KR0156623B1 - 상피세포 손상 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알로에의 글리코펩타이드를 주성분으로 하는 G1G1M1DI2 분획을 함유하는 상피세포손상 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 G1G1M1DI2 분획은 알로에의 전체잎의 외피를 제거하여 젤(gel) 분획만을 분리하고, 젤 분획을 동결건조시킨 후에 증류수에 용해시키고, C1-C4알콜 용매를 가하여 생성된 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 상등액을 취하여 알콜 추출용매를 제거한 후에 잔류물을 동결건조시키고, 수득된 동결건조물을 물에 용해시켜 비이온성 다공성 수지의 칼럼에 흡착시키고 C1-C4알콜 용매로 용출시켜 용출되는 분획을 물에 투석시켜 투석잔류물로 수득되는 분자량 5000 이상의 물질을 회수하고, 이 물질을 탄산수소암모늄에 용해시킨 후에 겔여과 크로마토그라피 칼럼에 주입시키고 염화나트륨으로 세척하여 용출되는 분획을 동결건조시킴으로써 수득된다. 이렇게 하여 수득된 알로에의 G1G1M1DI2 분획을 함유하는 상피세포 손상 치료용 조성물을 강력한 상피 세포 증식 및 상피조직형성 촉진작용 및 상피세포에 대한 세포독성을 나타내는 유리 산소 래디칼의 제거작용을 나타내어 창상, 수술부위 및 기타 외상 치유뿐만 아니라 위궤양 조직과 같은 인체 내부장기의 손상조직을 복구시키는데에도 효과적으로 사용할 수 있다.
Description
제1도는 실시예 1에서 추출된 본 발명에 따른 알로에의 글리코펩타이드의 분획인 G1G1M1DI2 분획의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
제2도는 실험예 1에 따라 측정된 것으로 실시예 1의 G1G1M1DI2 분획 제조과정에서 수득되는 알로에(Aloe)의 각종 분획이 인체 피부 암세포(SCC13)의 티미딘 섭취에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
제3도는 실험예 2에 따라 관찰된 것으로, 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 인체상피세포 증식에 대한 촉진작용을 나타내고 있음을 보여 주는 사진이다.
제4도는 실험예 3에 따라 관찰된 것으로, 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 인체상피조직 형성에 미치는 영향을 나타낸 사진이다.
제5도는 실험예 4에 따라 관찰된 것으로, 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 피부세포성장에 필요한 상피세포성장인자 수용체 발현을 증가시키고 있음을 나타내는 사진이다.
제6도는 실험예 4에 따라 관찰된 것으로, 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 피부세포증식시에 나타나는 케라틴(keratin) 5/14의 발현을 증가시키고 있음을 나타내는 사진이다.
제7도는 실험예 5에 따라 관찰된 것으로, 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 상피세포이동에 필요한 상피세포막에 존재하는 피브로넥틴 수용체(fibronectin receptor)의 발현을 증가시키고 있음을 나타내는 사진이다.
제8도는 실험예 5에 따라 관찰된 것으로, 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 상피세포 이동에 필요한 진피에 함유되어 있는 피브로넥틴의 발현을 증가시키고 있음을 나타내는 사진이다.
본 발명은 상피세포의 손상 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 알로에 추출물의 특정분획을 함유하는 인체의 피부 및 점막, 특히 위점막 등을 포함한 상피세포의 손상이 있을 때 상피세포의 성장을 촉진하고 산소래디칼의 세포독성을 억제함으로써 상피세포의 손상을 효과적으로 치료하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
알로에(Aloe)는 백합과(Liliaceae)에 속하는 식물로써 다양한 약리작용을 가지고 있는 것으로 알려져 있어 고대로부터 여러 질병의 치료를 위하여 민간약제로 광범위하게 이용되어 왔다. 현재까지 경험적 내지 실험적으로 알려진 알로레의 약리학적 효과로는 상처치유, 항염증, 노화방지, 항암 및 면역증강 작용 등이 있다. 이러한 알로에의 약리학적 효과중에서 특히 상처치유 효과는 가장 오래전부터 알려진 약효이며, 따라서 상처는 알로에가 가장 빈번히 사용되어 왔던 치료대상이라고 할 수 있다. 최근에는 이러한 알로에의 상처치유 효과가 현대과학적 방법으로 여러 종류의 상처에서 검증되고 있다. 즉 벤 상처, 방사선에 의한 손상 및 화상 등과 같이 외부로 노출된 손상은 물론, 인체 내부 장기의 궤양에도 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다.
그러나 지금까지 알려진 알로에의 약리학적 효과에 대한 연구는 거의 모든 경우에 있어서 알로에 잎 전체 또는 외피를 제거하고 얻은 젤(gel)로부터 얻은 액즙상태의 추출물 또는 이 추출물을 증발시켜 얻은 건조추출물을 이용하여 시행되어 왔기 때문에 각 약효가 구체적으로 어떠한 성분에 기인하는 것인지는 잦 밝혀져 있지 않다. 따라서 가장 뚜렷한 효과의 하나인 상처치유효과 역시 이같은 추출물 상태의 시료를 가지고 시행한 실험을 통하여 얻은 결과이므로 비록 상처치유 효과는 인정된다고 하더라도 그 약효를 나타내는 유효성분이 무엇인지는 알려져 있지 않았다. 그런데 이와 같이 알로에를 추출물 상태로 임상적으로 사용하는 경우에는 목적하는 효과를 나타내는 성분 이외의 다른 성분이 포함될 수 있기 때문에 복용하는 사람에 따라서는 원치 않는 부작용이 발생하는 경우도 빈번하게 있을 뿐 아니라, 목적하는 수준의 효과를 얻기 위해서는 다량의 추출물을 투여하여야 하는 등의 문제가 있다. 따라서, 목적하는 효과를 나타내는 유효성분이 무엇인지를 밝혀내는 것이 알로에의 의약품화에 가장 우선적으로 해결되어야 할 과제였다.
