라스Ⅱ고정화중공사, ●는 미반응중공사를 가리킨다. MHC클라스Ⅱ고정화중공사에 있어서만 TSS-1의 농도저하가 관찰되었다.
[실시예 6]
B세포에서 추출한 MHC클라스Ⅱ와 대장균에서 발현시킨 MHC클라스Ⅱ β소단위 및 펩티드합성기에 의해 합성한 MHC클라스Ⅱ β소단위의 부분아미노산 배열(초항원과의 결합성이 있는 30 아미노산잔기부분)을 10㎍/㎖의 농도로 PBS중에 용해한 다음, 아미노기를 포함하는 96구멍의 마이크로 플레이트의 각 웰에 0.1㎖씩 넣고, 촉매로서 카르보디이미드를 첨가해서 4℃로 하룻밤 방치하여 단백질의 고정화를 하였다. 0.5% 소혈청알부민(BSA)을 포함하는 PBS용액으로 블로킹을 하고, 그 다음 각 웰을 세정액(0.05% Tween20을 포함하는 PBS)으로 세정하였다.
이 MHC클라스Ⅱ 고정화플레이트에 황색포도구균외독소이고, 초항원인 SEA를 반응시켰다. 대조로서 BSA만을 고정화한 플레이트를 사용하여 동일하게 하여 SEA를 반응시켰다. 그다음, 항SEA 단일클론성 항체(바이오틴표지), 아비딘화 과산화효소, 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘을 순차반응시키고, 그 발색을 측정한 결과를 제5도에 표시하였다. BSA를 고정화한 플레이트에서는 발색을 거의 볼 수 없었지만 MHC클라스Ⅱ(약 400 아미노산 잔기길이), β소단(약 200 아미노산잔기길이), β소단위의 부분배열 펩티드(50 아미노산잔기와 30 아미노산잔기길이)에 있어서 발색을 볼 수 있고, SEA결합이 확인되었다. ○는 MHC클라스Ⅱ 고정화플레이트, △는 β소단위 고정화플레이트, ●는 β소단위 부분배열(50 아미노산잔기), ▲는 β소단위 부분배열(30 아미노산잔기), ■는 콘트롤(BSA플레이트)을 표시한다.
또, 아미노산잔기 수의 증가에 따라서 검출감도도 향상되어서 50mer 이상에서는 1㎍/㎖의 SEA 가 검출가능하게 된다. MHC클라스Ⅱ를 고정화한 플레이트에 있어서는 SEA농도가 0 내지 1㎍/㎖의 범위에 있어서, 또한 MHC클라스Ⅱ β소단위를 고정화한 플레이트에서는 SEA농도가 10³내지 106㎎/㎖의 범위에 있어서, 발색과 SEA농도의 사이에 양호한 직선관계를 나타내고, SEA의 정량도 가능하다는 것이 표시되었다.
본 발명에서는 대장균을 숙주미생물로 사용한 경우에 대해서만 기재하고 있으나, 그외에도 효모균 또는 고초균 등을 숙주미생물로 이용할 수 있다.
[산업상 이용 가능성]
본 발명에 의해 지금까지는 포유류세포나 곤충세포를 이용하여 제조하고 있었던 주요 조직 적합성 항원 클라스Ⅱ 단백질을 세균을 사용하여 효율적이고 저렴하게 대량 조정할 수 있게 되었다.
본 발명은 또한 MHC클라스Ⅱ에 친화성이 있는 물질, 예를 들면 황색포도구균외독소 등의 초항원 등을 수용액이나 혈액, 뇨 등의 체액, 식료품, 음료물 등으로부터 흡착, 분리 검출, 정량할 때에 유효한 재료를 제공하는 것으로서 의학, 면역학, 생화학의 연구나 임상, 예를 들면 패혈증이나 자기면역질환 등에 있어서의 치료시스템을 구축하는 면에서 유효하게 활용할 수 있다.

Claims (24)

  1. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 α 및/또는 β소단위를 코드하는 유전자를 이용하여 대장균을 형질전환하는 단계, 약품과 열 등으로 상기 유전자의 발현을 유도함으로써 상기 대장균내에서 상기 α 및 β소단위를 포함하는 불용성 단백질을 얻는 단계, 상기 대장균을 용균하여 상기 불용성 단백질을 침전, 회수하는 단계, 상기 불용성 단백질을 가용성 단백질로 개질하는 단계, 및 상기 가용성 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 α 및/또는 β소단위의 제조방법.
