KR0168415B1 - 전체혈장으로 혈액응고 viii 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전체(비-한랭침전) 혈장으로부터 높은 특이활성도가 있는 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
이 방법은 염화바륨과 수산화 알루미늄을 이용하는 2중 처리에 의한 예비-정제도 포함한다.
또한 이 방법은 DEAE-프렉토겔 종류의 음이온 교환 수지상에서의 크로마토그래피 처리에 따른 정제도 포함한다.
이 방법은 용매-세척제로 처리하는 바이러스 비활성 단계도 포함한다.
이 방법으로 피브리노겐, 알부민, 면역글로부린, 항트롬빈 Ⅲ, 피브로넥틴과 또한 동일혈장에서 나온 프로트롬빈 복합물을 희수할 수 있다.
Description
본 발명은 전체 혈장으로부터 그 특이활성도(specific activity)Ⅷ의 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법에 관계한다.
Ⅷ인자를 주사하여 A 혈우병을 치료하는 것은 공지 사실이며 고순도의 조제물을 사용하여 한편으로는 바이러스 오염의 위험을 줄이고 다른 한편으로는 반복주사로 인하여 환자에게 위험한 면역반응을 일으킬 수 있는 다른 잔유 오염물질도 감소시킨다.
이미 여러 가지 방법을 사용하여 인체혈장을 처리해서 Ⅷ 인자를 정제하고 있다. 그중에는 각종 화학제를 이용한 오염 단백질 침전법, 면역친화력 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피와 그외 이러한 방법의 다양한 복합적 방법이 있다.
단지 소량의 Ⅷ 인자가 혈장속에 들어있으므로, 정제 방법의 수득률이 문제가 된다. 더욱이, Ⅷ 인자는 불안정한 단백질이어서 다른 혈액인자에 의해 활성화될 수 도 있다; 그러나, 활성화 상태에서는 치료적인 가치가 없다; 따라서 정제법과 최종분량이 이 문제에 연루된다.
출원인은 이미 프랑스 특허출원 제 88 07530 호에서 설명한 것처럼 고순도 Ⅷ 인자 농축물을 수득할 수 있는 이온교환 크로마토그래피를 이용한 정제방법을 개발하였다.
그러나, 이 방법은 생산자가 이용하였을 때 사용한 출발 물질이 혈장의 한랭침전 성분이고 이 한랭침전단계에서 30 내지 40% Ⅷ 인자가 손실되고 이것은 상청액에 남는다.
따라서 비-한랭침전 혈장으로 제조하는 방법을 개발하여 Ⅷ 인자 손실을 제한하는 것이 유리하다. 더욱이, 이 방법은 한랭침전하기 어려운 부적절한 생산센터에 유리한 단순성이 있다.
따라서 고순도 안정성 농축물을 아주 우수한 수득률로 얻기 위해 전체 혈장으로 Ⅷ 인자를 정제하는 단순방법을 개발하는 것이 목적이다.
본 발명은 전체 혈장으로부터 Ⅷ 인자 농축물을 제조하는 방법에 관계한다. 이 방법은 예비-정제로 프로트롬빈 복합물의 성분들(Ⅱ인자, Ⅶ인자, Ⅸ인자, Ⅹ인자)을 제거하고 또한 겔과 용리물 완충액을 선택한 음이온 교환 크로마토그래피 정제에 따라 고순도의 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 수득하는 것을 포함한다.
이 방법은 또한 또다른 정제단계 후, 피브로넥틴, 알부민, 면역글로부린과 향트롬빈Ⅲ 같은 다른 혈장 단백질의 정제용액을 얻는데 사용할 수 있다.
이 방법은 인체 혈장을 사용하여 실행하였으나 동물 공급원의 혈장으로 응용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 따라서 출발물질로서 전체혈장 즉, 신선한 혹은 보존하기 위해 냉동한 혈장을 사용하면 한랭침전된 것은 사용하지 않는다. 항응고제나 안정화 용액이 있는 곳에서 이 혈장을 수거하는 것이 좋다. 종래적으로, 시트르산염-덱스트로오스-인산염 혼합물을 사용한다; Ⅷ 인자의 특이 안정화제를 여기에 첨가하거나 이것으로 치환하는 것이 유리하다.