이에 본 발명자들은 알로에에 대한 보다 과학적인 접근방법으로, 각종 물질의 분리방법을 이용하여 알로에의 성분들을 분리하고, 그에 대한 약물학적 실험을 수행하였으며, 그 결과 알로에 추출물의 특정 분획, 즉 글리코펩타이드를 주성분으로 하는 분획 탁월한 상피세포 성장촉진작용과 함께 상피세포에 손상을 일으키는 산소 래디칼을 제거함으로써 탁월한 상피세포 손상 치료효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
상처를 받은 피부조직은 복잡한 과정을 거쳐 재생된다. 우선 초기단계에는 파괴된 혈관 및 조직세포로부터 혈액 및 세포액이 유출된다. 유출된 혈액 및 세포액에는 각종 물질이 포함되어 있는데 이들 대부분은 조직에서 염증반응을 유발하는 물질들이다. 즉 혈소판활성물질, 혈액응고물질, 백혈구에서 유출된 가수분해효소, 산소라디칼 및 프로스트글라딘 등이 그 예라 할 수 있다. 이들에 의하여 손상된 조직에서는 염증이 일어나지만 이같은 염증반응은 일종의 방어기전으로써 이(異)물질 침투를 억제하여 결국 상처부위를 보호하게 된다. 이때 대식세포, 과립세포 및 비만세포 등이 관여하여 조직방어기능은 더욱 보강된다. 이같은 방어기전에 의한 보호아래 파괴된 조직은 재생단계로 들어가게 되는데, 이때 섬유아세포는 활발한 분열을 통하여 상처로 파괴된 조직공간을 메우고, 메워진 조직 표면으로 상피세포는 분열하여 이동함으로써 그 표면을 덮고 이후에 분화를 통하여 상피조직을 형성하여 파괴조직의 재생은 완성되었다.
이상에서 살펴본 바와 같이 파괴된 피부조직의 재생은 여러 과정을 거쳐 일어나지만 결국 최종단계는 상피세포의 분열, 이동 및 분화를 통한 상피조직의 형성이라고 할 수 있다. 따라서 상처치유에 효과를 나타내는 유효한 약제는 다음과 같은 작용을 동시에 발휘할 수 있어야 한다고 생각된다.
첫째, 상피세포의 분열을 촉진할 수 있어야 한다. 이때 상피세포의 성장인자 및 그 수용체의 생성촉진 등 작용기전이 입증되어야 한다.
둘째, 상피세포의 이동을 촉진할 수 있어야 한다. 이를 뒷받침하기 위해서 세포이동에 필요한 피브로넥틴 및 그 수용체의 생성을 촉진함이 입증되어야 한다.
셋째, 단순한 상피세포 분열 촉진 뿐만 아니라 분화까지도 촉진하여 균형있는 상피조직형성을 촉진할 수 있어야 한다.
본 발명에 따라 분리된 알로에 추출물의 특정 분획, 즉 글리코펩타이드를 주성분으로 하는 분획은 실험에 의해 상기 세가지 작용을 모두 가지고 있는 것으로 확인되었다.
본 발명의 알로에 추출분획은 또한 상피세포, 특히 상피세포로 구성된 위점막의 손상이 야기된 위궤양이 있는 경우에 그의 유발원인이 되는 산소 래디칼을 제거함으로써 산소 래디칼에 의한 세포독성으로부터 위점막의 상피세포를 보호할 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따르는 후술하는 바와 같은 특정의 알로에 분획은 상피세포 성장 촉진작용과 세포독성을 나타내는 산소 래디칼의 제거작용을 모두 가지고 있기 때문에 이 두가지 작용의 복합작용에 의해 상피세포 손상에 대한 보다 탁월한 치료효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명은 알로에 추출물의 글리코펩타이드 분획을 유효성분으로 함유하는 상처치유 목적의 상피세포 손상 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이와 같이 상피세포 손상 치료작용을 나타내는 알로에의 글리코펩타이드 분획을 제조하는 방법도 포함한다.
본 발명에 따라 인체의 상피세포에 대한 손상의 예방 및 치료작용을 가지고 있는 것으로 확인된 알로에의 글리포펩타이드 분획(이하에서는 G1G1M1DI2분획이라 함)은 알로에를 다음과 같은 방법에 의해 처리함으로써 수득된다.
즉, 알로에의 전체잎의 외피를 제거하여 젤(gel)분획만을 분리하고, 젤분획을 동결건조시킨 후에 증류수에 용해시키고, C1-C4알콜 용매를 가하여 생성된 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, 상징액을 취하여 알콜 추출 용매를 제거한 후에 잔류물을 동결건조시키고, 수득된 동결건조물을 물에 용해시켜 비이온성 다공성 수지의 칼럼에 흡착시키고 C1-C4알콜 용매로 용출시켜 용출되는 분획을 물에 투석시켜 투석잔류물로 수득되는 분자량 5000 이상의 물질을 회수하고, 이 물질을 탄산수소암모늄에 용해시킨 후에 겔여과 크로마토그라피 칼럼에 주입시키고 염화나트륨으로 세척하여 목적하는 글리코펩타이드 분획인 G1G1M1DI2 분획을 수득한다.