  2. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 α 및 β소단위를 각각 코드하는 유전자를 이용하여 대장균을 각각 형질전환하는 단계, 약품이나 열 등으로 상기 유전자의 발현을 유도함으로써 상기 대장균내에서 각각 상기 α 및 β소단위를 포함하는 불용성 단백질들을 얻는 단계, 상기 대장균을 용균하여 상기 불용성 단백질들을 침전, 회수하는 단계, 상기 불용성 단백질들을 각각 가용성 단백질로 개질하는 단계, 상기 가용성 단백질들을 항원 펩티드의 비존재하에서 혼합하여 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 복합체를 얻는 단계, 및 상기 복합체를 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제된 주요조직 적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 제조방법.
  3. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질 또는 그 일부분을 공유결합에 의해 합성고분자, 천연고분자 또는 무기재료로 구성된 주(珠), 섬유, 중공사, 플레이트, 튜브 등의 불수용성 재료에 고정화한 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 고정화 재료.
  4. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 α소단위 또는 그 일부분을 공유결합에 의해 합성고분자, 천연고분자 또는 무기재료로 구성된 주(珠), 섬유, 중공사, 플레이트, 튜브 등의 불수용성 재료에 고정화한 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 고정화 재료.
  5. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 β소단위 또는 그 일부분을 공유결합에 의해 합성고분자, 천연고분자 또는 무기재료로 구성된 주(珠), 섬유, 중공사, 플레이트, 튜브 등의 불수용성 재료에 고정화한 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 고정화 재료.
  6. 제3항에 기재된 고정화 재료를 초항원 흡착재료로 하여 칼럼상의 용기내에 필터 등을 이용하여 칼럼내에서 유출되지 않도록 충진되어 있으며, 상기 칼럼상의 용기 입구에 액체가 도입되는 경우에 상기 초항원 흡착재료가 이에 접촉하여 초항원을 흡착제거한 후, 상기 액체를 용기출구로 유출하는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 초항원 제거 모듈.
  7. 제6항에 있어서, 상기 액체는 혈액인 것을 특징으로 하는 초항원제거모듈.
  8. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질중 초항원과 친화성을 갖는 40아미노산잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 불수용성재료에 고정화하는 단계, 상기 불수용성재료에 포촉된 초항원을 이용하여 항(抗)초항원항체 또는 T세포를 이용한 생물활성을 검출하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출방법.
  9. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 α소단위 또는 그 α소단위중 초항원과 친화성을 갖는 40아미노산잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 불수용성재료에 고정화하는 단계, 상기 불수용성재료에 포촉된 초항원을 이용하여 항(抗)초항원항체 또는 T세포를 이용한 생물활성을 검출하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출방법.
  10. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 β소단위 또는 그 β소단위중 초항원과 친화성을 갖는 40아미노산잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 불수용성재료에 고정화하는 단계, 상기 불수용성재료에 포촉된 초항원을 이용하여 항(抗)초항원항체 또는 T세포를 이용한 생물활성을 검출하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출방법.
  11. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질중 초항원과 친화성을 갖는 40아미노산잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 불수용성재료에 고정화하는 단계, 상기 불수용성재료에 포촉된 초항원을 이용하여 항(抗)초항원항체 또는 T세포를 이용한 생물활성 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 초항원의 정량방법.
  12. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 α소단위 또는 그 α소단위중 초항원과 친화성을 갖는 40아미노산잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 불수용성재료에 고정화하는 단계, 상기 불수용성재료에 포촉된 초항원을 이용하여 항(抗)초항원항체 또는 T세포를 이용한 생물활성을 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 초항원의 정량방법.
  13. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 β소단위 또는 그 β소단위중 초항원과 친화성을 갖는 40아미노산잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 불수용성재료에 고정화하는 단계, 상기 불수용성재료에 포촉된 초항원을 이용하여 항(抗)초항원항체 또는 T세포를 이용한 생물활성을 정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 초항원의 정량방법.