0.2 내지 2U/ml 의 헤파린, 1 내지 5mM의 EDTA와 1 내지 10mM의 CaCl2또한 필요한 경우 5 내지 60g/l 농도의 글루코오스를 더한 혼합물을 혈장출발 물질을 위한 안정화 용액으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법은 염화바륨으로 침전하고 또한 수산화 알루미늄겔상에 흡착하는 것으로된 1차 예비-정제 단계를 포함한다.
혈장에 대한 염화바륨 처리는 최종농도가 0.08M로 될 때까지 1M 염화바륨용액을 첨가하여 교반하면서 pH 6.5로 조절하고 그후 다시 5℃ 내지 10℃에서 원심분리 하여 침전된 단백질을 제거하고 상청액을 수득한다. 침전 단백질을 수득하여 프로트롬빈 복합물이나 그 성분을 생산한다.
상청액을 pH 6.5의 3% 수산화 알루미늄겔과 접촉시켜서 잔존하는 오염 단백질을 흡착시킨다; 그후 0.5 내지 2U/ml의 헤파린을 첨가하는 후속 크로마토그래피 단계에 필요한 충전 완충액 존재하에서 한외여과 하거나 또는 동일 완충액에 있는 세파덱스 G25 상의 크로마토그래피로 상청액에 대해 탈염화한다.
본 발명의 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 분리하는 것도 포함한다. 출원인은 또한 이미 프랑스특허출원 제 88 07530호에서 저 이농 교환력과 공동의 크기가 큰 수지 종류의 장점을 발표하였고 특히 공동의 크기가 크면 매우 큰분자도 보유할 수가 있다. 이 보유력 신장에 따라 수지와 결합한 다소 소수성인 연결부가 생기고 또한 완충액의 이온강도를 선택하여 고착된 분자의 선별적인 탈착(desorption)이 가능하게 한다.
이러한 수지종류는 일반적으로 프렉토겔이라는 명칭으로 시판하고 있다. DEAE-프렉토겔 650(R)과 T-또는 D-MAE-프렉토겔(Merck)도 역시 사용할 수 있다. 이와 동일한 수지를 현재 공급자가 섬모형 수지로 시판하고 있다. 이 메트릭스구조를 변형하여 겔의 용량 증가에 유리한 양전하 고정 표면적을 증가시킨다.
크로마토그래피 칼럼의 충전완충액은 pH 7로 조정한 시트르산 나트륨 및 염화나트륨 기초 완충액에서 여기에 0.5 내지 6mM 농도의 염화칼슘, 2 내지 4g/l 농도의 리신, 또한 8 내지 11g/l 농도의 글리신이 함유되어 있으면 바람직하다.
본 발명에 따른 정제방법의 실행에 있어서, 크로마토그래피 칼럼상에 앞서 말한 예비-정제물을 주입한다. 정해진 조건하에서(0.11M NaCl), 칼럼에 반 빌레브란트인자-Ⅷ 인자 복합물 같은 크기가 큰 분자를 채우고 피브리노겐, 알부민, 면역글로부린, 향트롬빈 Ⅲ와 피브로넥틴을 여과물에 흘려보낸다.
본 발명의 바람직한 구체예는 최적의 Ⅷ인자 회수 효율을 얻는 것이 목적이며, 크로마토그래피 칼럼의 용리 작용을 위한 완충액의 이온 농도는 염화나트륨에 대해서 0.27M로 증가한다. 본 발명의 또다른 구체예에 따르면, 이 용리단계는 이온농도를 염화나트륨에서 0.13M로 증가시키든 예비-세정 작업에 따라 실행되고 피브로넥틴이 제거된다.
이 조건에서 탈착 및 용리된 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물은 최소한 5 내지 10U/mg의 특이 활성도를 갖는다. 이 공정에서의 전체 수득량은 초기혈장의 350U/리터 이며 앞서 말한 안정화 혼합물을 초기혈장에 더할 경우 최소한 500U/리터이다.
용도에 따라 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물의 용액을 정제단계에 또한 특히 또다른 크로마토그래피법에 의한 원심분리단계에 이용할 수 있다. 기존의 것과 마찬가지로, DEAE-나 T/D-MAE-프렉토겔 또는 다른 수지를 사용하여 실행할 수도 있다; 황산 덱스트란, 부동화된 아미노-헥실, 부동화된 헤파린 또한 설포프로필 수지와 친화성이나 면역 친화성 수지 같은 다른 지지물도 사용한다.