본 발명에 따르는 상기의 방법을 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
우선, 신선한 알로에의 잎을 물로 깨끗이 세척한 후에 잎의 외피를 기계적으로 제거하여 젤(gel)부분만을 얻어 이 젤을 동결건조시킨다(G1분획). 이 G1분획을 증류수에 용해시킨 후에 이 용액에 C1-C4알콜 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 1-부탄올 또는 2-부탄올, 특히는 에탄올 용매를 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 정치시켜 침전물과 상징액을 분리시키고, 이 혼합액을 원심분리하여 상징액만을 취하여 동결건조시킨다(G1G1 분획). 이 G1G1분획을 물에 용해시킨 후에 생성된 수용액을 비이온성 다공성 수지 칼럼, 예를 들면 앰버라이트(Amberlite) XAD-2칼럼에 흡착시키고 C1-C4알콜 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등, 특히는 메탄올로 용출시켜 배출되는 분획을 회수한다(G1G1M분획).
이 G1G1M분획을 물에 투석시켜 저분자물질을 제거하고 잔류물을 감압하에서 건조시켜 분자량이 5000이상인 물질만을 회수한다.
이렇게 하여 수득된 분자량 5000 이상의 용출물을 탄산수소암모늄(NH4HCO3)에 용해시킨 후에 겔여과 크로마토그라피 칼럼, 예를 들면 DEAE-토요펄(Toyopearl)650M 칼럼에 주입시키고 염화나트륨(NaCl)으로 세척하여 칼럼으로부터 용출되는 분획을 얻어 동결건조시켜 본 발명에서 목적으로 하는 G1G1M1DI2분획을 수득한다.
상술한 G1G1M1DI2 분획을 제조하는 본 발명에 따르는 방법은 다음과 같은 도식으로 요약하여 나타낼 수 있다.
상기한 본 발명의 방법에 따라 분리된 알로에의 G1G1M1DI2분획은 여러 가지 물리화학적 분석결과에 의해 글리코펩타이드를 주성분으로 함유하는 것으로 확인되었다.
본 발명에 따르는 알로에의 G1G1M1DI2 분획은 상기에서 언급한 바와 같이 피부세포 및 점막세포 등을 포함한 상피세포에 대한 성장촉진작용과 함께 이들 세포에 대한 산소 래디칼의 세포독성을 방지하는 작용을 나타낸다.
본 발명에 따르는 알로에의 G1G1M1DI2분획의 상피세포성장 촉진작용은 피부상피세포암의 일종인 SCC 13 세포의 티미딘 섭취(thymidine uptake)에 대한 촉진효과에 의해 확인되었다. 이 실험에서는 다양한 알로에의 분획 중에서 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 대조군에 비하여 거의 25배 이상 티미딘 섭취를 촉진하는 작용이 있는 것으로 관찰되었으며, 이를 기본으로 하여 알로에의 G1G1M1DI2 분획의 상피세포성장 촉진작용이 보다 구체적으로 검토되었다.
후술하는 실험예에서 구체적으로 입증되는 바와 같이 본 발명에 따르는 알로에의 G1G1M1DI2 분획은 인체의 상피세포에 대한 증식촉진작용, 상피조직형성 촉진작용 및 상피세포의 성장과 이동에 필요한 각종 단백질의 발현 촉진작용을 모두 나타내어 이들의 균형적인 협동작용에 의해 인체 상피조직의 손상을 효과적으로 정상조직으로 복구시켜 치유할 수 있다.
본 발명에 따르는 G1G1M1DI2 분획의 상피성장 촉진작용은 상피세포로 이루어진 위점막의 손상에 의해 야기되는 위궤양에 대한 탁월한 치료효과에 의해 더욱 명백하게 입증될 수 있다. 또한 위궤양에 대한 치료효과를 확인하는 실험을 통해 본 발명의 G1G1M1DI2 분획은 상기 언급한 바와 같이 손상된 상피조직의 성장을 촉진시킴으로써 정상으로 복구시키는 작용을 가지고 있을 뿐 아니라 세포독성을 나타내는 유리 산소 래디칼을 제거하는 작용까지도 나타냄으로써 이중적인 위궤양 치료효과를 나타냄을 알 수 있다.
최근의 연구결과에 의해 위점막의 상처인 위궤양은 유리 산소 래디칼에 의한 위점막 손상이 주된 발병기전인 것으로 밝혀지고 있다. 즉 위장질환이 많은 한국인을 포함한 동양인의 90% 이상에서는 위점막에 헬리코박터 파이로리(Helicobacter(H.) pylori)라는 균이 감염되어 있는데 이 균의 감염으로 위점막은 산소 래디칼에 의한 손상을 받고 있는 것이다. 왜냐하면 헬리코박터 파이로리에 감염되면 이 균을 제거하려는 방어기전으로 백혈구가 위점막에 침윤하여 이들 백혈구는 헬리코박터 파이로리를 포식하여 이 균을 제거하려 한다. 이때 헬리코박터 파이로리를 식한 백혈구는 산소 래디칼을 생성하여 살균작용을 일으켜 방어작용을 나타내는 동시에 균뿐만 아니라 위점막에도 손상을 유발하여 위궤양을 일으키게 되는 것이다. 본 발명에 따르는 G1G1M1DI2 분획은 이러한 위궤양 발병기전에 작용하여 산소 래디칼에 의한 위세포 손상을 거의 완전히 억제하며 이러한 산소 래디칼 억제작용은 상피세포 증식작용과 함께 복합적으로 작용하여 위궤양에 대한 우수한 치료효과를 나타내는 것이다.