  14. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질 또는 그 단백질중 초항원과 친화성을 갖는 40아미노산잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 불수용성재료에 고정화하여 초항원을 포촉하고, 포촉된 초항원을 이용하여 항(抗)초항원항체 또는 T세포를 이용한 생물활성을 검출 및/또는 정량하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출키트.
  15. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 α소단위 또는 그 α소단위중 초항원과 친화성을 갖는 40아미노산잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 불수용성재료에 고정화하여 초항원을 포촉하고, 포촉된 초항원을 이용하여 항(抗)초항원항체 또는 T세포를 이용한 생물활성을 검출 및/또는 정량하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출키트.
  16. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 β소단위 또는 그 β소단위중 초항원과 친화성을 갖는 40아미노산잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 불수용성재료에 고정화하여 초항원을 포촉하고, 포촉된 초항원을 이용하여 항(抗)초항원항체 또는 T세포를 이용한 생물활성을 검출 및/또는 정량하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출키트.
  17. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질 또는 그 단백질중 초항원과의 친화성을 갖는 40아미노산 잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 고정화한 재료를 이용하여 포촉한 초항원을, 효소 등으로 표식한 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ 단백질 혹은 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ단백질과 항(抗)주요조직적합성항원 클래스Ⅱ단백질의 항체를 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 초항원 검출 방법.
  18. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 α소단위 또는 그 α소단위중 초항원과의 친화성을 갖는 40아미노산 잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 고정화한 재료를 이용하여 포촉한 초항원을, 효소 등으로 표식한 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ 단백질 혹은 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ단백질과 항(抗)주요조직적합성항원 클래스Ⅱ단백질의 항체를 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출 방법.
  19. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 β소단위 또는 그 β소단위중 초항원과의 친화성을 갖는 40아미노산 잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 고정화한 재료를 이용하여 포촉한 초항원을, 효소 등으로 표식한 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ 단백질 혹은 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ단백질과 항(抗)주요조직적합성항원 클래스Ⅱ단백질의 항체를 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출 방법.
  20. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 또는 그 단백질중 초항원과의 친화성을 갖는 40아미노산 잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 고정화한 재료를 이용하여 포촉한 초항원을, 효소 등으로 표식한 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ 단백질 혹은 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ단백질과 항(抗)주요조직적합성항원 클래스Ⅱ단백질의 항체를 이용하여 검출 및/또는 정량하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출 키트.
  21. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 α소단위 또는 그 α소단위중 초항원과의 친화성을 갖는 40아미노산 잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 고정화한 재료를 이용하여 포촉한 초항원을, 효소 등으로 표식한 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ 단백질 혹은 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ단백질과 항(抗)주요조직적합성항원 클래스Ⅱ단백질의 항체를 이용하여 검출 및/또는 정량하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출 키트.
  22. 주요조직적합성 항원 클래스Ⅱ 단백질의 β소단위 또는 그 β소단위중 초항원과의 친화성을 갖는 40아미노산 잔기 이상의 길이를 갖는 부분을 고정화한 재료를 이용하여 포촉한 초항원을, 효소 등으로 표식한 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ 단백질 혹은 주요조직적합성 항원클래스Ⅱ단백질과 항(抗)주요조직적합성항원 클래스Ⅱ단백질의 항체를 이용하여 검출 및/또는 정량하는 것을 특징으로 하는 초항원의 검출 키트.
  23. 제4항에 기재된 고정화 재료를 초항원 흡착재료로 하여 칼럼상의 용기내에 필터 등을 이용하여 칼럼내에서 유출되지 않도록 충진되어 있으며, 상기 칼럼상의 용기 입구에 액체가 도입되는 경우에 상기 초항원 흡착재료가 이에 접촉하여 초항원을 흡착제거한 후, 상기 액체를 용기출구로 유출하는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 초항원 제거 모듈.
  24. 제5항에 기재된 고정화 재료를 초항원 흡착재료로 하여 칼럼상의 용기내에 필터 등을 이용하여 칼럼내에서 유출되지 않도록 충진되어 있으며, 상기 칼럼상의 용기 입구에 액체가 도입되는 경우에 상기 초항원 흡착재료가 이에 접촉하여 초항원을 흡착제거한 후, 상기 액체를 용기출구로 유출하는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 초항원 제거 모듈.
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