이 부가적인 크로마토그래피 단계를 기존의 것과 유사한 염기성 완충액으로 실행한다. 본 발명의 한 바람직한 구체예는 가능한한 농축된 Ⅷ 인자를 수득하는 것이 목적이며 처음과 동일한 조건에서 부가적인 크로마토그래피를 실행한다. 즉 이것은 완충액의 이온농도를 0.27M NaCl로 증가시켜 이루어지는 단일 탈착단계를 뜻한다. 본 발명의 또다른 구체예에 있어서, 먼저 완충액의 이온농도를 0.13M까지 증가시켜서 잔존하는 오염단백질을 제거하고, 2차로 0.27M까지 증가시켜서 고순도의 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합농축물을 회수하며 이것의 특이 활성도를 최소한 10 내지 20U/mg이 된다.
칼럼의 1차 여백에 있는 다른 단백질은 면역글로부린, 알부민, 향트롬빈 Ⅲ, 피브리노겐과 피브로넥틴이며 이것 역시 종래의 크로마토그래피법으로 정제 및 농축할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 공지기술에 따른 바이러스 비활성화 처리법도 포함한다. 화학제를 사용하는 경우 예컨대 용매-세척제로 처리할 때 어떤 크로마토그래피 단계에 앞서서 이러한 처리를 하면 크로마토그래피 단계에서 비활성 작용제를 제거할 수가 있다.
Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물과 또한 상기의 방법으로 얻은 다른 혈장 단백질도 본 발명의 대상이 된다.
이 농축물을 약전의 표준방법에 따라 만들고 치료학적 목적에 사용할 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는 두가지의 구체예를 보여주는 것이다.
[실시예 1]
항응고제/안정화제(예컨대 시트르산-덱스트로스-인산염)가 있는 곳에서 수거하고 또한 아세트산으로 pH 6.5로 조절한 250ml의 신선한 혈장 또는 22-25℃로 해빙한 냉동혈장을 사용한다.
a) 예비-정제
최종농도가 0.08M로 될 때까지 연동펌프로 pH 6.5의 1M 염화바륨을 20ml 첨가한다. 1분당 4 내지 8ml 속도로 염화바륨을 첨가하고 그후 실온에서 15분간 이 혼합물을 교반한다.
혼합물을 8℃에서 20분간 2,700r.p.m으로 원심분리한 후 상청액을 회수한다.
상청액을 수산화알루미늄 겔상에(Alhydrogel Eurobio with 3% Al(OH)3) 2.3g/l의 혈장비율로 흡착시킨다. pH를 6.5로 조절하고 온도는 저온 유지장치에서 5℃로 저하시킨다. 혼합물을 5℃에서 2,700r.p.m으로 20분간 원심분리하고 상청액을 회수한 후 5℃로 유지한다.
처리결과 공지방법으로 수득하여 정제할 수 있는 프로트롬빈 복합체(Ⅱ, Ⅶ, Ⅸ, Ⅹ인자)의 성분을 제거할 수 있다.
특히, 이 두가지 처리를 함께 실행하면 만족할 수 있는 결과가 나오며 Alhydrogel 처리만 할 경우 프로트롬빈과 PPSB의 다른 성분들을 완전히 제거할 수 없고 염화바륨 처리와 함께 실행하면 다소의 Ⅹ인자, 프로트롬빈 또한 무엇보다도 Ⅶ 인자를 담겨둘 수 있다.
따라서, 수거한 상청액을 1U/ml 헤파린이 첨가된 후속 크로마토그래피 단계의 완충액 존재하에서 실행하는 한외여과나 또는 동일한 완충액속에 있는 세파덱스 G25상에서의 크로마토그래피법으로 탈염처리한다. 용매-세척제를 이용하는 종래의 바이러스 비활성 처리를 24℃ 에서 6시간동안 실행한다(이 처리법은 유럽특허출원 제 0 131 740호에서 설명하였다).
b) 크로마토그래피 정제
예비-정제 투석된 상청액을 크로마토그래피 정제단계에 사용한다. K26/30 칼럼(Pharmacia-Uppsala Sweden)은 2.6㎝ 직경과 또한 30㎝ 높이로 된 것을 사용하고 2중 10㎝는 DEAE-프렉토겔-TSK 650(R) 수지로 충전한다(Merck).
칼럼 충전 및 시료용해 완충액의 조성은 다음과 같다; 시트르산 나트륨, 10mM; 염화칼슘, 1mM; 글리신, 9g/l; 리신, 3g/l.
이 완충액에 염화나트륨을 첨가하고 최종농도를 0.11M으로 또한 pH7로 조절한다.