본 발명의 G1G1M1DI2 분획은 강력한 상피세포 성장 및 상피조직 형성 촉진작용과 함께 산소 래티칼 제거작용을 가지고 있기 때문에 인체의 각종 손상조직, 예를 들어 열상, 창상, 수술부위, 동상, 화상 및 방사선에 의한 손상 등 각종 외상, 그리고 위궤양과 같은 장기내부의 손상에서 손상된 조직을 복구시키는데 바람직하게 사용될 수 있으며, 특히 위궤양에 대한 탁월한 치료효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따르는 G1G1M1DI2 분획의 투여용량은 손상부위의 크기, 환자의 상태, 연령 및 합병증 유무 등과 같은 다양한 요인을 고려하여 전문가에 의하여 결정될 수 있지만, 일반적으로 인체에 1일 1㎎ 내지 500㎎, 바람직하게는 4㎎ 내지 125㎎의 용량을 1회 또는 수회 분할하여 투여한다. 본 발명의 G1G1M1DI2 분획은 상기 1일 용량에서 뿐만 아니라 이를 초과한 대량의 투여시에도 거의 세포독성이 나타나지 않으므로 안전하게 투여할 수 있는 약제이다.
본 발명에 따르는 알로에의 G1G1M1DI2 분획을 임상적으로 이용시에, 이 분획은 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 따라 통상적인 약제학적 제제로 제형화시켜 사용할 수 있다. 이러한 목적에 바람직한 약제학적 제제에는 정제, 경질 또는 연질캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액과 같은 비경구투여용 주사제, 연고제, 크림제, 로숀 등과 같은 국소투여용 외용제 등이 포함된다. 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용되는 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활탁제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 중량제, 주사제의 경우에는 안정제, 보존제, 용해보조제, 완충제, 등장화제 등, 또는 외용제의 경우에는 수성 또는 유성 연구제, 산화방지제, 방부제, 증량제 등을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따르는 G1G1M1DI2 분획을 함유하는 상피세포성장 촉진제 조성물은 단위제형당 상기 언급된 G1G1M1DI2 분획의 1일 용량 또는 그의 1/2, 1/3, 1/4. 1/5 또는 1/6의 용량이 함유되도록 제조하며, 이러한 단위제형을 1일, 1내지 6회 투여한다.
본 발명은 이하의 실시예에 더욱 상세하게 설명되나, 이들 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 제시된 것일 뿐이며, 본 발명이 이들에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
[제조실시예]
[실시예 1 : 알로에의 G1G1M1DI2 분획의 제조]
신선한 알로에(Aloe vera)의 잎전체 5kg을 취하여 물로 세척한 후에 외피를 제거하여 젤 부분 3.5kg을 분리하였다. 이 젤을 동결건조시켜서 G1분획 25g을 수득하고, 이것을 증류수 200㎖에 용해시킨 후에 95% 에탄올(800㎖; 4배용적)을 가하여 4℃에서 하룻밤 동안 정치시켰다. 생성된 침전물을 4℃에서 30분 동안 원심분리(10,000rpm)시켜 침전물(다당 단백질 등의 고분자 화합물)과 상징액(극성이 작거나 중증도인 화합물)을 분리하였다. 분리된 상징액으로부터 감압하에서 에탄올을 증발시켜 제거하고 잔류물을 소량의 증류수에 용해시키고 동결건조시켜 상징액 분획(G1G1) 14.50g을 수득하였다.
G1G1분획 1g을 10㎖에 용해시킨 후에 앰버라이트 XAD-칼럼(수지: 250㎖, 2.5m× 25cm)에 주입하여 증류수, 50% 메탄올 및 메탄올과 아세톤의 1:1 혼합물로 순차적으로 용출시켜 각각 증류수 분획(G1G1W) 900㎎, 50% 메탄올 분획(G1G1M1) 53㎎ 및 메탄올 및 아세톤 분획(G1G1MA1) 8㎎을 수득하였다.
수득된 G1G1M1 분획 630㎎을 3일 동안 투석(분자량 : 5000)시킨 후에 투석잔사를 감압하에서 건조시켜 생성물 260㎎을 수득하였다. 수득된 생성물을 0.02M NH4HCO3(10㎖)에 용해시켜 DEAE-토요펄(Toyopearl) 650M 칼럼에 주입하여 이온교환 크로마토그라피시키고 0.02M NH4HCO3로 용출시켜 G1G1M1DI1 분획 88.4㎎을 수득하고, 계속해서 0.3M NaCl로 용출시키고 NaCl 용출물을 동결건조시켜 목적하는 G1G1M1DI2 분획 3㎎을 수득하였다. 수득된 G1G1M1DI2 분획에 대해 HPLC 크로마토그라피[칼럼: YMC-Pack ODS-AQ 250X10mm.D, 용출제; 0.05% TFA(트리플루오로아세트산) 중의 50% 수성 아세토니트릴, 검출기: UV 280nm]를 실시하여 그 측정된 결과를 제1도에 나타내었다.
[실시예 2 : 조성물 실시예]
이하의 조성물 실시예에서 활성성분은 상기 실시예 1에 따라 수득된 알로에의 글리코펩타이드 분획인 G1G1M1DI2 분획의 동결건조물을 의미하는 것이다.
[조성물1(정제)]
다음 성분들을 이용하여 대한약전 제제총칙 중의 정제의 제조방법에 따라 정제 1개당, 활성성분 5㎎을 함유하는 정제를 제조하였다.
[조성물 2(연질칼셀제)]
다음 성분들을 이용하여 대한약전 제제총칙 중의 캅셀제의 제조방법에 따라 캅셀 1개당, 활성성분 5㎎을 함유하는 연질칼셉제를 제조하였다.
[조성물 3(주사제)]
다음 성분들을 이용하여 대한약전 제제총칙 중의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당, 활성성분 2㎎을 함유하는 주사제를 제조하였다.
[조성물 4(연고제)]
다음 성분들을 이용하여 대한약전 제제총칙 중의 연고제의 제조방법에 따라 1g당, 활성성분 2㎎을 함유하는 연고제를 제조하였다.
[실험예]
[실험예 1 : 세포성장촉진 효과 검정]
알로에 추출물 중의 어떤 분획이 상피세포성장 촉진효과를 나타내는지 확인하기 위하여 실시예 1의 방법에 따라 G1G1M1DI2 분획을 제조하는 과정에서 수득된 각종 분획에 대하여 인체 상피세포의 일종인 SCC13세포의 티미딘 섭취 증진효과를 다음과 같은 방법에 의해 검정하였다.
96-웰 배양기에 인간의 SCC13 세포(Dr. Elaine Fuchs, Dept. Molecular Genetics, University Chicago, Chicago, IL 60637, U.S.A)를 웰당 5000개씩 배양하여 접합율(confluency)이 80%가 될 때까지 배양하였다[배양액 : DMEM 배지 + HAM-12 배지 + 송아지 태자혈청(FCS)]. 이 상태에서 배양액을 FCS를 제거한 DMEM+HAM-12 배양액으로 교체시킨 후에 해당하는 알로에 분획 1㎎/㎖씩을 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 그후에 배양액을 DMEM만 있는 배양액으로 교체하고 여기에 [3H]-티미딘을 5μCi/㎖이 되도록 첨가하여 3시간 동안 배양한 후에 세포를 수집하여 [3H]-티미딘의 섭취 신틸레이션 카운터(scintillation counter)를 이용하여 측정하였다. 측정된 결과는 제2도에 나타내었다.
이와 같은 방법으로 세포성장 촉진효과를 일차 검정하였을 때 제2도에서 보는 바와 같이 G1G1M1DI2 분획을 처리한 경우에는 무처리 대조군에 비하여 25배 이상의 티미딘 섭취를 나타낼 뿐 아니라 다른 알로에 분획을 처리한 경우에 비해서도 월등히 높게 티미딘 섭취를 촉진하였다.
[실험예 2 : 인체상피세포 증식촉진 작용]
G1G1M1DI2 분획이 실제로 인체 상피세포의 성장을 촉진하는지 여부를 검정하기 위하여 인체상피세포를 배양하고 이 배양세포층에 인취적으로 상처를 낸 후에 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 상처의 치유에 미치는 영향을 관찰하였다.
신생남아 성기의 포경수술을 통하여 얻은 피부조직(foreskin)을 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척한 후에 피하조직을 제거하고 0.25% 트립신 및 베르젠[versene(EDTA 2Na 염) 50 : 50]으로 처리한 후에 마우스의 섬유아세포와 함께 배양하여 배양밀도가 90 내지 95%에 도달하면 세포를 회수하여 트립신 처리함으로써 인체상피세포를 수득하였다. 이 세포를 2개의 배양접시에 심어 이들 세포들이 분영하여 배양접시 바닥를 단층(monolayer)으로 덮을 때까지 배양하였다. 이때 이 단층의 세포층에 현미경으로 검경하면서 뾰족한 바늘로 긁어서 직경 약 10㎛ 정도의 크기로 상처를 낸 후에 하나의 접시는 대조군으로서 아무것도 처리하지 않고, 다른 하나의 접시에는 G1G1M1DI2 분획 50㎍/㎖를 첨가한 후에 계속 배양하여 상처부위가 복구되는 속도를 비교하였다. 그 결과 처리하지 않은 대조군의 경우에는 40 시간이 경과하여도 상처부위가 복구되지 않는데 반하여, G1G1M1DI2 분획을 첨가한 경우에는 25시간이 경과하면 상처부위가 거의 완전히 복구되는 것을 관찰할 수 있었다(제3도).
이러한 결과로부터 본 발명에 따르는 알로에의 G1G1M1DI2 분획은 상피세포의 분열을 촉진하여 상피세포의 증식을 항진시키는 효과가 있음을 알 수 있다.
[실험예 : 3 인체상피세포로부터 상피조직형성 촉진 작용]
G1G1M1DI2 분획의 상피세포증식효과를 확인한 후, 이 분획이 상피세포로부터 상피조직을 형성하는데 미치는 영향을 관찰하였다. 세포가 조직을 형성하는데는 증식뿐만 아니라 분화가 수반되고 이 두과정이 균형있게 일어날 때 정상조직이 형성된다. 따라서 본 실험의 목적은 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 세포 증식 작용 이외에 분화촉진 작용을 통하여 균형있는 정상조직 생성 촉진 작용에 있는지를 확인하기 위한 것이다. 상피세포에서 상피조직형성은 래프트(raft) 배양법[Elaine Fuchs's Mehtod : 참고문헌 Kopan R. and Fuchs F., The use of retinoic acid to relation between hyperproliferation-associated keratins and cell proliferation in normal and malignant epidermal cells, J. Cell Biol. 1989, 109: 295-307 및 Choi Y. and Fuchs E., TGF-βand retinoic acid, Cell Regul, 1990, 1:791-809]을 이용하였고, 그 방법은 다음과 같다.