시료를 100ml/h의 속도로 칼럼에 주입한다. 칼럼을 충전 완충액으로 세척하여 피브리노겐, 알부민, 면역글로부린, 항트롬빈 Ⅲ과 피브로넥틴 또한 바이러스 비활성 작용제가 들어있는 무-흡착 단백질을 제거한다.
그후 완충액 이온농도를 염화나트륨에 대해 0.27M로 증가시켜 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 탈착시킨다.
이 방법으로 수득한 Ⅷ 인자용액의 특이활성도는 5 내지 10IU/mg 이고 칼럼상에 주입된 혈장에 관계하여 정제효율은 60 내지 80%이다.
두가지 인자 즉, Ⅷ 인자와 반 빌레브란트 인자의 농도에 있어서 1U/1U에 근접한 비율을 관측할 수 있으며 후자는 리스토세틴(ristocetin) 공동인자 단위로 표시한다.
이 Ⅷ 인자용액의 순도는 생성물을 농축할 수 있는 또다른 크로마토그래피 분리단계에서 다소 향상시킬 수 있다. 예컨대, 상기와 동일한 충전조건에서 DEAE-프렉토겔 2차 칼럼을 사용하고 한편 잔존하는 오염단백질을 제거하기 위해 0.13M NaCl로 예비-세척한다. 완충액의 이온농도를 염화나트륨에 대해 0.27M 까지 증가시켜서 고순도의 농축 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 탈착 및 용리한다.
2차 크로마토그래피 농축 단계를 한외여과 단계로 변경할 수 있다.
본 발명의 통상적인 구체예에 있어서, 크로마토그래피에 의한 1차 정제단계를 DEAE-프렉토겔 수지상에서 실행한다. 그러나 DEAE-프렉토겔과 동등한 특성의 TMAE-프렉토겔(TMAE=트리-메틸-아미노-에틸)이나 DMAE-프렉토겔(DMAE=Di-MAE) 같은 Merck사 시판의 새로운 수지를 사용해도 매우 우수한 결과를 수득할 수 있다. Merck사가 개발한 새로운섬모형(tentacular) 수지를 사용할 수 있다(W. Muller Conference on Liquid Chromatography, June 1989, in Stockholm).
[실시예 2]
본 발명의 또다른 구체예에서는 피브리노겐과 피브로넥틴 농축물을 제조하고 동시에 더 낮은 수득률과 다소 향상된 특이 활성도의 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 농축물을 제공한다.
이 처리법은 DEAE-프렉토겔 1차 칼럼에서 Ⅶ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물이 용리할 때까지 실시예1과 동일한 방법을 사용한다.
칼럼에는 피브리노겐, 향트롬빈 Ⅲ, 알부민과 또한 면역 글루부린 등이 남아있지 않고 여액에서 회수할 수 있다.
Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물은 DEAE-프렉토겔 칼럼상의 2차 크로마토그래피 분리단계에서 정제 및 농축할 수 있으며, 이때 염화나트륨에 대해 이온농도가 0.17M인 충전 완충액을 사용하고 그 결과 잔존하는 오염 단백질을 고착시키지 않게된다. 이온농도를 0.27M로 증가시키면 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 탈착 및 용리할 수 있다. 특이 활성도는 10 내지 20IU/mg이다.
공지된 크로마토그래피 처리법을 사용하여 피브리노겐과 피브로넥틴을 정제할 수 있고 그 결과로 프랑스 특허출원 제 88 07530호에서 설명한 것처럼 치료학적 사용에 적절한 용액이 나온다.
다른 혈장 단백질을 기존의 분류처리법으로 정제 및 농축할 수 있다.
[실시예 3]
25℃로 해동한 초기혈장에 다음과 같은 혼합물을 첨가해서 안정화하면 정제효율이 더 향상된다:
헤파린 : 1U/ml
EDTA : 2mM 또는 0.74g/l
염화칼슘 : 6mM 또는 0.67g/l
이 혼합물에서 5 내지 60g/l 농도의 글루코오스를 첨가한다. 아세트산을 첨가하여 pH 6.5로 낮춘다. 실시예 1이나 2와 같은 정제단계를 실행한다.
이 조건하에서, 정제 처리법의 총 수득량은 초기혈장 1리터당 500U FⅧ:C 이상이다.