즉, 실험예 2에 따라 신생남아에서 얻은 상피세포를 인공진피가 깔린 밀리셀(millicell)에 접종하고 37℃에서 7일간 배양하였다. 이때 인공진피는 밀리셀 바닥에 타입 I 콜라겐 라티스(collagen lattice)에 의해 형성된 매트릭스에 마우스 NIH 3T3 섬유아세포(fibroblast)를 바닥직경 12mm의 밀리셀의 바닥에 17,000 세포의 비율로 접종하고 37℃에서 2일간 배양하여(배양액 DMEM)형성시켰다. 이렇게 인공진피가 형성된 밀리셀에 인간의 피부세포를 밀리셀당 17,000 내지 20,000세포의 비율로 접종하고 7일간 37℃에서 배양하여 이들 세포들이 단층의 세포층을 이루도록 한다. 그리고 상부층의 배양액을 제거하고, 여기에 본 발명의 G1G1M1DI2 분획을 배양액 ㎖당 50ng, 500ng, 5㎍ 또는 50㎍의 양으로 가하고, 하나의 밀리셀에는 분획을 첨가하지 않아 대조군으로 하였다. 이렇게 하여 단층을 형성한 세포층의 아랫부분만을 배양액에 접촉시키고 상층부는 공기에 노출시키면서 배양하였다. 이때 배양액은 7일에 한번씩 교체하여 주었다. 이와 같이 기상액상계면(air-liquid interface)에서 21일간 배양하면 생체에서와 같은 피부조직이 형성된다.
본 발명의 G1G1M1DI2 분획 존재하에서 형성된 조직은 첨가된 분획의 농도에 비례하여 상피조직의 두께가 증가하였고, 50㎍/㎖의 농도로 처리하였을 경우에는 처리하지 않은 대조군의 피부조직의 5배의 두께를 나타내었다. 그리고 이때 두꺼워진 피부조직의 조직학적 소견은 정상피부조직의 구조를 가지고 있어 G1G1M1DI2 분획은 정상적인 피부조직으로 균형있게 그 형성을 촉진하고 있음을 알 수 있었다(제4도).
[실험예 4 : 상피세포의 성장과 이동에 필요한 각종 단백질 발현 촉진 작용]
상피세포의 성장에는 상피세포성장인자(EGF:Epidermal Growth Factor)가 작용하는데, 이 인자의 작용에는 상피세포 표면에 있는 이 인자의 수용체가 필수적으로 요구된다. 즉 이 성장인자가 특유의 자기 수용체에 결합하여야 비로서 세포 성장효과를 발휘할 수 있으며, 또한 분열이 왕성한 상피세포에서는 케라틴(keratin)이라는 단백질의 함량이 증가된다. 따라서 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 EGF 수용체 및 케라틴의 발현에 미치는 영향을 관찰하였다.
즉, 래프트(raft) 배양법에 따라 배양된 피부조직을 파라핀으로 코팅하여 마이크로톰(microtome)으로 절편을 만든 후에, 이 절편에서 파라핀을 제거하고 증류수로 수화시킨 후에 인체 상피세포 성장인자 수용체에 대한 마우수 모노클로날항체(mouse monoclonal anti-human EGF receptor)를 이용한 면역세포화학염색(immunocytochemistry)방법[참고문헌 : Choi Y. and Fuchs E. (1990) Cell Regulation 1, 791-809; Kursad Turksan et. al. (1991) Cell Regualtion 2, 613-625; Raphae Kopan and Elaine Fuchs(1989) Journal of Cell Biology 109, 295-307].
제 5도에서 보는 바와 같이 상피조직의 기저세포에서 검게 염색되므로 이 수용체의 존재를 확인할 수 있었으며, 그 염색정도는 G1G1M1DI2 분획의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 따라서 본 발명의 G1G1M1DI2 분획은 상피세포성 장인자 수용체의 발현을 농도-의존적으로 증가시키고 있음을 뚜렷이 관찰할 수 있었다.
G1G1M1DI2의 세포성장촉진 작용을 확인하는 또다른 방법으로 케라틴 5/14의 발현을 관찰하였다. 성장이 촉진되고 있는 세포에서 이 단백질의 발현이 증가되고 있음은 잘 알려졌다. 따라서 본 분획이 케라틴 5/14의 발현을 증가시킨다면 이 분획의 상피세포성장 촉진작용은 더욱 뒷받침된다고 할 수 있다. 앞에서와 같은 방법으로 얻어진 피부조직을 토끼에서 얻은 인체 케라틴 5/14의 항체(rabbit polyclonal anti-human Keratin 5/14)를 이용하여 상기의 방법으로 그 발현을 염색의 정도로서 관찰하였다. 제6도에서 보는 바와 같이 케라틴 5/14 역시 G1G1M1DI2 분획에 이하여 그 발현이 농도-의존적으로 증가하였다.
[실험예 5 : 세포이동에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향]
피부조직의 상처회복 과정에서 또다른 중요한 과정은 세포이동이다. 즉 상처로 비워진 공간을 채워야 하는데 이때 증식과 동시에 세포가 빈공간으로 이동되어야 한다.
이 세포이동에 필요한 단백질은 진피층에 있는 피브로넥틴과 상피세포 표면에 있는 이 단백질의 수용체이다. 즉 상피세포는 그 표면에 있는 피브로넥틴 수용체를 이용하여 피브로넥틴과 접촉하여 이동하게 된다. 따라서 이 두 단백질의 발현이 증가된다면 이는 곧 세포의 이동성이 증가되어 있음을 의미한다고 할 수 있다.
이 두 단백질의 발현을 알아보기 위하여 상기 실험예 3에서와 동일한 방식으로 G1G1M1DI2 분획 첨가하에 래프트(raft) 배양법에 따라 상피조직을 얻은 후, 두 단백질의 항체(rabbit polyclonal anti-human fibronection 및 rabbit polyclonal anti-human fibronection receptor)로 발현을 염색의 정도로서 관찰하였다.