이것은 단백질 1mg당 10 내지 30단위의 FⅧ:C 특이활성도에 대해 Ⅷ 인자의 활성도에서 55 내지 65%의 총 회수율에 상응한다.
Claims (16)
- Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법에 있어서, 신선한 또는 냉동된 전체 혈장을 염화바륨과 수산화 알루미늄으로 2중 처리하여 예비-정제하고, 분자량이 1,000,000달톤이상인 분자를 보존할 수 있는 음이온 교환 겔을 이용한 크로마토그래피로 정제하는 것을 특징으로 하는 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 5 내지 60g/ℓ 농도의 글루코오스, 0.2 내지 2U/㎖ 헤파린, 1 내지 5mM의 ETDA, 1 내지 10mM의 CaCl로 구성된 혈장의 변성과 응집을 방지하는 혼합물을 혈장에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 예비 정제는 a) 염화바륨으로 침전시킨 후 상청액을 원심 분리하여 수득하고; b) 수산화 알루미늄 겔에 흡착시킨 후 상청액을 원심 분리하여 수득하고; c) 탈염처리하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, a) 단계에서는 pH 6.5의 1M 염화바륨 용액을 교반하면서 첨가하여, 염화바륨을 이용해 침전시키고 그후 5℃ 내지 10℃로 원심 분리하여 상청액을 수득하고, b) 단계에서는 pH 6.5의 3% 수산화 알루미늄 겔을 사용하여 흡착하고 그 후 5℃로 액화 기체로 급속 냉각하고, 원심 분리하여 상청액을 수득하고, c) 단계에서는 헤파린이 첨가된 충전 완충액 존재하에서 한외 여과하여 탈염처리한 후 다음 크로마토그래피 단계에 사용하거나, 헤파린이 첨가된 충전 완충액속에 있는 세파덱스 G25 칼럼을 이용한 크로마토그래피로 탈염처리한 후 후속 크로마토그래피 단계에 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 예비-정제된 혈장의 상청액을 음이온 교환겔을 포함하는 크로마토그래피 칼럼에 넣고, 이때 크로마토그래피 칼럼은 분자량이 1,000,000달톤이상인 분자는 차단하지 못하고, 피브리노겐, 알부민, 면역글로부린, 항트롬빈 Ⅲ과 피브로넥틴은 여과물에 포함되도록 여과물로 용출시키고, 크로마토그래피 겔이 DEAE나 T-또는 D-MAE 종류가 고착된 비닐 고분자 겔인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 고분자 겔이 프렉토겔인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 크로마토그래피 칼럼충전 완충액은 글리신 8 내지-11g/ℓ, 리신 2 내지-4g/ℓ 포함된 구연산나트륨 및 염화칼슘계 완충액이고 여기에 0.11M 염화나트륨을 첨가하고 pH 7로 조정하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 완충액의 염화나트륨 이온 농도를 0.27M로 증강시켜, Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 크로마토그래피 칼럼에서 탈착시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 완충액의 염화나트륨 이온 농도를 0.13M 염화나트륨으로 증가시켜 피브로넥틴을 제거하고, 다시 0.27M로 증가시켜 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 크로마토그래피 칼럼에서 탈착하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 크로마토그래피 칼럼에서 탈착된 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합물을 크로마토그래피를 이용한 추가 정제 및 농축 단계를 실시하고 이때 추가 크로마토그래피 처리를 DEAE-또는 T/D-MAE-프랙토겔, 고정된 아미노-헥실, 고정된 헤파린, 황산 텍스트란, 설포프로필 또는 친화성 또는 면역친화성 수지 중에서 선택한 이온 교환 수지를 이용하여 실행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 0.11M 염화나트륨으로 적정한 완충액으로 크로마토그래피 처리하고, 염화나트륨 이온 농도는 연속하여 0.13M, 0.27M 으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 0.17M 염화나트륨으로 적정한 완충액으로 크로마토그래피 처리하고, 염화나트륨 이온 농도는 0.27M로 1회 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단백질이 제5항에 따른 크로마토그래피 여과물에 들어있고, 이 여과물은 추가 정제 및 농축시키는 단계로 보내는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 크로마토그래피하기 전에 실시하는 바이러스 비활성화단계는 용매-세척제를 사용하여 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 따르는 방법으로 수득하는 것을 특징으로 하는 Ⅷ 인자-반 빌레브란트 인자 복합 농축물.
- 제1항에 따르는 방법으로 수득하는 것을 특징으로 하는 혈장에서 유도된 단백질 농축물.
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