그 결과로 제7도에서는 상피조직의 기저세포층에서의 피브로넥틴 수용체의 발현을 나타내었으며, 제8도에서는 진피층의 피브로넥틴의 발현을 나타내었다. 제7도 및 8도에서 보는 바와 같이, 두 단백질 모두 G1G1M1DI2 분획에 의하여 그 발현이 농도-의존적으로 현저히 증가되었음을 관찰할 수 있었다.
[실험예 6 : 헬리코박터 파이로리에 의해 생성된 산소 래디칼 제거작용]
건강인의 혈액으로부터 백혈구를 분리한 다음에 이들 백혈구를 사람의 위점막으로부터 분리한 헬리코박터 파이로리와 반응시켰다. 이때 백혈구로부터 산소 래디칼이 생성되는데 생성된 산소 래디칼은 반응액에 첨가된 루미놀(luminol)과 반응하여 광화학반응(chemiluminescence)을 일으키는데 이 광화학반응을 광화학반응계(chemiluminometer)로 관찰하여 산소 래디칼의 생성을 측정하였다. 이하에서는 이와 같은 광화학반응을 본 발명의 G1G1M1DI2 분획이 억제할 수 있는지를 특정함으로써 G1G1M1DI2 분획의 산소래디칼 제거작용의 여부를 결정하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
반응용기중의 Ca++를 함유하지 않은 KPP 완충액(0.1M 인산나트륨완충액(pH 7.4) 21㎖, 0.1%(w/v) NaCl 100㎖, 0.154M KCL 4㎖, 0.154M MgCl21㎖)중에 건강인의 혈액으로부터 분리한 백혈구 106개/㎖를 가하고 여기에 루미놀(0.1㎎/㎖) 5㎕ 및 헬리코박터 파이로리 1.2×108세포/㎕를 가하여 37℃에서 35분 동안 반응시켰다. 생성되는 산소 래디칼을 광화학반응계(Multi-BiolumatR: Berthold Company)로 측정하여 그 측정된 양을 100%로 하였다. 본 발명에 따르는 G1G1M1DI2 분획을 각각 0.05㎎/㎖, 0.1㎎/㎖, 0.5㎎/㎖ 및 1㎎/㎖로 첨가하여 상기와 동일한 반응조건하에서 반응시키고 각각의 경우에 생성되는 산소 래디칼의 양을 광화학반응계로 측정하였다. 측정된 결과는 다음 표 1에 기재하였다.
상기 표1에 기재된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 따르는 알로에의 G1G1M1DI2 분획은 헬리코박터 파이로리에 의한 백혈구로부터의 산소 래디칼 생성을 농도의존적으로 억제한다. 즉, G1G1M1DI2 분획을 첨가하지 않았을 때 산소 래디칼의 생성을 100%로 하였을 때 G1G1M1DI2 분획을 0.05, 0.1, 0.5 및 1㎎/㎖의 농도로 첨가하면 각각의 경우에 산소 래디칼의 생성이 29.5, 40.0, 69.7 및 81.3%까지 억제됨을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 G1G1M1DI2 분획은 산소 래디칼의 생성에 대해 농도의존적인 억제작용을 나타냄을 알 수 있다.
[실험예 7 : 헬리코박토 파이로리에 의해 유도된 백혈구로부터 생성되는 산소 래디칼에 의한 카토(Kato) Ⅲ 세포독성에 의한 G1G1M1DI2 분획의 보호효과]
실험을 시작하기 전에 우선, 헬리코박터 파이로리에 의하여 백혈구로부터 생성된 산소 래디칼이 카토 Ⅲ세포에 독성을 유발할 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 우선 카토 Ⅲ세포와 백혈구 및 헬리코박터 파이로리의 반응액으로부터 검출된 LDH(lactate dehydrogenase)의 활성도와 백혈구와 헬리코박터 파이로리의 반응액으로부터 검출된 LDH 활성도와의 차이를 측정함으로써, 헬리코박터 파이로리에 의하여 백혈구로부터 생성된 산소 래디칼의 공격에 의한 카토 Ⅲ 세포의 파괴도를 결정하였다. LDH의 활성도 측정을 위한 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
96-웰 플레이트를 실험용 웰(A 구획), 표적세포 자발적 LDH 유리웰(B구획), 표적세포 최대 LDH 유리웰(C 구획), 효능세포 자발적 LDH 유리웰(D 구획), 용적보정용 조절웰(E 구획) 및 배지 백그라운드(background) 웰(F 구획)의 6구획으로 나누었다. 각 웰당 전체용량은 100㎕로 하였다. 우선 A, B 및 C구획의 웰에 각각 웰당 카토 Ⅲ 세포 2×10 개를 가하였다. A구획의 웰에는 또한 6가지로 구분하여 1)백혈구 10 세포, 2)헬리코박터 파이로리 1.2×10 세포, 3)백혈구 10 세포 및 헬리코박터 파이로리 1.2×10 세포, 4) 백혈구 10 세포 및 헬리코박터 파이로리 1.2×10 세포 및 G1G1M1DI2 분획 1㎎, 5) 백혈구 10 세포 및 헬리코박터 파이로리 1.2×10 세포 및 G1G1M1DI2 분획 0.5㎎ 및 6) 백혈구 10 세포 및 헬리코박터 파이로리 1.2×10 세포 및 G1G1M1DI2 분획 0.1㎎을 각각 추가로 가하였다. D구획의 웰은 3가지로 구분하여 1) 백혈구 10 세포, 2) 헬리코박터 파이로리 1.2×10 세포, 3)백혈구 10 세포 및 헬리코박터 파이로리 1.2×10 세포를 각각 가하였다. E구획의 웰에는 배양액으로 메디움(Medium) 199(Promega사 제품) 100㎕ 및 용해용액(lysis solution) (Promega사 제품) 100㎕를 가하였다. 구획 F에는 메디움 199 배양액 100㎕를 가하였다. 이 96-웰 플레이트를 37℃의 CO배양기에서 3시간 15분 동안 배양한 후에 250g에서 5분 동안 원심분리하였다. 각각의 웰로부터 상징액 50㎕씩을 위해 새로운 96-웰 플레이트에 상응하게 옮기고, 각 웰에 서브스트레이트 믹스(Substrate Mix)(Promega 사 제품) 50㎕를 가한 후에 실온하에 암소에서 30분 동안 방치하였다. 반응을 중지시키기 위해 6% 아세트산 50㎕를 가하고 1시간 이내에 엘리사 리더를 이용하여 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 각 웰의 데이타로 카토세포와 백혈구 및 헬리코박터 파이로리를 함께 배양한 웰(A구획)에서의 흡광도에서 백혈구와 헬리코박터 파이로리를 함께 배양한 웰(D구획)에서의 흡광도를 뺀값을 기준(100%)으로 하여 각각의 웰에서의 상대적 세포독성을 계산하였다. 축정된 결과는 댜음 표2에 기재하였다.
상대적세포독성 = [K+N+HP]-[N+HP]의 값을 100%로 하여 계산된 각각의 값의 상대적 비
상기 표2의 결과로부터 본 발명에 따르는 G1G1M1DI2 분획은 산소 래디칼에 의한 카토 세포의 파괴를 억제함을 알 수 있다. 즉 본 발명의 G1G1M1DI2 분획의 부재하에서 헬리코박토 파이로리에 의해 야기되는 산소 래디칼에 의한 카토 세포의 파괴를 100%로 하여 계산하면, 여기에 G1G1M1DI2 분획을 01,. 0.5 및 1㎎/㎖첨가하였을 때 카토 세포의 파괴는 각각 88.6, 44.2 및 0%로 나타났다. 즉 G1G1M1DI2 분획이 1㎎/㎖의 농도로 존재하는 경우에는 카토 Ⅲ세포의 파괴가 완전히 보호됨을 알 수 있다.
실험예 6 및 7의 결과로부터 본 발명에 따르는 알로에의 G1G1M1DI2 분획이 명백한 산소 래디칼 억제작용을 가지고 있음을 알 수 있었으며, 이러한 작용에 의하여 이 분획은 위궤양의 유발 모델인 헬리코박터 파이로리에 의하여 백혈구로부터 생성되는 산소 라디칼에 의한 위세포 손상을 거의 완전히 억제할 수 있음이 명백히 입증된다.
Claims (12)
- 알로에 젤의 동결건조물 중에서 알콜 가용성 상징액의 동결건조물을 알콜용매로 용출시키고, 얻어진 알코올 용출물에서 분자량 5000 이상의 투석 잔류물을 탄산수소암모늄과 염화나트륨으로 각각 용출시킨 글리코펩타이드 분획을 함유함을 특징으로 하는 상피세포 손상 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 추가로 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 상피세포 손상 치료용 조성물.
- 제2항에 있어서, 약제학적 제제의 형태로 제형화된 상피세포 손상 치료용 조성물.
- 제3항에 있어서, 약제학적 제제가 정제, 경질 또는 연질캅셀제, 액제, 현탁제, 주사용 용액 또는 현탁액, 연고제, 크림제 또는 로숀제 형태인 상피세포 손상 치료용 조성물.
- 제4항에 있어서, 약제학적 제제가 상기 분획 1㎎ 내지 500㎎을 함유하도록 제형화된 단위제형인 상피세포 손상 치료용 조성물.
- 제5항에 있어서, 약제학적 제제가 상기 분획 4㎎ 내지 125㎎을 함유하도록 제형화된 단위제형인 상피세포 손상치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 열상, 창상, 동상, 화상, 또는 방사선에 의해 손상된 피부조직 또는 수술부위의 피부조직에 대한 복구제로 사용되는 상피세포 손상 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 인체 내부장기의 손상된 조직에 대한 복구제로 사용되는 상피세포 손상 치료용 조성물.
- ⅰ)알로에의 전체잎의 외피를 제거하여 젤 분획만을 분리하고, ⅱ)젤 분획을 동결건조시킨 후에 증류수에 용해시키고, C1-C4알콜 용매를 가하여 생성된 침전물을 원심분리에 의해 제거하고, ⅲ)상징액을 취하여 알콜 추출용매를 제거한 후에 잔류물을 동결건조시키고, ⅳ)수득된 동결건조물을 물에 용해시켜 비이온성 다공성 수지의 칼럼에 흡착시키고 C1-C4알콜 용매로 용출시켜 용출되는 분획을 물에 투석시켜 투석잔류물로 수득되는 분자량 5000 이상의 물질을 회수하고, ⅴ)회수 분자량 5000이상의 물질을 탄산수소암모늄에 용해시킨 후에 겔여과 크로마토그라피 칼럼에 주입시키고 염화나트륨으로 세척하여 용출되는 분획을 동결건조시킴을 특징으로 하여. 제1항의 글리코펩타이드 분획을 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 ⅱ)에서 사용되는 C1-C4알콜 용매가 에탄올임을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 단계 ⅳ)에서 사용되는 C1-C4알콜 용매가 메탄올임을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 위궤양에 대한 치료제로 사용되는 상피세포 손상 치료용 조성물.
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